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“Evaluación del efecto protector de la bacteria probiótica Lactobacillus casei cepa
Shirota en ratones infectados con Trypanosoma cruzi”
Registro SIP: 20070662
1. RESUMEN
Se inoculó un grupo de ratones CD1 (G1) con 3 x 105 tripomastigotes sanguíneos de
Trypanosoma cruzi y se siguió la curva de parasitemia mediante el método de Pizzi. Otros
dos grupos (G2 y G3) fueron tratados la bacteria prebiótica Lactobacillus casei cepa
Shirota y se les administraron 3 inyecciones intraperitoneales (i.p), con separación de una
semana, de 1.8 x 108 unidades de la bacteria viable y muerta respectivamente, previo al reto
con Trypanosoma cruzi.
Ambos tratamientos con la bacteria prebiótica, generaron una fuerte resistencia a la
infección parasitaria presentando reducción significativa (p<0.05) en la curva de
parasitemia. La administración repetida de lactobacilos viables provocó mayor reducción
en la parasitemia hasta del 93% en el día 23 post infección.
La administración repetida de lactobacilos viables o muertos antes, del reto parasitario
indujo inmunidad inespecífica contra la infección por Trypanosoma cruzi cepa NINOA en
ratones CD1.
Palabras clave: Lactobacillus casei, probióticos, Trypanosoma cruzi, Inmunidad inespecífica.
2. INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas es una zoonosis causada por el parásito protozoario
Trypanosoma cruzi, es endémica exclusivamente en el continente americano, afecta al
humano y a una gran variedad de huéspedes reservorios. El parásito fue descrito en 1909
por Carlos Chagas, en Minas Gerais, Brasil; también describió el ciclo de vida, los insectos
transmisores, así como los mamíferos que actúan como reservorios en la naturaleza. La
enfermedad es crónica debilitante que afecta la salud, el bienestar y la productividad de un
gran número de seres humanos y representa un problema da salud pública en América
Latina (Guzmán-Marín et al., 1999).
En la naturaleza, T. cruzi se mantiene principalmente en un ciclo selvático que involucra a
ciertas especies de triatominos que actúan como transmisores y a varios mamíferos
salvajes, como tlacuaches, mapaches y ratas. Sin embargo, la invasión humana de la selva
ha facilitado el contacto de las chinches y los animales salvajes infectados con el hombre,
generando así un ciclo peri-doméstico. Ciertas especies de triatominos como Triatoma
infestans y Rhodnius prolixus, tienen mayor propensión a invadir las casas y anidar en
ellas, por lo que con mayor frecuencia son responsables de la transmisión de la infección al
1
hombre. La colonización de hábitats humanos se encuentra frecuentemente ligada a la
pobreza rural. En construcciones por debajo de los estándares recomendados, las grietas y
hoyos de las paredes sin recubrimiento y los techos de paja, proveen escondite adecuado
para las chinches, facilitando la infección del humano.
La infección aguda es común en niños y se presenta antes de los 10 años de edad en el 85%
de los casos, mientras que la fase crónica incapacitante se manifiesta fundamentalmente en
gente en edad productiva entre los 35 y 45 años.
La prevalencia de la enfermedad en México es muy variable, existen localidades, sobre
todo en Oaxaca, Guerrero y Chiapas, en donde se encuentra positividad a T. cruzi hasta en
el
29% de la población2, mientras que en otros sitios como Jalisco y Zacatecas la
prevalencia es cercana al 1.5%. En términos generales se estima que la prevalencia a nivel
nacional es de 1.5 a 1.6% (Trujillo, 1993).
Tripomastigote sanguíneo
En esta fase el parásito se encuentra en la sangre del
huésped mamífero mide 20 x 2.5 m, es infectante para
el transmisor, puede invadir otras células del huésped.
Morfológicamente es flagelado, alargado, con un
cinetoplasto grande en el extremo posterior. Se
distingue también por su movimiento rápido, propulsivo
y giratorio. En este estadio el parásito no se reproduce y puede infectar a mamíferos por
transfusión sanguínea (Burleigh y Andrews, 1995).
