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Un plásmido es una
molécula de ADN circular,
extracromosómico,
bicatenario,
superenrrollado, que se
replica
de
forma
independiente del genoma
y
que
puede
ser
propagado
en
una
población.
• Son pequeños 5,000 -40,000 pb.
• Replicación independiente y rastreabilidad.
• Tienen un único origen de replicación.
• Suelen llevar sólo uno o pocos genes.
• Molécula de DNA circular.
• Pueden conferir ventajas selectivas al organismo
que lo posee.
• Son transmisibles. Resistencia a antibióticos.
Permiten obtener preparaciones de cantidad y
calidad adecuadas que son la base de la mayoría
de los protocolos en biología molecular.
La mayoría toma en cuenta las diferencias
topológicas entre los plásmidos circulares y los
fragmentos cromosomales lineales, y el tamaño
de ambos.
Uno de los métodos más utilizados es el de
desnaturalización alcalina en presencia del detergente
dodecil sulfato de sodio (SDS).
o Puentes de hidrógeno de cadenas complementarias de DNA
se rompen y las cadenas permanecen cercanas entre sí.
o Cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan
completamente.
o Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA
cromosomal se renaturalizan rápidamente, la fidelidad de la
reasociación es diferente para ambas macromoléculas.
o La
renaturalización de los
plásmidos circulares es rápida
debido a que las cadenas están
próximas.
o Las moléculas lineales de DNA
se
renaturalizan
menos
precisamente, formando redes
de DNA o agregados que
pueden ser removidos de la
suspensión por centrifugación.
o El plásmido permanece en la
solución
y
puede
ser
precipitado
con
alcohol
después de que el DNA
cromosomal ha sido removido.
Se han desarrollado un gran número de métodos
para la purificación de DNA plasmídico de
bacterias y todos ellos implican invariablemente
tres pasos:
1. Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora
en medio de cultivo
2. Recogida y lisis de las bacterias
3. Purificación del DNA plasmídico
o Realizar el aislamiento de DNA plasmídico.
o Conocer los fundamentos para la purificación del
DNA plasmídico y su separación de DNA genómico.
• 5mL de medio Luria-Kanamicina
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(30μg/mL)
Solución GTE: 50mM glucosa, 25mM Tris/HCl
pH=8.0 y EDTA 10mM pH=8.0
Solución de lisis: 0.2N NaOH y 1% SDS p/v
3M Acetato de potasio pH=4.8
70% Etanol, Isopropanol
10 N NaOH
10% SDS
1.- Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)
Disuelve la membrana
Se une a las proteínas y las desnaturaliza
2.- NaOH Desnaturaliza DNA (rompe los
puentes de hidrógeno entre ambas
cadenas)
2.- Acetato de potasio/ ácido acético
A) Neutraliza el NaOH (renaturalización de DNA
plasmídico, se restablecen los puentes de
hidrógeno).
B) Convierte al SDS soluble a la forma insoluble PSD
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)
(H2O sol. = 10%)
Dodecil Sulfato de Potasio (PDS)
(H2O sol. < 0.02%)
DNA plásmidico separado de los
contaminantes por centrifugación
El sobrenadante contiene:
- El DNA del plásmido
- Los componentes celulares solubles
Pellet contiene:
- PDS
- Lípidos
- proteínas
- El DNA cromosómico
 Sánchez Nieto, Sobeida. Manual de Prácticas de
Bioquímica Experimental. Facultad de Química,
Departamento de Bioquímica Básica. Semestre
2012-2
 Mendoza DF Prácticas de Laboratorio de Biología
Molecular: Su Aplicación en Genética Básica.
Editorial de Universidad del Rosario, Colombia,
2010. p 58-62
 Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts
& P, Walter. 2007. Molecular Biology of the Cell. 5th.
ed. Garland Science. N.Y., EE.UU