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BIBLIOTECA DE PRUEBAS
Servicio De Oncología Molecular
AGC - Laboratorio de Medicina
Ed.01 Mayo 2013
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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ÍNDICE
DETERMINACIONES DE APOYO DIAGNÓSTICO EN ANATOMÍA PATOLÓGICA Y
HEMATOLOGÍA
REORDENAMIENTO DEL GEN IGH.................................................................................. 4
REORDENAMIENTO DEL GEN TCRG ............................................................................... 7
TRANSLOCACIÓN BCL2/IGH ......................................................................................... 9
TRANSLOCACIÓN BCL-1/IGH...................................................................................... 11
TRANSLOCACIÓN BCR/ABL P210 Y/O P190 .................................................................. 13
TRANSLOCACIÓN PML/RARA ...................................................................................... 15
MUTACIÓN JAK-2 (V617F).......................................................................................... 17
MUTACIÓN JAK-2 (EXÓN 12) ...................................................................................... 19
MUTACIÓN MPL (EXONES 10 Y 11).............................................................................. 21
TRANSLOCACIÓN TEL-AML1 ....................................................................................... 23
TRANSLOCACIÓN MLL-AF4 ......................................................................................... 25
TRANSLOCACIÓN E2A-PBX1 ....................................................................................... 27
TRANSLOCACIÓN CBFB-MYH11................................................................................... 29
TRANSLOCACIÓN AML1-ETO ...................................................................................... 31
TRANSLOCACIÓN SIL-TAL .......................................................................................... 33
TRANSLOCACIÓN NPM1-ALK ...................................................................................... 35
TRANSLOCACIÓN FIP1L1-PDGFRA............................................................................... 37
MUTACIONES EN FLT-3 (ITDS Y TK) ............................................................................ 39
MUTACIONES EN NPM1 (EXÓN 12).............................................................................. 42
MUTACIONES EN CEBPA ............................................................................................ 44
DETERMINACIÓN DE ESTADO MUTACIONAL DE IGHV.................................................... 46
TRANSLOCACIONES EWSR1-FLI1; EWSR1-ERG ............................................................ 48
TRANSLOCACIONES SYT-SSX1; SYT-SSX2 ................................................................... 50
TRANSLOCACIÓN EWSR1-ATF1 .................................................................................. 52
TRANSLOCACIONES PAX3-FOXO1A; PAX7-FOXO1A ....................................................... 54
TRANSLOCACION EWSR1-WT1 ................................................................................... 56
TRANSLOCACIÓN EWSR1-CHOP; TLS-CHOP ................................................................. 58
TRANSLOCACIÓN FUS-CREB3L2; FUS-CREB3L1............................................................ 60
DETERMINACIONES DE SEGUIMIENTO/ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN
HEMATOLOGÍA
TRANSLOCACIÓN BCR/ABL P210 Y/O P190 PCR CUANTITATIVA ...................................... 62
TRANSLOCACIÓN PML/RARA PCR CUANTITATIVA.......................................................... 64
QUIMERISMO POST TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO .................................................... 66
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN BCR-ABL ........................................................... 68
FACTORES PRONÓSTICO/TOMA DE DECISIONES TERAPEÚTICAS EN TUMORES
SÓLIDOS
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN KRAS..................................................... 70
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL DOMINO TK DE EGFR ..................................... 73
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN KIT (EXONES 8, 9, 10, 11, 13, 17)............ 75
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES V600E EN EL GEN BRAF ........................................... 77
DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA DE BRAZOS CROMOSÓMICOS 1P Y 19Q ........................... 80
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN IDH1 (R132) E IDH2 (R172) ................................ 83
DETERMINACIÓN DE ESTATUS DE METILACIÓN DEL PROMOTOR DE MGMT...................... 85
ESTUDIO DE GENOTIPADO EN EL GEN UGT1A1 (VARIANTE UGT1A1*28)......................... 87
DETERMINACIONES DE CÁNCER FAMILIAR
DETERMINACIÓN DE INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES ........................................... 89
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN LOS GENES SDHD Y SDHB .................................. 91
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DETERMINACIÓN
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DETERMINACIÓN
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
MUTACIONES EN VHL .................................................................. 93
MUTACIONES EN RET (EXONES 10, 11, 13, 14, 15 Y 16) ................. 95
MUTACIONES EN MYH (Y165C Y G382C) ........................................ 97
MUTACIONES EN TP53................................................................. 99
MUTACIONES EN BRCA1 .............................................................101
MUTACIONES EN BRCA2 .............................................................104
MUTACIONES EN MLH1...............................................................107
MUTACIONES EN MSH2 ..............................................................109
MUTACIONES EN MSH6 ..............................................................111
MUTACIONES EN PMS2...............................................................113
MUTACIONES EN APC .................................................................115
MUTACIONES EN NF1 .................................................................117
MUTACIONES EN NF2 .................................................................119
GRANDES DELECIONES EN BRCA1 Ó BRCA2 .................................121
GRANDES DELECIONES EN MLH1, MSH2 Y MSH6 ...........................124
GRANDES DELECIONES EN APC ...................................................126
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REORDENAMIENTO DEL GEN IGH
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las dificultades para llevar a cabo un diagnóstico preciso en patologías linfoides ocurren en un
porcentaje de casos de aproximadamente entre el 5 y el 10%. Cuando los datos de inmunofenotipado no
son suficientes, otros métodos adicionales han de ser utilizados, tales como el estudio de
monoclonalidad mediante técnicas moleculares.
Los genes de las inmunoglobulinas (de la cadena pesada y de las cadenas ligeras, kappa y lambda) se
componen de numerosos segmentos codificantes, que se encuentran separados de forma discontinua en
las regiones cromosómicas 14, 2 y 22 respectivamente. Durante la maduración de los linfocitos B, estos
segmentos génicos se reordenan de forma específica en cada una de las células, de tal forma que cada
célula B madura tiene un perfil único de reordenamiento de estos genes. La expansión clonal de
cualquier célula B dará lugar a una población de células que tienen un perfil de reordenamiento de IGH
idéntico.
Las expansiones de células B reactivas son policlonales, conteniendo cada clon un pequeño número de
células, y sin ninguno de ellos predominante. Sin embargo, los clones neoplásicos suelen tener mayor
número de células, de tal manera que las células clonales serán las células B predominantes en la
muestra.
En un contexto clínico y patológico adecuado, la detección de un perfil de reordenamiento predominante
del gen de las cadenas pesadas de Ig puede ser sugerente de la presencia de un clon neoplásico de
células B.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil para determinar si una población de células B o de células plasmáticas es policlonal o monoclonal.
Estos estudios se realizan para confirmar el diagnóstico por ejemplo en:
- Cualquier sospecha de proliferación de células B, cuando la morfología y el inmunofenotipado no son
concluyentes.
- Linfoproliferaciones en pacientes inmunodeficientes, incluyendo pacientes postransplantados.
- Evaluación de la relación clonal entre dos patologías linfoides en un paciente, o discriminación entre
una recidiva y una segunda patología.
- Ocasionalmente, para conocer el estadío de un linfoma.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-2
(van Dongen et al 2003). Se preparan grupos de PCR multiplex con las mezclas de oligonucleótidos,
conteniendo un oligonucleótido fluorescente, diseñadas por BIOMED2 y preparadas de forma manual en
el laboratorio. Se realizan las PCRs en las condiciones descritas utilizando entre 100 y 300 ng de ADN
por mezcla. Los productos da cada grupo de PCR se analizan mediante electroforesis capilar en un
instrumento ABIPrism310 (Applied Byosistems) y se analizan los resultados utilizando el software
Genemapper 4.0. Los resultados se interpretan de forma manual.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): 1-4 ml en Tubo de tapón morado
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Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
(entre 10-100 mg de tejido)
Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para
determinar su significación. La interpretación de la presencia o ausencia de un patrón predominante de
reordenamiento de Ig puede ser en ocasiones subjetiva, por lo que se necesita una interpretación en
conjunto con el resto de los datos clínicos.
La detección de un patrón de reordenamiento monoclonal mediante esta técnica no siempre es sinónimo
de la presencia de una neoplasia clonal.
El ensayo no es 100% específico ni 100% sensible. Pueden obtenerse resultados falsos negativos si las
células a estudiar han pasado ya la fase de hipermutación somática que ocurre en el centro folicular, y
por tanto se han introducido ya mutaciones puntuales en el gen IGH y los oligonucleótidos diseñados
para la reacción de PCR ya no se unen eficazmente al molde. También pueden ocurrir falsos negativos si
las células clonales a estudio aún no han reordenado el gen IGH a estudio, como puede ocurrir en
neoplasias de células muy inmaduras, o también si las células clonales están en un porcentaje por
debajo del nivel de sensibilidad del ensayo. Se requieren al menos entre un 1-5% de células clonales en
la muestra para ser detectado el reordenamiento clonal. Los falsos positivos son raros.
Si la cantidad de ADN obtenido a partir de la muestra para realizar el estudio está en el rango de < 15
ng/microlitro, un resultado negativo se considerará “no valorable”.
Este ensayo no da información sobre el grado de diferenciación de la población clonal detectada, ni si un
reordenamiento monoclonal detectado es fisiológico o es neoplásico.
De acuerdo con Evans et al (2007), en relación con las distintas patologías de células B maduras, se
pueden detectar reordenamientos monoclonales de IGH con este método en el 100% de los linfomas del
manto, en el 100% de las leucemias linfáticas crónicas, en el 84% de los casos de linfoma de la zona
marginal extraganglionar, en el 100% del linfoma de la zona marginal ganglionar, en el 84% de los
casos de linfoma folicular y en el 79% del linfoma B difuso de célula grande.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 4 y 20 días laborables. La prueba se realiza una vez a la semana, aproximadamente.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia
(2003) 17: 2257-2317
Van Krieken et al. Improved reliability of lymphoma diagnostics via PCR-based clonality testing: Report
of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia (2007) 21: 201-206
Langerak et al. Polymerase chain reaction-based clonalitu testing in tissue samples with reactive
lymphoproliferations: usefulness and pitfalls. A report of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia
(2007) 21:222-229
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Evans et al. Significantly improved PCR-based clonality testing in B-cell malignancies by use of multilple
immunoglobulin gene targets. Report of the BIOMED-2 Concerted Action. Leukemia (2007) 21: 207-214
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REORDENAMIENTO DEL GEN TCRG
INFORMACIÓN CLÍNICA
Los genes que codifican los receptores de células T (TCR alfa, beta, gamma y delta) están compuestos
por numerosos segmentos codificantes discontinuos, que se reordenan somáticamente durante la
maduración del linfocito T, para producir los receptores T de superficie, que son heterodiméricos
(alfa/beta , el 90-95% de las células T; gamma/delta, el 5-10% de las células T). Durante la
maduración de los linfocitos T, todos sufren reordenamiento del gen TCRG (gamma) que se mantiene
incluso en los linfocitos que finalmente van a expresar los receptores alfa/beta. Por ello, el estudio del
reordenamiento del gen TCRG se ha utilizado para la detección de clonalidad linfoide T.