Amastigote
Mide de 2-4 m, tiene forma esférica u ovalada que
carece de flagelo libre y es inmóvil es intracelular y
se reproduce en diversos tipos de células del
huésped mamífero (Burleigh y Andrews, 1995).
2
Manifestaciones clínicas
La enfermedad de Chagas tiene tres etapas: aguda, indeterminada y crónica.
Fase aguda. Después de la picadura por una chinche infectada, puede aparecer una lesión
focal en el sitio de inoculación. Esta lesión recibe el nombre de “chagoma” y consiste en
una zona indurada con eritema e hinchazón acompañada de inflamación de los ganglios
locales. Cuando la puerta de entrada ha sido la conjuntiva, hay un edema no doloroso de los
párpados y de los tejidos aledaños que característicamente es unilateral, lo que se conoce
como el signo de Romaña. La fase aguda de la enfermedad es generalmente asintomática,
sólo 1-2% de los pacientes presentan síntomas, los cuales se presentan 1-2 semanas después
de adquirir la infección. Las manifestaciones clínicas de la fase aguda incluyen fiebre,
anorexia, diarrea, inflamación de los ganglios, inflamación del hígado y del bazo y
miocarditis. La fase aguda se resuelve espontáneamente en 4-8 semanas. Un pequeño
número
de
pacientes,
generalmente
niños,
desarrollan
miocarditis
aguda
o
meningoencefalitis que pueden ser fatales. En individuos que adquirieron la infección por
transfusión, particularmente pacientes inmunosuprimidos, la fase aguda puede ser
fulminante con daño cardiaco y neurológico. La infección congénita puede producir aborto,
muerte intrauterina o enfermedad aguda, la cual puede detectarse al momento de nacer,
pero se hace evidente varias semanas después. Se caracteriza por fiebre, ictericia, anemia,
crecimiento de bazo e hígado y lesiones cutáneas. La mortalidad es secundaria a
miocarditis, neumonitis o encefalitis (Montiel G y Díaz G., 2002).
Fase indeterminada o latente. Empieza 8-10 semanas después de la infección. Durante esta
etapa los enfermos no tienen ningún síntoma y son detectados por la presencia de
anticuerpos específicos. Generalmente estos pacientes no tienen evidencia de parásitos en la
sangre. En estos pacientes, la infección puede ser rápidamente activada durante una
enfermedad concomitante severa o en condiciones de inmunosupresión.
Fase crónica. En aproximadamente un 30% de los casos se presentan complicaciones en el
corazón y en el tracto digestivo, 10 a 30 años después de la infección inicial. Los problemas
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cardiacos son los más serios y se manifiestan principalmente como daño al tejido muscular
del corazón y con trastornos de la conducción de la señal eléctrica, lo que produce
insuficiencia cardiaca y facilita la producción de tromboembolias. La afectación
gastrointestinal consiste en la dilatación del esófago (mega esófago) y del colon
(megacolon) y se debe muy probablemente a daño local al sistema neuronal autónomo. El
mega esófago se manifiesta como dificultad y dolor al tragar y regurgitaciones. El
megacolon se manifiesta con dolor abdominal y estreñimiento crónico; en casos muy
severos puede haber obstrucción y perforación. Por razones que se desconocen, la
enfermedad chagásica gastrointestinal es común en el sur del Amazonas, pero rara en
México y en Centroamérica (Montiel y Díaz, 2002).
Respuesta inmune.
Los mecanismos de patogenicidad de Trypanosoma cruzi actualmente no son bien
comprendidos, sólo se sabe que la respuesta inmune humoral juega un papel muy
importante en la resistencia y eliminación de los parásitos de circulación y que algunos
epítopos del parásito pueden desarrollar una reacción cruzada con antígenos propios,
desencadenando un proceso auto inmune. En el huésped infectado la respuesta inmune
protectora involucra principalmente la producción de anticuerpos específicos y la
activación de células fagocíticas por interferón gama.
