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Las enzimas difieren de los catalizadores químicos en los siguientes aspectos:
Mayor velocidad de reacción: La velocidad de una reacción catalizada por
enzimas es 106 a 1012 veces mayor que la de una no catalizada y varios
órdenes de magnitud mayor que la reacción correspondiente catalizada químicamente.
Condiciones de reacción suaves: Las reacciones catalizadas enzimáticamente
ocurren a temperaturas bajo los 100ºC, presión atmosférica y pH cercano a la
neutralidad. En contraste, las catalizadas químicamente requieren temperatura
y presión elevadas y pH extremos.
Gran especificidad de reacción: Las enzimas tienen una mucho mayor
especificidad que las reacciones catalizadas químicamente respecto de los
sustratos y sus productos. En las reacciones enzimáticas no hay productos
secundarios.
Capacidad de regulación: La actividad catalítica de muchas enzimas varía en
respuesta a sustancias diferentes del sustrato.
La catálisis enzimática de las reacciones químicas que ocurren en las células
es indispensable para los organismos vivos.
Ya que, en condiciones fisiológicas:
- La mayoría de las reacciones químicas tienden a ser muy lentas.
- La mayoría de las moléculas orgánicas son muy estables a pH neutro, a la
temperatura de los organismos vivos, y en el ambiente acuoso de las células.
- Muchas de las reacciones bioquímicas más comunes involucran eventos
químicos desfavorables energéticamente o muy improbables en el ambiente
celular.
- Es decir, estas reacciones no ocurren a la velocidad requerida si no son
catalizadas.
Considerando estas propiedades catalíticas tan
destacadas, surge una pregunta central:
¿Cómo funcionan las enzimas?
A + B
C + D
- Un equilibrio favorable no significa que la reacción sea rápida.
- Un ∆Gº’ negativo significa que el equilibrio favorece la
formación de los productos, pero no que la reacción ocurra
en forma espontánea.
- Se debe traspasar una barrera energética.
Velocidad = Frecuencia Colisión x Factor Energía x Factor Probabilidad
Colisión.
• Para que ocurra una reacción química, la colisión entre las moléculas
reaccionantes es un evento crítico y necesario.
• El número de colisiones es tan grande que sólo una fracción de ellas
son efectivas para producir la reacción química.
Energía:
• La velocidad de una reacción química depende del contenido calórico, H,
necesario para efectuar la conversión del reactante en producto.
• Todas las reacciones químicas deben pasar a través de un estado de
transición inestable de alta energía.
• El estado de transición es el punto de máxima de energía, donde el
estado de los sustratos o productos es igualmente probable.
• El estado de transición no es una especie química con una estabilidad
significativa. Es una especie fugaz y no un intermediario de la reacción.
• La diferencia en el contenido calórico entre el estado de transición y el
contenido calórico de los reactantes se llama calor de activación, ∆H*.
Una aproximación para comprender como las enzimas aumentan la velocidad de reacción es
suponiendo que el estado de transición (S‡) y el sustrato (S) están en equilibrio.
En donde K‡ es la constante de equilibrio para la formación de S‡, y v es la velocidad de formación
del producto a partir de S‡.
La velocidad de reacción es proporcional a la concentración de S‡.
Ya que solo S‡ puede convertirse en producto. La concentración de S‡ se relaciona con la
diferencia de energía libre entre S‡ y S, ya que se supone que estas especies están en
equilibrio.
Ya que la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de S‡, y la concentración de S‡
depende de ∆G‡, la velocidad de reacción V depende de ∆G‡. Específicamente,
k es la constante de Boltzmann, y h es la constante de Planck.
Probabilidad
• Refleja el cambio en el orden (o desorden) del sistema de reacción.
• Este factor puede ser representado en forma mas precisa y
cuantitativa por la función termodinámica, entropía.
∆S* = S* - Sr
S* = Entropía estado de transición
Sr = Entropía reaccionantes
Tomando en cuenta tanto ∆H y ∆S, se puede definir la Energía de Activación
como:
∆G = ∆H - T∆S
∆G = Energía de
Activación
∆H = Calor de Activación
∆S = Entropía
E + S
ES
EP
E + P
Teoría del Estado de Transición
• Teoría de la “llave - cerradura” . Complementariedad de la enzima con el sustrato.
• Mayor afinidad de la enzima por el estado de transición que por el o los
sustratos
• Las interacciones óptimas se obtienen en el estado de transición.
• Compuestos semejantes al estado de transición se unen varios órdenes de
magnitud mas fuerte que los sustratos.
