Download Introducción a la Espectrometría de Masa

Introducción a la
Espectrometría de Masa
Algunas aplicaciones de la
Espectrometría de Masa
en biología y biomedicina
Espectrometría de Masa
• La Espectrometría de Masa es una técnica que
permite determinar la masa de moléculas por
medio de la medida de la relación masa/carga
(m/z).
• La medida de masas moleculares involucra la
producción, separación y detección de iones
moleculares en fase gaseosa.
• Cada molécula puede originar iones moleculares
con distinto número de cargas ( y distintas m/z).
• La masa molecular es una propiedad física
fundamental e inalterable de la materia……
Bioespectrometría
• Aplicación de la Espectrometría de Masa al
estudio de bio-moléculas: identificación,
niveles, modificaciones.
• Incluye la combinación de herramientas de la
Bioquímica
(cromatografía,
electroforesis,
bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre
otras) con la Espectrometría de Masa.
Espectrometr
ía de masa y Biolog
ía
Espectrometría
Biología
Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de
otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles
de realizar hasta fines de los años 80’, cuando
aparecieron dos nuevos métodos para producir iones
en fase gaseosa:
•
Matrix
Assisted
Laser
Desorption/Ionization
(MALDI), para muestras sólidas
•
Ionización por “Electrospray” (ESI) para muestras
líquidas
Espectrometría de masa: equipos de tipo MALDI-TOF
Espectrómetro de masa MALDI-TOF
Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF
(Applied Biosystems Voyager DE-PRO)
(Applied Biosystems 4800 Analizer)
ESQUEMA:
Instrumento de tecnología MALDI-TOF
plate
Extraction
grids
Laser
Reflector
Timed ion detector
selector
Reflector
Beam
guide
Camera
Pumping
Pumping
Linear
detector
4000 Series MALDI TOF/TOF™ Analyzer Training
Analizador de masa TOF
Aceleración
post-irradiación
láser
Detector
Región de deriva (Tubo de vuelo)
+20 kV
Iones de
masas
diferentes
L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de
manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración .
Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de
masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada
uno se puede usar para calcular su masa.
7
© 2007 Applera Corporation and MDS Inc.
Espectro de masa por MALDI-TOF de péptidos generados por digestión
con tripsina “in gel” de una proteína de membrana de 91 kDa.
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
Elemento
Masa
%
1H
1.0078
99.985
2H
2.0141
0.015
12C
12.0000
98.90
13C
13.0034
1.10
14N
14.0031
99.634
15N
15.0001
0.366
16O
15.9949
99.762
17O
16.9991
0.038
18O
17.9992
0.200
31P
30.9738
100.00
32S
31.9721
95.02
33S
32.9715
0.75
34S
33.9679
4.21
36S
35.9671
0.02
79Br
78.9183
50.69
81Br
80.9163
49.31
Resolución en MALDI-TOF
Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]
1672.917
1672.92
100
3222.3
90
80
% Intensity
70
60
50
Modo lineal
Resolucion: 2467
(FWHM)
40
30
20
10
0
1655.0
1662.2
1669.4
1676.6
1683.8
0
1691.0
Mass (m/z)
Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]
1672.918
100
1.6E+4
90
80
% Intensity
70
60
Modo reflector
Resolucion:8500
(FWHM)
50
40
30
20
10
0
1655.0
1662.2
1669.4
1676.6
Mass (m/z)
1683.8
0
1691.0
Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005]
2xC13
100
90
2093
C13
80
% Intensity
70
60
50
40
C12
30
20
10
0
5725
5729
5733
Mass (m/z)
5737
5741
5745
Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina.
(aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 µl de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)
0
Algunas aplicaciones............
CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR
ESPECTROMETRÍA DE MASA
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de
secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Identificación de dominios
– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs.
enzima
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos
Espectro de masa del citocromo c de caballo
A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico
Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367]
12366.46
100
6.0E+4
90
80
6187.17
70
12583.58
% Intensity
60
50
12326.17
40
30
20
6292.68
12784.48
10
0
5000
7000
9000
11000
Mass (m/z)
13000
0
15000
Mapeo peptídico por EM
(Peptide Mass Fingerprinting/MS)
proteína
intacta
péptidos
enzima
proteolítica
MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS
PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW
EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK
SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE
SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL
LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE
PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK
GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED
HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT
B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido α-ciano hidroxicinámico
Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883]
2.0E+4
1633.82
100
1168.61
90
80
% Intensity
70
60
50
1190.54
40
1212.53
30
20
1046.18
10
0
1000
1170.181213.53
1152.36
1124.52
1230.50
1160
1433.76
1655.59
1296.68
1350.70
1320
1478.82
1480
1631.62
1640
0
1800
Mass (m/z)
Masa Teorica
(Da)
1168.61
1296.71
1350.72
1433.77
1470.68
1478.82
1478.82
1633.81
Masa Medida
(Da)
1168.61
1296.68
1350.69
1433.76
1470.67
1478.82
1478.82
1633.82
Error (Da)
Residuos
Secuencia
0.00
0.03
0.03
0.01
0.01
0.00
0.00
0.01
28-38
28-39
89-99
26-38
40-53
89-100
88-99
9-22
TGPNLHGLFGR
TGPNLHGLFGRK
TEREDLIAYLK
HKTGPMLHGGLFGR
TGQAPGFTYTDANK
TEREDLIAYLKK
KTEREDLIAYLK
IFVQKCAQCHTVEK
RESUMEN:
Niveles de información………
en la caracterización de proteínas por MS.