La respuesta humoral contra el parásito es generada por una mezcla compleja de antígenos,
por lo que no es posible determinar las variaciones de las especificidades de anticuerpos en
los diferentes estadios de la enfermedad: aguda, crónica e infección congénita. La
producción de anticuerpos contra los diferentes determinantes antigénicos, depende del
estado de la infección en que se encuentre el huésped. De hecho los tripomastigotes meta
cíclicos poseen invasinas o moléculas de invasión celular, que son específicas, por lo que la
inmunidad inducida no neutraliza las invasinas expresadas por la siguiente generación de
tripomastigotes.
4
Una alta respuesta inmune específica mantenida por años, sugiere un estimulo antigénico
constante, por persistencia del parásito. Y se sabe que en los humanos la IL-4 induce el
cambio de inmunoglobulina IgM a IgG.
Actualmente se sabe que los títulos de los diferentes isotipos de anticuerpos IgG se
relacionan con el estadio de la enfermedad y con la patología desarrollada en los pacientes
chagásicos (Montiel y Díaz, 2002).
Protección contra Trypanosoma cruzi
Actualmente se desarrolla investigación abundante en diferentes países del primer mundo
pero sobre todo en países endémicos, se ha planteado la necesidad de desarrollar vacunas
contra la enfermedad de Chagas.
Kato et al., 2002. Probaron la eficacia de dos vacunas DNA, el gene que codifica para la
dihidroorotato deshidrogena no confirió inmunidad protectora en ninguna de las cepas de
ratones congénicos utilizados mientras que la que codifica para la trans-sialidasa (TSSA).
Confirió protección en algunas cepas pero no en todas. Con esta vacuna y adyuvantes
inmunomoduladores como la IL-12, se ha logrado mejorar la eficacia en protección
experimental.
Planelles et al., 2001. Inmunizaron ratones con un plásmido recombinante que codifica y
expresa una proteína de choque térmico (HSP70) y un péptido específico del orden
Kinetoplastida (KMP11) reportado como un potente inductor de la respuesta inmune
celular y que se encuentra localizado en el flagelo. Encontraron que esta inmunización
genera respuesta inmune humoral de larga duración (IgG2a) y celular citotóxica (CD8+)
induciendo protección contra la infección pero cuando sólo inmunizaron con KMP11 no
hubo inmunidad.
Schnapp et al., 2002. Utilizaron a la cruzipaina (cistein proteinasa) de T. cruzi y
encontraron que las células T especificas contra la cruzipaina, produjeron grandes
cantidades de IFN- cuando fueron cultivadas con macrófagos infectados con el parásito,
disminuyendo la replicación intracelular del parásito. Al inmunizar con una cruzipaina
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recombinante junto con IL-12 y un neutralizante de IL-4, se desarrolló una potente
memoria Th1 específica contra la cruzipaina. Postulando así a la proteinasa como un
candidato para la producción de vacunas contra T. cruzi.
Actualmente la enfermedad de Chagas y otras enfermedades parasitarias son de gran
importancia y poco se han relacionado con el estudio de los probióticos en
inmunoprofilaxis. Sin embargo, el laboratorio de Inmunoparasitología del Departamento de
Parasitología de la ENCB, ya cuenta con algunos datos en modelos experimentales con
Plasmodium chabaudi, Babesia microti y Trichinella spiralis en los que se ve disminuida
la infección por el tratamiento inmunoestimulador con bacterias prebióticas como
Lactobacillus casei ATCC 7469 y Lactobacillus casei cepa Shirota.
Se sabe que las bacterias probióticas tienen los siguientes efectos en el organismo:
 Prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas
 Disminución de los niveles de colesterol.
 Disminución de diarreas por virus.
 Tratamiento de la intolerancia a la lactosa.
 Exclusión o reducción de la adherencia patógena
 Producción de ácidos, peroxido de hidrógeno y bacteriocinas antagonistas al
crecimiento patógeno y habilidad de adherirse a las células
 Formación de una flora intestinal balanceada.
 Prevención de manifestaciones alérgicas.
 Prevención varios tipos de cáncer
 Estimulación del sistema inmune.
Lactobacillus casei.