• Compuestos no relacionados químicamente, pero que tienen en común una
semejanza estructural, son potentes inhibidores.
La teoría supone:
- La velocidad de la reacción está determinada por la descomposición del complejo
en el estado de transición.
- El estado de transición se encuentre en equilibrio con los sustratos.
Inhibición por análogos del Estado de Transición. (A) La isomerización de l-prolina a d-prolina
por prolina racemasa, una enzima bacterial, procede a través de un estado de transición plano
en el cual el carbono a es trigonalal mas que tetrahedrico. (B) Pyrrole 2-carboxylate, un análogo
del estado de transición es un potente inhibidor por su geometría trigonal.
Sitio Activo
Enzimas
- Eficientes
Reacciones químicas energéticamente favorables
- Específicas
Un sustrato – una reacción
- Regulables
Actividad
Masa
Sitio Activo
- Es una porción relativamente pequeña de la molécula completa.
- Residuos de aminoácidos participan en la unión del sustrato y
en la catálisis propiamente tal.
Aminoácidos
- Unión de sustrato
- Catálisis
- Mantención de integridad estructural
Clasificación de las Reacciones Catalizadas por Enzimas.
1. Desplazamiento o sustitución, donde una base o un nucleofilo
reemplaza a otro.
2. Adición, en la cual un reactivo se agrega a un doble enlace.
3. Eliminación, se remueve un grupo creando un doble enlace. Este
tipo es la reacción reversa de las reacciones de adición.
Nombre y Clasificación de las Enzimas.
Clase 1.
Oxido-reductasas. Catalizan reacciones de oxidación y reducción.
Incluyen a las deshidrogenasas, oxidasas, reductasas, peroxidasas,
oxigenasas, hidrolasas, hidroxilasas y catalasas.
Clase 2.
Transferasas. Transfieren grupos químicos de una molécula a otra, o
dentro de una molécula.
Incluyen a las amino, acil, metil, glucosil, y fosforil transferasas, quinasas,
fosfomutasas, transaldolasa y transcetolasa.
Clase 3.
Hidrolasas. Usan el agua para romper una molécula en dos moléculas.
Incluyen a las esterasas, glicosidasas, peptidasas, tiolasas, fosfolipasas,
amidasas, ribonucleasas y dexoiribonucleasa.
Nombre y Clasificación de las Enzimas.
Clase 4.
Liasas. Rompen moléculas en un proceso no hidrolítico, produciendo dobles
enlaces, o alternativamente, agregando grupos al doble enlace.
Incluyen a decarboxilasas, aldolasas, hidratasas, deshidratasas y sintetasas.
Clase 5.
Isomerasas. Convierten estructuras isoméricas por rearreglos intramoleculares.
Incluyen a las isomerasas, transferasas intramoleculares (mutasas), y liasas
intermoleculares.
Clase 6.
Ligasas. Unen dos moléculas separadas por la formación de un nuevo enlace
químico a expensas de la hidrólisis de ATP.
Incluyen a las enzimas que forman enlaces C-O, C-S, C-N, y C-C. Sintetasas y
ligasas.
Coenzimas.
Muchas enzimas requieren la presencia de coenzimas para llevar a cabo su actividad
catalítica. Las coenzimas pueden actuar como transportadores: aceptando o donando
grupos, átomos de hidrógeno, o electrones.
Las coenzimas se pueden agrupar en tres diferentes categorías:
1. Compuestos con grupos con alto potencial de transferencia tales como ATP y GTP,
que participan en el metabolismo energético en las células.
2. Compuestos, generalmente derivados de las vitaminas, unidas en el sitio activo
que reaccionan con el sustrato alterando su estructura de ma nera que la nueva
forma del sustrato es mas reactivo y por lo tanto la reacción ocurre mas fácilmente.
3. Coenzimas oxidativas tales como NAD, NADP, FAD, que tienen estructuras que
le permiten participar en reacciones de oxido reducción, donde actúan como
transportadores de átomos de hidrógeno o electrones.
Sitio Activo de la Lisosima
Modificación de Aminoácidos
- A nivel de proteína
- A nivel génico
Mutagénesis Sitio dirigida
- Rol de aminoácidos en actividad enzimática
- Producir enzimas con características especiales
Estudio de aminoácidos del sitio activo:
- Mapeo mediante métodos químicos tradicionales
- Medición de constante de unión de inhibidores y derivados
- Alteración de estructura del sustrato
Modificación química de proteínas.