• medida de masa de una molécula entera
• medidas de masas en
mapeo peptídico
• secuenciado de péptidos
por MS/MS
1 valor experimental
5-20 valores experimentales
más de 100 valores experimentales
…mejora en cantidad y calidad de la información
El Proteoma es dinámico
Estado metabólico
Drogas
Condiciones ambientales
Interacciones
Proteína-Proteína
Proteoma
Estadío de Desarrollo
ADN
Genoma
Control transcripcional
Estrés
Control traduccional
y post-traduccional
mARN
Análisis por electroforesis 2D
Identificación de proteínas
1000
m/z
Mass (m/z)
1500
2000
Extracción de péptidos
y análisis de masas
Separación en gel 2D
Selección de la muestra
Tratamiento con una enzima proteolítica
Búsqueda en banco de datos
Protein Prospector Homepage
MS-Fit Search
ProFound Search for Protein
Identification
Set Kingdom
Enzyme used
for digestion
Cys Modificatition
(reduced, alkylated)
Set Charge state
Search Result after Peptide Mass Fingerprinting
The result showed that in fact
the spot contained 2 proteins.
Both were identified,
Vimentin and Tubulin.
Up to 5 proteins in the same spot
could potentially be identified.
Note that the genome
of CHO-cells (hamster)
is not sequenced.
Therefore the most
homologues proteins of
related species are
scored.
Detailed Search Results View
Identificación de una proteína
regulada por hierro en membrana
externa de Sinorhizobium meliloti
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
FIG. 1. SDS-PAGE analysis of S. meliloti 242 outer membrane proteins. S. meliloti 242 was grown in M3 medium
containing 37 µM FeCl3 (lanes 1 and 2), 500 µM EDDHA (lanes 3 and 4), 500 µM EDDHA and 4 µM hemoglobin
(lanes 5 and 6), or 500 µM EDDHA and 16 µM hemin (lanes 7 and 8). Outer membrane proteins were extracted as
described in the text, electrophoresed in a 10% acrylamide gel, and stained with 0.1% Coomassie brilliant blue. The
bracket indicates the position of IROMPs. The positions of molecular mass standards (in kilodaltons) (lane 0) are
indicated on the left. St, standards; Hb, hemoglobin; Hm, hemin.
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
FIG. 3. Mass spectrum of the 91-kDa outer membrane protein
digested in-gel with trypsin obtained by MALDI-TOF mass
spectrometry.
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
Identificación de proteínas por MALDI-TOF
• Proteína aislada
• Proteína identificada por la masa de los péptidos
(PMF), generados por un método específico:
– Enzimático o químico
• Para su identificación, la secuencia de la
proteína debe estar en una base de datos
• La identificación es probabilística: según criterios
estadísticos
Caracterización de proteínas por
espectrometría de masa
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de
secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Identificación de dominios
– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs.
enzima
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos
Identificación de Proteínas de Células Huésped en
materia prima del Factor G-CSF
Pureza/SDS-PAGE/ GCSF
36
29
24
Pureza/HPLC/GCSF
A
20
B
14
B
A
Identificación de Proteínas de Células Huésped en
materia prima del Factor G-CSF
28.952 Da
muestra A
A
B
Electroforesis 2D de la materia prima
Espectro de masa por MALDI-TOF,
del contaminante proteico (spot A en
gel 2D).
Identificación de Proteínas de Células Huésped en
materia prima del Factor G-CSF
Voyager Spec #1=>BC[BP = 1286.8, 20135]
0
867.0
2021.94
1414.87
1297.67
10
1242.66
20
1086.56
30
1029.53
50
40
1740.84
60
988.45
% Intensity
70
1191.6
1516.2
1840.8
2178.06
80
2083.09
90
2.0E+4
1783.87
100
1351.78
1286.77
Digestión tríptica: muestra A
2165.4
Mass (m/z)
#/13(
Mea
%)
Data
%
MOW
% n
Mass
Tol
Co
SE
TIC Err
es
Da
v
Score
Da
Matc
hed
4.709e 13 60. 100.
0.03
1
0.011
+06 (100) 0 0
58
2
0.03
4.709e 13 60. 100.
0.011
2
58
+06 (100) 0 0
2
0.03
3.603e 13 55. 100.
