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SEMINARIO
CURSO OPTATIVO
DE ENFERMEDAD DE CHAGAS
GRUPO 4
Dístel, Matías Nicolás
Guiñez, María Florencia
La Cono, María Victoria
MEDIADORES SOLUBLES LIBERADOS POR
LA INFECCIÓN CON TRYPANOSOMA CRUZI
PODRÍAN DESENCADENAR MECANISMOS
DE FISIOPATOGENIA EN LA ENFERMEDAD
DE CHAGAS EXPERIMENTAL
RESUMEN
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Esta enfermedad afecta a cerca de 2.500.000 personas en
nuestro país y 18 millones en América Latina.
El parásito presenta en el hospedador 2 estadíos:
- amastigote (intracelular)
- tripomastigote (extracelular)
Para el control de la infección es necesario una potente
respuesta inmune humoral y celular
Períodos clínicos e inmunológicos
- fase aguda (tripomastigote en sangre, asociado a
inmuno supresión, asintomática)
- fase indeterminada (baja parasitemia y serología
positiva)
- fase crónica (sintomatología: cadiopatías o patologías
digestivas)
RESUMEN
 El
macrófago tiene un rol esencial (interacción
célula-parásito)
 La evolución de la infección depende de la
estrategia de evasión del parásito y los
mecanismos microbicidas del macrófago:
- NO
- citocinas proinflamatorias
- IL-12 , IFN-γ, TNF-α (activacion de NOSi
en macrófagos)
OBJETIVOS

Estudiar el líquido peritoneal (sitio de infección)
en un modelo experimental murino, algunos
mediadores de respuesta innata en las primeras
horas post infección con T. cruzi y la respuesta
adaptativa al final de la fase aguda.
DETERMINACIONES
1.
2.
3.
4.
5.
Estallido respiratorio
NO
Activación de arginasa
IL-6
Anticuerpos específicos (IgM e IgG)
MATERIALES Y MÉTODOS


Parásito: T. cruzi (forma tripomastigote)
Animales:
•Ratones control (C): recibieron PBS por vía
intraperitoneal
•Ratones infectados (I): inoculados por vía
intraperitoneal con 1500 tripomastigotes.


Obtención del líquido peritoneal: lavado del peritoneo
con medio RPMI suplementado con suero fetal bovino al
10% en diferentes momentos (previo a la infección, durante
las primeras hs, 15 y 20 días post infección)
Cultivo de células de peritoneo:
•Centrifugación de células
•Recuento
•Observación de morfología (Giemsa)
•Determinación de viabilidad (azul Trypan)
DETERMINACIONES Y RESULTADOS
CURVA PARASITÉMICA
Se pueden observar los niveles de tripomastigotes circulantes, los
cuales aumentan con la evolución de la infección. Los recuentos se
realizaron hasta el día 20 post infección, debido a que después de
este período la mortalidad fue del 95%.
1.
Determinación del estallido respiratorio en células
adherentes por técnica de reducción de NBT
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Incubación de células a 37°C durante 2hs. (células
peritoneales de ambos grupos de ratones, obtenidas
previo y durante las primeras horas post infección)
Células no adherentes (linfocitos) se descartan y se
lavan las adherentes (macrófagos-neutrófilos)
En otros tubos se opsonizan tripomastigotes con suero
de ratón normal ó infectado crónico.
Incubaar 1hs a 37°C cada sistema con células
adherentes de infectados y controles y se agregó NBT
Frenar la reacción con HCl
Centrifugar y descartar el sobrenadante
Colocar dioxano para extraer fracción coloreada y leer
absorbancia (540nm)
En el gráfico están representados los incrementos de la
reducción del NBT en los animales infectados respecto de
los controles. La diferencia fue significativa a las 12hs
post infección, independientemente de que el estímulo
específico fuera previamente opsonizado con suero de
animales infectados crónicos o de ratones normales.
2.
Determinación de NO (óxido nítrico) por
reacción de Griess
Células no adherentes se mantuvieron en baño de
hielo
b) Células adherentes se incuban 2hs con
tripomastigotes de T. cruzi
c) Se lava con RPMI-suero fetal 10% y se agregaron
las células no adherentes.
d) Cultivar a 37°C y 5% CO2 por 72hs.
e) Extraer sobrenadante, agregar reactivo de Griess y
leer absorbancia (540nm)
a)
Los niveles de NO en sobrenadante de cultivo de
células peritoneales (reestimuladas in vitro) están
relacionados con el aumento de parásitos
circulantes y con la evolución de la infección.
Las células en el sitio de la infección inducen un
aumento de la producción in vitro de este mediador.
3.
Determinación de la activación de arginasa
medida por los niveles de urea
Previo lavado con RPMI, se agrega tritón 0,1%
con inhibidor de proteasas, se dejó 30 min. a T°
ambiente (para lisado de las células adherentes
peritoneales)
b) Se agregó MnCl2 y Tris HCl para activar la
enzima y se dejó por 10 min. a 55°C
c) Agregar L-arginina (sustrato de la arginasa) y
se dejó por 1hs a 37°C.
d) Frenar la reacción con solución ácida H3PO4H2SO4
e) Agregar reactivo ISPF y leer absorbancia
(540nm)
a)
Los niveles de urea, marcadores de la vía metabólica de la
arginasa, se mantuvieron por debajo de valores basales con
una ligera tendencia a disminuir con la evolución de la
infección. Se observa un patrón inverso a la producción de NO,
lo que sugiere una polarización del metabolismo de la Larginina hacia la activación de NOSi.
4.
Determinación de IL-6 en líquido peritoneal
por ELISA
Las muestras y las diluciones estándares se
incubaron en las placas sensibilizadas con
anticuerpos monoclonales anti IL-6
b) Lavado
c) Agregar anti IL-6 conjugado con peroxidasa
d) Revelar con estreptavidina y tetrametilbencidina
e) Frenar la reacción con H2SO4
f) Leer absorbancia (450nm)
a)
Se observa un aumento significativo en los animales
infectados desde las primeras horas post infección
hasta los días 15 post infección, momento en el cual
comienza a disminuir
5.
Determinación de anticuerpos específicos
por ELISA
Sensibilizar las placas de poliestireno con
antígenos de T. cruzi durante toda la noche
b) Bloquear con PBS-albúmina por 2hs .
c) Incubar las muestras de líquido peritoneal
durante 2hs.
d) Lavar con PBS-Tween
e) Agregar anti IgM ó anti IgG conjugado a
peroxidasa
f) Revelar con estreptavidina y
tetrametilbencidina
g) Leer absorbancia (450nm)
a)
Se observa un incremento significativo de
anticuerpos específicos en LP con la evolución de la
infección presentando mayores niveles de IgM. Por
otra parte los niveles de IgG fueron significativos
recién a los 20 días post infección.
CONCLUSION

