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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS
PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO
ESQUELÉTICO DE POLLO
PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR DESALADO
Las funciones biológicas de las proteínas
Las proteínas tienen diferentes funciones:
• Enzimas (Actividad catalítica)
• Receptores de membrana
• Acarreadores de membrana (Reconocimiento, actividad catalítica y transporte)
• Estructurales (Andamios moleculares)
• Hormonas
• Anticuerpos
• Transporte
Purificación de Proteínas
• La purificación de proteínas es un proceso mediante el cual se separa una
proteína a partir de una mezcla compleja.
• Para la purificación se toman en cuenta las propiedades fisicoquímicas y
se hace mediante métodos de cromatográficos en un proceso paulatino.
• El método de purificación debe diseñarse tomando en cuenta la cantidad
de proteína que queremos obtener (rendimiento). Este rendimiento depende
del uso que se le desea dar.
• Podemos obtener la proteína en estado nativo o desnaturalizado
dependiendo la finalidad de la purificación:
 Para evaluar la actividad biológica se requiere en estado nativo
 Para determinar su estructura primaria, puede estar desnaturalizada
Las proteínas se pueden purificar para diferentes finalidades:
Investigación
• Estudiar su función biológica.
• Evaluar la estructura primaria, secundaria,
terciaria y cuaternaria de las proteínas.
• Hacer análisis filogenéticos.
• Analizar la relación estructura-función.
Biotecnología
• Aplicaciones médicas.
• Aplicaciones terapéuticas.
• Suplementos alimenticios
• Detergentes y limpiadores.
• Cosméticos
Pasos para purificar una proteína…
Para que purificar la proteína:
Actividad
Concentrarla
Purificarla
Propiedades de la proteína:
Masa Molecular
Punto Isoeléctrico
Solubilidad
Estabilidad
De donde vamos a obtener la
proteína:
Localización subcelular
Tejido
Organismo
Que técnica vamos a usar para
purificar. (Dependiendo de que
queremos analizar)
Cuidados de la muestra
durante la purificación.
Para purificar la mayor cantidad de proteína se requiere tomar en cuenta varios
aspectos como:
El tejido del cual vamos a obtener la proteína.
La elección debe tener en cuenta tres aspectos importantes:
1. Disponibilidad. Cantidad de tejido necesario para obtener suficiente proteína.
2. Cantidad de proteína. Cuanta proteína de interés encontramos en el tejido
que vamos a analizar.
3. Características de la proteína. Que nos ayuden en el proceso de purificación.
Para obtener un mayor rendimiento se necesita:
Rendimiento
y
Pureza
Por lo que…
Degradación
y
Desnaturalización
Propiedades de la proteína…
Masa Molecular: Conocer el tamaño de la proteína es importante cuando hacemos un gel
SDS-PAGE o métodos cromatográficos para purificar la proteína como filtración en gel.
Punto Isoeléctrico: Es una valor importante que nos permite seleccionar adecuadamente el
buffer a utilizar o técnicas como precipitación isoeléctrica o cromatografía de intercambio
iónico.
Solubilidad: Diversos factores afectan la solubilidad de las proteínas, tales como la
composición de aminoácidos, la estructura tridimensional y factores externos como pH,
temperatura, fuerza iónica
Estabilidad: Las características físicas y químicas de la proteína son importantes para la
purificación, en términos de agregación, actividad, etc.
Polaridad: La hidrofobicidad de la proteína nos permite seleccionar técnicas de purificación
como columnas de interacción hidrofóbicas o en aspectos de extracción de proteínas.
Uniones específicas: Algunas proteínas tienen unión a ligandos que permiten usar técnicas
de purificación como la cromatografía de afinidad.
Técnicas de purificación según las propiedades de las proteínas:
• Solubilidad:
 Precipitación.
• Carga iónica:
 Cromatografía de intercambio iónico.
• Tamaño Molecular:
 Electroforesis en gel.
 Centrifugación diferencial.
 Diálisis.
 Cromatografía de filtración en gel.
• Polaridad:
 Cromatografía de interacción hidrofóbica.
• Uniones específicas:
 Cromatografía de afinidad.
Métodos generales para obtención de proteínas
1.
2.
3.
4.
5.
Ruptura del material
Obtención del material libre de células (extracto proteico)
Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos)
Concentración (diálisis o ultracentrifugación)
Fraccionamiento cromatográfico.
1. Ruptura del material.
• Lisis celular. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica. Debido a la
diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando hinchamiento y
ruptura.
• Destrucción mecánica.
 Homogenización: hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que
ajustan casi totalmente.
 Mortero: moler en un mortero usando arena o alúmina.
 Molino con piedras de vidrio.
 Prensa de French: hacer pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño
orificio.
 Sonicación: Someter las células a vibraciones ultrasónicas.
• Congelación y descongelación. La rotura se produce al someter las células a un cambio
brusco de temperatura, congelando primero a -196°C (usando nitrógeno líquido) y
pasándolos rápidamente a temperatura ambiente (25°C).
Buffer de lisis
Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de
purificación suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4ºC) y
se procura que el proceso sea lo más corto posible.
2. Obtención de material libre de células (extracto proteico)
El resultado de los tratamientos de lisado u homogenizado contiene una mezcla
de enzimas membranas y células rotas.
Esta mezcla se somete a centrifugación para eliminar los restos celulares y
separar el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles.
El extracto soluble con o sin detergente constituye el extracto crudo donde se
encuentra la proteína de interés.
A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga sea
refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores
estén fijos.
3. Precipitación
Debido a los grupos cargados de las proteínas, la solubilidad se altera aumentando
o disminuyendo cuando se modifican factores como el pH, temperatura y fuerza
iónica.
Los métodos de precipitación son:
• Precipitación con solventes orgánicos.
