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Tema 5
Plásmidos
• Su existencia en la Naturaleza. Importancia
en la Transferencia Horizontal de genes en
comunidades microbianas. Ocurrencia y
abundancia en arqueas, levaduras y
bacterias. Ventajas adaptativas.
• Tipos: Circulares y Lineales. Modos de
replicación.
• Se conocen tres mecanismos generales por
los que las bacterias pueden transferir
lateralmente información genética:
• conjugación,
• transformación
• y transducción
• Estos mecanismos sexuales, o mas bien
parasexuales, difieren en muchos aspectos de los
mecanismos sexuales de los eucariontes:
• Son unidireccionales, de un donador a un receptor;
se transfiere solo una fracción del genoma, que
puede involucrar desde algunos pares de bases a
cientos de kilobases, dependiendo principalmente
del mecanismo de transferencia;
• La transferencia de genes ecológicamente
adaptativos permite la diversificación y
especiación bacteriana,
• Por lo que estos eventos tienen un gran impacto
sobre la evolución de las poblaciones de estos
organismos.
• Esta es una de las grandes diferencias y ventajas
del intercambio genético en bacterias con
respecto al de los eucariontes; las bacterias no
tienen que “reinventar la rueda”:
• La transferencia de genes, operones e islas
genómicas
crean
nuevos
linajes
con
combinaciones únicas que pueden explotar
nuevos nichos y generar nuevas especies o
ecotipos a través de uno o unos pocos eventos
evolutivos
• La transferencia horizontal de genes (HGT, por
sus siglas en inglés) consiste en la transmisión del
genoma o parte de éste de un organismo a otro
que no forma parte de su descendencia.
• Por el contrario, el tipo de transferencia habitual,
o transferencia vertical de genes, es la que se da
desde un ancestro a su descendencia, como ocurre
por ejemplo en la reproducción sexual.
• Desde hace tiempo se conoce la importancia del
proceso de HGT en procariotas, como en el caso
de la conjugación bacteriana, con la mediación de
plásmidos.
• Estos procesos son muy importantes como fuente
de variación genética, equivalentes en cierto
modo a la recombinación cromosómica de los
organismos con reproducción sexual.
• Sin embargo, la HGT en bacterias va más allá, dado
que también se produce transferencia genética entre
especies alejadas filogenéticamente,
• Lo cual permite la formación de genomas
extraordinariamente heterogéneos y dinámicos.
¿Qué es un Plásmido?
• El plásmido es una molécula circular de DNA que
tiene una existencia independiente en la célula.
• Los plásmidos son muy abundantes en las bacterias,
y mas escasos en las células eukariotas.
• Llevan en su seno varios genes, a menudo
responsables de características útiles para la célula.
• Por ejemplo, la capacidad para soportar
concentraciones tóxicas de un antibiótico, como
el cloranfenicol o la ampicilina.
• Son elementos genéticos que se replican
independientemente del cromosoma.
• Se encuentran dentro de la célula.
• Existen varios tipos de plásmidos.
• En E. coli, se han aislado mas de 300
• Estos genes se emplean para seleccionar aquellas
células que tienen un plásmido de las que no lo
tienen.
• La mayoría de los plásmidos tienen una
secuencia que sirve como orígen de replicación.
Esto le permite replicarse independientemente.
• Los plásmidos mas pequeños emplean la
maquinaria celular para su duplicación y
mantenimiento.
• Otros son capaces de integrarse en el cromosoma
principal durante generaciones (episomas).
Luego se pueden volver a escindir.
• Están presentes normalmente en bacterias, y en
algunas ocasiones en organismos eucariotas como
las levaduras.
• Su tamaño varía desde 1 a 250 kb.
• El número de plásmidos puede variar, dependiendo
de su tipo, desde una sola copia hasta algunos
cientos por célula
Tamaño y número de copia
• El tamaño de un plásmido es variable. (1 kb-250kb).