- Las cadenas laterales de los aminoácidos reaccionan con una gran cantidad
de reactivos químicos formando enlaces covalentes.
- Los reactivos son inespecíficos y reaccionan con cualquier residuo que se
encuentre accesible.
- La modificación puede llevar a una pérdida irreversible de la actividad:
- Si se bloquea un residuo catalíticamente esencial.
- Si se impide estéricamente la unión del sustrato.
- Si se distorsiona la proteína.
- Si se impide su movilidad.
El objetivo de la modificación química de las proteínas es:
- Obtener información respecto del mecanismo de reacción.
- Modificar su actividad.
Modificación de Aminoácidos
•
•
•
•
Intermediario enzima-sustrato estable: Unión covalente
Estabilizar intermediario: Reducción base de Schift
Utilizar cuasi sustratos (Sus-X)
Modificación en presencia de sustrato o inhibidor competitivo
100
% Actividad Remanente
o Contenido de Aminoácido
X5
X 5o
X2
X 2o
X1
X1o
X4
X 4o
A
Ao
10
Tiempo de Reacción
Desventajas de la modificación
• Inespecificidad
• Condiciones de marcación extremas
• Grupos no accesibles
Inhibidores irreversibles
Dirigidos hacia el sitio activo.
El inhibidor es un compuesto químico que se parece al sustrato de la enzima,
se une específicamente al sitio activo y forma enlaces covalente con los
residuos de la proteína.
Algunas de las características de la inhibición irreversible son:
- La velocidad de inactivación es inhibida por inhibidores reversibles o
sustratos de la enzima.
- La velocidad de inhibición es función del pH, con una curva similar a la
observada con la velocidad de una reacción enzimática.
- La enzima inactivada tiene 1 mol de inhibidor unido por mol de sitios activos.
- La inhibición sigue una cinética de saturación.
Inhibición por Diisopropylphosphofluoridate (DIPF), un reactivo grupo-específico. DIPF
Puede inhibir la enzima modificando covalentemente un residuo de serina clave.
Inactivación de la enzima por Iodoacetamide, un reactivo grupo-específico.
Iodoacetamide puede inactiva la enzima reacionando con un residuo de ciste ína clave.
Marcación por Afinidad. (A) Tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) es un reactivo
Análogo al sustrato normal de la quimotripsina. (B) TPCK se une al sitio activo de la enzima
y modifica un residuo de histidina esencial.
Bromoacetol Phosphate , un marcador por afinidad de la Triosa Fosfato Isomerasa (TIM).
Bromoacetol phosphate , un análogo de dihidroxiacetona fosfato, se une al sitio activo de
la enzima y modifica covalentemente un residuo de ácido glutámico necesario para la
actividad de la enzima.
Inhibidores irreversibles
Activados por enzimas.
Hay mucho interés en la generación de inhibidores irreversibles de enzimas por el
gran potencial terapéutico que tienen. Su selectividad se logra por unión al sitio
activo de la enzima blanco.
Además de utilizar la unión específica a su enzima blanco, utiliza específicamente
su aparato catalítico para su activación química.
Un inhibidor normalmente inocuo se convierte en un potente inhibidor irreversible.
Estos inhibidores que no son reactivos en ausencia de la enzima blanco, son
llamados inhibidores suicidas: las enzimas se suicidan al activar al inhibidor.
Un inhibidor suicida efectivo debe tener las siguientes características:
1. Debe ser no reactivo químicamente en ausencia de la enzima.
2. Debe ser activado específicamente por su enzima blanco.
3. Debe reaccionar, en su forma activada, más rápido con su enzima blanco que
disociarse de ella.
Inhibición basada en el mecanismo de reacción. Monoamino oxidasa, una enzima importante para la
Síntesis de neurotransmisor, requiere del cofactor FAD (flavin adenin dinucleotido).
N,N-Dimetilpropargilamina inhibe la monoamino oxidasa por modificación covalente del grupo prostético
flavina solo después que el inhibidor es oxidado. El aducto N-5 flavina se estabiliza por la adición de un
protón.
Mutagénesis Sitio - dirigida
- Técnicas que cambien específicamente algún aminoácido resultará en proteínas con
propiedades diferentes a las de las proteínas nativas, lo cual puede ser de interés en
su aplicación industrial.
- Determinar cual aminoácido debe ser cambiado para obtener el cambio deseado en
las propiedades es fácil si se conoce la estructura tridimensional de la proteína
(análisis por cristalografía de rayos X u otras técnicas analíticas).
