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ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS
Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de
músculo esquelético de pollo
PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.
Las proteínas se purifican mediante métodos de fraccionamiento que son
una serie de etapas independientes basadas en las diversas propiedades
fisicoquímicas de la proteína de interés y que se usan para separarlas
de manera progresiva de otras moléculas.
¿Para qué queremos purificar proteínas?
 Conocer secuencias de aminoácidos.
 Establecer relaciones evolutivas.
 Investigar la función biológica.
Establecer relaciones estructura-función.
Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas
GUÍA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
• Definir los objetivos de la purificación
Pureza, actividad y cantidad.
•Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas.
PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan dañar a
las proteínas (ej proteasas).
• Seleccionar la fuente de proteína.
Organismo, tejido, localización celular.
• Desarrollar una técnica de análisis.
Para una detección rápida de la pureza, actividad y/ o contenido
total de la proteína de interés.
•Minimizar el manejo de la muestra.
Evitar procedimientos largos para evitar perder actividad
biológica.
• Minimizar el uso de aditivos.
Usar lo mínimo necesario.
• Eliminar los contaminantes.
Por ejemplo, las proteasas.
• Usar una técnica diferente en cada paso.
Con el fin de aprovechar al máximo las características de la muestra
en el proceso de separación.
•Reducir el número de pasos.
Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el
tiempo de purificación.
Seleccionar la fuente de proteína
La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales
como:
a) la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la
proteína
b) la cantidad de la proteína de interés en el tejido y
c) cualquier propiedad peculiar de la proteína de interés, que ayudará en su
estabilización y su aislamiento.
Definir las Propiedades de la Proteína de Interés
Masa Molecular
• La información es útil para detectar la proteína a través de SDSPAGE, también es importante cuando seleccionamos un método
de filtración en gel.
Punto
Isoeléctrico
• El conocer el valor del pI puede ser utilizado con diferentes
propósitos: precipitación isoeléctrica, selección de columna de
intercambio iónico, pH de trabajo.
Solubilidad
• Afectada por temperatura, pH, fuerza iónica. Esto debe ser
considerado para evitar la agregación y precipitación de la proteína.
También útil para separación.
Polaridad
• Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una
columna de interacción hidrofóbica.
Unión Específica
• Ligandos útiles para separar la proteína por cromatografía de
afinidad.
Estabilidad
• En términos de actividad, agregación y composición de
subunidades. Las características físicas y químicas de la proteína
son importantes a lo largo del proceso.
Técnicas de purificación/separación de acuerdo a las
propiedades de las proteínas
Características
Solubilidad
Carga iónica
Polaridad
Tamaño molecular
Especificidad de unión
Procedimiento
1. Salting in
2. Salting out
1. Cromatografia de intercambio
iónico
2. Electroforesis
1. Cromatografía de adsorción
2. Cromatografía en papel
3. Cromatografía en fase reversa
4. Cromatografía interacción
hidrófoba
1. Dialisis y ultrafiltración
2. Electroforesis en gel
3. Cromatografía de filtración en gel
4. Ultracentrifugación
1. Cromatografía de afinidad
Fases de la Purificación
1. Fase I o fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y
estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los
contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de
la proteína. (Homogenización, centrifugación)
2. Fase II o fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría
de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos,
endotoxinas y virus. (Precipitación selectiva)
3. Fase III o fase de perfeccionamiento, la mayoría de las
impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que
están muy relacionadas con la proteína de interés y que se
encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es
logar la mayor pureza posible. (Métodos cromatográficos)
FASE I.
Métodos de
baja resolución
FASE II.
Métodos de
baja resolución
Homogenización, filtración,
centrifugación
Precipitación con sales, solventes,
temperatura o pH
Métodos cromatográficos:
FASE III. Métodos
de
alta
resolución
filtración en gel, intercambio iónico,
afinidad
Métodos electroforéticos:
electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante
Ruptura de la Célula
¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante?
ESTABILIDAD
Las proteínas se desnaturalizan fácilmente a temperaturas elevadas, aunque
algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe
llevarse a cabo a 0°C o temperaturas cercanas.
MÉTODOS
•Suaves:
Lisis celular (choque osmótico)
Digestión enzimática (lisozima)
Lisis química (detergentes)
Homogenización manual
Molienda
Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no
aseguran su liberación celular.