UTILIDAD CLÍNICA
El gen TCRG está reordenado en más del 90% de las leucemias agudas linfoblásticas T, de los linfocitos
grandes granulares T, y de leucemia prolinfocítica T, y en el 50-75% de los casos de linfoma noHodgkin T y micosis fungoides pero no en proliferaciones NK. También está reordenado en una parte de
las leucemias agudas linfoblásticas B y mucho menos en los linfomas no-Hodgkin B.
Es útil para determinar si una población de células T es policlonal o monoclonal. Estos estudios se
realizan para confirmar el diagnóstico por ejemplo en:
- Cualquier sospecha de proliferación de células T, cuando la morfología y el inmunofenotipado no son
concluyentes.
- Evaluación de la relación clonal entre dos patologías linfoides en un paciente, o discriminación entre
una recidiva y una segunda patología.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-2
(van Dongen et al 2003). Se preparan grupos de PCR multiplex con las mezclas de oligonucleótidos,
conteniendo un oligonucleótido fluorescente, diseñadas por BIOMED2 y preparadas de forma manual en
el laboratorio. Se realizan las PCRs en las condiciones descritas utilizando entre 100 y 300 ng de ADN
por mezcla. Los productos da cada grupo de PCR se analizan mediante electroforesis capilar en un
instrumento ABIPrism310 (Applied Byosistems) y se analizan los resultados utilizando el software
Genemapper 4.0. Los resultados se interpretan de forma manual.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
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Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para
determinar la significación de los mismos. La interpretación de la presencia o ausencia de un patrón
predominante de reordenamiento de TCRG puede ser en ocasiones subjetiva, por lo que se necesita una
interpretación en conjunto con el resto de los datos clínicos.
La detección de un patrón de reordenamiento monoclonal mediante esta técnica no siempre es sinónimo
de la presencia de una neoplasia clonal. Se pueden producir falsos positivos en el estudio de
reordenamiento del gen TCRG cuando el número total de células T en la muestra es limitado, ya que el
repertorio de reordenamientos de los segmentos génicos es bastante reducido y puede estar sesgado
hacia unos tipos concretos de reordenamientos en algunas condiciones fisiológicas, como la edad, en
situaciones post-trasplante, y en reacciones autoinmunes. Por otra parte, se pueden producir falsos
negativos por varias razones, tales como el tipo de muestra con escaso número de linfocitos para
estudiar, baja cantidad de ADN obtenida de la muestra, o imposibilidad de detección de una pequeña
minoría de reordenamientos génicos no amplificables por los oligonucleótidos utilizados.
En algunas ocasiones se detectan resultados difícilmente interpretables, caracterizado por un patrón de
reordenamientos anormal (comparado con un típico reordenamiento policlonal T) pero que no llega a ser
posible interpretar de forma definitiva como una población monoclonal. En estas situaciones no es fácil
distinguir una pequeña subpoblación monoclonal de una población reactiva aumentada. En estos casos el
resultado será “no concluyente” y conviene analizar una nueva muestra pasados unos meses si la clínica
lo requiere, para confirmar o descartar la presencia de una población monoclonal.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 4 y 20 días laborables. La prueba se realiza una vez a la semana, aproximadamente.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia
(2003) 17: 2257-2317
Van Krieken et al. Improved reliability of lymphoma diagnostics via PCR-based clonality testing: Report
of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia (2007) 21: 201-206
Langerak et al. Polymerase chain reaction-based clonalitu testing in tissue samples with reactive
lymphoproliferations: usefulness and pitfalls. A report of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia
(2007) 21:222-229
Bruggemann et al. Powerful strategy for polymerase chain reaction-based clonality assessment in T-cell
malignancies. Report of the BIOMED-2 concerted action. Leukemia (2007) 21:215-221
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TRANSLOCACIÓN BCL2/IGH
INFORMACIÓN CLÍNICA
La translocación t(14;18) es una de las alteraciones citogenéticas recurrentes mejor caracterizada en los
procesos linfoproliferativos B. Se detecta aproximadamente en el 90% de los linfomas foliculares y en un
20% de los linfomas B de célula grande. Como consecuencia de esta alteración, el gen BCL2 ubicado en
18q21 queda colocado en el locus de IGH, bajo el control de potentes estimuladores de la transcripción
(“enhancers”), lo que da lugar a la desregulación del patrón normal de expresión del gen BCL2. La
proteína BCL2 se localiza en la membrana exteARN mitocondrial y su función normal es antagonizar el
proceso de apoptosis. Por tanto, su sobre-expresión implica un aumento en la inhibición de la apoptosis,
lo que podría estar implicado en la patogénesis tumoral.
UTILIDAD CLÍNICA
Como consecuencia de su posible papel en la patogénesis tumoral, la determinación de la presencia de la
translocación t(14;18) es adecuada tanto para apoyo diagnóstico como para monitorizar la presencia de
enfermedad mínima residual.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-2
(van Dongen et al 2003). Se preparan tres grupos de PCR multiplex con las mezclas de oligonucleótidos,
conteniendo un oligonucleótido fluorescente, diseñadas por BIOMED2 y preparadas de forma manual en
el laboratorio. Se realizan las PCRs en las condiciones descritas utilizando entre 100 y 300 ng de ADN
por mezcla. Los productos da cada grupo de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa.
La presencia de un fragmento amplificado en alguna de las mezclas de PCR dentro de un rango de
tamaños posibles es sugerente de la presencia de la translocación. Se verifica mediante secuenciación.
El tamaño final del producto positivo se determina mediante electroforesis capilar en un instrumento
ABIPrism310 (Applied Byosistems).
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
La aparición de un fragmento amplificado en una de las mezclas de PCR es sugerente de presencia de
translocación. El análisis de secuencia permitirá verificar la presencia de la misma. La mayor parte de los
puntos de ruptura en el gen BCL2 ocurren en la zona denominada MBR (“Major breakpoint region”) en
unas 150 pb localizadas en la zona 3’ no trasladada del exon 3. Existe otro punto de ruptura posible a 4
kb del anterior, denominado 3’ MBR y que ocupa unas 3,8 kb. Por último, la región mcr (“minor cluster
region”) es una zona de una 500 pb, localizada a 20 kb 3’ de MBR.
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Precauciones.
A pesar de que la técnica de PCR ofrece resultados rápidos y puede ser utilizada para monitorizar la
enfermedad mínima residual, los estudios de detección de esta translocación basados en PCR solo
cubren hasta un 60% de las translocaciones posibles, lo cual hace que esta técnica no sea la ideal con
fines exclusivamente diagnósticos, ya que hasta un 40% de los casos con translocación podrían no ser
detectados. Debería utilizarse como método de diagnóstico la citogenética y la hibridación mediante
FISH, que tienen el potencial de detectar un porcentaje más alto de translocaciones.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 4 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia
(2003) 17: 2257-2317
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TRANSLOCACIÓN BCL-1/IGH
INFORMACIÓN CLÍNICA
La translocación t(11;14)(q13;q32) es característica del linfoma del manto, ya que se ha observado en
el 60-70% de los casos de este tipo de linfoma, y sólo muy esporádicamente en otros tipos de linfomas
no- Hodgkin. La región de ruptura en el cromosoma 11 se denominó inicialmente región BCL1.
Aproximadamente en el 40% de los casos con translocación, ésta ocurre dentro de una zona de 85 pb
en la zona 5’ del gen que codifica la ciclina D1 (gen CCND1). La región de ruptura en el cromosoma 14
corresponde en casi todos los casos a una zona del locus IGH yuxtapuesto a una región de potentes
estimuladores de la transcripción de IGH (“enhancers”), lo que da lugar a la activación trascripcional del
gen que codifica la ciclina D1. La ciclina D1, junto con la proteina CDK4 fosforila e inactiva la proteina
RB, permitiendo a las células el paso por la fase G1 del ciclo celular. Puesto que la ciclina D1 no se
expresa normalmente en linfocitos B ni en otros linfomas no Hodgkin, excepto el linfoma del manto, se
considera que la presencia de ciclina D1 está relacionada con la patogénesis del linfoma del manto.
UTILIDAD CLÍNICA
La determinación de la presencia de la translocación t(11;14) es adecuada tanto para apoyo diagnóstico
como para monitorizar la presencia de enfermedad mínima residual en el linfoma del manto.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-2
(van Dongen et al 2003). Se realiza una PCR con los oligonucleótidos diseñados por BIOMED2,
conteniendo un oligonucleótido fluorescente, preparando al mezcla de forma manual en el laboratorio.
Se realiza la PCR en las condiciones descritas utilizando entre 100 y 300 ng de ADN por mezcla. Los
productos da cada grupo de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. La presencia de
un fragmento amplificado en alguna de las mezclas de PCR dentro de un rango de tamaños posibles es
sugerente de la presencia de la translocación. Se verifica mediante secuenciación. El tamaño final del
producto positivo se determina mediante electroforesis capilar en un instrumento ABIPrism310 (Applied
Byosistems).
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
La aparición de un fragmento amplificado es sugerente de presencia de translocación. El análisis de
secuencia permitirá verificar la presencia de la translocación. En el 40% de los casos, el punto de
ruptura se encuentra en una zona de 85 pb denominada región MTC (Major Translocation Cluster),
aunque pueden ocurrir rupturas hasta en una zona de 2 kb más delante de esta zona y no se detectarían
mediante la técnica utilizada.
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Precauciones.
A pesar de que la técnica de PCR ofrece resultados rápidos y puede ser utilizada para monitorizar la
enfermedad mínima residual, los estudios de detección de esta translocación basados en PCR solo
cubren hasta un 40% de las translocaciones posibles, lo cual hace que esta técnica no sea la ideal con
fines exclusivamente diagnósticos, ya que hasta un 60% de los casos con translocación podrían no ser
detectados. Debería utilizarse como método de diagnóstico la citogenética y la hibridación mediante
FISH, que tienen el potencial de detectar hasta el 100% de las translocaciones.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 4 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia
(2003) 17: 2257-2317
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TRANSLOCACIÓN BCR/ABL P210 Y/O P190
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia mieloide crónica (LMC) es una neoplasia de las células madre hematopoyéticas que se
incluye dentro del ámbito de las neoplasias mieloproliferativas. La LMC está asociada de manera
consistente con la translocación que fusiona el gen BCR en el cromosoma 22q11 con el gen ABL,
localizado en 9q23. Esta fusión se conoce como BCR/ABL.