- Para la mayoría de las proteínas no se dispone de esta información detallada, por lo
tanto la mutagénesis dirigida es una estrategia de “prueba y error”, en la cual se
introducen modificaciones en aquellos nucleótidos que probablemente producen un
cambio en una propiedad específica de la proteína.
La mutagénesis sitio - dirigida ha sido utilizada para producir enzimas, para uso
industrial o terapéutico, cuyas propiedades sean mejores que las enzimas naturales.
1. La modificación de la Km y de la Vmax, produce un aumento de la eficiencia catalítica
(Vmax/Km).
2. Cambio de la estabilidad térmica o de pH de la enzima, permite que ésta sea utilizada
en condiciones de pH y temperatura que inactivarían la forma nativa.
3. La modificación de la reactividad de una enzima en solventes orgánicos, permite que
ésta sea usada en condiciones no fisiológicas.
4. La modificación del sitio de unión de sustrato para aumentar su especificidad, puede
disminuir reacciones secundarias no deseadas.
5. La alteración de la regulación alostérica de una enzima, disminuye la inhibición
feedback y por consiguiente aumenta la producción de ciertos metabolitos.
Para producir la mutagénesis sitio - dirigida es necesario:
1) Saber que aminoácido es el que debe ser cambiado.
2) Conocer la secuencia de nucleótidos en la región del DNA que codifica
el codón del mRNA que se desea cambiar.
¿Cómo se hace?
El método mas común es introducir el gen clonado en
un vector de doble hebra.
La simple hebra del vector recombinante se aísla y
se mezcla con un oligonucleótido sintético.
El oligonucleótido tiene, a excepción de un
nucleótido, la secuencia complementaria exacta del
segmento del gen clonado.
El nucleótido cambiado coincide con el nucleótido del
codón del mRNA que codifica para el aminoácido que
se quiere cambiar.
El oligonucleótido hibridará y el extremo 3’ actuará
como primer para la síntesis de DNA.
Las moléculas completas de doble hebra que
contienen, ahora, los nucleótidos cambiados se
introducen a células de E. coli por transformación.
Ya que el DNA se replica semiconservativamente, la
mitad de las células contiene el gen nativo y la otra
mitad tiene el gen mutado (con el nucleótido
cambiado)
Mutagénesis sitio -dirigida de Subtilisin. Residuos de la triada catalítica fueron cambiados por Ala y se midió
la actividad de la enzima mutada. La mutación de cualquier componente produce un dramático cambio en la
actividad enzimática. S: serina, H: histidina, D: Aspártico. La actividad está en escala logarítmica.
Aumento del número de enlaces S-S
Aminoácidos
Enzima
3
9
21
54
97
142
164
Nº de SS
Actividad
(%)
T
(ºC)
wt
Ile
Ile
Thr
Cys Cys
Thr
Leu
0
100
41.9
A
Cys
Ile
Thr
Thr
Cys
Thr
Leu
1
96
46.7
B
Ile
Cys
Thr
Thr
Ala
Thr
Cys
1
106
48.3
C
Ile
Ile
Cys
Thr
Ala
Cys
Leu
1
0
52.9
D
Cys
Cys
Thr
Thr
Cys
Thr
Cys
2
95
57.6
E
Ile
Cys
Cys
Thr
Ala
Cys
Cys
2
0
58.9
F
Cys
Cys
Cys
Thr
Cys
Cys
Cys
3
0
65.5
Reemplazo de un aminoácido por otro
Aminoácidos
Enzima
14
78
Vida Media (min)
Wt
Asn
Asn
13
A
Asn
Thr
17
B
Asn
Ile
16
C
Thr
Ile
25
D
Asp
Asn
11
Tyr + ATP
Tyr-A + PPi
Tyr-A + tRNATyr
Tyr-tRNA + AMP
Enzima
kcat (s-1)
Km (mM)
kcat / Km (s-1 M-1)
Thr-51
4.7
2.5
1,860
Ala-51
4.0
1.2
3,200
Pro-51
1.8
0.019
95,800
Proteasa Subtilisin.
Especificidad: X-Ala-Pro-Phe-, P4=X es un residuo hidrofóbico
El principal determinante de la especificidad de esta enzima radica en el subsitio S1 el
cual es hidrofóbico y une la cadena lateral del residuo P1 del sustrato.
La actividad mas alta de esta enzima es hacia un sustrato que tenga tirosina en P1,
siendo menos activa con fenilalanina, metionina y alanina.
Gly-166 se encuentra en parte de atrás de donde se une P1.
