Download de Salmonella spp, L. monocytogenes y E. coli O157:H7

Microbiología de Alimentos
Q.B.P María Eugenia Alarcón Sáenz
235962
1 Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Facultad de
Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas,
Venezuela.
2 Ministerio del Poder Popular para la Alimentación. Caracas,
Venezuela.
a Magíster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos; b
licenciada en Biología; c licenciado en Ciencias de los
Alimentos.
Recibido: : 11-01-14 Aprobado: 23-07-14
Citar como: Palomino-Camargo C, González-Muñoz Y. Técnicas
moleculares para la detección e identificación de patógenos
en alimentos: ventajas y limitaciones. Rev Peru Med Exp Salud
Publica. 2014;31(3):535-46.
INTRODUCCIÓN
ETA problema de salud a nivel mundial
98% m.o encontrados en los alimentos no son patógenos
Importante para la agricultura, la industria y consumidores
Métodos microbiológicos clásicos:
◦ Cultivo de enriquecimiento
◦ Aislamiento en medios selectivos
◦ Posterior confirmación con pruebas bioquímicas
◦ Resultados en días o semanas
◦ Baja sensibilidad
◦ Bacterias en estado viable pero no cultivable (VPNC) en alimentos.
El uso de métodos moleculares
Pruebas de diagnóstico que pueden
detectar
específicamente
el
microorganismo de interés
Métodos rápidos y sensibles para la
detección,
cuantificación
identificación
de
transmitidos por alimentos.
y
patógenos
OBJETIVO
Describir los distintos métodos moleculares utilizados para la
detección, e identificación de microorganismos patógenos
transmitidos por alimentos, haciendo particular énfasis en sus
ventajas y limitaciones.
METODOLOGÍA
Se realizo una revisión de tipo narrativa, no sistemática, referente a las técnicas moleculares
utilizadas actualmente en la detección e identificación de patógenos en alimentos, destacando a
la vez, sus aplicaciones, ventajas y limitaciones.
La recolección de la información se efectuó durante noviembre y diciembre de 2013.
La búsqueda se llevó a cabo en las bases de datos:
Science Direct
Springer Journal
Medline.
Métodos moleculares para la detección e identificación
de patógenos transmitidos por alimentos
La identificación molecular se basa en la composición de los ácidos nucleicos
Primeros avances 1980
Hibridación ADN-ADN
Análisis de secuencias del ADNr
Análisis ribotipificación (RFLP)
Segunda generación de métodos moleculares:
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
PCR múltiple
Secuenciación de genes específicos
Análisis de restricción del ADNr amplificado
Aplicación de técnicas moleculares en la
detección e identificación de patógenos
transmitidos por alimentos
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Se basa en el principio de complementariedad de bases del ADN y en
la participación de la enzima polimerasa que permite la extensión del
fragmento a amplificar, agregando nucleótidos en secuencia
complementaria al ADN molde por medio de un proceso cíclico
Comprende tres pasos:
1) Desnaturalización
2) Hibridación
3) Extensión
Técnica mas utilizada debido a su protocolo rápido y fácil uso
Son necesarias de 2-3 h
Aplicaciones de PCR:
Es posible identificar una única célula de C. jejuni en
muestras de leche y agua por PCR junto con técnica de
Un estudio realizado por Gous y
Ledemann (2005) utilizaron PCR
específico para el gen hly de L.
monocytogenes, y los métodos
de cultivo convencionales, para
analizar 27 productos de leche.
separación inmunomagnética (IMS)
La PCR dirigida a los genes genes flaA, CadF, ceuE y cdt y
la región 16S del ARNr.
Tiempo de ensayo: 8 horas, sin enriquecimiento de la
muestra.
RESULTADOS:
Los autores concluyeron que la PCR eliminó falsos
• 74% fueron positivos en agar Ocford
• 37% positivos en PCR
positivos que se observaron por los métodos de cultivo.
PCR múltiple
Desarrollada para la detección simultánea de dos o más agentes
patógenos asociados a alimentos.
