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Transferencia de material
genético II
Aislamiento de plásmidos y
ensayos de restricción
20 Octubre, 2009
Objetivos obtención de plásmido


Conocer los fundamentos para la
purificación del DNA plasmídico y su
separación del DNA
Realizar el aislamiento de DNA
plasmídico
DNA


La extensión de DNA
que tiene cada
organismo no es la
misma.
El DNA a pesar de su
extensión tiende a
formar una
estructura helicoidal
compacta.
Estructura del DNA



Doble hélice
Estabilizada por
puentes de
hidrógeno
En la célula
generalmente
superempacada
o superenrollada
Conformaciones de un
plásmido





Linealizado: Es decir cuando se ha cortado
ambas cadenas del DNA sólo una vez.
Parcialmente linealizado: Cuando se ha
cortado el DNA en una de las cadenas
DNA relajado circular. DNA que no se ha
empacado.
Superenrrolado: Covalentemente cerrado y
muy empacado
Superenrollado desnaturalizado. Parecido
al anterior pero un poco menos empacado
Superenrollamiento
plásmido


Existen varias
conformaciones de los
plásmidos en el estado
superenrollado.
Por lo que pueden
migrar en un campo
eléctrico de manera
muy diferente cada uno
a pesar de tener el
mismo peso molecular
DNA se puede desnaturalizar



El calor, pH, la
concentración de iones,
influyen en la estabilidad
de la doble hélice.
En la desnaturalización
se deshace su estructura
nativa, es decir se
eliminan sus puentes de
hidrógeno.
Dos hebras separadas
que se pueden volver a
unir.
La re-naturalización



El DNA se puede
volver a re-naturalizar.
Hay que hacerlo en
condiciones suaves
para que el apareo de
bases sea el correcto.
De no ser así se
pueden producir
agregados fácilmente
precipitables.
Temperatura de fusión: Tm


Temperatura a la cual el
50% del DNA se
encuentra en la forma
desplegada.
Al monitorear su
absorbancia a 260 nm se
observa que hay un
aumento en está
conforme alteramos o
despegamos la doble
hélice EFECTO
HIPERCRÓMICO
Fundamento


Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas
complementarias del DNA plasmídico circular se rompen,
ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las
cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de
las dos cadenas no se ha perturbado grandemente.
En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA
cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por
enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución y la
fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente
para ambas macromoléculas.
Continuación...


La re-naturalización de los plásmidos circulares
es rápida porque las cadenas se encuentran
próximas. Mientras el DNA lineal se renaturaliza
menos rapidamente formando agregados que se
pueden remover de la suspensión por
centrifugación.
El plásmido permance en solución y puede ser
precipitado con alcohol después de remover el
DNA cromosomal.
Primera
parte
Clase jueves 22 octubre
Segunda
parte
Clase jueves 22 octubre
Clase jueves 22 octubre
Tercera parte

A.
B.
C.
D.
Una vez que se tenga el plásmido
purificado entonces:
Medir la absorbancia a 260 y 280 nm.
Estimar la concentración.
Correr una muestra en un gel de
agarosa
Guardar a –20°C O HACER
RESTRICCIÓN
Obtención del
plásmido



Determinación
de concentración
Determinación
de pureza
Determinación
de integridad
(corrimiento
electroforético)
Vector con inserto
Objetivos de ensayos de
restricción de plásmidos




Conocer el principio de separación y
detección de ácidos nucleicos en geles de
agarosa.
Emplear la electroforesis en geles de agarosa
para visualizar ácidos nucleicos.
Determinar el tamaño de fragmentos de
ácidos nucleicos separados en geles de
agarosa.
Conocer la utilidad de las enzimas de
restricción en la transformación genética y la
biotecnología.
Enzimas de restricción


Las endonucleasas se caracterizan por su
habilidad de reconocer una secuencia
usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y
cortarla específicamente en ambas cadenas
de la molécula de DNA.
Existen tres tipos de endonucleasas, las de
tipo II son las que se utilizan en biología
molecular, debido a que son capaces de
cortar sobre la secuencia que reconocen y a
que han perdido su capacidad de ser
metilasas de DNA.
Restricción

Las endonucleasas se denominan
enzimas de restricción, debido a que
es la forma de defensa de las bacterias
contra la invasión por virus, es decir,
restringen la invasión por el DNA viral.
Las enzimas de restricción reconocen
secuencias palindrómicas

Palíndrome. segmentos de DNA que se
leen igual de derecha a izquierda que
de izquierda a derecha.
Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre científico de la
bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la
enzima proviene de Escherichia coli.
Extremos romos o cohesivos


Algunas enzimas de restricción rompen las
dos cadenas del DNA en posiciones no
simétricas del centro del palíndrome y
producen fragmentos con secuencias
complementarias de una cadena,
denominados extremos cohesivos.
Mientras que otras enzimas cortan
exactamente sobre los dos ejes de simetría,
produciendo extremos romos
¿Para qué extremos romos o
cohesivos?
Las enzimas de restricción son una
herramienta experimental muy importante



Desarrollo de las técnicas para el análisis y la
manipulación de los ácidos nucleicos.
Han sido utilizadas en la eliminación de
secuencias genómicas desde un nucleótido
hasta cientos de bases,
En la introducción de secuencias distintas a
un genoma, lo que ha permitido la
producción de proteínas recombinantes.
Mapas de restricción


Generalmente, un segmento de DNA
contiene secuencias blanco para varias
enzimas de restricción.
Si un fragmento de DNA a analizar es lo
suficientemente extenso, se puede cortar con
una o varias enzimas de restricción, de
manera individual o en mezclas. Un diagrama
de una molécula de DNA en donde se
muestran los sitios de corte de las enzimas
de restricción se denomina mapa de
restricción.
Usos de los mapas de
restricción

El análisis de los mapas de restricción
constituyen una importante herramienta
para localizar secuencias de bases
específicas en un cromosoma y para
estimar el grado de diferencias entre
cromosomas relacionados.
Vector

Sitio múltiple
de clonación
Usos de las enzimas de
restricción
Identificación de muestra
Ensayo de restricción

1.5 h
incubación de
DNA con 2
enzimas: NdeI y
BamHI.
Clase jueves 22 octubre
Ensayo de restricción
Enzima de
restricción
1 uL NdeI
1 uL BamHI
E1
E2
+
+
+
Clase jueves 22 octubre
Continúa..
Incubar a 37°C por 1.5 h.
Añadir 0,5 μl de RNasa (1 μg/ml)
Incubar 30 min a 37°C.
Guardar muestra a -20°C
Clase del Jueves 29 de Octubre:
Fase A
1. Preparación de un gel de agarosa
2. Preparación de muestras
3. Corrimiento electroforético: Gel de agarosa
4.
5.
6.
con bromuro de etidio (aprox 45 min).
Visualización del gel en UV.
Fotografía del gel.
Comparación con las bandas del marcador
de peso molecular
Preparación de un gel de
agarosa
Migración en gel de Agarosa


En soluciones alcalinas, los fosfatos de los
nucleótidos
se
encuentran
cargados
negativamente, entonces al imponer un
campo eléctrico, estas moléculas migran
hacia el electrodo positivo o ánodo.
Cuando la migración toma lugar en un gel,
las moléculas de DNA se separan de acuerdo
a su tamaño, en donde las moléculas
pequeñas se mueven más rápidamente a
través del poro del gel que las más grandes.