Al aumentar el tamaño de la cadena lateral del residuo 166, disminuye la actividad hacia
tirosina en P1.
La actividad hacia residuos más pequeños en P1 aumentan.
Proteasa Subtilisin.
En S4 se encuentra un residuo hidrofóbico voluminoso, Ile-107. Esto permite reconocer
sustratos que tengan en P4 grupos hidrofóbicos.
La velocidad catalítica es similar para cualquier residuo hidrofóbico en P4.
La mutación de Ile por Gly-107 aumenta el tamaño del bolsillo.
Produce una disminución de 200 veces en la velocidad catalítica para Ala.
Solo tiene pequeños efectos para Phe, Ile o Leu.
Las cadenas más grandes complementan la lesión causada introduciendo una cavidad en
la proteína.
Los mecanismos catalíticos se pueden clasificar en:
• Catálisis Acido – Base
• Catálisis Covalente
• Catálisis por ion metálico
• Catálisis Electrostática
• Catálisis por Efectos de proximidad y Orientación
• Catálisis por Unión preferente al complejo del estado de transición
Catálisis Acida General
La transferencia parcial de un protón desde un ácido de Bronsted
(especie capaz de donar un protón) baja la energía libre del estado
de transición de la reacción.
Catálisis Básica General
Se aumenta la velocidad de la reacción por la captación de un protón
por una base de Bronsted (especie que puede combinar un protón).
Catálisis Acido-Base General
Se combinan ambos procesos.
Mecanismos de la Catálisis.
Ya que la velocidad de una reacción es función de la energía libre, lo que hace un
catalizador es bajar esta barrera energética; esto es estabilizar el estado de transición.
Lo que hace a las enzimas poderosos catalizadores son dos propiedades relacionadas:
su especificidad de unión del sustrato combinada con una óptima orientación de los
grupos catalíticos.
1. Catálisis ácido – base.
La catálisis ácido general es un proceso en el cual la transferencia parcial de un
protón desde un ácido disminuye la energía de activación del estado de transición.
También la reacción se puede acelerar por la captación de un protón por una base.
Algunas reacciones pueden estar sometidas a ambos procesos simultáneamente:
catálisis ácido - base general concertada.
Entre los muchos tipos de reacciones bioquímicas que son susceptibles de
catálisis ácido y/o base se incluyen:
- Hidrólisis de péptidos y ésteres
- Reacción de grupos fosfatos
- Adiciones al grupo carbonilo
Las cadenas laterales de los aminoácidos
Glu, Asp, Lys, Arg, Cys, His, Ser,Tyr
tienen pKs en el rango de pH fisiológico, lo cual les permite actuar como
catalizadores ácido o básicos, en analogía con los mecanismos orgánicos
conocidos.
Catálisis Acido-Base:
Reacción catalizada por la ribonucleasa.
En el sitio activo hay dos His: His12 e
His119
La reacción ocurre en dos etapas:
1. His12 actúa como una base general,
atrae un protón desde el grupo 2’ OH del
RNA, promoviendo el ataque nucleofílico
al átomo de P adyacente.
His119 actúa como ácido general,
promueve el rompimiento del enlace
protonando al grupo saliente.
2. El intermediario 2’,3’ es hidrolizado
haciendo esencialmente el camino
inverso del paso 1 en el cual el agua
reemplaza al grupo saliente. Así, His12
actúa como ácido general e His119
como base general produciendo el RNA
hidrolizado y dejando a la enzima en su
estado original.
2. Catálisis Covalente.
Este tipo de catálisis involucra el aumento de la velocidad a través de la formación
(transiente) de un enlace covalente entre el catalizador y el sustrato.
La catálisis covalente conceptualmente se puede descomponer en tres etapas:
1. Reacción nucleofílica entre el catalizador y el sustrato para formar el enlace
covalente.
2. El retiro de los electrones desde el centro de reacción.
3. La eliminación del catalizador, una reacción esencialmente inversa a la etapa 1.
Mientras mas estable sea el enlace covalente formado, se descompone menos
fácilmente en las últimas etapas de la reacción.
Un buen catalizador covalente debe combinar dos propiedades aparentemente
contradictorias:
- Una alta nucleofilicidad y
- La capacidad de formar un buen grupo saliente,
es decir, que la formación del enlace covalente sea fácilmente reversible.
La nucleofilicidad de una sustancia está estrechamente relacionada con su
basicidad.
Si la formación el enlace covalente es la etapa limitante de la reacción catalizada
covalentemente, la velocidad de reacción tiende a aumentar con la basicidad del
catalizador.