El ARNm de BCR/ABL (gen de fusión, producto de la translocación que une el gen BCR en el cromosoma
22q11 con el gen ABL en el cromosoma 9q23) se detecta en casi todos los pacientes con leucemia
mieloide crónica (LMC) y en un subgrupo de aquellos con leucemia linfoblástica aguda (LAL) y leucemia
mieloide aguda (LAM). Aunque los puntos de translocación en BCR y ABL pueden ocurrir en varias
localizaciones, mediante el proceso de splicing sólo se obtienen 8 variantes (e1/a2, e6/a2, e13/a2,
e14/a2, e19/a2, e1/a3, e13/a3, e14/a3) que incorporan la secuencia completa de los exones a ambos
lados del punto de fusión. Aunque no descritas, variantes adicionales (e20/a2, e6/a3, e12/a3, e19/a3,
e20/a3) podrían, en teoría, resultar en proteínas BCR/ABL patogénicas. Sí se han descrito, aunque en
meros casos puntuales, pacientes con puntos de translocación dentro de la secuencia de los exones.
En LMC, >95% de los pacientes presentan una translocación de tipo e13/a2 (b2a2) o e14/a2 (b3a2), las
cuales dan lugar a una proteina de 210-kDa (p210). Más del 50% de los pacientes con LAL de tipo BCRABL-positivo presentan la translocación e1/a2, que genera una proteína de 190-kDa (p190), mientras la
mayoría de los pacientes restantes tienen, bien la variante e13/a2 o la e14/a2. El resto de las
translocaciones son muy raras en neoplasias que presentan BCR/ABL.
Cuando se analiza la presencia de ARNm de BCR/ABL en el momento del diagnóstico es importante
utilizar un ensayo que detecte tantos tipos de translocaciones como sea posible y que las identifique.
Esto evita falsos positivos al diagnóstico y asegura que el método de seguimiento seleccionado para la
monitorización del paciente sea el adecuado para cada paciente. Este ensayo está diseñado para
detectar todas las variantes de BCR/ABL.
UTILIDAD CLÍNICA
Apoyo diagnóstico en pacientes con neoplasias bcr-abl positivas, principalmente leucemia mieloide
crónica (LMC) y leucemia aguda linfoblástica (LAL).
En la prueba, un resultado positivo viene acompañado de la identificación de la variante de fusión,
información imprescindible para un apropiado seguimiento del paciente.
Si no estuviera disponible una prueba de monitorización adecuada para una variante rara, este ensayo
tendría un cierto valor de monitorización, pudiendo aportar resultados positivos o negativos.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
PCR siguiendo los protocolos recomendados por el consorcio BIOMED-1 (van Dongen et al. Leukemia
1999; 13: 1901-1928).
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguno en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre (4 ml) o médula ósea (3 ml) anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
Se obtiene un resultado cualitativo que indica la presencia o ausencia de ARNm BCR/ABL. Cuando es
positivo, la variante de fusión también se determina.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 13 de 127
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 14 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Hochhaus A, Reiter A, Skladny H, et al: A novel BCR-ABL fusion gene (e6a2) in a patient with
Philadelphia chromosome-negative chronic myelogenous leukemia. Blood 1996 September
15;88(6):2236-2240
van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA et al: Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts
from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the
BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia.
1999 Dec;13(12):1901-28
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 14 de 127
TRANSLOCACIÓN PML/RARA
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda promielocítica (LAP) una entidad claramente diferenciable del resto de leucemias
agudas mieloides, especialmente en lo referido a sus requerimientos terapéuticos específicos. Se
caracteriza por la presencia de la translocación t(15;17) que produce el gen de fusión PML-RARa y que,
además de ser un marcador clínico para el diagnóstico, se utiliza para la monitorización de enfermedad
mínima residual.
Esta translocación implica la fusión del gen PML en el cromosoma 15 y el gen RARA en el cromosoma 17
con los puntos cromosómicos de ruptura 15q22-q24 y 17q11q21. Según la localización del punto de
ruptura se producen los subtipos de transcrito bcr1, bcr2 y bcr3, con una frecuencia aproximada del
55%, 5% y 40% respectivamente.
El gen de fusión PML-RARa dispone de una molécula específica, el ácido retinoico todo-trans (ATRA), que
actúa sobre la proteína de fusión generada por la translocación. De forma que, aunque los pacientes con
LAP tienen un alto riesgo de muerte temprana, la existencia de una terapia específica hace que llegue a
la curación un 80% de los pacientes (Lo-Coco et al. 2006).
UTILIDAD CLÍNICA
La determinación de la presencia de la translocación t(15;17) es adecuada tanto para apoyo diagnóstico
como para monitorizar la presencia de enfermedad mínima residual en leucemia aguda promielocítica
(LAP).
Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un
seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la efectividad del
tratamiento y prevenir una posible recaída.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se lisan los eritrocitos mediante lisis osmótica. Se prepara ARN y ADN a partir de la muestra y
posteriormente se obtiene cADN a partir del ARN.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1
(van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el
protocolo y preparados de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual. En caso de dudas en la
interpretación del tamaño del fragmento amplificado, se realiza secuenciación para verificar la presencia
de la translocación.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 15 de 127
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se observa amplificación de ninguno de los transcritos anteriormente descritos, o
- Se obtuvo amplificación de un fragmento de un tamaño correspondiente al transcrito resultante de la
translocación PML-RARa según está descrito. Muestra positiva para la translocación PML-RARa t(15;17).
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 1 y 5 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Lo-Coco et al. The biology of acute promyelocytic leucemia and its impacto n diagnosis treatment.
Hematology Am Soc Hematol Educ Program (2006): 156-161, 514.
Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: 1901-1928
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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MUTACIÓN JAK-2 (V617F)
INFORMACIÓN CLÍNICA
El gen JAK2 (Janus kinase 2) codifica una tirosin kinasa intracelular (JAK2), que se asocia con la parte
citoplásmica de varios receptores transmembrana de citokinas y factores de crecimiento. La unión de
estos receptores con su ligando extracelular da lugar a la multimerización del receptor y el reclutamiento
de JAK2, que los activa por transfosforilación. Esta activación permite la unión de un factor de
transcripción STAT5, que estaba en estado latente, y que también es fosforilado por JAK2. STAT5
fosforilado se dimeriza y se transloca hacia el núcleo celular, iniciando la transcripción de genes
implicados en el crecimiento celular y la diferenciación.
En el año 2005 se identificó la presencia de una mutación puntual (V617F) en el gen JAK2 en células
hematopoyéticas de varios síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC), siendo esta mutación más
frecuente en policitemia vera (65-97%), en trombocitemia esencial (25-55%) y en mielofibrosis
idiomática crónica (35-57%). La mutación da lugar a una activación constitutiva de JAK2, y se piensa
que juega un papel importante en el desarrollo de las patologías neoplásicas reseñadas anteriormente.
UTILIDAD CLÍNICA
La detección la mutación en JAK2 tiene un valor de apoyo diagnóstico en los SMPC.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN genómico a partir de la sangre periférica o médula ósea tras la lisis de los eritrocitos. Se
realiza una amplificación mediante PCR específica de alelos a partir de ADN genómico de la región
correspondiente
al
exon
14
del
gen,
con
los
siguientes
oligonucleótidos:
268
5’
TGCATCTTTATTATGGCAGAG,
269
5’
TACACTGACACCTAGCTGTG
y
276
5’
TTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa.
Se detecta una banda control en todas las muestras. En las muestras positivas para la presencia de la
mutación se detecta una banda adicional de menor tamaño. Se utiliza siempre un control positivo que
contiene un 10% de celularidad positiva para la mutación.
Línea celular positiva para la presencia de la mutación: HEL
Línea celular negativa: HL60
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre periférica entre 1 - 4 ml en tubos de EDTA
Médula ósea: entre 0,5 - 2 ml en tubo de EDTA
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es negativa para la presencia de la mutación V617F en JAK2.
- La muestra es positiva para la presencia de la mutación V617F en JAK2.
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La presencia de mutación es altamente sugerente de la presencia de una neoplasia mieloide, pero los
datos deben corroborarse con otros aspectos clínicos y patológicos. La ausencia de mutación no excluye
la presencia de un síndrome mieloproliferativo crónico u otra neoplasia.
La sensibilidad de la técnica está entre 2 y 5%.
Precauciones
Un resultado positivo no es específico de un diagnóstico en particular y debe de existir una correlación
clínico-patológica en todos los casos. Un resultado negativo no excluye la presencia de un síndrome
mieloproliferativo crónico u otra neoplasia.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 20 días laborables. La prueba se realiza una vez a la semana.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Baxter et al. Lancet (2005) 365: 1054-1061
James et al. Nature (2005) 434: 1144-1148
Kralovics et al N Engl J Med (2005) 352: 1779-1790
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 18 de 127
MUTACIÓN JAK-2 (EXÓN 12)
INFORMACIÓN CLÍNICA
El gen JAK2 (Janus kinase 2) codifica una tirosin kinasa intracelular (JAK2), que se asocia con la parte
citoplásmica de varios receptores transmembrana de citokinas y factores de crecimiento. La unión de
estos receptores con su ligando extracelular da lugar a la multimerización del receptor y el reclutamiento
de JAK2, que los activa por transfosforilación. Esta activación permite la unión de un factor de
transcripción STAT5, que estaba en estado latente, y que también es fosforilado por JAK2. STAT5
fosforilado se dimeriza y se transloca hacia el núcleo celular, iniciando la transcripción de genes
implicados en el crecimiento celular y la diferenciación.
En el año 2005 se identificó la presencia de una mutación puntual (V617F) en el gen JAK2 en células
hematopoyéticas de varios síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC), siendo esta mutación más
frecuente en policitemia vera (65-97%), en trombocitemia esencial (25-55%) y en mielofibrosis
idiomática crónica (35-57%). La mutación da lugar a una activación constitutiva de JAK2, y se piensa
que juega un papel importante en el desarrollo de las patologías neoplásicas reseñadas anteriormente.