Pertenece a la familia Lactobacilaceae y se caracteriza por ser un microorganismo Gram
positivo, catalasa negativa, inmóvil, no esporulado. Microscópicamente es un bacilo
microaerofílico, crece lentamente en condiciones aeróbicas y produce pequeñas colonias
cuya morfología varia dependiendo del medio en que sea sembrado. Es anaerobia pero no
sensible al oxígeno por lo que se considera aerotolerante, su temperatura óptima de
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crecimiento es de 35°C con capacidad de crecer entre 37 y 45°C. Para que el crecimiento de
este microorganismo prospere se requiere de la producción de una cantidad considerable de
ácido láctico que disminuye el pH del medio de cultivo (Elmer y Koneman, 1992)
Actividad antitumoral
Kato et al., 1983. Estudiaron el efecto antitumoral que tienen L. casei y L. bulgaricus
contra tumores murinos (LC9018), cuando estos microorganismos prebióticos son
administrados por vía intraperitoneal ocurre activación de macrófagos con capacidad
antitumoral. Cuando los Lactobacilos son administrados por vía oral inducen la liberación
de enzimas lisosomales y no lisosomales de macrófagos peritoneales, las cuales están
involucradas en la actividad antitumoral.
Hashimoto et al., 1984. Encontraron que dentro de los mecanismos que inhiben el
crecimiento de células tumorales, los macrófagos producen y liberan radicales libres de
oxigeno y esta actividad se incrementa substancialmente por la administración de L. casei
o L. fermentum por vía intravenosa o intraperitoneal.
Kato et al., 1994. Encontraron que la administración de L. casei muerto por calor, reduce
el desarrollo de tumores inducidos experimantalmente, incrementa significativamente la
supervivencia del huésped y las células inmunocompetentes mostran su efecto potenciado.
También se demostró que cuando se administra la bacteria viva por vía intravenosa, el
efecto antitumoral se hace patente.
En humanos se ha comprobado el efecto antitumoral, ya que en estudios realizados con
Lactobacillus casei cepa Shirota (LcS) se observó una disminución en la recurrencia del
cáncer superficial de vejiga (Aso et al., 1992). Otros estudios con esta bacteria, muestran
que además tiene propiedades antimetastásicas, este efecto se observó experimentalmente
haciendo transplante de células tumorales e induciendo inmunosupresión en ratones
tratados con la bacteria probiótica por vía oral (Kato et al., 1994). Por otro lado, la
administración intrapleural de LcS en ratones que padecen tumores, inhibe el crecimiento
de células tumorales en la cavidad torácica, prolongando significativamente el tiempo de
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sobrevivencia, e induciendo la producción de IFN-γ, TNF-α e IL-1
(Matzusaki et al.,
1998).
Actividad antibacteriana
Sato K. en 1984, observó el efecto protector de los lactobacilos sobre una infección
producida por Listeria monocytogenes en ratones, encontrando que la protección frente a
Listeria incrementa el periodo de sobrevivencia de los ratones previamente tratados con L.
casei. Además indica
que el aumento en la resistencia de la infección por Listeria
monocytogenes podría estar mediada por la migración de macrófagos desde el torrente
sanguíneo hacia el sistema retículo endotelial, en respuesta a la administración del L. casei
antes o después de la infección con la bacteria patógena.
Nomoto et al., 1985. Estudiaron el efecto protector que presenta L casei YIT9018 muerta
por calor, en contra de una infección por Pseudomonas aeruginosa en ratón. La bacteria
prebiótica administrada por vía intraperitoneal aumentó la actividad de macrófagos y así la
actividad protectora contra P. aeruginosa, lo que sugiere que la inducción de macrófagos
activados por lactobacilos es el principal mecanismo involucrado en la inmunidad
protectora.
En 1991 Perdigón et al., estudiaron el efecto que tiene L. casei al ser administrado en
diferentes dosis por vía oral, sobre la respuesta secretota de IgA específica y la capacidad
protectora de este microorganismo en la prevención de infecciones intestinales, previniendo
la colonización por Salmonella typhimurium y Escherichia coli. La administración de una
dosis adecuada, produce un incremento en la inmunidad en mucosas para prevenir
infecciones entéricas. La administración de estos microorganismos puede ser usada como
una estrategia inmunológica para el control de desordenes entéricos.
