Download Revisión de las metodologías para aislar e identificar campylobacter

REVISIÓN DE LAS METODOLOGÍAS
PARA AISLAR E IDENTIFICAR
CAMPYLOBACTER SPP DE LOS
ALIMENTOS
Ing. Nancy Paola Grajeda Nieto
Campylobacter coli
Campylobacter jejuni
Introducción
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Campylobacteriosis es una enfermedad transmitida
por los alimentos.
Es la tercera enfermedad transmitida por alimentos
8% de casos globales.
Vehículo de transmisión:29%
11%
5%
otro.
Menos de 1000celulas de campylobacter produce
enfermedades en seres humanos (Negro et al
1988)
Objetivo
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Los protocolos para el aislamiento de
Campylobacter de los alimentos fueron adaptadas
a microbiología clínica y metodologías para el
aislamiento de Campylobacter de la leche se
mantiene sin cambios, sin embargo los de ave de
corral son objeto de investigaciones.
Aislamiento de Campylobacter de los alimentos
Condiciones de enriquecimiento para el aislamiento
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Durante el aislamiento a partir de muestras, la
presencia de otras bacterias presenta una
limitación, por eso esta etapa es importante.
Hay varios tipos de caldos para el enriquecimiento
que se han desarrollado. (Corry et al 1995)
Desactivación del oxígeno
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Existen varios agentes para la desactivación de
oxigeno se han utilizado para los medios (agar y
caldo) para el aislamiento, estos agentes pueden
incluir sangre de caballo de otros animales o
hematina alcalina sales de hierro, norepinefrina,
sulfatos ferrosos, sodio metabisulfito, piruvato de
sodio y carbón vegetal
Oxyrase es una enzima selectiva que elimina el
oxigeno de su entorno
PFGE
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DGGE
PFGE
En general es una técnica que permite la separación de fragmentos de DNA de alto peso
molecular y tiene varias utilidades en el rastreo e investigación de los brotes de origen
alimentario, también como la detección temprana de estos por el aumento de la
incidencia de algunos subtipos usualmente indicados en brotes.
DGGE
electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización, también referida como
electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente, es una técnica de huella, rastreo o
trazado molecular (vulgarmente conocida en Inglés como molecular fingerprinting) usada
en diversas disciplinas de la biología y la química, que consiste en la separación de
cadenas de ADN de doble cadena dependiendo de su punto de desnaturalización, siendo
dicha desnaturalización definida en éste caso como la separación de cadenas
complementarias de ADN.
Condiciones micro aeróbicas en caldos
de enriquecimiento.
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Parece cuestión de tiempo para que las técnicas
basadas en ADN para aclarar la diversidad de la
población microbiana.
Los géneros ya identificados principalmente son
Pseudomonas y Acinetobacter, son bacterias que
están mejor controladas durante el enriquecimiento
bien adaptado
Revestimiento del medio
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La mayoria de los medios de placa selectiva tienen
varios agentes antimicrobianos, como cefoperazona
y vancomicina como el principal inhibidor de la
flora bacteriana.
La incorporación de estos compuestos parecen ser
una cuestión de costos, el uso de filtros mejorar el
rendimiento de los medios que parecen tener una
baja tasa de selectividad y aislamiento debido al
crecimiento de microorganismo que compiten
Filtros de membrana
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Primera técnica de aislamiento
Principal ventaja es que los cultivos de
Campylobacter puros se obtiene en 36- 48 h.
Identificación de Campylobacter
Pruebas de aglutinación en látex
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Uso de anticuerpos policlonales para detectar
proteínas de la membranas de proteínas exteriores,
las partículas de látex se recubren con
inmunoglobulina y se enlazan contra el antígeno de
Campylobacter.
Ensayo innumoenzimático (EIA)
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La metodología EIA valora anticuerpos específicos
según el antígeno que se emplee, produciéndose
una reacción antígeno-anticuerpo. Al final de la
reacción, se obtiene una solución de color que se
mide con un espectrofotómetro, cuya intensidad está
en relación directa con la cantidad de anticuerpos
en la muestra.
métodos moleculares de identificación
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Los métodos moleculares de identificación son
rápidos y específicos para la identificación de
Campylobacter spp. Además de la detección de
segmentos específicos de ADN o ARN, protocolos
de secuenciación están proporcionando una manera
rápida para detectar segmentos específicos del
ADN que son únicas para la identificación de la
especie y en ocasiones nivel de subespecie
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métodos basados en las características bioquímicas
del microorganismo -método fenotípico- y en la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) -método molecular
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los ensayos de PCR multiplex (mPCR)
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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el
que un segmento particular de éste es específicamente
amplificado al ser delimitado por un par de cebadores,
primers o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se
logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos
de diferentes periodos y temperaturas de incubación
en presencia de una enzima ADN polimerasa
termoestable. Así se obtienen en cuestión de horas
millones de copias de la secuencia deseada del ADN
(Mullis, 1990).