En los casos donde no se detecta la mutación V617F, especialmente en sospecha de policitemia vera,
podría estar indicado clínicamente un mayor estudio de JAK2. Se han detectado mutaciones que afectan
al exón 12 de JAK2, que pueden ser de tipo puntual o pequeñas inserciones o deleciones. La mayoría de
estas alteraciones se asocian con policitemia vera (aproximadamente un 4% de los casos de policitemia
vera) y en menor frecuencia aún en mielofibrosis idiopática.
UTILIDAD CLÍNICA
La detección la mutación en JAK2 tiene un valor de apoyo diagnóstico en los SMPC.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se purifican eritrocitos a partir de sangre periférica mediante un gradiente de ficoll. Se obtiene ADN
genómico a partir de los eritrocitos o de médula ósea tras la lisis de los eritrocitos.
Se realiza una amplificación mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las
regiones a estudio. Se utiliza un control negativo en cada estudio. El producto de PCR se analiza
mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto de PCR es secuenciado utilizando uno de los
oligonucleótidos con los que se amplificó la muestra. Los cromatogramas de las secuencias se analizan
mediante programas informáticos y manualmente para determinar la presencia o ausencia de
mutaciones en este gen.
El ensayo para detectar mutaciones mediante secuenciación tiene una sensibilidad analítica teórica del
15-20%.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre periférica entre 1 - 4 ml en tubos de EDTA
Médula ósea: entre 0,5 - 2 ml en tubo de EDTA
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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- La muestra es negativa para la presencia de mutación en el exón 12 de JAK2.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en el exón 12 de JAK2. Se incluirá una
descripción de la mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
La presencia de mutación es altamente sugerente de la presencia de una neplasia, pero los datos deben
corroborarse con otros aspectos clínicos y patológicos. La ausencia de mutación no excluye la presencia
de un síndrome mieloproliferativo crónico u otra neoplasia.
Precauciones
La sensibilidad de este ensayo es menor que la prueba para la detección de JAK-2 (V617F) puesto que
se realiza mediante secuenciación (sensibilidad aproximada 20% frente a sensibilidad del 1-5% en la
prueba para determinar V617F). La mutación V617F debe realizarse siempre primero ya que la carga
mutacional puede ser muy baja en algunos especímenes.
Un resultado negativo no excluye la presencia de una mutación, que puede estar presente, pero por
debajo de los límites de detección del ensayo.
Para aumentar la sensibilidad del estudio, algunos autores sugieren que éste se debería realizar en
muestra de médula ósea del paciente.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables. La prueba se realiza una vez a la semana o cada 10 días,
aproximadamente.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Baxter et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders Lancet
(2005) 365: 1054-1061
James et al. Nature (2005) 434: 1144-1148
Kralovics et al N Engl J Med (2005) 352: 1779-1790
Scout, LM et al. JAK2 Exon 12 Mutations in Polycythemia Vera and Idiopathic Erythrocytosis. N Engl J
Med 2007; 356:459-68
Tefferi A and Vainchenker W. Myeloproliferative neoplasms: molecular pathophysiology, essential clinical
understanding, and treatment strategies J Clin Oncol (2011)29: 573-582
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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MUTACIÓN MPL (EXONES 10 Y 11)
INFORMACIÓN CLÍNICA
El gen MPL, localiczado en la región cromosómica 1p34, codifica para el receptor de la trombopoietina.
MPL es clave para el crecimiento y la supervivencia de los megacariocitos. Se han descrito mutaciones
(tales como la S505N) que implican ganancia de función, asociadas con trombocitosis familiar. También
se ha descrito un polimorfismo (K39N), presente en el 89% de la población de raza negra y que está
asociado con un recuento de plaquetas alto. Se han descrito asimismo, aunque con una frecuencia muy
baja, mutaciones somáticas en el gen MPL, estando limitadas principalmente a pacientes con neoplasias
mileoproliferativas, aunque también se han observado en pacientes con leucemia aguda megacariocítica.
Las mutaciones somáticas más frecuentemente descritas son mutaciones en los aminoácidos W515 y en
S505, en el exón 10 del gen. La mutación W515L fue la primera descrita en 2006, en pacientes con
mielofibrosis primaria y con mutación de JAK2 V617F negativa. En modelos animales (ratón), esta
mutación induce un síndrome mieloproliferativo con trombocitosis. Posteriormente se describieron las
mutaciones W515K, W515S y S505N en pacientes con trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria,
con frecuencias aproximadas del 3% en pacientes con trombocitemia esencial y de <10% en los
pacientes con mielofibrosis primaria. Las mutaciones en MPL se han asociado con edad avanzada, sexo
femenino, bajo nivel de hemoglobina y recuento de plaquetas alto, lo que sugiere que los efectos
provocados por esta mutación son diferentes de los que ocurren debido a mutaciones en JAK2. La
presencia de mutación en MPL no parece tener efecto sobre la supervivencia, ni en transformación
leucémica o a fibrosis.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil como apoyo diagnóstico en síndromes mieloproliferativos sugerentes de trombocitemia esencial o
mielofibrosis primaria, que previamente se han demostrado negativos para la mutación de JAK2 V617F.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se purifican eritrocitos a partir de sangre periférica mediante un gradiente de ficoll. Se obtiene ADN
genómico a partir de los eritrocitos o de médula ósea tras la lisis de los eritrocitos.
Se realiza una amplificación mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las
regiones a estudio (exones 10 y 11 del gen MPL). Se utiliza un control negativo en cada estudio. El
producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto de PCR es
secuenciado utilizando uno de los oligonucleótidos con los que se amplificó la muestra. Los
cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos y manualmente para
determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen.
El ensayo para detectar mutaciones mediante secuenciación tiene una sensibilidad analítica teórica del
15-20%.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre periférica entre 1 - 4 ml en tubos de EDTA
Médula ósea: entre 0,5 - 2 ml en tubo de EDTA
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 21 de 127
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es negativa para la presencia de mutaciones en los exones 10 y 11 del gen MPL.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación. Se incluirá una descripción de la mutación a
nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
La presencia de mutación es altamente sugerente de la presencia de una neplasia, pero los datos deben
corroborarse con otros aspectos clínicos y patológicos. La ausencia de mutación no excluye la presencia
de un síndrome mieloproliferativo crónico u otra neoplasia.
Precauciones
La sensibilidad de este ensayo es menor que la prueba para la detección de JAK-2 (V617F) puesto que
se realiza mediante secuenciación (sensibilidad aproximada 20% frente a sensibilidad del 1-5% en la
prueba para determinar V617F). La mutación V617F debe realizarse siempre primero ya que la carga
mutacional puede ser muy baja en algunos especímenes.
Un resultado negativo no excluye la presencia de una mutación, que puede estar presente, pero por
debajo de los límites de detección del ensayo.
Para aumentar la sensibilidad del estudio, algunos autores sugieren que éste se debería realizar en
muestra de médula ósea del paciente.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 30 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Ding J, Komatsu H, Wakita A, et al. Familial essential thrombocythemia associated with a dominantpositive activating mutation of the c-MPL gene, which encodes for the receptor for thrombopoietin.
Blood. 2004;103:4198-4200.
Pikman Y, Lee BH, Mercher T, et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis
with myeloid metaplasia. PLoS Med. 2006;3:1140-1151.
Tefferi A and Vainchenker W. Myeloproliferative neoplasms: molecular pathophysiology, essential clinical
understanding, and treatment strategies J Clin Oncol (2011)29: 573-582
Tefferi A and Vardiman JW Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World
Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms Leukemia (2008) 22, 14–22
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 22 de 127
TRANSLOCACIÓN TEL-AML1
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda linfoblástica (LAL) es un grupo heterogéneo de enfermedades originadas a partir de
células progenitoras B o T, que pueden ser clasificadas en base a criterios inmunológicos y moleculares.
La identificación de alteraciones moleculares asociadas a la trasformación leucémica ha aportado, no
solo información biológica, sino que también marcadores clínicos relevantes tanto para el pronóstico de
subgrupos, como para la monitorización de enfermedad mínima residual.
La translocación t(12;21)(p13;q22) es el reordenamiento detectado más comúnmente en niños con
leucemia aguda linfoblástica, ocurriendo aproximadamente en un 25% de los casos. Es especialmente
frecuentemente entre 2 y 5 años de edad al diagnóstico aunque el rango de edad puede variar entre 1 y
12 años. Por debajo de un año de edad nunca se ha descrito y por encima de los 12 años la frecuencia
es menor de un 2%.
Esta translocación implica la fusión del gen TEL (ETV6) en el cromosoma 12 con el gen AML1 (CBFA2) en
el cromosoma 21. La unión se produce entre el exón 5 de TEL y los exones 2 o 3 de AML1 produciendo
dos tipos de transcrito de fusión. Esta tranlocación no puede ser detectada mediante análisis
citogenéticos, por lo que su presencia sólo puede determinarse mediante FISH o PCR.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de leucemia aguda linfoblastica
infantil al diagnóstico, en el que también se analiza la presencia de las tanslocaciones E2A-PBX1, MLLAF4 y BCR-ABL.
Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un
seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa para determinar la efectividad del tratamiento y
prevenir una posible recaída.
Actualmente la presencia de la translocación TEL-AML1 tiene valor pronóstico favorable en los pacientes
con LAL.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara cADN de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1
(van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el
protocolo y preparado de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento
amplificado se secuenciará para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 23 de 127
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación t(12;21) (TEL/AML1)
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: 1901-1928
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 24 de 127
TRANSLOCACIÓN MLL-AF4
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda linfoblástica es un grupo heterogéneo de enfermedades originadas a partir de células
progenitoras B o T, que pueden ser clasificadas en base a criterios inmunológicos y moleculares. La
identificación de alteraciones moleculares asociadas a la trasformación leucémica ha aportado, no solo
información biológica, sino que también marcadores clínicos relevantes tanto para el pronóstico de
subgrupos, como para la monitorización de enfermedad mínima residual.
La translocación t(4;11)(q21;q23) se observa en un 50-70% de LAL infantiles y en aproximadamente un
5% de LAL en adultos y pediátricas. Su presencia se asocia a fenotipo pro-B y coexpresion de antígenos
de diferenciación mieloide además del antígeno NG2.
Esta translocación implica el gen MLL en el cromosoma 11 y el gen AF4 en el cromosoma 4. Los puntos
de ruptura más frecuentes ocurren entre los exones 8 y 12 en MLL y entre los exones 4 y 7 de AF4. En
función del la combinación de los puntos de unión entre ambos genes se determina el tipo de transcrito
de fusión. El gen MLL está implicado en más de 30 tipos diferentes de translocaciones relacionadas con
LAL precursor B, LAM, síndrome mielodisplasico, algunos casos de LAL-T y leucemia secundaria.