Ogawa et al., 2001. Observarón la inhibición del crecimiento in vitro de Escherichia coli
productora de Toxina Shiaga (STEC) por parte de varias cepas de Lactobacillus. Los datos
sugieren que el efecto bactericida de Lactobacillus sobre STEC se basa en la capacidad de
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la bacteria probiótica de producir ácido láctico, y que esto a su vez disminuye el pH del
medio donde han crecido los dos microorganismos.
Actividad antiparasitaria.
Bautista et al., 2002, mostraron que L. casei induce una respuesta protectora inespecífica
contra la infección experimental por Trichinella spiralis al ser administrada viva, por vía
intraperitoneal, siete días antes de la infección con larvas infectantes del parásito.
Bautista et al., 2004, evaluaron a L. casei vivo como adyuvante con antígenos de
Trichinella spiralis, administrado por vía intraperitoneal, esto se comparó utilizando el
adyuvante completo e incompleto de Freund y después se les retó con larvas musculares de
T. spiralis. Encontraron que la reducción de gusanos adultos en el intestino fue de 87.26%
cuando se uso L. casei como adyuvante, 26.7% cuando se uso adyuvante incompleto de
Freund y 86.7% cuando se uso adyuvante completo de Freund; por lo tanto se concluye que
L.casei viable funciona como adyuvante cuando se administra a ratones con antígenos de
Trichinella spiralis.
En un estudio realizado por este mismo grupo de investigadores, trataron a ratones con L.
casei para después retarlos con una dosis infectiva del parasito intracelular Babesia microti.
Ellos inocularon ratones con la bacteria viva por vía oral e intraperitoneal, y 7 días después
los retaron con una dosis infectiva de B. microti, en este experimento encontraron una
reducción significativa en el porcentaje de eritrocitos parasitados (GRP) comparado con
aquellos que no fueron tratados con L. casei. Además al hacer un estudio inoculando a la
bacteria viva y muerta y comparándola con el efecto que tiene el Adyuvante completo de
Freund, también se observó una disminución en el % de GRP después de la infección con
B. microti.
Además encontraron que L casei aumenta la resistencia no específica hacía Plasmodium
chabaudi, reduce el poder infectivo del parásito a nivel del bazo y eleva la concentración de
oxido nítrico en el suero en ratones estimulados con la bacteria (Martínez-Gómez, et al.,
2006).
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JUSTIFICACIÓN
La enfermedad de Chagas es un problema de salud pública en el continente americano, es
por ello que la prevención es de suma importancia, ya que en la actualidad no se cuenta con
un tratamiento efectivo contra la enfermedad. Por lo que resulta interesante evaluar el
efecto de los probióticos sobre el desarrollo de esta parasitosis en un modelo experimental.
Objetivo general
Evaluar el efecto protector de Lactobacillus casei Shirota viable y muerto, administrado a ratones
vía intraperitoneal, sobre los niveles de parasitemia de Trypanosoma cruzi cepa NINOA.
Particulares:
a) Inmunoestimular por vía intraperitoneal ratones de la cepa CD1 con tres dosis de
Lactobacillus casei Shirota (LcS) vivo y muerto, con separación de una semana.
b) Evaluar la carga parasitaria de tripomastigotes sanguíneos en ratones infectados con
la cepa NINOA de T. cruzi e inmunoestimulados con LcS vivo o muerto
HIPÓTESIS
Dado que Lactobacillus casei tiene la capacidad de estimular la actividad de macrófagos,
y la respuesta Th1 (producción de IFN- , IL-12 y TNF-α) y por ser ésta, una línea
importante de defensa contra la infección por Trypanosoma cruzi, se afectará la
parasitemia, en ratones inmunoestimulados previamente con la bacteria.
3. MATERIAL Y MÉTODOS
Ratones
Se usaron ratones hembra sanos, de la cepa CD1 de 6-8 semanas de edad. Se revisaron para
detección de parásitos intestinales no deseados mediante la técnica de concentración de
sulfato de zinc. Los casos positivos fueron tratados durante una semana con albendazolmebendazol.