Decarboxilación de acetoacetato catalizado químicamente por aminas primarias.
La amina ataca nucleofílicamente el grupo carbonilo del acetoacetato para formar una
base de Schiff (enlace imino).
El átomo de nitrógeno protonado del intermediario covalente actúa como un resumidero
de electrones, reduciendo la alta energía que de otra forma tiene el enolato en el estado
de transición.
Catálisis Covalente
- Ser195 ataca nucleofílicamente el grupo
carbonilo del enlace peptídico que se va a
romper, formando un complejo conocido como
intermediario tetrahédrico.
- Estudios de rayos X muestran que Ser 195 está
en una posición ideal para llevar a cabo este
ataque (proximidad y orientación)
- El anillo imidazol de His57 capta el protón
liberado, formando un ion imidazolium (catálisis
general básica).
- Este proceso es facilitado por el efecto
polarizante carboxilato del Asp102, el cual forma
un enlace de H con His57 (catálisis
electrostática).
- Si se cambia Asp102 por Asn, no cambia Km
pero la kcat se reduce a menos del 0,05% de su
valor original.
- El intermediario tetrahédrico se descompone al
intermediario acil-enzima dirigido por la cesión de
un protón de N3 de His57 (catálisis general
ácida).
El intermediario acil-enzima es
deacilado por reacciones
reversas de los pasos anteriores.
3. Catálisis por iones metálicos.
De acuerdo a la fuerza con que se une el metal, las enzimas se clasifican en:
Metaloenzimas. El ion metálico se encuentra unido fuertemente y son iones
tales como Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, o Co2+.
Enzimas activadas por metales. Unen metal libremente de la solución y son
del tipo Na+, K+, Mg2+ o Ca2+.
Los iones metálicos participan en el proceso catalítico principalmente de tres
maneras:
- Uniéndose al sustrato de manera de orientarlo apropiadamente.
- Mediando reacciones de oxido-reducción a través de cambios reversibles
en el estado de oxidación del ion metálico.
- Estabilizando o enmascarando electrostáticamente cargas negativas.
4. Catálisis electrostática.
La unión del sustrato generalmente excluye al agua del sitio activo.
La constante dieléctrica local se parece a un solvente orgánico,
donde las interacciones electrostáticas son mucho mas fuertes
que en solución acuosa.
5. Catálisis a través de efectos de proximidad y orientación.
Aunque las enzimas utilizan mecanismos que se parecen a reacciones orgánicas
modelos, ellas son catalíticamente mas eficientes que esos modelos.
Esta eficiencia puede surgir de condiciones físicas específicas en el sitio catalítico
de la enzima que promueve la reacción química correspondiente.
Los efectos mas obvios son:
- Proximidad
- Orientación
Los reaccionantes deben estar juntos y en la disposición espacial correcta para que
ocurra la reacción.
Efectos de Proximidad y Orientación.
Reacciones con cada vez menos grados de libertad.
Ataque de un ácido carboxílico sobre un éster en un anillo aromático.
Si ambos grupos están en la misma molécula, es decir R1 y R2 se encuentran juntos.
(Ar = methoxyphenyl group.)
Efectos de Proximidad y Orientación.
Efectos de Proximidad y Orientación.
OH
O
O
+
COOH
A
OH
COOH
CH3
B
CH3
CH3
H2O
6. Catálisis por unión preferente al estado de transición.
El aumento de la velocidad enzimática es a menudo mucho mayor que lo que
pueden explicar los mecanismos descritos.
El factor mas importante de la catálisis enzimática es la unión al estado de
transición con mayor afinidad que los correspondientes sustratos y productos.
La unión al estado de transición produce una tensión a sus sustratos para que
adopten la geometría de éste en un sitio donde no encaja el sustrato no
distorsionado.
Esto se basa en las evidencias que existen respecto del rol de la tensión en
reacciones orgánicas.
El reactivo tensado se parece mas al estado de transición de la reacción que
el correspondiente reactivo no tensado.
Si una enzima une preferentemente su estado de transición, análogos de éste
se comportan como potentes inhibidores de la enzima.
Inhibidor análogo al estado de transición
En resumen, las enzimas ejercen su poder catalítico:
1. Manteniendo los sustratos juntos y en la orientación adecuada.
2. Proveyendo los grupos ácidos y básicos en la orientación apropiada
para promover la transferencia de protones dentro del sustrato.