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Dada la reacción en cadena (PCR) se utiliza para
la identificación de Campylobacter.
Los ensayos multiplex han sido diseñados para
detectar la presencia de dos o mas especies en la
misma muestra.
Este protocolo de PCR fue capaz de detectar
100% de los 59 trenes de Campylobacter s
examinados, que incluían 34 cepas de C. jejuni y 25
cepas de C. coli.
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Actualmente el FSIS recomienda el uso de contraste
de fase o aglutinación de látex.
Metodologías de detección actuales en
los EE.UU.
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USDA Servicio de Inspección de Seguridad Alimentaria
(FSIS), Oficina de Ciencias de la Salud Pública (OPHS)
metodología de detección / coli C. jejuni.
La metodología sugerida por el FSIS se describe en el
Laboratorio de Microbiología de Guía (MLG) 41.02 (
Anónimo, 2013 a)
El método de detección de Campylobacter actual de
alimentos y agua se describe en el capítulo 7 del
Manual Analítico Bacteriológico (BAM) ( Hunt et al., 200
1).
100 ml de caldo
Bolton
suplementado
con sangre de
caballo
Etapa pre
enriquecimiento
25 g de matiz
del alimento
sospechoso
Revestimiento
CCDA
37°C , 4 h
antibióticos
La temperatura
de incubación
42°C a 44h
Presuntas
colonias son
examinadas
en el
microscopio
de contraste
de fase
Las colonias
son
confirmadas
con las
pruebas
bioquímicas
Se sacuden
los matraces
Ejemplo la
leche cruda,
tiene un paso
de
centrifugación
Muchas
variantes se
enumeran en
función de la
matriz
alimentaria
Un ajuste pH
y requiere
filtración
Revisión de la Organización Internacional de Normalización (ISO)
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En 2009 la Organización Internacional de Normalización
(ISO) revisó 10.272. Esta revisión describe numerosas
nuevas actualizaciones en el protocolo para la detección y
enumeración de Campylobacter de alimentos para los
alimentos y los animales ( Anónimo, 200 6).Actualmente
10.272 establece que hay enriquecimiento individual es
óptima para la detección de Campylobacter en todos los
alimentos y que la selectividad es mayor utilizando caldo
de Preston. La versión revisada sugiere el uso de caldo de
Bolton incubó micro aeróbicamente a 4 - 6 h a 37 ° C y
luego 40 - 48 horas a 41.5 ° C en alimentos con bajo fondo
o estresado organismos Campylobacter ( Anónimo, 2009)
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La confirmación e identificación de las colonias
sospechosas se determinara de la forma tradicional
mediante pruebas bioquímicas y se utilizara el PCR
conclusiones
Es posible encontrar a bacterias del genero Campylobácter en todas las especies de
aves de corral, la infección de estas suele ser, a través de agua contaminada,
alimentos y transmisión horizontal. En el ser humano, la transmisión indirecta es la más
importante, debida a alimentos poco cocinados como son las aves (principalmente
pollo), la leche y el agua.
En muestras con bajo numero de células, se recomiendo el
enriquecimiento durante 48 horas bajo condiciones aerobias para
lograr un numero detectable de células
La incubación de la
muestra a 42 °C durante
el proceso de
aislamiento
Los medios mas
recomendados son
Bolton y agua de
peptona y la
CCDA
La confirmación de campylobacter según
FSIS se basa en la microscopia de
contraste de fase y prueba de fijación
del látex
Aun no son aceptados por el ISO los ensayos de
ADN son métodos sencillos y rápidos para confirmar
Campylobacter he identificar el nivel de especie
La carne de pollo
contaminada requiere
mayor tiempo de
preparación
Las pruebas de ADN
pueden acoplarse a los
métodos tradicionales ,
para mejor resultados