En algunos casos esta tranlocación no puede ser detectada mediante analisis citogenéticos, por lo que su
presencia sólo puede determinarse mediante FISH o PCR.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de leucemia aguda linfoblástica
infantil al diagnóstico, en el que también se analiza la presencia de las tanslocaciones TEL-AML1, E2APBX1 y BCR-ABL.
Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un
seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa para determinar la efectividad del tratamiento y
prevenir una posible recaída.
Actualmente la presencia de la translocación MLL-AF4 tiene valor pronóstico adverso en los pacientes
con ALL.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara cADN de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1
(van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el
protocolo y preparado de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento
amplificado se secuenciará para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósea anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 25 de 127
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación MLL-AF4
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: 1901-1928
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 26 de 127
TRANSLOCACIÓN E2A-PBX1
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda linfoblástica es un grupo heterogéneo de enfermedades originadas a partir de células
progenitoras B o T, que pueden ser clasificadas en base a criterios inmunológicos y moleculares. La
identificación de alteraciones moleculares asociadas a la trasformación leucémica ha aportado, no solo
información biológica, sino que también marcadores clínicos relevantes tanto para el pronóstico de
subgrupos, como para la monitorización de enfermedad mínima residual.
La translocación t(1;19)(q23;p13) se observa en un 5-6% de LAL infantiles y en aproximadamente un
3% de LAL en adultos. Su presencia se asocia a fenotipo pre-B y expresión de Igµ citoplasmático.
Esta translocación implica el gen E2A en el cromosoma 19 y el gen PBX1 (PRL) en el cromosoma 1. En
la mayoría de los casos se trata de la unión entre un punto concreto de la región intrónica entre los
exones 13 y 14 de E2A y la región intrónica entre los exones 1 y 2 de PBX1 que genera dos tipos de
transcrito de fusión.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de leucemia aguda linfoblástica
infantil al diagnóstico, en el que también se analiza la presencia de las tanslocaciones TEL-AML1, MLLAF4 y BCR-ABL.
Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un
seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa para determinar la efectividad del tratamiento y
prevenir una posible recaída.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara cADN de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1
(van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el
protocolo y preparado de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento
amplificado se secuenciará para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación E2A-PBX1
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 27 de 127
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: 1901-1928
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TRANSLOCACIÓN CBFB-MYH11
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda mieloide (LAM) corresponde a un grupo heterogéneo de neoplasias. La elección del
tratamiento que se aplica a los pacientes depende en gran medida del pronóstico estimado, siendo uno
de los factores más importantes la caracterización citogenética de las células tumorales, que permite
estratificar los pacientes en tres grupos: los de pronóstico favorable, intermedio y desfavorable (Byrd et
al. 2002).
En general, el grupo de pronóstico favorable, con buena respuesta a quimioterapia, conocido como “core
binding factor leukemia” (CBF), se define mediante la presencia de translocaciones específicas, t(8;21) y
t(16;16)/inv(16) que producen los genes de fusión AML1-ETO (RUNX1-RUNX1T1) y CBFB-MYH11
respectivamente.
La inv(16)(p13q22) que une el gen CBFB (Core Binding Factor B subunit) en el cromosoma 16 con el gen
MYH11 también en el cromosoma 16 ocurre en aproximadamente un 10% de los casos de nuevo
diagnoóstico. Se han observado hasta 10 transcritos de fusión, siendo el tipo A el más frecuente
abarcando más del 85% de los casos positivos. Esta translocacion esta asociada a LAM-M4 con
eosinofilia anormal (M4Eo).
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de Leucemia Aguda Mieloide
(LAM) al diagnóstico.
Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un
seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa para determinar la efectividad del tratamiento y
prevenir una posible recaída.
Actualmente la presencia de la translocación CBFB-MYH11, en ausencia de mutaciones en el gen KIT,
tiene valor pronóstico favorable en los pacientes con LAM.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara cADN de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1
(van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el
protocolo y preparado de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento
amplificado se secuenciará para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
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Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación CBFB-MYH11.
- No se detecta ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Byrd et al. "Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative
incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results
from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461)." Blood (2002) 100(13): 4325-36.
Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: 1901-1928
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TRANSLOCACIÓN AML1-ETO
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda mieloide (LAM) corresponde a un grupo heterogéneo de neoplasias. La elección del
tratamiento que se aplica a los pacientes depende en gran medida del pronóstico estimado, siendo uno
de los factores más importantes la caracterización citogenética de las células tumorales, que permite
estratificar los pacientes en tres grupos: los de pronóstico favorable, intermedio y desfavorable (Byrd et
al. 2002).
En general, el grupo de pronóstico favorable, con buena respuesta a quimioterapia, conocido como “core
binding factor leukemia” (CBF), se define mediante la presencia de translocaciones específicas, t(8;21) y
t(16;16)/inv(16) que producen los genes de fusión AML1-ETO (RUNX1-RUNX1T1) y CBFB-MYH11
respectivamente.
La translocación t(8;21)(q22;q22) que une el gen AML1 (RUNX1) (core binding factor subunit alpha) en
el cromosoma 21 con el gen ETO (RUNX1T1) en el cromosoma 8, ocurre en aproximadamente un 7% de
los casos de nuevo diagnóstico, siendo más común en pacientes jóvenes. Esta translocación es más
frecuente en LAM-M2, donde se encuentra en un 20-40% de los casos. Generalmente se produce un
único transcrito de fusión originado al unirse el exón 5 de AML1 con el exón 2 de ETO.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de Leucemia Aguda Mieloide
(LAM) al diagnóstico.
Una vez determinada la presencia de esta translocación y el tipo de transcrito, se podrá realizar un
seguimiento del paciente mediante PCR cuantitativa para determinar la efectividad del tratamiento y
prevenir una posible recaída.
Actualmente la presencia de la translocación AML1-ETO (RUNX1-RUNX1T1), en ausencia de mutaciones
en el gen KIT, se asocia a relativamente buen pronóstico en los pacientes con LAM, con una buena
respuesta a ciertos agentes terapéuticos, como arabinosido de citosina.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara cADN de la muestra a estudio.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1
(van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el
protocolo y preparado de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual.
En caso de observar una banda del tamaño adecuado, esta se secuenciará para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación AML1-ETO (RUNX1-RUNX1T1).
- No se detecta ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Byrd et al. "Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative
incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results
from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461)." Blood (2002) 100(13): 4325-36.
Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: 1901-1928
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TRANSLOCACIÓN SIL-TAL
La leucemia aguda linfoblástica se corresponde con un grupo heterogéneo de enfermedades originadas a
partir de células progenitoras B o T, que pueden ser clasificadas en base a criterios inmunológicos y
moleculares. La identificación de alteraciones moleculares asociadas a la trasformación leucémica ha
aportado, no solo información biológica, sino que también marcadores clínicos relevantes tanto para el
pronóstico de subgrupos, como para la monitorización de enfermedad mínima residual.
La fusión de los genes SIL (STIL) y TAL1 debido a una microdeleción en la región cromosómica 1p32 se
ha observado exclusivamente en leucemia aguda linfoblástica T (LAL-T). SIL codifica una proteína
citoplásmica implicada en la regulación del punto de chequeo mitótico. La proteína que codifica TAL1 es
esencial para el desarrollo de los linajes hematopoyéticos. La unión de estos genes genera tres posibles
de transcritos de fusión.
La incidencia de esta alteración en niños con LAL-T se estima entre un 2 y un 25% de los casos, y en
adultos en aproximadamente un 16%, predominando en adultos jóvenes. El valor pronóstico de esta
alteración no está claramente establecido en la actualidad.
Esta fusión génica debida a una microdeleción no puede ser detectada mediante análisis citogenéticos
clásicos.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de LAL-T.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ARN total a partir de la muestra de médula ósea tras la lisis osmótica de los eritorcitos. Se
prepara cADN a partir del ARN.
El método se realiza siguiendo las indicaciones de los protocolos desarrollados por el grupo BIOMED-1
(van Dongen et al 1999). Se realiza una PCR con las condiciones y los oligonucleótidos descritos en el
protocolo y preparado de forma manual en el laboratorio. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se interpretan de forma manual.
En caso de observar una banda del tamaño adecuado, esta se secuenciará para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación SIL-TAL1
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- No se detecta ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Van Dongen et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia (1999) 13: 1901-1928
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TRANSLOCACIÓN NPM1-ALK
INFORMACIÓN CLÍNICA
La translocación t(2;5)(p23;q35) está asociada al linfoma T anaplásico de célula grande. En esta
translocación se produce la fusión del gen NPM1 en 5q35, que codifica la nucleofosmina 1 con el gen
ALK, en el cromosoma 2, que codifica la protein kinasa ALK. La proteína quimérica que se produce
consiste en la fusión de la región N-terminal (aminoácidos 1-117) de NPM1 con el dominio citoplasmático
de ALK. Esta proteína quimérica mantiene una activación constante de la actividad tirosin kinasa de ALK,
con la consiguiente activación de las vías de señalización STAT3 y la inducción del factor de transcripción
C/EBPb y se considera que juega un papel fundamental en la oncogénesis. Existen otras translocaciones
del gen ALK que dan lugar al mismo tipo de alteración intracelular, aunque la más frecuente es la NPM1ALK.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil como apoyo diagnóstico en el linfoma anaplásico de célula T (ALK+) y para utilizar la detección de
la translocación para el seguimiento de enfermedad mínima residual.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ARN total de la muestra y posteriormente se sintetiza cADN.
La translocación se detecta mediante PCR con oligonucleótidos específicos del gen NPM1 y ALK. El
fragmento amplificado se secuencia para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
El estudio se realiza preferentemente sobre tejido en fresco o congelación.
Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino.
Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
En los resultados se indicará si se ha detectado o no la presencia de la translocación NPM1-ALK.
Precauciones.
Es posible que no todos los puntos de translocación estén cubiertos por las parejas de oligonucleótidos
utilizadas; de hecho se han descrito también fusiones de otros genes con el gen ALK en esta patología y
no se detectarían con las parejas de oligonucleótidos utilizadas. Por tanto, siempre que se produce un
resultado negativo mediante PCR, hay que tener en cuenta que la translocación podría existir y no haber
sido detectada.
