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1 QUÍMICA BIOLOGICA (FARMACIA Y MEDIO AMBIENTE) Curso 2009 Guía de Problemas V: Proteínas - Purificación Temario Métodos de separación y/o concentración de proteínas. Precipitación por solventes orgánicos, sales, pH. Salting in, saltingout. Importancia del pI. Precipitación por desnaturalización: temperatura, ácido tricloroacético. Métodos de separación y/o caracterización basados en el tamaño molecular (masa/forma). Diálisis. Ultracentrifugación. Cromatografía de exclusión molecular. Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Separación en base a la carga (carga/masa). Electroforesis en acetato de celulosa, poliacrilamida. Isoelectroenfoque. Electroforesis bidimensional. Cromatografía de intercambio iónico. Otras técnicas cromatográficas: Cromatografía de afinidad y de interacción hidrofóbica. Purificación de proteínas. Marcha de la purificación, criterios en la elección de métodos, criterios de pureza.. Esquema experimental, protocolos. Utilización de anticuerpos para detección, purificación y cuantificación de proteínas Problema 1 Se determinó el PM de una proteína X corriéndola simultáneamente con proteínas patrones, en gel de poliacrilamida, a pH 8,0 y en presencia de SDS. Los resultados fueron los siguientes: PROTEINA Seroalbúmina Quimiotripsina Citocromo C Proteína X DISTANCIA RECORRIDA (cm) 3,0 4,7 5,7 4,1 PM (Da) 68.000 23.000 12.000 a- Haga un diagrama del gel indicando la posición de las distintas proteínas. b- Calcule el PM de la proteína X. c- Si la electroforesis se realiza en poliacrilamida, a pH 8,0, sin SDS, ¿podría calcular el PM de la proteína X de la misma manera que en b? ¿Por qué? Problema 2 Se tiene una mezcla de cuatro proteínas: Proteína A: PM 120.000 Da (4 subunidades de 30.000, unidas por interacciones no covalentes). Proteína B: PM 120.000 Da. Proteína C: PM 160.000 Da (2 subunidades de 40.000 unidas entre sí por enlaces S-S, más 4 subunidades de 20.000 unidas entre sí por enlaces S-S). Proteína D: PM 80.000 Da. Se sabe que sus pI son: A: 5,8; B: 7,0; C: 7,0; D: 6,0. Todas las proteínas son muy inestables a pH no muy alejados de neutralidad, y la proteína D tiende a formar agregados cuando se encuentra a temperaturas mayores de 8 ºC. a. ¿Qué resultados obtendría si a la mezcla de proteínas la sometiera a los siguientes tratamientos? i) Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. ii) Electroforesis en gel de poliacrilamida con urea 8M. iii) Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y -mercaptoetanol. b. Se tiene la posibilidad de usar una columna de intercambio iónico para separar las proteínas: i) ¿Qué tipo de intercambiador elegiría (aniónico o catiónico)? Indique cuál debería ser el pH del buffer de la muestra y la columna, y con qué buffer las eluiría (pH y concentración salina). ii) ¿Qué resultado espera obtener? ¿Se llega a una separación completa? Si no es así, indique qué otros pasos seguiría para conseguirlo. c. Una vez separadas ¿qué método utilizaría como criterio de pureza? d. ¿A qué puede deberse el comportamiento (agregación) de la proteína D? Problema 3 Se obtuvo una preparación purificada de una enzima que, en cromatografía de intercambio iónico, eluyó en un solo pico. Se estudió su tamaño molecular por cromatografía de exclusión molecular, en una columna de Sephadex cuya calibración fue la siguiente: 2 Vol. elución (ml) 240 200 163 138 Peso molecular (Da) 30.000 67.000 140.000 440.000 Volumen excluído: 88 ml Se sembraron 0,7 ml con una actividad enzimática de 230 unidades/ml y una concentración de 8,00 mg proteínas/ml. La columna se eluyó en fracciones de 2 ml cada una. Los resultados obtenidos se encuentran en la tabla 1. Tabla 1 Fracción 1 2 3 --75 76 77 78 79 80 Volumen (ml) 2 4 6 ---150 152 154 156 158 160 Actividad (unidades totales) 0 0 0 --0 23 107 23 0 0 Proteínas (mg totales) 0 0 0 --0,10 1,55 3,10 0,65 0 0 i. ¿Son suficientes estos datos para calcular el peso molecular de la proteína? Si