Un ensayo de PCR múltiple para la detección de Salmonella spp,
L. monocytogenes y E. coli O157:H7, luego de un cultivo de
enriquecimiento, tuvo un limite de detección de 1 UFC/g de carne
de cerdo, en un tiempo de 30 h.
Se han desarrollado métodos de PCR para detectar genes que
codifican toxinas o factores de virulencia (lo que convierte a las
bacterias en patógenas).
PCR en tiempo real
Se han desarrollado para
patógenos de origen
alimentario, ofreciendo una
detección rápida, sensible y
específica de una serie de
agentes patógenos.
Facilidad de uso
Tiempo de resultados: 2
días.
Automatización
Existe un numero creciente
de kits de PCR en tiempo
real, disponibles
comercialmente.
Amplificación basada en la secuencia de
ácidos nucleicos (NASBA)
Detectan
ARNm de
patógenos
asociados a
alimentos
Capacidad
para detectar
organismos
viables
Sensibilidad a
tiempo real
deficiente
No
diferenciación
ente ARN y
ADN.
Electroforesis en gel de campo pulsado
(PFGE)
Se ha utilizado satisfactoriamente en la tipificación de Salmonella, aislada a partir de alimentos
de origen animal y pacientes humanos.
Ha sido extensamente utilizada a nivel mundial para:
• La vigilancia e investigación de los brotes de E. coli O157:H7
• Trazado de las vías de transmisión
• Rastreo de las fuentes de brotes de restaurantes, granjas, aguas contaminadas, animales,
humanos y/o equipos.
La Pulse-Net EE.UU ha estandarizado protocolos de PFGE para E. coli O157, S. entérica, Shigella
spp., L. monocytogenes, Campylobacter spp. y V. cholerae
Biosensores
Los biosensores ópticos que utilizan una
señal fluorescente son los mas comunes.
Biosensores: anticuerpos, bacteriófagos,
electroquímicos.
Transductor piezoeléctrico  frecuencia
en la resonancia  numero de células
capturadas.
Resultados 1 hora.
Microarreglos
Consisten en un gran numero de sondas (clones de ADN, productos
de la PCR u oligonucleótidos sintéticos) inmovilizadas sobre una
superficie solida.
Tras los pasos de hibridación y lavado, el ácido nucleico enlazado a
las sondas genera un patrón de fluorescencia que es registrado y
analizado utilizando un escáner.
Microarreglo particular basados en el gen gyrB, utilizado para
detectar e identificar a Salmonella y Shigella.
Pueden identificar un amplio rango de bacterias patógenas y ayudar
a la caracterización de la resistencia antimicrobiana y los genes de
virulencia presentes, logrando gran sensibilidad y especificidad.
Pirosecuenciación 454
Una nueva herramienta para la detección de patógenos en
alimentos y medioambiente
Secuenciación rápida y de alto rendimiento
Los genomas pueden ser completamente secuenciados en
semanas (incluso horas), en lugar de años, debido a que
esta metodología no requiere bibliotecas de ADN, ni clones,
solo el ácido nucleico aislado.
Ha ampliado el repertorio de los genomas bacterianos
secuenciados y ha ayudado a identificar los agentes
potenciales, bacterianos, protozoarios o virales, asociados
con enfermedades de etiología desconocida
Ventajas y limitaciones de las
técnicas moleculares
CONCLUSIONES
Las técnicas de diagnóstico molecular representan una alternativa
prometedora en el campo de lo alimentos, debido a su rapidez,
elevada sensibilidad y eficiencia para la detección temprana de
microorganismos patógenos.
La PCR destaca como el método de diagnóstico molecular mas
aplicado en el área de alimentos.
Las variaciones de PR han sumado ventajas a esta técnica, entre las
que destacan mayor velocidad en la obtención de resultados.
Los equipos y reactivos resultan mas costosos que aquellos
empleados en los métodos tradicionales de cultivo.
La estandarización y normalización de estos métodos son un
requisito indispensable para lograr la aplicación práctica y rutinaria de
estas técnicas.
Gracias