TIEMPO DE RESPUESTA
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Entre 7 y 20 días laborables. La prueba se realiza
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Morris, S. W. et al. Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin’s
lymphoma. Science 1994; 263, 1281–1284
Falini B et al. ALK1 Lymphoma: Clinico-Pathological Findings and Outcome. Blood 1999 93: 2697-2706
Drexler HG et al. Pathobiology of NPM-ALK and variant fusion genes in anaplastic large cell lymphoma
and other lymphomas.Leukemia. 2000;14:1533–1559
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TRANSLOCACIÓN FIP1L1-PDGFRA
INFORMACIÓN CLÍNICA
La eosinofilia (> 0.5 x 109/L) es un hallazgo clínico frecuente que puede ser secundario a una gran
variedad de enfermedades. Cuando el estudio de la eosinofilia no revela cuáles pueden ser las causas
subyacentes, se sugiere el diagnóstico de síndrome hipereosinofílico. Éste se define por la presencia de
eosinofilia durante más de 6 meses, la exclusión de eosinofilia reactiva debida a infecciones por
parásitos, a alergias u otras causas conocidas, incluida eosinofilia asociada con neoplasias, y evidencia
de daño en órganos. En la última década se ha avanzado en el conocimiento de las bases moleculares de
del síndrome hipereosinofílico, lo que ha resultado en la caracterización de alteraciones genéticas
específicas asociadas a eosinofilia de origen clonal. La alteración genética más frecuentemente descrita
es una deleción críptica en la región cromosómica 4q12, del4(q12), que da lugar a la fusión de los genes
FIP1L1 y PDGFRA característico de la leucemia eosinofílica crónica.
El gen de fusión FIP1L1-PDGFRA induce un aumento en la actividad tirosin kinasa de PDGFRA, y está
presente en aproximadamente el 10-15% de los pacientes con síndrome hipereosinofílico. A pesar de
que los pacientes que presentan este gen de fusión parecen tener un fenotipo de la enfermedad más
severo, implicando una infiltración de órganos importante, son altamente sensibles al tratamiento con
inhibidores de tirosin kinasa tipo imatinib.
UTILIDAD CLÍNICA
La detección de la presencia del reordenamiento FIPIL1-PDGFRA es útil para confirmar el diagnóstico de
leucemia esoinofílica crónica y para identificar pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con
inhibidores de tirosin kinasa tipo imatinib.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ARN con Trizol tras eliminar los eritrocitos mediante lisis osmótica. Se obeitne cADN. Se
estudia la presencia de la fusión FIP1L1-PDGFRA mediante PCR de ARN utilizando parejas de
oligonucleótidos deducidas de las fusiones descritas por Cools et al (2003). En caso de obtener la
amplificación de algún fragmento, éste se secuenciará para confirmar los resultados.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se obtuvo amplificación de ningún fragmento correspondiente a la alteración mencionada.
- Se detecta la presencia de transcritos correspondientes a la translocación FIP1L1-PDGFRA
Preacauciones.
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Es posible que no todos los puntos de translocación estén cubiertos por las parejas de oligonucleótidos
utilizadas, de hecho se han descrito también fusiones de otros genes relacionadas con hipereosinofilia.
Por tanto, siempre que se produce un resultado negativo mediante PCR, hay que tener en cuenta que la
translocación podría existir y no haber sido detectada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Cools J et al. A tyrosine kinase created by fusion of the PDGFRA and FIP1L1 genes as a therapeutic
target of imatinib in idiopathic hypereosinophilic syndrome. New Engl J Med (2003) 348: 1201-1214
Pardanani A et al. FIP1L1-PDGFRA in eosinophilic disroders: Prevalence in routine clinical practice, longterm experience with imatinib therapy and critical review of the literature. Leukemia Res. (2006)
Store J et al. Identification of a novel imatinib responsive KIF5B-PDGFRA fusion gene following screening
for PDGFRA overexpression in patients with hypereosinophilia. Leukemia (2006)
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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MUTACIONES EN FLT-3 (ITDS Y TK)
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda mieloide aguda (LAM) constituye un grupo heterogéneo de neoplasias. La elección del
tratamiento que se aplica a los pacientes depende en gran medida del pronóstico estimado, siendo uno
de los factores más importantes la caracterización citogenética de las células tumorales, que permite
estratificar los pacientes en tres grupos: los de pronóstico favorable, intermedio y desfavorable (Byrd et
al. 2002).
El grupo de riesgo intermedio abarca un 40-50% de los pacientes; se define por la presencia de un
cariotipo normal (LAM-CN), presenta unas tasas de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia
global intermedias, aunque con una alta variación individual (Thiede et al. 2002) haciendo que sea un
grupo muy heterogéneo. En los últimos años, el avance en la caracterización de nuevas alteraciones
moleculares ha sido muy relevante, descubriéndose alteraciones que, además de tener un claro papel
pronóstico, podrían abrir la vía a nuevos tratamientos específicos. La identificación de mutaciones en los
genes FLT3 (“FMS-like tyrosine kinase 3”) y NPM1 (“nucleophosmin 1”) han sido algunas de las más
destacadas en este aspecto.
El gen FLT3 codifica un receptor de membrana que juega un papel importante en la hematopoyesis. Su
activación provocaría en último término el bloqueo de la apoptosis, de la diferenciación y el aumento de
la proliferación de progenitores específicos (Parcells et al. 2006). En este gen se han descrito dos tipos
de mutaciones relacionadas con la LAM.
La alteración más común consiste en una duplicación inteARN en tándem en el dominio juxtamembrana
(FLT3-ITD), de entre 3 y 400 bases, que no afecta a la pauta de lectura y que ocurre en un 15-35% de
los pacientes. El efecto de esta alteración supone una activación constitutiva del receptor que provoca en
las células una proliferación independiente de señalización y un bloqueo de la diferenciación de los
progenitores hematopoyéticos tempranos (Stirewalt et al. 2003). En una revisión del impacto del
porcentaje, tamaño y número de FLT3-ITD, Gale et al. 2008 Observaron que existía una elevada
tendencia a mayor riesgo de recaída y una menor supervivencia global a medida que aumentaba el nivel
de FT3-ITD, especialmente en aquellos pacientes con un nivel de ITD mayor del 50%, mientras que no
observaron impacto en cuanto a pronóstico en relación al tamaño y número de esta alteración.
El segundo tipo de alteración en FLT3 es una mutación puntual en uno de los dos dominios tirosín-kinasa
(FLT3-TKD), que provoca el cambio de ácido aspártico a tirosina (D835Y) y que ocurre en un 5-10% de
los casos (Stirewalt et al. 2003). Al igual que la alteración FLT3-ITD, esta mutación también podría
generar activación constitutiva del receptor (Abu-Duhier et al. 2001). Su relación con el pronóstico ha
sido menos clara y en la mayoría de estudios no se demuestra que exista una asociación de esta
mutación con el pronóstico Thiede et al. 2002.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de Leucemia Aguda Mieloide
(LAM) al diagnóstico, especialmente las de cariotipo normal y en pacientes menores de 65 años, de
acuerdo con los protocolos de Pethema (Programa Español de Tratamientos en Hematología de la
Sociedad Española de Hematología y Hemoterapia).
Actualmente la presencia de mutaciones tipo duplicaciones inteARNs en tandem (ITD inteARNl tandem
duplications) en el dominio JM del gen FLT3 tienen valor pronóstico negativo en los pacientes con LAM,
especialmente si el ratio entre el alelo mutado y el salvaje MUT/WT es mayor de 0,7.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se lisan los eritrocitos mediante lisis osmótica. Se prepara ARN y ADN a partir de la muestra.
El estudio mediante PCR se realiza a partir de cADN obtenido del ARN. Para la detección de las ITDs, se
realiza PCR utilizando oligonucleótidos que flanquean la región del exón 14 y se analiza mediante
electroforesis capilar en un ABIPRism310 utilizando software Genemapper 4.0. Se observa un pico de
amplificación único en caso de no existir mutación, y uno o más picos adicionales, de entre 3 y 90 pb
mayores de tamaño que el normal, en el caso de presencia de ITD. Se calcula el ratio MUT/WT
dividiendo el área de los picos MUT entre el area del pico WT.
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Para estudiar la mutación D835 del dominio TK se realiza PCR a partir del ADN genómico utilizando
oligonucleótidos que flanquean la zona. El producto de PCR se digiere con el enzima de restricción EcoRV
y se analiza en una electroforesis en agarosa.
El ensayo para detectar ITDs tiene una sensibilidad analítica teórica del 1-5%.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Médula ósea, anticoagulada con EDTA. (Contenedor): Tubo de tapón morado. 0,5-2 ml
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado. 2-4 ml.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
El resultado se interpretará como positivo para la presencia de mutación tipo ITD o en el dominio TK del
gen FLT3 o negativo para la presencia de mutaciones tipo ITD o en el dominio TK. Actualmente la
presencia de mutaciones tipo ITD es un factor de mal pronóstico en las LAM con cariotipo normal.
Precauciones.
El ensayo funciona de forma óptima en muestras al diagnóstico con importante carga tumoral. La
sensibilidad del ensayo no es suficiente para utilizarlo para determinar enfermedad mínima residual
durante la terapia, si bien estudios de nuestro laboratorio indican que la determinación de FLT3 ITD a
partir de cADN puede tener sensibilidad al menos igual a la citometría de flujo en la mayoría de las
muestras y por tanto podría ser una prueba complementaria en el estudio de emr.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 30 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Abu-Duhier et al. "Identification of novel FLT-3 Asp835 mutations in adult acute myeloid leukaemia." Br
J Haematol (2001) 113(4): 983-8.
Byrd et al. "Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative
incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results
from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461)." Blood (2002) 100(13): 4325-36.
Parcells et al. "FMS-like tyrosine kinase 3 in normal hematopoiesis and acute myeloid leukemia." Stem
Cells (2006) 24(5): 1174-84.
Patel JP et al. Prognostic Relevance of Integrated Genetic Profiling in Acute Myeloid Leukemia. New Engl
J Med (2012) 366:2321-2322.
Stirewalt et al. "The role of FLT3 in haematopoietic malignancies." Nat Rev Cancer (2003) 3(9): 650-65.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Thiede et al. "Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia:
association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis." Blood (2002)
99(12): 4326-35
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MUTACIONES EN NPM1 (EXÓN 12)
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda mieloide (LAM) constituye un grupo heterogéneo de neoplasias. La elección del
tratamiento que se aplica a los pacientes depende en gran medida del pronóstico estimado siendo uno
de los factores más importantes la caracterización citogenética de las células tumorales, que permite
estratificar los pacientes en tres grupos: los de pronóstico favorable, intermedio y desfavorable (Byrd et
al. 2002).
