Download Descargar Actualizacion congreso AACR_Javier Gomez

Javier Gómez Román
Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Santander
Barcelona, 11 Junio 2015
Un procedimiento de análisis molecular
Una extracción simple de sangre periférica
del paciente
Extracción de ácidos nucleicos
Identificación de las dianas moleculares
deseadas
3
2
PRIMARY
TUMOR
1
Biomarcadores
susceptibles de ser
detectados en sangre
o Ácidos nucleicos
circulantes (cfDNA,
miRNA)
o Proteínas libres o
receptores celulares
o Células tumorales
circulantes (CTCs)
Facilitar el desarrollo de la medicina de precisión a
través de biomarcadores circulantes
La sangre es un material fácilmente accesible en
comparación con la biopsia
Predicción:
o En 2-5 años: Los tests de sangre estratificarán a los pacientes
para la medicina personalizada secuencial
o Detectarán recidivas tempranas e identificarán mecanismos de
resistencia a fármacos
o Serán lo suficientemente sensibles como para permitir el
diagnóstico precoz
Están listos para sustituir al gold standard (biopsia)
En 2014 Astra-Zeneca obtiene la aprobación para
uso de Iressa en pacientes tras determinación en
biopsia líquida por método de Qiagen
cfDNA: Monitorización
miRNA circulante: Reproducibilidad, sensibilidad,
estandarización
CTCs: Heterogeneidad, Investigación
Existe discrepancia entre el número de CTCs y la
cantidad de cfDNA en sangre
o Una célula humana contiene 6 pg de ADN. Hay unos 17 ng de
ADN por ml de plasma en pacientes con cáncer avanzado
o Si las CTCs fueran la fuente primaria de cfDNA debería haber
unas 2000/3000 células por ml de plasma
o En realidad hay menos de 10 CTCs por 7,5ml de sangre
o 100-10.000 veces más material genómico en cfDNA comparado
con el de CTCs
o El cfDNA se encuentra muy fragmentado
El DNA libre circulante (ccfDNA) fue descubierto
en 1948 por Mandel y Metais
Diagnóstico prenatal*, enfermedades
autoinmunes, sepsis o IAM
Hay circunstancias que elevan el contenido de
cfDNA como el ejercicio físico, el embarazo y las
enfermedades autoinmunes
*Cuidado con falsos positivos por análisis de DNA
somático de células tumorales en trisomías
Células malignas y células no
malignas
Apoptosis, Necrosis,
Eliminación activa, Fagocitosis,
Descamación
cfDNA derivado de tumor
puede suponer 50% de todo el
cfDNA (Mol Oncol 2014;8:927)
Nucleosomas, Cuerpos
apoptóticos, Unido a
membrana
DNA, RNA, miRNA
Mutaciones y
polimorfismos, análisis de
microsatélites, metilación,
alteraciones en número de
copias
106 pacientes con colorectal metastásico
Muestras de tumor y plasma
103 de tumor y 98 de plasma (excluyen 8 de
plasma por baja concentración de cfDNA)
Analizan 95 en paralelo para mutaciones de exón
2 de KRAS y BRAF
KRAS
Sangre
Mut
WT
BRAF
Mut
WT
Tumor
Mut
36
3
Mut
5
0
WT
1
55
WT
0
90
Sensib 92%
Espec 96%
Thierry Nat Met 2014
Las concentraciones de DNA
son diferentes en pacientes
con carcinoma metastásico
que en individuos sanos
La concentración de DNA
mutado es factor pronóstico
al igual que el índice de
fragmentación
Existe emergencia de
mutaciones en
pacientes wt con
tratamiento específico
Los pacientes
refractarios a
tratamiento se
confirmaban como
mutados
Baja concentración de DNA.
o Se necesitan volúmenes mayores de sangre (10-20ml)
o La vida media del AND libre es corta (<1.5 horas)
Manipulación y almacenamiento de las muestras crítico
o Puede existir ADN de células de línea hematopoyética si la sangre no está
bien estabilizada (Aumento del “fondo” no tumoral)
o Pueden existir mutaciones en células de línea germinal que no sean
deletéreas. Comparación con células germinales en el caso de secuenciación
de exoma
Estandarización en los métodos de extracción
o DNA muy fragmentado
Diana
Seq
IntPlex
Single locus
Beamng
TAmSeq
NGS
WGS
Bases
examinadas
1-10
1-10
1-10
104
103-108
108
Sens
<0,01%
<0,1%
<0,1%
0,2%
1%
10%
Coste $
100
100
500
1000
1000
3000
Tiempo
2 días
2 días
6-10 días
2 semanas
1 mes
2 meses
Hospital Vall d’Hebron
Líquido cefalorraquideo en tumores cerebrales
primarios y metastásicos
o El DNA circulante en LCR es más abundante que en plasma en el
caso de tumores de SNC
o Se puede caracterizar el DNA libre en LCR mediante NGS
permitiendo análisis complejos
o La concentración fluctua en respuesta a cambios en el ambiente
tumoral. Permite la monitorización en carcinomatosis meníngea
¿Por qué NGS?
Para navegar por la
tormenta perfecta de la
genómica del cáncer, el
diagnóstico y la terapia
de precisión
Panel de 91 mutaciones en 8 genes
o EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, ERBB2, PI3K, MEK1, AkT
o Seis multiplexed cada una con 10 ng (total 60 ng)
Análisis multiplex de tamaños para deleciones e
inserciones en exón 19 y 20 de EGFR y exón 20 de
ERBB2
FISH para ALK
FISH para RET/ROS1
Panel clínico del MSKCC en
Adenocarcinoma de pulmón
El adenocarcinoma de pulmón es el ejemplo
perfecto de porqué necesitamos plataformas
multimarcador
o Escasez de material
o Necesidad de múltiples técnicas
o Problemas para conseguir material tisular
PCR
Genoma
Fragmentos enriquecidos
3 GB
<1% del genoma
Captura de
híbridos
Next Gen Seq
Mutaciones
Indels
Fusiones
Ganancias
Pérdidas
*Sólo con captura de híbridos
MSK-IMPACT
Cheng D et al. MSK-Impact. A Hybridization capture-based next-generation sequencing
clinical assay for solid tumor molecular oncology.
