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CARACTERIZACIÓN Y USO DEL locus b DEL TIPO DE APAREAMIENTO
COMO MARCADOR MOLECULAR EN Ustilago maydis
Margarita Fuentes-Hernández, P. Sánchez-Alonso
Centro de Investigaciones Microbiológicas, Instituto de Ciencias de la Benemérita
Universidad Autónoma de Puebla. Complejo de Ciencias, edificio 76 3er. piso. C.U.
72570 Puebla, Pue. México. [email protected] .
RESUMEN
El locus b es el principal determinante de la patogenicidad en Ustilago maydis, contiene los genes bE y bW
que codifican para un par de proteínas homeóticas que forman heterodímeros funcionales cuando provienen
de diferentes alelos. Ambos genes contienen una region amino terminal variable. En este trabajo proponemos
tomar ventaja de la variabilidad del gen bW para utilizarlo como marcador molecular. La estrategia utilizada
involucra la amplificación de la región variable de bW, el análisis de secuencia y la determinación de
patrones de restricción. Se reporta la caracterización de 20 alelos del locus b que comprende tres grupos
definidos.
INTRODUCCIÓN.
Ustilago maydis, el hongo causante del carbon del maíz, es un microorganismo dimórfico que exhibe una fase
saprobia no patogénica que crece en forma levaduriforme y es haploide, y una fase biotrófica micelial, la cual
es dicariota y patogénica. Las transiciones morfológicas y la patogenicidad son concomitantes en este hongo,
y están reguladas a través de su compatibilidad sexual por un sistema de apareamiento tetrapolar gobernado
por los loci de apareamiento a y b9. El locus a tiene dos alelos a1 y a2 que codifican para un sistema receptorferohormona responsable de controlar el reconocimiento celular y la fusión de células compatibles 5, que se
reconocen cuando el receptor y la ferhormona son de tipo de apareamiento opuesto16. Las esporidias
apareadas forman una estructura que adoptan la forma filamentosa llamada dicarión. Una vez formado, el
dicarión podrá crecer como un tubo filamentoso recto y largo y será capaz de infectar a la planta de maíz solo
si contiene diferentes alelos del locus b1. El locus b es el principal determinante de la patogenicidad en
Ustilago maydis. Este locus genes bE y bW que codifican para un par de proteínas homeóticas que forman
heterodímeros funcionales cuando provienen de diferentes alelos7, 10. Ambos péptidos contienen una region
amino terminal variable y un motivo de homeodominio (HD) similar al de proteínas que gobiernan el
desarrollo de Schizophyllum y Saccharomyces cerevisiae. En ambos también existe una alta variabilidad en
los primeros 120 y 140 aminoácidos de la región amino-terminal (polipéptidos bE y bW respectivamente),
esta región es la responsable del reconocimiento alelo-específico y de la interacción entre polipéptidos para
formar dos heterodímeros diferentes, uno de los cuales es suficiente para desencadenar el desarrollo de la fase
patógena del hongo10, y se descarta la posibilidad de variación en las distancias de los homeodominios para el
reconocimiento de los sitios de unión a DNA12. Existen reportes sobre el papel del heterodímero bE-bW como
un regulador transcripcional positivo o negativo, que actúa directamente sobre ciertos genes como Iga2, dik6,
egl1 y rep1, e indirectamente sobre muchos de la cascada regulatoria que controla el desarrollo de la forma
filamentosa y patógena de Ustilago maydis 3, 4, 6, 11. La formación del heterodímero a través de los dominios
variables de las proteínas homeóticas bE y bW es el evento regulatorio clave para el desarrollo sexual y
patogénico del hongo. Actualmente se conocen algunos elementos de respuesta a este factor transcripcional
que es esencial para completar el ciclo de vida de éste hongo 11. En este trabajo proponemos tomar ventaja de
la variabilidad del gen bW para utilizarlo como marcador molecular. La estrategia utilizada involucra la
amplificación de la región variable de bW, el análisis de secuencia y la determinación de patrones de
restricción. Se reporta la caracterización de 20 alelos del locus b que comprende tres grupos definidos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Se colectaron agallas del carbón de maíz (huitlacoche) de diferentes zonas geográficas de los Estados
de Puebla, Tlaxcala y Veracruz, incluyendo áreas naturales protegidas y algunos aislados de teozintle. Las
teliosporas fueron tratadas de acuerdo a Holliday8 y se obtuvieron las esporias, las cuales fueron crecidad en
medio completo con carbón activado para aislar colonias únicas. Una vez aisladas, las cepas se caracterizaron
mediante la prueba de fuz y de tum+ que identifica los alelos (a1 o a2) y del locus a, y determina la
compatibilidad de los alelos de locus b del tipo de apareamiento. Para este ensayo utilizamos cepas de
laboratorio reportadas, cuyo genotipo a y b se conoce, las cepas utilizadas fueron: FB1 (a1,b1), FB2 (a2,b2),
521(a1,b2) (Banuett 1989, anablemente donadas por el Dr. José Ruíz Herrera CINVESTAV-IPN, Unidad
Irapuato; I2 (a2, bx) gentilmente donadas por el Dr. Octavio Paredes López (CINVESTAV-IPN, Unidad
Irapuato) y UCM 521 (a1, b1) y 104 (a1,b2) amablemente donada por el Dr. W. K. Holloman, Medical Weill
Cornell University, N.Y.