El grupo de riesgo intermedio abarca un 40-50% de los pacientes; se define por la presencia de un
cariotipo normal (LAM-CN), presenta unas tasas de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia
global intermedias, aunque con una alta variación individual (Thiede et al. 2002) haciendo que sea un
grupo muy heterogéneo. En los últimos años, el avance en la caracterización de nuevas alteraciones
moleculares ha sido muy relevante, descubriéndose alteraciones que, además de tener un claro papel
pronóstico, podrían abrir la vía a nuevos tratamientos específicos. La identificación de mutaciones en los
genes FLT3 (“FMS-like tyrosine kinase 3”) y NPM1 (“nucleophosmin 1”) han sido algunas de las más
destacadas en este aspecto.
La nucleofosmina (NPM1) es una fosfoproteína abundante que se expresa de manera ubicua en todos los
tejidos. Su localización principal es en el nucleolo, aunque se traslada constantemente entre el núcleo y
el citoplasma tomando parte en varios procesos celulares relacionados tanto con proliferación como con
supresión del crecimiento (Falini et al. 2007).
Las mutaciones en NPM1 fueron descritas en por primera vez por Falini et al. 2005, y son además, las
mutaciones más frecuentes en los pacientes de LAM, ocurriendo en un 27% de todas las LAM o en un
45% considerando unicamente las de cariotipo normal (Thiede et al. 2006). La alteración más frecuente
consiste inserciones de 4 bases en el exón 12 del gen, que provocan un cambio de pauta de lectura en el
extremo C-terminal de la proteína, con aumento del número de aminoácidos de la proteína, destrucción
de señales de localización nucleolar y una localización aberrante de la proteína en el citoplasma.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de Leucemia Aguda Mieloide
(LAM) al diagnóstico, especialmente las de cariotipo normal y en pacientes menores de 65 años, de
acuerdo con los protocolos de Pethema (Programa Español de Tratamientos en Hematología de la
Sociedad Española de Hematología y Hemoterapia).
Actualmente la presencia de mutaciones en NPM1 son un factor de buen pronóstico en pacientes con
LAM, cariotipo normal, mutaciones en IDH1 o IDH2 y ausencia de mutaciones en FLT3 (ITD) (Patel et al
2012).
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se lisan los eritrocitos mediante lisis osmótica. Se prepara ARN y ADN a partir de la muestra.
El estudio se realiza según lo descrito en Pitiot et al 2007. Se realiza PCR a partir de cADN obtenido del
ARN. Los oligonucleótidos que se utilizan flanquean la región del exón 12, uno de ellos está marcado con
fluorescencia de forma que el resultado se analiza mediante electroforesis capilar en un ABIPRism310
utilizando software Genemapper 4.0. Se observa un pico de amplificación único de 238 pb en caso de no
existir mutación, y un pico adicional 4pb mayor de tamaño que el normal, en el caso de presencia de
inserción.
El ensayo para detectar inserciones tiene una sensibilidad analítica teórica del 1-5%.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 42 de 127
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
El resultado se interpretará como positivo para la presencia de mutación en NPM1 o negativo para la
presencia de mutaciones en NPM1. Actualmente la presencia de mutaciones en NPM1 es un factor de
mejor pronóstico en las LAM con cariotipo normal, especialmente si van acompañadas de mutaciones en
IDH1 o IDH2 y en ausencia de alteraciones tipo ITD en FLT3 (Patel et al, 2012)
Precauciones.
El ensayo funciona de forma óptima en muestras al diagnóstico con importante carga tumoral. La
sensibilidad del ensayo no es suficiente para utilizarlo para determinar enfermedad mínima residual
durante la terapia, ya que la sensibilidad es baja, alrededor del 1-5%.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 30 días laborables. La prueba se realiza una vez
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Byrd et al. "Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative
incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results
from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461)." Blood (2002) 100(13): 4325-36.
Falini et al. "Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype." N
Engl J Med (2005) 352(3): 254-66.
Falini et al. "Acute myeloid leukemia carrying cytoplasmic/mutated nucleophosmin (NPMc+ AML):
biologic and clinical features." Blood (2007) 109(3): 874-85.
Patel JP et al. Prognostic Relevance of Integrated Genetic Profiling in Acute Myeloid Leukemia. New Engl
J Med (2012) 366:2321-2322.
Pitiot et al. A new type of NPM1 gene mutation in AML leading to a C-terminal truncated protein.
Leukemia (2007) 21: 1564-6
Thiede et al. "Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia:
association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis." Blood (2002)
99(12): 4326-35
Thiede et al. "Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutations in 1485 adult patients with acute
myeloid leukemia (AML)." Blood (2006) 107(10): 4011-20.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 43 de 127
MUTACIONES EN CEBPA
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda mieloide (LAM) constituye un grupo heterogéneo de neoplasias. La elección del
tratamiento que se aplica a los pacientes depende en gran medida del pronóstico estimado siendo uno
de los factores más importantes la caracterización citogenética de las células tumorales, que permite
estratificar los pacientes en tres grupos: los de pronóstico favorable, intermedio y desfavorable.
El grupo de riesgo intermedio abarca un 40-50% de los pacientes; se define por la presencia de un
cariotipo normal (LAM-CN), presenta unas tasas de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia
global intermedias, aunque con una alta variación individual, haciendo que sea un grupo muy
heterogéneo. En los últimos años, el avance en la caracterización de nuevas alteraciones moleculares ha
sido muy relevante, descubriéndose alteraciones que, además de tener un claro papel pronóstico,
podrían abrir la vía a nuevos tratamientos específicos.
Además de mutaciones más frecuentes en los genes FLT3 y NPM1, en los últimos años se han
identificado otras alteraciones con una prevalencia menor, pero que pueden asimismo tener gran
relevancia. Entre ellas destacan, como indicadores de un pronóstico favorable, las mutaciones en CEBPA
(“CCAAT enhancer binding factor”). CEBPA codifica un factor de transcripción que juega un papel
importante en la diferenciación hematopoyética. Está mutado aproximadamente en un 10% de AML con
cariotipo normal, siendo las mutaciones muy heterogéneas y distribuidas en toda la región codificante
del gen.
La proteína de 42 kDa codificada por este gen es el factor de transcripción CCAAT/enhancer binding
protein-α (C/EBPα). Esta proteína contiene 3 elementos de transactivación, TE-I, TE-II and TE-III, así
como una región básica de unión al ADN con estructura de cremallera de leucinas (BR-LZ) en la zona Cterminal. Esta proteína media la represión del factor de transcripción E2F y la granulopoiesis. Las formas
mutantes de C/EBPα que se observan en pacientes con LAM dan lugar a la producción de una proteína
de menor tamaño, 30 kDa, por eliminación de una región N-terminal. Esta proteína no puede reprimir la
actividad de E2F, aunque conserva la capacidad de unión al ADN mediante el dominio BR-LZ. Por ello
puede promover el paso hacia la granulopoiesis y la proliferación celular, pero no la diferenciación
terminal. Este es el tipo de mutación más frecuentemente detectado en pacientes con LAM, junto otras
mutaciones en la región BR-LZ, que impiden la unión al ADN bloqueando la transcripción de genes clave.
Es importante señalar que el valor pronóstico positivo de las mutaciones en CEBPA se ha demostrado
sólo cuando existe inactivación bialélica del gen.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de Leucemia Aguda Mieloide
(LAM) al diagnóstico, en paciente con cariotipo normal, menores de 65 años y con FLT3 y NPM1 no
mutados.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se lisan los eritrocitos mediante lisis osmótica. Se prepara ARN y ADN a partir de la muestra.
Se realiza una amplificación mediante PCR a partir de 100-300 ng de ADN y utilizando oligonucleótidos
específicos que flanquean las regiones a estudio. Se utiliza un control negativo en cada estudio. El gen
CEBPA no contiene intrones. Se amplifica toda la región codificante utilizando parejas de oligoncleótidos
que amplifican varios fragmentos solapantes. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en
gel de agarosa y es secuenciado utilizando los oligonucleótidos con los que se amplificó la muestra. Los
cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos y manualmente para
determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen.
Mediante esta técnica se puede detectar posibles mutaciones puntuales y pequeñas deleciones o
inserciones en este gen mediante secuenciación con una sensibilidad analítica teórica del 15-20%.
CEBPA es un gen con alto contenido en GC, por lo la amplificación mediante PCR en algunas regiones es
poco eficaz. Para subsanar este problema se necesita utilizar una ADN polimerasa específica para este
tipo de secuencias.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
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Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para
determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es negativa para la presencia de mutación en CBPA.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en CBPA. Se incluirá una descripción de las
mutaciones a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Precauciones importantes.
El valor pronóstico positivo de las mutaciones en este gen sólo es válido cuando se detectan mutaciones
en ambos alelos del gen. Es decir, se deben detectar dos mutaciones o una de ellas en homocigosis.
Existen numerosos polimorfismos descritos en este gen que anteriormente se consideraron mutaciones
somáticas pero actualmente están cuestionados como mutaciones con valor pronóstico.
Un resultado negativo no excluye la presencia de una mutación que pueda estar presente pero por
debajo de los límites de detección del ensayo.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 30 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Benthaus et al. “Rapid and sensitive screening for CEBPA mutations in acute myeloid leukaemia” Brtish J
Hematol (2008) 143: 230-239.
Byrd et al. "Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative
incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results
from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461)." Blood (2002) 100(13): 4325-36.
Frohling et al. "CEBPA mutations in younger adults with acute myeloid leukemia and normal
cytogenetics: prognostic relevance and analysis of cooperating mutations." J Clin Oncol (2004) 22(4):
624-33.