Journal of Molecular Diagnostics.2015 May;17(3):251-64.
Michael Berger
MSK- IMPACT
Detección de alteraciones tratables en
pacientes con cáncer avanzado candidatos
para terapia de precisión en ensayos
clínicos
Secciones de tejido fijadas en formol e
incluidas en parafina
Consentimiento informado
MSK- IMPACT
Tiempo necesario para el análisis 2-3 semanas
De manera óptima se requiere tejido normal
pareado con el tumoral para evitar considerar SNPs
como mutaciones patogénicas
La extracción de ADN a partir de tejido parafinado
o Más del 10% de células tumorales
o 100 ng de ADN
Fuente de ADN normal
o Sangre (5-10 ml tubo malva)
o Bloque con tejido normal
MSK-IMPACT
Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer
Targets
Aplicaciones clínicas
o Selección de terapias personalizadas basadas en perfil molecular
o Seleccionar pacientes para ensayos clínicos
o Clarificar diagnóstico y pronóstico
Aplicaciones de investigación
o Descubrimiento de genes driver en tipos tumorales poco frecuentes
o Identificar nuevos biomarcadores
o Definir marcadores de progresión, resistencia a fármacos
o Definir los efectos de mutaciones concurrentes
MSK-IMPACT
Comité de selección de genes
o Anatomía Patológica, Oncología médica y radioterápica, Biología
computacional
Panel de 341 genes (exones)
33 intrones de 14 genes susceptibles de reordenamiento
(ALK, BRAF, EGFR, ETV6, EWSR1, RET, ROS1, TMPRSS2,
NTRK1, PAX8, FGFR2, FGFR3, NUT, BCL2L11
Promotor del gen de la telomerasa (TERT)
Múltiples controles
Sensibilidad 2% para hotspot
MSK-IMPACT
Genes importantes desde el punto de vista
asistencial
AKT1, ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, FGFR2, FGFR3,
GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT,
KRAS, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, TP53
MSK-IMPACT
125 casos / semana
Satisfactorio,
85
Celularidad
insuficiente,
2.5
ADN
insuficiente,
7.3
Fallo de
técnica, 4.7
Algunos datos…
Media de mutaciones por
caso: 6 (mediana 3)
o El gen mutado más
frecuentemente TP53
Nuevo enfoque para
detección de amplificaciones
génicas (coamplificaciones)
Detección de nuevas
mutaciones driver
Comparación con TCGA atlas
MSK - IMPACT
TCGA
Tumores recidivantes o metastásicos,
frecuentemente tratados
Tumores no tratados
Tejido fijado en formol e incluido en
parafina (celularidad 10-20%)
Tejido de alta calidad congelado con
celularidad >50%
Secuenciación con profundidad de
lectura >500x
Secuenciación standar de exoma a
100-200x
Mejor detección de mutaciones
subclonales
Mayor espectro de datos
Mejor detección de alteraciones en
número de copias y reordenamientos
estructurales
Datos limitados
Material limitado para otros estudios
http://www.cbioportal.org/index.do
Ensayos clínicos Basket
Independientes de la histología
Alteraciones genómicas como base
de clasificación
Terapia uniforme (única o en
combinación)
Múltiples cohortes específicas de
enfermedad. Análisis estadístico
independiente
Screening molecular centralizado
prospectivo poco común
No randomiza
Conclusiones
La genómica de gran escala es posible con un
tiempo de respuesta clínico práctico
Los paneles grandes permiten la inclusión de
nuevos genes
Colección de muestras de sangre con
consentimiento informado para estudio de
líneas germinales
Gran inversión inicial en infraestructura y
personal
Puede llegar a ser coste-efectiva
Heterogeneidad tumoral
“Una biopsia es como tratar de comprender cómo funciona
una vaca estudiando una hamburguesa”
A. Aktypis
Preguntas
¿Qué es un clon?
o Un grupo de células genéticamente idénticas
(probablemente cada célula es única)
o Un grupo de células que comparte una alteración
genética distintiva a partir de un ancestro común
Los estudios de divergencia
proporcionan datos respecto al tiempo de
separación de ese ancestro común.
o Requieren un reloj molecular
El 86% de los tumores tiene más de un clon con
>10% de celularidad
Carlo Maley. San Francisco
Tumor heterogeneity and evolution
Concepto de divergencia como evolutivo asociado a un
reloj biológico relacionado con la distancia al ancestro
común.
o Se analiza mediante LOH o microsatélites en diferentes loci.
La heterogeneidad es debida a dos factores, Jerárquicos
y Genéticos
o Es decir, existen células stem, y tumorales con diferentes programas y
jerarquí
o Existe una evolución clonal que provoca diferentes mutaciones en
diferentes células.
o La combinación de estos fenómenos hace que todo tipo de célula
jerárquica pueda tener cualquier tipo de mutación.
Carlo Maley. San Francisco
El microambiente tumoral (acidosis, hipoxia, contacto
directo con fibroblastos) provoca cambios en el
fenotipo.
Las situaciones de stress pueden originar una
canalización de determinados fenotipos o acabar
extinguiéndolos
El carcinoma renal es mucho más heterogéneo que el
colorrectal o el gástrico
Mutaciones de resistencia presentes desde el inicio