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Parásito
Se uso la cepa NINOA de Trypanosoma cruzi. Esta fue conservada en nitrógeno líquido y
mediante pases seriados en ratones CD1. La dosis infectiva usada fue de 300,000
Tripomastigotes sanguíneos diluidos en solución salina fisiológica e inoculados por vía
intraperitoneal (i.p) en cada ratón.
Bacteria viva
Se usó la cepa Lactobacillus casei Shirota que se ha conservado en nitrógeno líquido
Se resuspendió el contenido de un criovial en un volumen conocido y se sembró en un
matraz con 150 ml de medio de cultivo Mann-Rogosa-Sharpe (MRS)
Se incubó a 37oC por 18 horas, se cosecharon las células y se lavaron 2 veces por
centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos, con PBS pH 7.2, estéril
Se resuspendió el botón de células en solución de PBS pH 7.2, estéril
Se hizo cuenta viable de la bacteria de la siguiente manera:
Se hicieron diluciones decimales de la bacteria en PBS hasta 10-10
Se sembró por duplicado, 1 mL de las diluciones 10-5-10-10 en agar MRS, mediante la
técnica de vaciado en placa, se verificó la pureza bacteriana por morfología colonial y
pruebas bioquímicas
Nuevamente, se incubó a 37oC por 48 horas
Se calcularon las UFC/mL obtenidas y se ajustaron a 1.8x109 UFC/mL. Se conservaron en
alícuotas de 1 mL a -20ºC, hasta su uso.
La cepa se conservó en nitrógeno líquido
Se inoculó por vía i.p, una dosis de 1.8x108 UFC a cada ratón. (Bautista 2002; MartínezGómez et al., 2005)
Bacteria muerta
El concentrado con 1.8 x109 UFC se sometió a ebullición en baño maría durante 30
minutos. Se comprobó la muerte de la bacteria sembrando en agar MRS. (Bautista et al.,
2002)
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Evaluación de la parasitemia
Se hizo por cuenta directa del parásito por el método de Pizzi modificado:
Se obtuvieron 10 l de sangre de la vena caudal de cada ratón y se realizó una dilución 1:5
con cloruro de amonio 0.9%.
Se tomó una muestra de 5 l de la dilución anterior y se colocó en un portaobjetos limpio y
desengrasado
Se cubrió con un cubreobjetos de 18 x 18 mm, del Nº 1
Se observó al microscopio óptico a seco fuerte (objetivo de 20 X) y se contaron los
tripomastigotes sanguíneos presentes en 50 campos.
Se hizo el cálculo aritmético para obtener el número de Tripomastigotes sanguíneos por
mililitro de sangre (Brener, 1962)
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Se partió de 3 tres grupos de 6 ratones CD1. El primer grupo fue el testigo de la infección
parasitaria y no recibió tratamiento con la bacteria prebiótica (Grupo 1), el segundo grupo
fue tratado con la bacteria viva (Grupo 2), y el tercer grupo fue tratado con la bacteria
muerta (Grupo 3). Todos los grupos fueron retados con 3 x 105 tripomastigotes sanguíneos
de Trypanosoma cruzi.
Esquema de inmunoestimulación con Lactobacillus casei Shirota.
El Grupo 1 se inoculó con 100 l de solución de PBS estéril, cada semana durante tres
semanas.
El Grupo 2 recibió por vía i.p una dosis de 1.8x108 UFC/ml de Lactobacillus casei Shirota
viva, cada semana durante tres semanas.
El Grupo 3 recibió por vía i.p una dosis de 1.8x108 UFC/ml de Lactobacillus casei Shirota
muerta, cada semana durante tres semanas.
Reto
Cinco días después de la última inmunoestimulación:
Se inocularon por vía i.p, los tres grupos, con una dosis infectiva de 3 x 105 tripomastigotes
sanguíneos.
12
Cinco días después post-infección se tomaron muestras de sangre de la vena caudal de
cada ratón y se evaluó la parasitemia, como se describió en los métodos. La revisión se
realizó cada dos días durante cinco semanas.
