Download Métodos para la Identificación Microbiana Bioq. Federico Nicola

Bioq. Federico Nicola
CEMIC
Sub-Comisión de Antimicrobianos
(SADEBAC)
Rol actual del profesional bioquímico en el campo de la salud. Perspectiva en la práctica y formación profesional
Primer Congreso Bioquímico del Litoral, Santa Fe 2011– Bioq. Federico Nicola
Comunicación
Transporte
Rol actual del profesional bioquímico en el campo de la salud. Perspectiva en la práctica y formación profesional
Primer Congreso Bioquímico del Litoral, Santa Fe 2011– Bioq. Federico Nicola
Laboratorio (Química clínica)
Laboratorio de Microbiología
Rol actual del profesional bioquímico en el campo de la salud. Perspectiva en la práctica y formación profesional
Primer Congreso Bioquímico del Litoral, Santa Fe 2011– Bioq. Federico Nicola
Nuevas tecnologías aplicadas a la microbiología clínica
* Métodos rápidos para la detección de antígenos
* Sistemas miniaturizados para identificación y sensibilidad
* Medios de cultivo cromogénicos
* Equipos automatizados para hemocultivos
* Sistemas automatizados para identificación y sensibilidad
* PCR
* Real-time PCR
* Microarrays
* Secuenciación
Medios de Cultivo
 Base
 Enriquecido
 De Enriquecimiento
 Diferencial
 Selectivo
 Selectivo y Diferencial
 Cromogénicos
Metodología utilizada para la
Identificación microbiana
 Fenotípicos
 Manuales
 Galerías Multi-pruebas
 Automatizados
 Serológicos
 Moleculares
 Ribotipificación
 Secuenciación
 Pirosecuenciación
 Proteómica
Métodos Fenotípicos
 Morfología celular y características de las colonias
 Pruebas inmediatas (segundos a pocos minutos)
 Pruebas rápidas (hasta 4-6 hs)
 Pruebas lentas (18-48 hs)
 Pruebas de inhibición o sensibilidad
Métodos Fenotípicos
En el proceso de identificación bacteriana tradicional, la experiencia
del microbiólogo es fundamental para la elección de una prueba
o una batería de pruebas de forma secuencial, en función de la
fiabilidad de las mismas, del género o de la especie bacteriana que se
pretende identificar, del origen del aislado bacteriano, así como del
costo de las mismas.
Los laboratorios deben elaborar y realizar un proceso de
identificación normalizado en su actividad diaria, que utilice de
forma secuencial o simultánea un conjunto de pruebas cuyo
propósito final sea la identificación del microorganismo a nivel de
género y especie y que incluya la mayoría de las bacterias desde el
punto de vista infeccioso.
Curso a Distancia sobre Bacteriología Clínica 2010 – Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy
Algoritmo inicial para la identificación de
Bacilos gram-Negativos No Fermentadores
(BNNF)
INICIO
Ox+ Mov+
Oxidan Glucosa
1
5
Oxidasa
Ox - Mov –
Movilidad
Glucosa O.F.
2
Ox+ Mov+
NO Oxidan Glucosa
4
3
Ox+ Mov -
Ox - Mov+
Oxidan Glucosa
Curso a Distancia sobre Bacteriología Clínica 2010 – Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy
Identificación de BNNF del Grupo 1
(Oxidasa + / Movilidad + / Oxidan Glucosa)
Roseomonas spp.
Methylobacterium spp.
Pig. rosado
Oxidasa +
Movilidad +
Glucosa + (oxida)
Shewanella spp.
SH2 +
(TSI)
Pigm. verde
+
Sphingomonas
Agrobacterium
“gpo. amarillo”
-
Fluorescencia
Colistin
R
Lisina
+
Burkholderia cepacia
Bu
Sub-Grupo A
S
Pseudomonas spp. Ps
ONPG +
complejo
P. aeruginosa
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. putida
-
Pig. amarillo
+
1
y otras bacterias infrecuentes
Lisina ONPG
Maltosa Achromobacter
xylosoxidans
Xilosa +
sbsp. xylosoxidans
Arginina - Esculina - Nitrato +
Curso a Distancia sobre Bacteriología Clínica 2010 – Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy
Ps
P. fluorescens
P. putida
P. stutzeri
P. mendocina
P. alcaligenes
P. pseudoalcaligenes
P. luteola
P. oryzihabitans
+/- +
+ -+
+/- + + +
+/- -+ + +/- +- +/- + +- +/- -+ -/+ -/+
-
Esculina
Almidón
+
+
-
-
Acetamida
-
+
-
-
+
Hidrólisis de
Gelatina
+
+/- +- + +
+ - -/+ +
+- - - +
- - + -
Crecimiento
a 42ºC
+
+
+
Arginina
+
+
+
+
Nitrato
+
+
+
+
Pigmento
verde
Glucosa
(oxidación)
P. aeruginosa
Oxidasa
(Movilidad +)
Fluorescencia
Identificación de BNNF – Pseudomonas spp.