Para determinar el tipo de apareamiento b, se eligieron cepas con tipo de apareamiento del locus a
compatibles (a1 con a2 y viceversa) para asegurar la prosecución de la infección. Las cepas seleccionadas
provenían de cada una de las regiones muestreadas y se infectaron plantulas de maíz de 15 días
postgerminación de la variedad MCS 02. La infección en planta se realizó como describe Thakur 17 midiendo
la densidad óptica de los cultivos y el número de células con hemacitómetro antes de infectar plántulas
quintuplicado. De las cepas caracterizadas por su tipo de apareamiento se seleccionaron 32 cepas y se
procedió a extrar DNA genomico. Se diseñaron oligonucleótidos iniciadores para amplificar mediante PCR
la region variable tanto del gen bE como del gen bW del locus b. Este primer producto de PCR tendría que
servir como templete para amplificar finalmente la region variable del gen bW mediante PCR anidado. Para
aislar las secuencias de bW se seleccionaron 12 cepas, que incluyeron linajes con los dos tipos de
apareamiento a y que representaran aislados de mazorca, tallo y flor.
Figura 1. Alineamiento del producto de la región variable
de bW de diferentes aislados.
Las secuencias de nucleótidos de los amplificados sirvieron para la búsqueda de los patrones de restricción
que definieron 3 grupos generales y para determinar su utilidad en la determinación de la frecuencia alélica
por SSPE (datos no mostrados)
La amplificación abarcó una región de aproximada de 442 pb, y que codifica 147 aminoácidos de la región
variable de la proteína, siguiendo las instrucciones del manufacturador, y como se describe en cualquier
manual13. Una vez obtenidos, los amplificados se clonaron en el plasmido pKS- y se secuenciaron. La figura
1 muestra el alineamiento de los productos conceptuales de las secuencias aisladas, las cuales muestran una
variabilidad no muy extensa, que coincide con lo descrito por Yee y Kronstad 18
Los amplificados fueron sometidos a un análisis de secuencia para determinar un patrón de restricción que
permitiera diferenciar los amplificados de las diferentes cepas. El patrón de restricción agrupa a las cepas
muestreadas en tres grupos que denominamos arbitrariamente 2H, 1B y 3C, siendo más frecuente en
nuestros.aislados el patrón 1B. Esto es congruente con resutados previos de Yee y Kronstad 18, quienes
mediante la elaboración de quimeras definieron tres grupos de variantes del gen bW. En la figura 2A. se
muestran los amplificados de las regiones variables de bE y bW. Los patrones de restricción obtenidos con las
enzimas HindIII, BamHI y BclI se muestran en la figura 2B
Figura 2. Amplificación y análisis de restricción de la región variable del locus b del tipo de
apareamiento de Ustilago maydis.
A
B
A. Amplificación de un fragmento del gen bW como se indica en el texto. Los amplificados fueron aislados
clonados en pKS+ Bluescript (Stratagene Cloning Systems) y secuenciados, una vez obtenidos, los amplificados también
fueron digeridos con enximas de restricción . B. Patron de restricción 1B del amplificado del locus bW.
Nuestros datos indican que la secuencia que codifica los primeros 10 aminoacidos se encuentra
conservada o existe poca variación. Tambien se encontramos aminoacidos muy conservados, así como
cambios especificos de aminoacidos presentes en la region que Yee and Kronstand 18 habian señalado como
importantes para la especificidad (51, 52, 53, 55, 56, 58, 59,60,61 y 62), además encontramos cambios en las
posiciones 88 a la 142 los cuales no habían sido reportados previamente.
Actualmente los datos de secuencia, y grupos de restricción se están utilizando para definir patrones
SSCP que permitirán la determinación de la frecuencia alélica del gen bW en la naturaleza y para definir si
existen más alelos que los 25 reportados.
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Proyecto parcialmente financiado por la Vicerrectoría de Investigación, B.U.A.P.