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DIAGRAMA DE FLUJO
Preparación de las cepas
Aislamiento y purificación de
la cepa de Lactobacillus casei
Shirota en medio MRS
Conservación de Trypanosoma cruzi
cepa NINOA mediante pase, en ratones
♀ CD1
Tinción Gram y pruebas
bioquímicas
Tinción Giemsa
Ajustar la cepa pura a una
concentración de 1.8 x 109 en
solución de PBS pH 7.2 estéril
A partir de la suspensión de LcS
ajustada, someter a baño de agua
en ebullición durante 30 min.
14
Confirmar la muerte celular por
resiembra en medio MRS
Inmunoestimulación
Solución de PBS
estéril, pH 7.2
Lactobacillus casei Shirota
viva, 1.8 x 108 UFC, en solución
de PBS pH 7.2 estéril
3 dosis cada 7 días, vía
ip.
3 dosis cada 7 días, vía
ip.
Testigo (Grupo 1) 6 ratones
CD1 ♀ de 6-8 semanas de
edad
Problema
Grupo 2
6 ratones CD1 ♀ de
6-8 semanas de edad
5 días después de la última inmunoestimulación
Reto
Se inocularon por vía ip con dosis infectiva de 3 x 105
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tripomastigotes sanguíneos.
Lactobacillus casei Shirota
muerta por calor, 1.8 x 108
UFC/mL en solución de PBS pH
7.2 estéril
3 dosis cada 7 días, vía
ip.
Problema
Grupo 3
6 ratones CD1 ♀ de
6-8 semanas de edad
5. RESULTADOS
En la tabla 5.1 se muestran el promedio de la parasitemia de Trypanosoma cruzi cepa
NINOA, registradas en la sangre de seis ratones por grupo experimental, a lo largo de 49
días, tiempo que dura la fase aguda de la infección.
Estos datos fueron analizados estadísticamente con la prueba de Distribución-t, * p<0.05.
con 95% de confiabilidad.
El análisis estadístico mostró diferencia significativa en el día máximo de parasitemia,
cuando se comparó el grupo que fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x
108 UFC/mL de Lactobacillus casei Shirota viable y retado con 3.0x105 tripomastigotes
sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa NINOA (Grupo 2) con respecto al grupo testigo
(Grupo 1).
Así mismo se encontró diferencia estadística significativa en el día máximo de parasitemia,
cuando se comparó el grupo que fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x
108 UFC/mL de Lactobacillus casei Shirota muerto y retado con 3.0x105 tripomastigotes
sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa NINOA (Grupo 3) con respecto al grupo testigo.
Por otro lado no se encontró diferencia significativa en el día máximo de parasitemia,
cuando se comparó el grupo que fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x
108 UFC/mL de Lactobacillus casei Shirota muerto y retado con 3.0x105 tripomastigotes
sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa NINOA (Grupo 3) con respecto al grupo que fue
inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL de Lactobacillus casei
Shirota vivo y retado con 3.0x105 tripomastigotes sanguíneos de Trypanosoma cruzi cepa
NINOA(Grupo 2).
16
Tabla 5. 1 N° promedio de parásitos en sangre registrado del día 5 al 49 en los tres
grupos experimentales
Tripomastigotes sanguíneos /mm3
Día pos-infección
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
31
33
35
37
39
41
43
45
47
49
Grupo 2
Grupo 3
Grupo Testigo
0
0
0
3766.66
4233.33
4750
6750
8866.66
10633.33
45666.66
62833.3
69166.66
58000
62333.33
55166.66
41666.66
4033.33
1750
0
0
0
0
0
0
4766.66
18000
21416.66
7866.66
10516.66
17216.66
85333.33
103333.33
164166.66
136500
95500
78333.33
112166.66
57500
67000
37000
32750
14766.66
7083.33
4133.33
0
0
21416.66
7866.66
10516.66
16250
24366.66
32083.33
67333.33
109500
144833.33
652500
471166.66
285600
88750
72250
59000
47000
9825
6900
5250
3650
2950
2417.5
1225
En el grupo testigo que fue inoculado con 3.0x105 tripomastigotes sanguíneos mostraron un
pico máximo de 6.5x105 tripomastigotes sanguíneos por mm3 en el día 23 post-infección.