Ruptura de la Célula
¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante?
ESTABILIDAD
MÉTODOS
•Moderados:
Homogenización con cuchillas
Molienda abrasiva
Congelamiento
•Vigorosos:
Ultrasonicación
Homogenizador Manton-Gaulin
Prensa francesa
Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.
Buffer de Lisis
Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la
estabilidad de la proteína.
pH
Fuerza Iónica
Aditivos
Mantener un pH en el
cual la proteína es
estable y se previene la
precipitación isoeléctrica.
Mantener una
concentración de sales
adecuada para reducir las
pérdidas por
precipitación
Son componentes que
previenen la degradación
y mejoran la estabilidad.
Se deben agregar solo si
es necesario.
Aditivos
Fraccionamiento Celular:
Centrifugación Diferencial
• Eliminar contaminantes o clarificar la muestra
• Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad,
tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína
es diferente.
• Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.
Centrifugación Diferencial
Homogenización del tejido
Baja
decentrifugación
centrifugación
Baja velocidad
velocidad de
(1 000
000g,g,10’)
10’)
(1
Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación
media
(20 000 g, 20’)
Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación
alta
(80 000 g, 1 h)
Tejido homogenado
Sobrenadante sujeto
a velocidad de
centrifugación
muy alta
(150 000 g, 3 h)
Pellet, contiene
células completas,
núcleos, membranas
plasmáticas
Pellet, contiene
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas
Sobrenadante
contiene proteínas
solubles
Pellet, contiene microsomas
(fragmentos de RE), vesículas
pequeñas
Pellet, contiene ribosomas, macromoléculas
grandes
Remover contaminantes y/o
concentrar la muestra
Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el
siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes
métodos:
Ultrafiltración
Precipitación selectiva
Precipitación selectiva
¿Qué propiedad de la proteína es
importante? SOLUBILIDAD
• Debido a que la proteína contiene varios grupos cargados, la solubilidad es
sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica.
• Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la
solubilidad de la proteína.
• El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con
(NH4)2SO4.
Sin embargo, también hay otros métodos
Precipitación con solventes orgánicos.
Precipitación isoeléctrica.
Precipitación térmica.
Log (S/S’)
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es
importante? SOLUBILIDAD
Fuerza Iónica
Precipitación por salado
Solubilidad
Capa de
Hidratación
Salting in
Salting out
Concentración de sal
Precipitación por salado
Salting in: La solubilidad de una proteína, a una
concentración baja de iones, aumenta a medida que se
incrementa la concentración de la sal.
Salting out: Las interacciones proteína-proteína se hacen
más fuertes que las interacciones proteína-disolvente y la
proteína precipita.
La concentración de sales requerida para alcanzar el efecto
de salting out varía de acuerdo a las características de la
proteína
Precipitación por salado
Concentración inicial de sulfato de amonio (%)
Concentración final de sulfato de amonio (%)
Gramos de sulfato de amonio que hay que añadir a 1 L de solución
En la práctica
Purificación de la lactato deshidrogenasa 1.1.1.27
Investigar:
Propiedades de LDH de Gallus gallus
LDH A
Número de aminoácidos
Peso molecular (Da)
Punto isoeléctrico
Promedio general de
hidropaticidad (GRAVY)
Localización celular
Forma activa
Superfamilia
Tipo de enzima
Cofactor
LDH B
¿Cómo vamos a purificar a la
LDH de Gallus gallus?
Importante: Anotar los volúmenes de las fracciones
Homogenización
1)
2)
3)
4)
5)
6)
100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo)
Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.)
Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0)
Centrifugar a 7,000 rpm 4° C 10 min.
Decantar sobrenadante y tomar fracción 1 mL (F1)
Guardar fracciones a -20°C
Precipitación por salado
1) 25 mL del sobrenadante en vaso de pp.
2) Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio (55 % de
saturación)
3) Centrifugar a 4°C a 10,000 rpm 10 min.
4) Registrar volumen y tomar 1 mL fracción 2 (F2) Guardar a -20°C
5) Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y 3
6) Descartar el sobrenadante
7) Resuspender botón o pellet en 1 mL de agua
8) Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20°C