- - - + - - - - +
- -
FUNDAMENTOS DE LA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA
La identificación fenotípica bacteriana se basa fundamentalmente
en la comparación de las características fenotípicas de
bacterias desconocidas con aquellas de cultivos tipo.
La fiabilidad de la identificación está en proporción directa al
número de características similares.
En Microbiología Clínica, la experiencia y asociación entre el
microorganismo y el sitio y tipo de infección es de gran ayuda
en la identificación preliminar.
Galerías Multi-Pruebas
API (bioMérieux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID
systems y MicroID (Remel), Biochemical ID systems (Microgen), etc.
Video DEMO API
Video DEMO Enterotube
Video DEMO Rapid ID
Sistemas comerciales automatizados
Tarjetas multipruebas cuya inoculación, incubación y
lectura se efectúan de modo automatizado.
También hay paneles en los que, además de los sustratos
para las pruebas bioquímicas, se encuentran diversos
antimicrobianos a distintas concentraciones, con lo que se
realiza simultáneamente la identificación y antibiograma
del microorganismo
MicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix, etc.
Video Demo Vitek 2
Hibridación Fluorescente in situ (FISH)
Figure 1. Diagram of a molecular beacon. The hairpin structure contains a fluorescent
signal molecule on one end and a signal quencher on the other end. If the probe comes into
contact with a PCR product with a complementary nucleic acid sequence, the probe opens
up and binds to the PCR product, thus separating the fluorescence-reported dye
from the quencher, which results in a measurable fluorescent signal.
Hibridación Fluorescente in situ
(FISH)
S aureus PNA FISH: sobre muestras de hemocultivos,
usa hibridizaciòn in situ frente a S aureus 16 S rRNA.
S:100, E:99.4, VPP:99.4 y VPN:100%
Gonzalez Padilla E y col, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 23, 396-8, 2004
Takaashi M et al, 1025-8, 2007
Utilización de PNA FISH para detectar S aureus directo sobre
muestras de hemocultivos fue asociado con reducción de
mortalidad (8 vs 17%) ,reducción de días cama y costos
Tam Ly et al, Therap Clin Risk Man, 4(3), 637-640, 28
Detecciòn ràpida de ESBL en K pneumoniae usando hibridizaciòn
in situ . TAT: 1 hora
Palasubramaian S et al, J Microbiol Methods, 72, 107-9, 2008
DNA Microarrays (Microchips)
DNA Microarrays (Microchips)
MiniVideo
Aplicaciones de Microarrays en
Microbiología Clínica
 Microbial Detection and Identification
 human intestinal bacterial pathogens in human fecal
samples
 identification of respiratory pathogens
 rapid diagnosis of bloodstream infections
 to identify pathogenic yeasts and molds
 Antimicrobial Resistance
 MRSA
 detection of M. tuberculosis strains resistant to rifampin,
isoniazid, kanamycin, streptomycin, pyrazinamide, and
ethambutol
 HIV-1 antiretroviral-drug-resistant profiles
PCR – PCR Múltiple
Multiplex permitió identificar 24 organismos adicionales
Hemocultivo detectó más bacterias que PCR
Ambas técnicas se complementan
Tsalik E et al, JCM, 48: 26-33, 2010
Carver y col estudiaron el impacto clínico de la detección del gen mecA
directo del cultivo (24 hs antes) en pacientes con bacteriemias por S
aureus en dos fases. 64 pac MSSA y 103 con MRSA tratamiento
adecuado tardío se asoció a mayor mortalidad relacionada a infección y
días cama.
Carver P et al , JCM, 46, 2381-83, 2008
Ruimy et al usando triplex PCR directo sobre hemocultivos
diferencia S. aureus de SCN y detecta gen mecA evita uso de
glucopéptidos en 33% de los pacientes.
Ruimy R et al, JCM, 46,2045-51, 2008
PCR en Tiempo Real
La PCR en tiempo real permite detectar los microorganismos
que provocan alrededor de un 90% de las bacteriemias
Pfaller, M.A., et al. Diagn Microbiol Infect Dis 1999;33:283-97.