En ratones que fueron inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL
de Lactobacillus casei Shirota viable y retado con 3.0x105 tripomastigotes sanguíneos de
Trypanosoma cruzi cepa NINOA, mostraron un pico máximo de parasitemia de 6x104
tripomastigotes sanguíneos por mm3 en el día 27 post-infección. El grupo de ratones que
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fue inmunoestimulado con tres dosis cada 7 días con 1.8 x 108 UFC/mL de Lactobacillus
casei Shirota muerto y retado con 3.0x105 tripomastigotes sanguíneos de Trypanosoma
cruzi cepa NINOA se muestra un pico máximo de parasitemia en el día 23 post-infección
con 1.6x105 tripomastigotes sanguíneos por mm3 (Figura 5.1).
PARASITEMIA EN RATONES TRATADOS CON L. CASEI
G1: TESTIGO
G2: Lc-VIABLE+ T. cruzi
G3: Lc-MUERTO+T. cruzi
900000
TRIPOMASTIGOTES/ L
800000
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
DÍAS POST INFECCIÓN
Figura 5.1. Parasitemia promedio en ratones CDI (n=6), sin tratamiento con Lactobacillus casei (G1),
tratados con Lactobacillus casei viable (G2) y con Lactobacillus casei muerto (G3). Los tres grupos
inoculados con 3 x 105 tripomastigotes de Trypanosoma cruzi cepa NINOA
Tabla 5.2. Identificación del día de inicio de las parasitemias en los diferentes grupos con respecto al
Testigo.
Grupo tratado
Día de inicio
de parasitemia
No de parásitos/ mm3
Grupo 2
11
3.7 x103
Grupo 3
7
4.1 x103
Grupo Testigo
5
2.1x104
18
Tabla 5.3. Identificación del día en donde se encontró mayor número de parásitos
Grupo tratado
Día de Pico
de parasitemia
No de parásitos/ mm3
Grupo 2
27
6.9 x104
Grupo 3
23
16 x105
Grupo Testigo
23
6.5x105
Tabla 5.4. Identificación del día de término de la parasitemia
Grupo tratado
Día de término
de parasitemia
No de parásitos/ mm3
Grupo 2
39
1.7 x103
Grupo 3
45
4.1x103
Grupo Testigo
49
1.2x103
En la Figura 5.2, se muestra el porcentaje de reducción de parasitemia con especial atención
en el día 11, tomado como referencia por ser éste en el cual, todos los grupos presentan
indicios de parasitemia, pudiendo observar que en este día encontramos un 76.82% y 45%
de reducción para los Grupos 2 y 3 respectivamente. Para el día 23 el porcentaje de
reducción de parasitemia es de 93% y 74% para los Grupos 2 y 3 respectivamente, este día
fue tomado por ser en donde se presenta el pico máximo de parasitemia. Finalmente
encontramos que en el día 39 (día en el cual aun se presenta parasitemia en todos los
grupos), se registró 74.63% y 2.6% de reducción para los Grupos 2 y 3 respectivamente.
Todos los datos se registraron en comparación con el Testigo (Grupo 1).
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G1: TESTIGO
G2: Lc VIABLE+T.cruzi
G3: Lc-MUERTO+T.cruzi
100
90
% REDUCCIÓN
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
DÍAS POST INFECCIÓN
Figura 5.2. Porcentaje de reducción en la parasitemia registrada en los ratones CD1, tratados con lactobacilos
viables (G2), muertos (G3) respecto al grupo testigo (G1).
6. Impacto
Los resultados sugieren que el cambio en la parasitemia podría estar determinado por la
estimulación directa del lactobacilo en la respuesta Th1 a la cual es susceptible
Trypanosoma cruzi, originando resistencia a la infección y controlando de esta manera la
fase aguda, la cual se vio reducida de manera significativa. Es importante resaltar el alto
potencial protector generado con la bacteria probiótica administrada de manera repetida (3
ocasiones) ante el reto de un parásito hemático y tisular con un alto poder patogénico como
es Trypanosoma cruzi. Por lo que resulta conveniente continuar esta línea de investigación
con otros parásitos hemáticos y tisulares para poder en seguida evaluar los cambios
generados por la bacteria probiótica en la respuesta inmunológica.
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