es así, calcúlelo. ii. A partir de estos resultados ¿puede Ud. corroborar que la preparación de la enzima era homogénea? Justifique su respuesta numéricamente. Problema 4 Usted forma parte de un laboratorio de análisis bioquímicos y ha recibido un material de marcada actividad citotóxica, acompañado del siguiente informe previo de caracterización: A) Los ensayos de Lowry y antrona dieron resultados positivos (sensiblemente mayores que los blancos respectivos). B) Electroforesis en geles de poliacrilamida: -electroforesis a 25 0C sin 2-mercaptoetanol; Fig. Ia: con SDS; Fig. Ib: sin SDS. -electroforesis a 25 0C con 2-mercaptoetanol;. Fig. Ia: con SDS; Fig. Ib: sin SDS. -La electroforesis a 10 0C sin 2-mercaptoetanol y sin SDS presenta un perfil con una sola banda coincidente con la banda de mayor movilidad de la Fig. Ib. C) - Cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-75 sin urea Fig. IIa. - Cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-75 con urea Fig. IIb. D) Isoelectroenfoque con gradiente de pH 3-6. Figura III. E) Medida de la actividad citotóxica del material: - material original:+ - tratado con urea 3M y dializado + - tratado con 2- mercaptoetanol y dializado: + - tratado con urea 3M y 2- mercaptoetanol, luego dializado: 5% de la actividad inicial. - tratamiento a 60 °C 20 minutos y ensayo de la actividad a 37 °C: + - tratamiento a 10 °C 20 minutos y ensayo de la actividad a 10 °C: - tratamiento a 10 °C 20 minutos y ensayo de la actividad a 37 °C: + - tratamiento a 0 °C 10 minutos y ensayo de la actividad a 37 °C: F) Tratamiento con carboxipeptidasa de los picos A y B del isoelectroenfoque. Figura IV. G) Isoelectroenfoque de los tratados con carboxipeptidasa durante 3 min. Figura V, pico A2*. H) Cromatografía en Sephadex G-75 de los tratados con carboxipeptidasa. Fig. Iic. i) Describa brevemente los métodos empleados. ii) Se requiere de usted la evaluación más completa posible (naturaleza, propiedades, detalles de estructura u otros que pueda informar) de la muestra recibida. 3 Problema 5 El objetivo de este trabajo consiste en la obtención de una vacuna para prevenir una enfermedad producida por un nuevo virus. Como antígeno que induce la protección contra la enfermedad (vacuna) se ha seleccionado una subunidad P de una proteína oligomérica de la cápside del virus. La subunidad está acompañada por otras subunidades con elevada actividad tóxica en mamíferos. Las subunidades tóxicas no tienen actividad protectora. 4 Durante la purificación y caracterización de la subnidad P se obtuvieron los siguientes resultados: Paso de purificación Volumen Proteínas (ml) (mg) Extracto crudo 10 CM Sepharose 5 Gel filtración en presencia de mercapto etanol (fracciones@-@) Cromatografía de int hidrofóbica en presencia de mercapto etanol Concentración Actividad Protectora (*) 1.700 149 9 1.500 2 1.200 0,1 18 1.200 Actividad tóxica Actividad Específica (Unidades protectoras /mg proteína) ++++ Rendimiento Grado de (%) purificación --- --- ++++ 10,7 94 0.95 + 64,5 88 5,7 66,6 70 66,6 70 (no detectable) (no detectable) 5,9 (*) La actividad protectora se determinó midiendo para cada fracción de la tabla su capacidad de inducir la formación de anticuerpos específicos en animales (unidades arbitrarias). I.a. Calcule la cantidad de proteína total en el extracto crudo teniendo en cuenta la siguiente información: * 100 l del extracto crudo se llevaron a 800 l finales con agua. * De dicha dilución se tomaron 75 l, se mezclaron con125 l de buffer pH 7.5 y se realizó un ensayo de Lowry cuya curva de calibración se muestra en la Tabla 2. La medida de Absorbancia de la muestra a 750 nm fue 0,22. l de albúmina 0 (1mg/ml) Buffer pH 7.5 (l) 200 Absorbancia (750 nm) 0,02 20 40 60 80 180 0,37 160 0.47 140 0.66 120 0.91 Oligómero purificado Marcador de peso Molecular Cromatografía Hidrofóbica Cromatografía Exclusión Molecular Intercamnio Iónico Extracto Crudo I.b. Describa el método y fundamento de la determinación de proteínas por Lowry