Kolleff, M.H., et al. Chest (1999); 115: 462-74.
Video Demo LightCycler Roche
Secuenciación
ARNr 16S
 Marcador housekeeping presente en todas las bacterias.
 Familia de multigenes u operones cuya función no se
modifica con el tiempo, con un alto grado de conservación,
y actúa como un marcador eficiente de evolución
(cronómetro molecular ).
 Posee regiones altamente conservadas (primers) y regiones
variables especie-específicas.
 Tamaño adecuado para realizar el análisis de la secuencia
de sus bases.
 Proporciona información útil y rápida sobre identificación
y filogenia mediante la comparación con bases de datos
públicas (GenBank) que contienen un amplio número de
secuencias bacterianas (más de 2 millones !!).
Secuenciación
Otros genes utilizados
 ARNr 16S-23S (ITS = espacio intergénico)
 ARNr 23S
 rpoB (subunidad β de la ARN polimerasa)
 gyrB (subunidad β de la ADN girasa)
 Hps65 (micobacterias)
 recA (genovariedades de B. cepacia complex)
 hsp60 (bacterias, arqueas y eucariotas)
Recomendaciones Cepas a Secuenciar
Cepas con escasa descripción
Cepas con baja frecuencia de aislamiento
Cepas con fenotipos atípicos
Cepas de difícil identificación fenotípica
Cepas de crecimiento lento o fastidioso
Nuevos patógenos
Bacterias de difícil cultivo
Pirosecuenciación
Figure 2. Schematic diagram of a pyrosequencing reaction, in which light is emitted as
each specific base is incorporated into the growing DNA sequence. The light signals are
translated into sequence data. ATP, adenosine triphosphate; (d)XMP, deoxynucleotic
monophosphate; dXTP, deoxyxanthine triphosphate; PPi, inorganic pyrophosphate.
Pirosecuenciación
Metagenómica
Study diversity in environmental microbial communities using the GS FLX and GS
Junior Systems. 454 Sequencing Systems have become the standard for ribosomal
RNA identification (i.e. 16S, 18S, etc.) and whole genome surveys having enabled an
unprecedented view of microbial diversity in such environments as the human gut
and mouth, soil, coral reefs, deep sea thermal vents, drinking water, and much more.
The clonal reads provided by 454 Sequencing Systems enable population
characterization without laborious cloning protocols.
 Analyze the relative abundance of microbial species under varying environmental
conditions
 Discover new genes and make functional predictions in unculturable species
 Perform gene expression analysis and functional annotation within microbial
communities
 Identify novel pathogens in viral outbreaks by sequencing fragments of amplified
RNA from infected individuals
 Take advantage of the long read lengths to generate the most accurate
representation of samples
Video Demo Secuenciador 454 Roche
Video Demo Secuenciador Genoma
Proteómica
La proteómica es el estudio y caracterización del conjunto
de proteínas expresadas por un genoma (proteoma).
Las técnicas de proteómica abordan el estudio de este
conjunto de proteínas y las más usadas se basan en la
electroforesis y en la espectrometría de masas
MALDI-TOF
Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry
(MALDI-TOF MS)
La espectrometría de masas es una técnica analítica que permite analizar con gran
precisión la composición de diferentes elementos químicos al permitir la medición de
iones derivados de moléculas separándolos en función de su relación masa/carga (m/z)
Se basan en la detección de proteínas ribosómicas S y L (2.000 a 20.000 Da). Se asume
que el 80-90% de las señales del espectro de la bacteria son proteínas ribosomales.
MALDI-TOF
Video Demo MALDI-TOF
– La muestra debe estar embebida en una matriz orgánica.
– Como fuente de ionización emplea un láser.
– La separación de los iones se produce según el «tiempo de vuelo».
– El tiempo de obtención del espectro es aproximadamente de un Minuto
Las características principales de estos sistemas son las siguientes:
- Sin procedimiento previo de extracción => Se utiliza directamente
una colonia bacteriana.
– Comparan perfil o huella espectral desconocida frente a las de
bacterias conocidas => Comparación de espectros generados con bases
de datos previas.
– Rapidez de la técnica (aproximadamente 90 microorganismos/hora).
– Identificación a nivel de género y especie, en ocasiones subespecies.
Laboratorio de Microbiología
So…..
Keep smart
Up grade your lab if you can
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Muchas
Gracias