• Como vector, es deseable que su tamaño no sobrepase
10kb.
• Ejemplos:
• PUC8
2,1kb
E. coli
• ColE1
6,4kb
E. coli
• F
95 kb
E. coli
Tamaño
• Existe una amplia gama: hasta plásmidos muy
grandes (ciertos plásmidos de Pseudomonas
tienen 500 kb).
• Incluso existen “megaplásmidos” en ciertos
Rhizobium que llegan a tener 1600 kb.
Características de los
Plásmidos
•
•
•
•
Replicación autónoma
Estabilidad
Incompatibilidad
Transferencia:
–Plásmidos conjugativos
–Plásmidos no conjugativos
• Integración (Episomas)
• Confieren distintas propiedades fenotípicas
Tipos de plásmidos
• P. conjugativos: codifican pili sexuales y proteínas
necesarias para la transferencia de DNA.
• P. R (resistencia a los antibióticos, mercurio).
• P. Producción de bacteriocinas y antibióticos.
FENOTIPOS Y FUNCIONES
DETERMINADOS POR
PLÁSMIDOS
• Plásmidos de virulencia: producción de toxinas,
factores de penetración en tejidos, adherencia a
tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias
patógenas.
•
.
• Plásmidos de virulencia: producción de toxinas,
enzimas, tumores. (E. coli O157 Toxina shiga)
• Plásmidos de funciones fisiológicas:
Utilización de urea,
Fermentación de carbohidratos.
Producción de pigmentos.
• Producción de sideróforos
secuestrar iones Fe3+).
(quelatos
para
• Utilización de hidrocarburos, incluyendo algunos
cíclicos recalcitrantes (degradación de tolueno,
xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas.
• Inducción de tumores en plantas (plásmido Ti de
Agrobacterium tumefaciens).
• Interacciones simbióticas y fijación de nitrógeno en
ciertos Rhizobium
Número de copias
• Cada tipo de plásmido tiene un número medio de
copias por célula característico.
• Por regla general, los grandes plásmidos tienen una
o dos copias por célula (plásmidos con control
estricto de la replicación).
• Mientras que los pequeños suelen estar presentes
como varias copias (>10), denominándose
plásmidos de control relajado.
• E coli, posee un plásmido conjugativo llamado
Factor F:
- Capacidad para sintetizar pili.
- Movilización del DNA para su transferencia.
- Alteración de receptores de la superficie de la
célula.
Conjugación
• Los plásmidos se pueden clasificar en dos grupos:
conjugativos y no conjugativos.
• Los conjugativos tienen la capacidad de promover la
conjugación.
• El plásmido F de E. coli es capaz de integrarse en el
cromosoma.
• Cuando la conjugación tiene lugar en esta situación, parte
del cromosoma se transfiere a la cepa F-.
• Solo los plásmidos conjugativos tienen la
capacidad de ser transferidos en la conjugación.
• A veces, en presencia de un plásmido conjugativo,
otro plásmido puede transferirse.
• A este mecanismo de conjugación se debe el
surgimiento de la resistencia bacteriana a los
antibióticos
Conjugación en Gram negativos
Conjugación en Gramnegativos
1. Formación de
pares efectivos
2. Transferencia
de ADN
F+
F-
F+
F-
F+
F+
F+
F+
− Origen de
transferencia
− Replicación
cadenas ADN
Conjugación: Importancia
• Bacterias Gram −Resistencia antimicrobianos
−Diseminación rápida
• Bacterias Gram +
−Producción de factores de adherencia
−Resistencia antimicrobianos
Compatibilidad
• Plásmidos distintos pueden encontrarse en una
misma célula.
• En E. coli se han descrito hasta siete tipos
distintos coexistiendo en una célula.
• Sin embargo, para ello, tienen que ser
compatibles.
• Algunos plásmidos se pierden rápidamente en
presencia de otros, y por tanto, hay una serie de
grupos de incompatibilidad.