II. Complete el resto de los datos faltantes de la Tabla 1. III. Indique cuántas veces se han concentrado la muestra en el último paso que se describe en la Tabla 1, respecto del paso anterior. IV. En la cromatografía de interacción hidrofóbica se separan la actividad protectora de la tóxica. Una de ellas eluye y la otra queda unida a la columna. ¿Cómo recuperaría la fracción que queda unida a la columna? Justifique. V. En la Figura 2 se muestra el resultado de un gel de poliacrilamida con SDS y -mercaptoetanol teñido con Coomassie blue, de las muestras obtenidas en cada uno de los pasos de purificación. En el segundo gel se presenta el resultado correspondiente a un SDS-PAGE realizado a partir de la purificación del oligómero nativo (PM 100.000 110.000). V.a. ¿Qué conclusiones extrae de la electroforesis? 55.000 V.b. Indique qué bandas del SDS-PAGE podrían corresponder a componentes del oligómero ¿Por 30.000 qué? 25.000 V.c. ¿Qué experimento realizaría para confirmar que la/s bandas que Ud. ha seleccionado son en efecto el oligómero? VI. En base a los criterios que Ud. conoce para evaluar una marcha de purificación, indique con 14.000 fundamentos si considera necesarias todas las etapas que se presentan en la Tabla 1. Tenga en cuenta el SDS-PAGE origen, características de la muestra y su destino SDS-PAGE + -mercaptoetanol final. VII. ¿Considera que la muestra que Ud. obtuvo al final de la marcha de purificación está pura? Justifique su respuesta. 5 Problema 6 En la purificación de una enzima se obtuvieron los siguientes resultados: Fracción Extracto acuoso Fracción 40-50% de sat. (NH4)2SO4 Eluato Ca3(PO4)2 Volumen total (ml) 62 5 5 Actividad total (unidades enzim.) 4550 640 335 Proteínas (mg/ml) 40,2 5,9 1,2 a. Calcular la actividad específica en cada fracción b. Calcular cuántas veces se ha purificado la proteína. c. Calcular el rendimiento en todo el procedimiento. d. ¿Cómo supone Ud. que puede variar la actividad específica a lo largo del proceso de purificación? (aumenta, disminuye, permanece constante) ¿Por qué? Problema 7 Se desean estudiar las propiedades de una enzima que se encuentra en plantas. Para ello se ha diseñado un método de purificación con el que se pretende obtener esta enzima en condiciones nativas, y se han realizado algunos análisis de sus propiedades. TABLA 1 Actividad Proteina Actividad Factor de Rendimiento Fracción UE/ml mg/ml Específica Purificación Extracto crudo 342 57 Ppdo. De sulfato de 653 36 amonio Precipitación 1262 3 isoelectrica Cromatografía en 433 0,26 DEAE-celulosa Concentrado de 1068 1 proteína Para la purificación de esta enzima usted partió de hojas de espinaca y obtuvo un extracto crudo de 72 ml. Seguidamente se precipitó con sulfato de amonio por agregado de 117 ml de solución saturada de dicha sal. Luego de separar el precipitado, el mismo se resuspendió en buffer pH 7,0 en un volumen final de 25 ml. A esta fracción se la precipitó isoelectricamente y se separó el precipitado del sobrenadante mediante centrifugación. La fracción conteniendo la enzima (precipitado) se resuspendió en 7.5 ml de buffer pH 7 y se cromatografió en DEAE-celulosa. Se juntaron todas las fracciones correspondientes al pico de actividad (volumen total 7,2 ml). Como último paso se realizó una concentración de la muestra. A todas las fracciones de la purificación se les midió actividad de la enzima y concentración de proteínas por el método de Lowry (0,2 ml de muestra en el tubo de colorimetría de volúmen final 1,3 ml). 1- En base a los datos presentados: ¿A qué grado de saturación de sulfato de amonio precipita la enzima? 2- ¿Cual es principio de la precipitación isoeléctrica? ¿Cómo procedería para realizarla? 3- En cada etapa de la purificación de esta enzima calcule: la actividad específica, el rendimiento respecto de la etapa anterior y del proceso total. ¿Cree que el protocolo aplicado fue adecuado en todas las etapas? Si no es así, explique por qué y sugiera las modificaciones que crea necesarias.