• Precipitación isoeléctrica
• Precipitación térmica
• Precipitación salina
La precipitación salina de las proteínas es una técnica donde se precipita una
fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio.
Grandes cantidades de una sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la
interacción proteína-H2O porque quita la capa de solvatación, predominando la
interacción proteína-proteína y generando la precipitación de las mismas.
La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para todas
las proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación
de proteínas particulares a partir de mezclas complejas.
Sin embargo el método más utilizado es la precipitación por salado con (NH4)2 SO4
Precipitación con sulfato de amonio
• El sulfato de amonio (NH4)2SO4 presenta una gran solubilidad (760 g de sulfato de
amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20°C) y es un ión divalente que alcanza
altas fuerzas iónicas.
• La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de
proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas.
Salting in. Es el fenómeno por el cual la concentración de sal aumenta la
solubilidad de la proteína. Al aumentar la concentraciones se reducen las fuerzas
electrostáticas.
Cuando a un sistema proteico se le adicionan sales neutras en concentraciones
menores a 1.0 M, las proteínas incrementan su solubilidad.
Los cationes y aniones reaccionan con los grupos ionizables de las proteínas
impidiendo las interacciones entre las cadenas laterales o extremos terminales
cargados de las proteínas.
Salting out. A medida que se aumentan las concentraciones de sales en el
medio, las interacciones proteína-proteína se hacen más fuertes que las
interacciones de la proteína con el medio (agua), por lo que precipitan
A concentraciones mayores a 1.0 M, las proteínas tienden a precipitar.
3. Concentración de proteínas
La concentración es proceso mediante el cual reducimos el volumen del solvente
en el que se encuentra la proteína y así aumentar la cantidad de proteína por
volumen.
La concentración de las proteínas puede llevarse a cabo mediante dos técnicas
principalmente:
• Diálisis
• Ultracentrifugación
Diálisis
Técnica que consiste en separar de una mezcla los componentes de una
disolución, ya sea para eliminar impurezas como sales o moléculas
pequeñas a través de una membrana.
Ultracentrifugación
Concentración de una muestra mediante centrifugación.
Centrifugación diferencial
Es una técnica en la cual se aplica la fuerza centrifuga para separar partículas.
Esta basado en el coeficiente de sedimentación.
Práctica:
Purificación de la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) de músculo
esquelético de pollo.
La lactato deshidrogenasa (LDH):
•Su función es oxidación de lactato a piruvato
• Es una enzima que se encuentra en casi todos los tejidos.
(Hígado, corazón, vasos sanguíneos, riñones, bazo, páncreas, pulmones, cerebro y
músculo)
• Esta formada por 4 subunidades.
• Se conocen tres tipos de subunidades: H (LDHB), M (LDHA) y X (LDHC),
que presentan pequeñas diferencias en su secuencia de aminoácidos.
• Su coenzima es la vitamina B.
• Sus subunidades tipo H y M pueden asociarse de manera que puede
formar 5 isoenzimas.
Las diferentes isoenzimas pueden encontrarse en diferentes tejidos :
LDH-1 (H4): Corazón, músculo, eritrocitos.
LDH-2 (H3M): Sistema retículo endotelial, leucocitos.
LDH-3 (H2M2): Pulmones.
LDH-4 (HM3): Riñones, placenta y páncreas.
LDH-5 (M4): Hígado y músculo esquelético.
Investigar:
Propiedades de la lactato deshidrogenasa de pollo (lactate deshydrogenase from
Gallus gallus isoformas A o B):
 Localización subcelular
 Secuencia primaria de aminoácidos
pI (punto isoeléctrico)
 Número de residuos cargados positivamente y negativamente
 Actividad enzimática
 Peso molecular
 Estructura terciaria y/o cuaternaria
Ligas:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
http://www.uniprot.org/uniprot/P00340
http://www.expasy.org
http://www.uniprot.org/
http://www.brenda-enzymes.info/
Para determinar pI y número de residuos de aminoácidoscargados
http://web .expasy.org/compute pi/
Parte A. Extracción.
1. Cortar en trozos pequeños 80g de pechuga de pollo (eliminar la grasa y tejido
conectivo)
2. Agregar 3 volúmenes de amortiguador A frío por cada gramo de tejido y licuar en
pulsos de 3 seg./3 a 6 veces.
3. Filtrar la mezcla con gasa. Se obtiene la fracción F0.
4. Distribuir el filtrado en botellas de centrifuga y centrifugar a 7,000 RPM a 4°C durante
10 min. Recuperar el sobrenadante (F1). Almacenar 1mL a -20°C.
Parte B. Precipitación con sulfato de amonio (NH4)2SO4.
5. Tomar 25 mL de la fracción 1 y colocarlos en un vaso de precipitado.
6. Agitar en hielo el sobrenadante de manera continua y suave. Agregar el sulfato de
amonio sólido (8.5 g), Agitar vigorosamente.
7. Saturación del 55% de sulfato de amonio.
8. Centrifugar la mezcla turbia a 10,000 RPM a 4°C durante 10 minutos.
9. Recolectar el sobrenadante (Fracción 2) y registrar el volumen. Tomar una alícuota de 1
mL y almacenar a -20°C.
10. Realizar una segunda precipitación con(NH4)2SO4 al 75% de saturación. Repetir paso 6
y 7.
11. Repetir paso 8.
12. Resuspender el pellet en 1 mL de agua.
13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fracción 3. Almacenar a -20°C.
Formula para calcular concentración de sulfato de amonio
Concentración inicial de sulfato de amonio (%)
Concentración final de sulfato de amonio (%)
Gramos de sulfato de amonio que hay que añadir a 1 L de solución
Utilizar esta tabla para realizar los cálculos en la práctica