0.011
3
58
+06 (100) 0 0
2
MSDigest
Index #
Protein
Accessi
MW
on #
(Da)/pI
93727
28949/5.5
377118
28950/5.3
590830
Species
Protein Name
999812 UNREADABL gi|999812|pdb|1BTL| Beta-Lactamase Tem1
(E.C.3.5.2.6)
M E
gi|9257166|pdb|1CK3|A Chain A, N276d
925716 UNREADABL
Mutant Of Escherichia Coli Tem-1 Beta6 E
Lactamase
EXPRESSION
299595
VECTOR
beta-lactamase
31530/5.7
9M
PPK113
Realizado por la Unidad de Bioquímica Analítica del IIBCE/ Laboratorios CLAUSEN
0
2490.0
Caracterización de proteínas por
espectrometría de masa
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de
secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Identificación de dominios
– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs.
enzima
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos
Identificación de Modificaciones
Postraduccionales
Fosforilación?
NO2?
Common Protein Post-Translational Modifications
∆ (monoisotopic)
-17
-2
-0.98
0.98
2
14
16
28
42
43
44
71
79.9568
79.9663
modification
pyrrolidone carboxylic acid
disulfide formation (thiol oxidation)
amidation
Some modifications are natural.
deamidation
Many are the result of handling.
disulfide reduction (thiol formation)
methylation
oxidation (e.g. sulfoxide formation)
formylation
acetylation
disulfide vs. two thiols
carbamylation
phosphate group vs. sulfate group
γ-carboxyglutamic acid
good mass spectrometer needed
Cys-propionamide
especially with large molecules
sulfation
phosphorylation
M. R. Wilkins et al., J. Mol. Biol. 289: 645-657 (1999).
Delta Mass at http://www.abrf.org
Identificación de sitios de
fosforilación
PknB de Mycobaterium tuberculosis
1
51
101
151
201
251
301
GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH
RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE
TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ
NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVTQTAAVIGTAQ
YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR
EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP
PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR
1
51
101
151
201
251
301
GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH
RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE
TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ
NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVpTQpTAAVIGTAQ
YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR
EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP
PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR
Caracterización de proteínas por
espectrometría de masa
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de
secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Identificación de dominios
– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs.
enzima
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos
2-D DE T. cruzi- RESULTADOS PRELIMINARES
A)
pH 3
10
B)
pH 3
10
Epimastigotes CL-Brener (vista parcial) A) y B) tratados y
no tratados con H2O2 respectivamente
ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA
Proteína
Enzima
Mezcla de péptidos
Espectrómetro de masa
Masa de los péptidos
Búsqueda en bancos de datos;
Identificación de la proteína
Alternativamente,
secuenciación de
cada péptido
Verificación de secuencia y
detección de modificaciones
postraduccionales
.…MS/MS
MS/MS
Mezcla de péptidos
1 péptido
seleccionado
para MS/MS
+
MS/MS
+
+
+
+
+
Espectro MS
Espectro MS/MS:
masa de los
fragmentos
b ions
y ions
Del Genoma al Proteoma
Secuencia
ADN
mARN
Control
Transcripcional
Proteínas
Control
Traduccional
Proteínas
Funcionales
Control
post-traduccional
Algunas propiedades VITALES de las
proteínas no pueden ser predecidas de su
secuencia de ADN
Proyectos de Proteoma Humano
~40,000
Proteinas
~>1,000,000
Proteinas
Variantes
~>5,000,000
Complejos?
APLICACIONES DE LA
PROTEOMICA
Estudios de la funcion y organización
Molecular de la celula
Descubrimiento de nuevas
actividades
Biologicas y drogas
Investigaciones en
Fisiopatologia
Predecir respuestas
individuales a
drogas
Marcadores para diagnostico de
enfermedades
Estudio de modo de accion de drogas
y toxicidad
Descubrimiento de nuevas moleculas
blanco de drogas
Linear Detector
4800 MALDI
TOF/TOF™
Analyzer
Schematic
2-Stage Mirror
Lens 3
Mirror Deflectors
Metastable
Suppressor
Collision
Cell
Source 2
CID Lens (Lens 2)
Decel Stack
Lens 1
Camera
Laser
Decel Deflectors
Lamp
TIS
X2,Y2 Deflectors
Attenuator
Reflector Detector
X1,Y1 Deflectors
Sample Loading
Chamber
Mirrors
Source 1
Source 1 Lens
Sample Plate and Stage
Tubo de
vuelo
4-25 kV
Detector
Los iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de
manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración.
Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de
masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada
uno se puede usar para calcular su masa.
Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF
(Applied Biosystems 4800 Analizer)
Time-of-Flight Mass Analyzer
Source
Acceleration
Detector
Drift Region (Flight Tube)
+20 kV
Ions will separate according to their mass-to-charge ratios:
light ions accelerated to a higher velocity that heavy ions.
The lighter ions strike the detector before the heavier ions. The time
of flight (TOF) can be used to calculate the mass-to-charge ratio.
• Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA).
• Datos técnicos:
• Posibilidades de operación:
- Modo lineal
- Laser de nitrógeno (λ 337 nm)
- Modo reflector
- Voltaje de aceleración: hasta ± 25 kV
- "Delay extraction" (DE)
- Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector)
- Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10-8 Torr) - "Post Source Decay“ (PSD)
- "Collision-Induced Dissociation“ (CID)
- Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kDa
- Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm)
- Sensibilidad (péptidos): subpicomolar