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
El T. cruzi es destruido por el macrófago mediante la
activacion de diferentes mecanismos microbicidas:
produccion de radicales libres de oxígeno y síntesis de NO.
La evolución de la infección a nivel experimental depende
de la carga parasitaria y de la respuesta innata, la cual si es
baja disminuye los daños en la fase crónica.
El proceso de fagocitosis gatilla el estallido respiratorio en
el macrófago (observado por el aumento de la reducción de
NBT).
El aumento de calcio intracelular activa la NADPH oxidasa,
lo que lleva a una liberación de radicales de oxígeno y
superóxidos que se combinan con NO y tienen efectos
microbicidas.
En otros trabajos previos desarrolados se demostraron altas
concentraciones de NO a nivel sistemico en animales que
cursaban el final del periodo agudo, lo cual junto con la
síntesis de citocinas inflamatorias (IL-12 y TNF-α) estaría
relacionado a la morbimortalidad de la infección.

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A su vez, las citocinas inflamatorias producidas en la etapa aguda
aumentan la inducción de la NOSi, que junto con el NO, no sólo
eliminan el parásito sino que también generan daño tisular a nivel
local provocado por el estrés oxidativo.
Los niveles elevados del NO y la escasa producción de urea
(determinacion de actividad de arginasa) sugieren una mayor
inducción de la NOSi, mientras la activación de arginasa estaría
regulada (la arginina es sustrato de las dos enzimas)
La IL-6 en etapa crónica tiene relación con los daños en la función
cardíaca. En este trabajo se observa el aumento de IL-6 en las
primeras hs. de infección (fase aguda), por lo que esta citocina se
correlaciona con altas parasitemias y mortallidad.
Los niveles de IgM aumentaron antes que los de IgG, pero ambas
aumentan con la evolución de la infección.
Se encontraron altos niveles de Ig anti galectina I
(inmunomodulador), tanto en suero de pacientes en fase aguda como
crónica, lo cual está relacionado con el daño cardíaco.
Los resultados demostraron la compartamentalizacion de la rta
inmune, producción temprana de mediadores inflamatorios
(radicales, NO) y el aumento de IL-6. Estos mediadores a largo
plazo generan una rta inmune contra las células del hospedador.