• Las bases de la incompatibilidad no se entienden
bien, pero parecen tener que ver con la replicación.
INCOMPATIBILIDAD ENTRE
PLÁSMIDOS Y GRUPOS DE
INCOMPATIBILIDAD
• Cada plásmido, dentro de la amplia diversidad de los que
se conocen, se suele clasificar según el grupo de
incompatibilidad al que pertenece.
• Los grupos de incompatibilidad se suelen denominar con
las siglas Inc seguidas de una letra mayúscula (por
ejemplo IncP, IncFII, etc).
REPLICACIÓN
• Modelo de replicación en  (theta):
• Separación de las dos cadenas en el sitio oriV, creando una
estructura que se parece a la letra griega  (theta).
• La replicación es unidireccional (sólo hay una horquilla de
replicación , que avanza a lo largo de la molécula, hasta que vuelve
al sitio oriV, en el que las dos moléculas hijas se separan).
• Otros plásmidos se replican en  por un modelo bidireccional (dos
horquillas de replicación de sentidos opuestos, que se encuentran
cerca de la mitad de la molécula).
•
La replicación en  es frecuente en plásmidos de bacterias Gramnegativas.
Modelo de replicación en σ (sigma), o
modelo del círculo rodante
• Una de las dos cadenas es rota a nivel de oriV, de modo
que el extremo 3’ suministra el cebador para la replicación
de la “cadena adelantada”.
• La cadena desplazada (cadena “menos”) funciona como
cadena retrasada (“lagging”) y debe ser replicada a partir
de sitios de cebado especiales.
• Este tipo de replicación es frecuente en plásmidos de
bacterias Gram-positivas.
El mismo tipo de sistema de control
del número de copias y de reparto
• El número total de copias nA+nB = N (determinado por
el sistema de control) no varía,
• Pero por fluctuaciones aleatorias en el reparto, algunas
células heredan más copias de uno de los plásmidos que
del otro, y tras varias generaciones aparecen células
carentes de uno o del otro plásmido (nA = 0 y nB = N, o
viceversa).
• Cada plásmido contiene al menos una secuencia de
ADN que sirve como un origen de replicación u
ORI (un punto inicial para la replicación del
ADN),
• Lo cual habilita al ADN para ser duplicado
independientemente del ADN cromosomal.
• Los plásmidos de la mayoría de las bacterias son
circulares, pero también se conocen algunos
lineales, los cuales reensamblan superficialmente
los cromosomas de la mayoría de eucariotes.
Vectores de clonado
• Plásmidos, fago Lambda, cósmidos, y
cromosoma artificial de levadura (YAC).
• Un típico vector de clonado (Modelo de
clonado)
• Contiene un sitio de policlonado( polilinker),
• Un gen de resistencia a Ampicilina (ampr) como
marcador
• Y un origen de replicación (ORI).
• Utilizando un plásmido se inserta y liga un
fragmento con un gen de interés.
• Capacidad de almacenaje: hasta 25 Kb.
• Los plásmidos se utilizan en ingeniería
genética como vectores de clonado por la
facilidad con la que se manipulan.
• Un vector plasmídico se fabrica a partir de
plásmidos naturales cuyos segmentos
innecesarios son eliminados, agregándose en
cambio secuencias esenciales
• Para clonar una muestra de la ADN, se debe
utilizar la misma enzima de restricción para cortar
el vector y la muestra de ADN.
• Por lo tanto, un vector contiene generalmente una
secuencia (polylinker) que pueda reconocer varias
enzimas de restricción para poder utilizar el vector
para clonar diversos fragmentos de ADN.
Características generales de los vectores de expresión:
- promotor
- terminador
- sitio de unión a ribosoma
- sitios único de corte de enzimas
- marcadores genéticos
- orígen de replicación
- tamaño pequeño
Vectores basados en plásmidos
pBR322
• Nomenclatura: pBR322.