3. Los grupos en la enzima (especialmente los grupos nucleofílicos)
pueden formar enlaces covalentes con el sustrato para formar
estructuras que son mas reactivas que las originales.
4. La enzima es capaz de introducir torsión en los sustratos, quizás
acompañada con cambios conformacionales de la proteína.
Inmunoglobulinas o Anticuerpos:
Proteínas grandes (150.000 daltons),
Formadas por cuatro cadenas polipeptídicas:
dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas
Contienen regiones variables
Altamente específicos
Anticuerpos Catalíticos: Abzymes
Aprovechando la gran especificidad de unión por el antígeno que tienen los
anticuerpos, se han desarrollado estrategias experimentales para producir
anticuerpos que catalizan reacciones químicas.
Estos anticuerpos catalíticos, o abzymes, se seleccionan desde
anticuerpos monoclonales generados por inmunización de ratones con
haptenos que semejan el estado de transición de la reacción catalizada por
la enzima.
Estrategias para generar anticuerpos con actividad catalítica:
i) Usar los anticuerpos para estabilizar estados de transición,
ii) Usar anticuerpos como trampas entrópicas,
iii) Generar anticuerpos con grupos catalíticos o cofactores.
Por ejemplo, abzyme 28B4 cataliza la oxidación por periodato de p-nitrotoluen-metil sulfuro
a sulfoxido, donde los electrones del átomo de S se transfieren al oxigeno.
La velocidad de esta reacción es acelerada por enzimas que estabilizan el estado de
transición de la reacción.
Para generar abzymes complementarias en estructura al estado de transición, los
ratones son inmunizados con un hapteno cuya estructura es un espejo de la estructura
y propiedades electrostáticas del estado de transición.
De los anticuerpos monoclonales generados con este hapteno, se encontraron muchos
que catalizan la oxidación del sulfuro, pero con un rango de afinidad de unión y
eficiencia catalítica muy amplio.
Abzyme 28B4 une el hapteno con alta afinidad (Kd = 52 nM) y tiene una alta eficiencia
catalítica (k3/KM = 190,000 M-1s-1).
Las enzimas aumentan la velocidad de una reacción química
a través de mecanismos catalíticos concertados:
- Efectos de proximidad y orientación,
- Catálisis covalente
- Catálisis ácido-base general.
Introducción de Grupos Catalíticos:
- Introduciendo modificaciones al antígeno es posible generar grupos
catalíticos en los sitios de unión del anticuerpo.
- Uso de la mutagénesis sitio dirigida. Es posible introducir aminoácidos
específicos para aumentar la capacidad catalítica del anticuerpo.
- Modificación química
Las enzimas inmovilizadas pueden ser clasificadas en las siguientes
cuatro categorías:
i)
ii)
iii)
iv)
Absorbidas fuertemente a soportes insolubles
Unidas covalentemente a un soporte sólido
Atrapadas en una matriz (geles)
Microencapsuladas.
Unión a un soporte sólido: la enzima se une a un soporte insoluble.
- Adsorción física
- Unión iónica
- Unión covalente
Enzimas atrapadas en matriz: se incorpora la enzima
en la trama de un gel semipermeable o se encierra
la enzima en una membrana semipermeable.
Entrecruzamiento de moléculas de enzimas por reactivos bi o
multifuncionales.
Adsorción Física
Este método se basa en la adsorción física de la enzima sobre la superficie de un
soporte insoluble. Por eso, el método provoca poco o ningún cambio conformacional de
la enzima o destrucción de su sitio activo. Si se encuentra el soporte adecuado, este
método es simple y económico.
Desventaja: La enzima adsorbida se puede soltar durante su uso debido a lo débil que
son los enlaces de unión entre la enzima y el soporte.
Debido a los enlaces débiles involucrados, la desorción de la proteína es provocada
por cambios de temperatura, pH, fuerza iónica o aún la presencia de sustrato.
Ventajas: Generalmente no requiere de reactivos y sólo de un mínimo de
etapas de activación.
La adsorción tiende a ser menos disruptiva de la enzima que los medios químicos de
unión ya que la unión es principalmente por enlaces de hidrógeno, enlaces
electrostáticos, etc .
El método de la unión iónica se basa en la interacción iónica de la enzima con grupos
de intercambio iónico en el soporte insoluble.
Polisacáridos y polímeros sintéticos que tienen grupos de intercambio iónico son los mas
usados como soportes.
La unión se lleva a cabo fácilmente y las condiciones son mucho mas suaves que las
necesarias para la unión covalente.