• Tamaño: 4363pb. Capacidad: hasta 10.000
• Contiene dos marcadores de resistencia:
Amp y Tet.
• Es un plásmido multicopia. Pueden
encontrarse hasta 15 copias por célula.
Utilizando cloranfenicol, puede aumentarse
hasta 1000-3000.
El mapa de pBR322
pUC18: un plásmido avanzado
• Desciende de pUC8, a su vez de pBR322.
• Conserva el origen de replicación y ampR.
• La secuencia del marcador se ha alterado para
eliminar los sitios de restricción.
• Estos se encuentran insertos en la secuencia de
lacZ.
• Ventajas: 500-700 copias/célula. Identificación
directa empleando X-gal. Múltiples sitios para
clonar (sitios de restricción).
Mapa de restricción de pUC18
El plásmido pGEM3
Vectores basados en M13
• El genoma de M13 consiste de 6,4Kb, de los que
la mayoría corresponde a 10 genes
empaquetados.Todos son esenciales.
• Queda una región intergenica de 507 nucleótidos
que tiene el origen de replicación: ori.
• A pesar de estas dificultades, el hecho de que este
vector se encuentra en forma monocatenaria lo
hace muy atractivo para procesos de clonaje.
Estrategias para desarrollar vectores
basados en M13
Los vectores MP13mp contienen el gen LacZ.
Los más modernos (mp7) tienen insertado un polilinker
“simétrico”.
O en su caso, polilinkers que permiten incorporar
fragmentos con extremos cohesivos distintos,
asegurando la orientación de la inserción (mp8/9).
Existen otros vectores mixtos con plásmidos: phagemids
o fagómidos.
CLONACIÓN MOLECULAR
Aislamiento e incorporación de un
fragmento de DNA dentro de
un vector en el que puede
replicarse
Aislamiento del gen de interés
Inserción en un vector de clonación
Transformación de la célula huésped
Purificación y análisis del ADNc
Expresión del ADNc y análisis de la proteína
Selección de recombinantes empleando la
técnica de la a complementación
X-galactosa incorporado en la placa de cultivo permite la
selección de las colonias que han incorporado el plásmido
con el inserto:
- Colonias con inserto
Se inactiva el gen LacZ, no hay a complementación
 Se observan colonias blancas
-Colonias sin inserto
No se inactiva el gen LacZ, hay a complementación
 Se observan colonias azules
Que representan las colonias blancas?
Que representan las colonias azules?
Que colonias utilizaría?
Si nos olvidamos de colocar ATB en la placa que resultado
obtendriamos?
¿Qué pasó???????????????
Tres formas de plásmidos en los
geles
Bibliotecas genéticas o genotecas
• Son colecciones de vectores que colectivamente
contienen todos los fragmentos de un organismo.
• Cuantos clones hacen falta para albergar un
genoma?
• N= ln(1-P)/ln(1-a/b)
• P= la probabilidad de que un gen esté presente, a
es el tamaño medio de fragmento y b es el tamaño
total del genoma.
Valores de N: Tabla por especies
Especie
E.coli
S. cerevisiae
Arroz
Humanos
Genoma (pb)
4 x 106
1.8 x 107
5.7 x 108
3.2 x 109
nº clones
de 17kb
820
3225
100000
564000
de 35kb
410
1500
49000
274000
ARCHAEA
BACTERIA
Características:
• Tienen una pared celular que brinda protección a los
procariotas y les confiere su forma característica.
• Algunos procariotas se desplazan mediante flagelos
simples.
• Las endosporas protectoras permiten a ciertas
bacterias soportar condiciones adversas.
• Se reproducen por fisión binaria
• Se especializan en hábitats específicos y
presentan diversos metabolismos.
• Desempeñan muchas funciones que son
importantes para otras formas de vida.
• Algunas bacterias constituyen una amenaza para
la salud humana.
BACTERIA y ARCHAEA
Diferencias
• La rígida pared celular que encierra las células bacterianas contiene
peptidoglicano, pero las paredes celulares de las arqueas carecen de
esta
sustancia
exclusivamente
bacteriana
y
poseen
pseudopeptidoglicano, glicoproteínas o proteína dispuesta en simetría
hexagonal (capa superficial paracristalina-Capa S)
• La estructura y composición de otros componentes celulares como las
membranas plasmáticas, los ribosomas y las ARN polimerasas.
• Las características fundamentales de procesos básicos como la
transcripción y la traducción.
• El grupo más antiguo, las arqueobacterias, constituyen
un fascinante conjunto de organismos y por sus
especiales características se considera que conforman un
Dominio separado: Archaea.
• Fenotípicamente, Archaea son muy parecidos a las
Bacterias. La mayoría son pequeños (0.5-5 micras) y con
formas de bastones, cocos y espirilos.
• Las Archaea generalmente se reproducen por fisión,
como la mayoría de las Bacterias.
• Los genomas de Archaea son de un tamaño sobre 2-4
Mbp, similar a la mayoría de las Bacterias.
• Si bien lucen como bacterias poseen características
bioquímicas y genéticas que las alejan de ellas.
• Por ejemplo: no poseen paredes celulares con
peptidoglicanos
• Presentan secuencias únicas en la unidad pequeña
del ARNr
• Poseen lípidos de membrana diferentes tanto de las
bacterias como de los eucariotas (incluyendo
enlaces éter en lugar de enlaces éster)
• Las arqueas existen en una gran variedad de
hábitats, son una parte importante de los
ecosistemas globales
• Cuatro grupos fisiológicos principales. Son los
halófilos,
• termófilos,
• alcalófilos
• y acidófilos
• Las arqueas, por lo general, tienen un único
cromosoma circular al igual que las bacterias, que
varía en tamaño desde 5.751.492 pares de bases
en Methanosarcina acetivorans,
• El mayor genoma secuenciado hasta la fecha,
hasta 490.885 pares de bases en Nanoarchaeum
equitans, el genoma más pequeño conocido que
puede contener sólo 537 genes codificadores de
proteínas.
• Las arqueas también pueden presentar plásmidos
que se pueden propagar por contacto físico entre
células, en un proceso que puede ser similar a la
conjugación bacteriana.
• Los plásmidos son cada vez más importantes como
herramientas genéticas pues permiten la realización
de estudios genéticos en Archaea
¿Qué es una levadura?
•
•
•
•
Dominio:Eukaria
Reino:Fungi
Principales
Características: Heterótrofos
–
–
–
–
•Unicelulares
•Pared celular de quitina
•Reproducción por gemación
•Metabolismo respiratorio (aeróbico) y fermentativo
• El genoma de levadura contiene un conjunto de
16 cromosomas completamente caracterizados.
• Sus tamaños oscilan desde 200 a 2.200 kb.
• Se calcula que aprox. debe contener unos 6200
marcos abiertos de lectura, o genes.
Plasmidos en levadura
• Se conocen plásmidos en eucariotas.
• Los más conocidos son el plásmido de 2 micras
en levaduras y los plásmidos que transmiten
androesterilidad en el maíz, llamados S1 y S2
presentes en las mitocondrias.
• El gran interés que despertaron estas partículas
fue principalmente por su propiedad para
transmitir la resistencia a los antibióticos y a
sustancias tóxicas
Plasmidos en levadura
• Ciertos vectores (YEP o Yeast episomal plasmids)
contienen el origen de replicación de un plásmido natural de
S. cerevisiae, el plásmido 2 µ (mu, letra griega).
• Tal vector se mantiene en forma de epísomos en número de
10 a 40 copias por célula (integrado al cromosoma).