Este método de unión provoca pocos cambios en la conformación y sitio activo de la
enzima.
Las enzimas inmovilizadas con este método tienen alta actividad.
La enzima se puede soltar desde el soporte en condiciones de alta fuerza iónica o
variaciones de pH, porque las fuerzas de unión entre las proteínas y el soporte son
débiles.
La principal diferencia entre la unión iónica y adsorción física es que la unión de la
enzima al soporte es mucho mas fuerte en la unión iónica aunque mas débil que la
unión covalente.
La unión covalente se basa en la unión de la enzima a soportes insolubles a través de
enlaces covalentes.
Los grupos funcionales que pueden participar de esta unión son:
Amino, Carboxilo, Sulfidrilo, Hidroxilo, Imidazol, Fenólico, Tiol, Treonina, Indol
- Las condiciones de inmovilización por enlaces covalentes son mucho mas complejas y
mas drásticas que en el caso de la adsorción física y unión iónica.
- La unión covalente puede alterar la conformación y sitio activo de la enzima, resultando
en una mayor pérdida de la actividad y/o cambios de afinidad por el sustrato.
- La unión entre la enzima y el soporte es tan fuerte que la enzima no se suelta aún en
presencia de sustrato o de soluciones de alta fuerza iónica.
Aminoácido
Grupo
Nº Reacciones
Porcentaje
ε-amino
27
7,0
Cisteína
Sulfihidrilo
31
3,4
Aspártico
Carboxilo
4
4,8
Glutámico
Carboxilo
4
4,8
Tirosina
Fenol
16
3,4
Arginina
Guanidinio
6
3,8
Histidina
Imidazol
13
2,2
Triptofano
Indol
7
1,2
Metionina
Tioester
7
1,6
Serina
Hidroxilo
0
7,8
Metionina
Hidroxilo
7
1,6
Lisina
Inmovilización en diferentes soportes sólidos.
Al momento de seleccionar el soporte es importante considerar los
siguientes factores:
1. Propiedades mecánicas: rigidez y durabilidad.
2. Forma física: gránulos, láminas, pared interna de un tubo.
3. Resistencia a ataque químico o microbiano.
4. Hidrofilicidad, manifestada por la capacidad de incorporar agua en su estructura.
5. Permeabilidad.
6. Capacidad para ser derivatizada sin modificar sus características.
7. Precio y disponibilidad.
Reactor Tanque con agitación
Un reactor en un tanque con agitación es el tipo mas simple
de reactor. Se compone de un reactor y de un mezclador, agitador.
Este reactor es útil para soluciones de sustratos de alta viscosidad
y para enzimas inmovilizadas con relativamente baja actividad.
Sin embargo, las enzimas Inmovilizadas tienden a inactivarse con la
agitación. Este sistema es utilizable para la producción de pequeñas
cantidades de reactivos.
Una modificación es un reactor en tanque continuo con agitación,
el cual es mas eficiente que el anterior, pero el equipamiento es
levemente mas complicada.
Reactor en columna
Son los reactores mas ampliamente usado para las enzimas inmovilizadas.
Se debe considerar la velocidad de flujo y el efecto de las dimensiones de la
columna en la velocidad de la reacción.
Este tipo de reactores puede ser del tipo:
1. Flujo hacia abajo
2. Flujo hacia arriba
3. Reciclaje
Hidrólisis de Lactosa: Una importante aplicación de las enzimas inmovilizadas
El objetivo es convertir el disacárido lactosa, vía hidrólisis, en sus componentes: glucosa y galactosa.
Lactosa está normalmente en la leche humana y de vaca y es muy usada en fórmulas lácteas infantiles.
Un gran problema con la lactosa es que muchas personas son intolerantes a la lactosa, es decir el
organismo es incapaz de digerirla.
Se estima que anualmente se acumulan 1.2 millones de toneladas de lactosa por el procesamiento
de la leche para producir diversos productos lácteos, como en el suero generado en la elaboración
de quesos.
La conversión de lactosa en glucosa y galactosa representa una manera de agregar valor al suero y
sus productos. Para la hidrólisis enzimática de la lactosa se han descrito varias ß-glicosidasas,
alguna de las cuales ya se encuentran en el mercado.
Independiente de la técnica utilizada para generar un sistema de
enzima inmovilizada, es importante tener en cuenta lo siguiente:
a)
b)
c)
d)
Enzima cargada
Comportamiento cinético
Estabilidad
Configuración del reactor.
Aplicaciones.
- Estudios Bioquímicos.
- Biotecnología.