• Los plásmidos que contienen las secuencias 2 µ son
relativamente estables en la levadura, son transmitidos
eficientemente a la descendencia durante la mitosis.
Plasmidos en levadura
• Los vectores pESC constituyen una serie de vectores
epítopes marcados diseñados para la expresión y el análisis
funcional de genes eucariotas en la levadura S. cerevisiae.
• Estos vectores contiene los promotores GAL1 y GAL10 de
levadura.
Plasmidos en levadura
• YCP ou Yeast centromere plasmids:
Otros vectores (YCP o Yeast centromere plasmids)
contienen un orígen de replicación cromosómico
ARSH4 (Autonomous replicating sequence), secuencia
de replicación autónoma y un centrómero CEN6 : ellos
están presente en número de 1 a 2 copias por célula .
.
Plasmidos en levadura
• Los vectores pYC
Contienen el orígen de replicación para un número
pequeño de copias CEN6/ARSH4 en levadura.
• Se encuentran disponibles con una variedad de
marcadores de selección.
• A los vectores pYC también se los encuentra con una
variedad de epítope tags (marcadores epitopes) para la
detección y purificación de proteínas recombinadas.
Plasmidos en levadura
• El vector pYC2/NT contiene un N-terminal Xpress™6xHis tag,
• Mientras que los vectores pYC2/CT y pYC6/CT
contienen un C-terminal V5-His tag.
• Tanto el vector pYC2/NT como el pYC2/CT poseen el
gen marcador URA3 para su selección.
• El vector pYC6/CT contiene el gen de resistencia al
Blasticidina para su selección en levadura.
Vectores de levaduras
Tipos de vectores
• YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma
• YEp: episomales: ori 2m (alto número de copias)
• YCp: centroméricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)
Promotores
Promoter
Acid phosphatase
Alcohol dehydrogenase I
Alcohol dehydrogenase II
Galctokinase
Metallothionein
Phosphoglycerate kinase
Triose Phosphate isomerase
Status
PHO5
ADH I
ADH II
GAL 1
Cup 1
PGK
TPI
Inducible
Constitutive
Inducible
Inducible
Inducible
Constitutive
Constitutive
21-Expresión proteínas-BM 2009
Vectores episomales
Vectores centroméricos
22-Expresión proteínas-BM 2009
23-Expresión proteínas-BM 2009
Expresión de proteínas en Pichia pastoris
1) Requiere técnicas simples para la manipulación genética (similar a S. cerevisiae)
2) Producción de altos niveles de proteínas (intra y extracelular)
3) Modificaciones post-traduccionales: glicosilación, puente disulfuro, procesamiento
proteolítico.
4) Kits de expresión disponibles.
5) Empleo del gen AOX1
Ampr, oriE: mantenimiento en E. coli
AOX1p: promotor de alcohol oxidasa.
AOX1t: secuencias terminador transcripción.
MCS: sitio múltiple clonado.
HIS4: marcador biosintético.
3´-AOX1
MCS
Diagrama general de un vector P pastoris shuttle
24-Expresión proteínas-BM 2009
Integración del vector de P. pastoris
•Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresión.
•Corte del vector que lleva inserto de interés flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinación
homóloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.)
•Transformación con vector linealizado por electroporación o métodos químicos.
•Cepa huésped: his4 pep4 prb1 (auxotrófica para Histidina y deficiente en proteasas).
Inserto
Inserto
Selección en medio hisCepa resultante aox1=Muts
Metanol: crec lento, alta producción prot.
25-Expresión proteínas-BM 2009
Pichia methanolica Expression System
Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol
oxidasa):
reprimido por glicerol o glucosa
Inducido por metanol
a-factor: péptido señal para secreción de la
proteína expresada.
V5 epítope: para detección con anticuerpos anti-V5
6xHis: tag polihistidina purificación níquel-agarosa.
ADE2: marcador biosintético.
26-Expresión proteínas-BM 2009
MUCHAS GRACIAS