Nerlov C. CEBPA mutations in acute myeloid leukemia. Nat Cancer Rev (2004) 4: 394-400
Thiede et al. "Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia:
association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis." Blood (2002)
99(12): 4326-35
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DETERMINACIÓN DE ESTADO MUTACIONAL DE IGHV
INFORMACIÓN CLÍNICA
En los últimos años se ha incrementado de forma significativa el conocimiento de los mecanismos
moleculares que subyacen a la patogénesis de la leucemia linfática crónica (LLC), y ha habido un
importante avance en la identificación de marcadores moleculares y celulares que pueden predecir el
curso de la enfermedad y guiar en el diseño de terapias adaptadas al riesgo. Uno de estos marcadores
se identificó en 1999, cuando dos grupos de manera independiente demostraron que las
hipermutaciones somáticas presentes en las regiones variables de la cadena pesada de los genes de
inmunoglobulinas reordenados (IGHV) predicen el curso clínico de la enfermedad en LLC. En concreto, el
curso de la enfermedad en los pacientes con el gen IGHV mutado es mucho más indolente que en
aquellos pacientes que tienen los genes IGHV no mutados, en los que es más frecuente presentar una
enfermedad avanzada, con mayor número de alteraciones citogenéticas, con evolución clonal y
resistencia a la quimioterapia. Este hallazgo ha sido confirmado posteriormente por muchos grupos,
quedando establecido que “el estatus mutacional” del gen IGHV es uno de los marcadores de pronósticos
más robustos en LLC.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil para determinar si la población de células tumorales de LLC tiene un estatus mutado o no mutado
del gen IGHV reordenado que portan, sirviendo el conocimiento de este estatus como factor pronóstico.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN genómico a partir de la sangre periférica tras lisis osmótica de los eritrocitos.
Se amplifican los fragmentos correspondientes a los segmentos IGHV-D-JH con reordenamiento
monoclonal realizando reacciones de PCR por separado con cada pareja de oligonucleótidos de los
descritos en el protocolo de PCR múltiple recomendado por el consorcio BIOMED-2 (van Dongen et al.
2003). Para realizar el estudio de secuencia, se selecciona y purifica el fragmento correspondiente a la
amplificación del mayor segmento génico, que contiene tres CDRs (complementarity-determining regions
1-3) y dos FR (frameworks 2 y 3). La reacción de secuencia se analiza en un secuenciador y los
resultados se comparan con secuencias del banco de datos IMGT (Immunogenetics database).
El porcentaje de homología con la secuencia de línea germinal IGHV más parecida se calcula teniendo en
cuenta el número de diferencias entre el extremo 5’ de CDR1 y el extremo 3’ de FR3. Se consideran
secuencias como “mutadas” si el porcentaje de diferencias respecto a la secuencia de IGHV línea
germinal más parecida difiere en más del 2%.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Ganglio linfático / biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Ganglio linfático en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
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El porcentaje de homología con la secuencia de línea germinal IGHV más parecida se calcula teniendo en
cuenta el número de diferencias entre el extremo 5’ de CDR1 y el extremo 3’ de FR3. Se consideran
secuencias como “mutadas” si el porcentaje de diferencias respecto a la secuencia de IGHV línea
germinal más parecida difiere en más del 2%.
Teniendo en cuenta estos datos, tras la interpretación de los mismos, los resultados se expresarán de la
siguiente forma:
- Estatus mutacional de IGHV en este paciente: MUTADO, o
- Estatus mutacional de IGHV en este paciente: NO MUTADO
El curso de la enfermedad en los pacientes con el gen IGHV mutado es mucho más indolente que en
aquellos pacientes que tienen los genes IGHV no mutados, en los que es más frecuente presentar una
enfermedad avanzada, con evolución clonal y resistencia a la quimioterapia.
Precauciones.
En ocasiones no es posible realizar una interpretación clara del resultado de la secuenciación, debido a
varios tipos de posibles problemas, tales como la amplificación de un único fragmento cuyo
reordenamiento IGHV/IGHD/IGHJ no es “productivo”, es decir, no daría lugar a una proteína funcional;
otro problema puede ocurrir cuando existe un doble reordenamiento, siendo el estatus mutacional
discordante entre ellos; también podría ocurrir la amplificación de un fragmento que carece de residuos
críticos en CDR3 y por tanto daría lugar a una proteína no funcional. En todos estos casos, o en otros en
los que se produzcan problemas técnicos, si no se puede resolver la interpretación del estatus
mutacional, el resultado se dará como “no valorable”, explicando las razones que llevan a esta
conclusión.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 10 y 45 días laborables. La prueba se realiza
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Damle RN, et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in
chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94:1840–1847.
Hamblin TJ et al. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic
lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94: 1848–1854.
Ghia P, et al. European Research Initiative on CLL. ERIC recommendations on IGHV gene mutational
status analysis in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2007; 21: 1–3.
Langerak et al. Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC
review board for reliable interpretation of problematic cases. Leukemia (2011) 25: 979-984
Lefranc M-P, et al. IMGTs, the inteARNtional ImMunoGeneTics information systems. Nucl Acids Res
2009; 37: D1006–D1012.
Van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations. Leukemia
(2003) 17: 2257-2317.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 47 de 127
TRANSLOCACIONES EWSR1-FLI1; EWSR1-ERG
INFORMACIÓN CLÍNICA
Los tumores de la familia de los sarcomas de Ewing incluyen: el sarcoma de Ewing, tumor
neuroectodermico primitivo (PNET) y tumor de Askin. Son tumores de célula redonda pequeña
indiferenciada que aparecen principalmente en el hueso y con menor frecuencia en tejidos blandos.
Aunque que estos tumores son raros, menos del 10% de las malignidades humanas, son muy agresivos
y ocurren frecuentemente en los huesos largos y en la pelvis donde pueden metastatizar rápidamente a
la medula ósea, pulmón y otros tejidos. El sarcoma de Ewing es el segundo cancer de hueso más común,
ocurriendo más frecuentemente en niños caucásicos, adolescentes y adultos jóvenes, y siendo
considerado una malignidad de alto grado.
Este tipo de tumores se caracterizan por la translocación del gen EWS con un miembro de la familia de
genes ETS, que son factores de transcripción. En aproximadamente el 90% de los casos se produce la
translocación EWS-FLI1 t(11;22)(q24;12). Los puntos de ruptura son variables, con al menos 10
transcritos diferentes detectables mediante RT-PCR. El más frecuente es el transcrito tipo 1 (EWS exón 7
unido a FLI1 exón 6) que parece tener un pronóstico más favorable comparado con otros tipos de
transcritos, aunque este aspecto no ha sido confirmado en estudios multicéntricos.
La translocación EWS-ERG, t(21;22)(q22;q12), es la siguiente más común y ocurre en
aproximadamente un 5% de los casos. En este tipo de tumores, EWS puede fusionarse también con
otros genes que incluyen FEV, ETV1, ETV4 y ZSG, aunque la frecuencia con la que ocurre es menor del
1%.
UTILIDAD CLÍNICA
Apoyo al diagnóstico en caso de sospecha de sarcoma de Ewing.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ARN total a partir de la muestra a estudio y posteriormente se sintetiza cADN.
Tras comprobar la amplificabilidad del cADN, se realizan pruebas de amplificación mediante PCR
utilizando parejas de oligonucleótidos específicos que permiten amplificar los genes de fusión más
frecuentes del sarcoma de Ewing , EWS-FLI y EWS-ERG. Los experimentos de amplificación mediante
PCR se realizan de acuerdo con técnicas standard, utilizando siempre los correspondientes controles
negativos de amplificación para cada pareja de oligonucleótidos. Los productos de PCR se analizan
mediante electroforesis en gel de agarosa y los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento
amplificado se secuencia para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino.
Biopsia en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación EWSR1-FLI1/ EWSR1-ERG.
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
Precauciones:
Es posible que no todos los puntos de translocación estén cubiertos por las parejas de oligonucleótidos
utilizadas, o la calidad de la muestra impida la amplificación correcta del producto. Por tanto, siempre
que se produce un resultado negativo mediante PCR, hay que tener en cuenta que la translocación
podría existir y no haber sido detectada. Existen otras translocaciones entre EWSR1 y otros genes, muy
poco frecuentes, que se podrían ensayar adicionalmente en caso de solicitud por el clínico cuando la
muestra es negativa para las translocaciones más frecuentes y existe alta sospecha de diagnóstico de
este sarcoma.
Se recomienda enviar tejido en fresco o en congelación para realizar este tipo de estudios, en lugar de
tejido en parafina.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Chang et al. Molecular Genetics of Pediatric Soft Tissue Tumors. Review. JMD (2003) 5 (3): 143-154.
Ross el al. The Biology of Ewing Sarcoma. Review. ISRN Oncology (2013) ID 759725.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 49 de 127
TRANSLOCACIONES SYT-SSX1; SYT-SSX2
INFORMACIÓN CLÍNICA
El sarcoma sinovial es un tumor de partes blandas que puede ocurrir a cualquier edad aunque afecta
principalmente a adultos jóvenes. Se divide en dos subtipos histológicos, bifásico y monofásico según la
presencia o ausencia de un componente epitelial glandular bien desarrollado. En un 95% de los
sarcomas sinoviales, se ha identificado una translocación característica, t(X;18)(p11;q11) que produce
la unión del extremo 5’ del gen SYT en el cromosoma 18 con el extremo 3’ del gen SSX1 o SSX2 en el
cromosoma X. El gen de fusión que se genera codifica un factor de transcripción quimérico, que altera la
remodelación de la cromatina, y puede inducir cambios en los patrones de expresión de genes
importantes.
Por un lado SYT-SSX1 se asocia a sarcomas sinoviales con histología bifásica con una mayor tasa de
proliferación y a un peor pronóstico; mientras que la presencia de SYT-SSX2 se asocia a morfología
monofásica y a una mayor supervivencia global y libre de metástasis, aunque el valor pronóstico de las
distintas fusiones se encuentra aún en discusión.
UTILIDAD CLÍNICA
Apoyo diagnóstico de sarcoma sinovial.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ARN total a partir de la muestra a estudio, y a continuación se sintetiza cADN. Se comprueba
la calidad del ARN obtenido mediante retro-transcripción y amplificación de un segmento del gen de
actina, mediante técnicas estandarizadas en nuestro laboratorio. El método para amplificar las fusiones
SYT-SSX1 y/o SYT-SSX2 se realiza siguiendo las indicaciones de Kawai et al. 1998. Los experimentos de
amplificación mediante PCR a partir de cADN sintetizado in vitro se realizaron de acuerdo con técnicas
estándar, utilizando siempre los correspondientes controles negativos de amplificación para cada pareja
de oligonucleótidos. Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa y los
resultados se interpretan de forma manual. El fragmento amplificado se secuencia para confirmar el
resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Biopsia de tejido en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación SYT-SSX1 ó SYT-SSX2
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Precauciones:
Es posible que no todos los puntos de translocación estén cubiertos por las parejas de oligonucleótidos
utilizadas, o la calidad de la muestra impida la amplificación correcta del producto. Por tanto, siempre
que se produce un resultado negativo mediante PCR, hay que tener en cuenta que la translocación
podría existir y no haber sido detectada.
Se recomienda enviar tejido en fresco o en congelación para realizar este tipo de estudios, en lugar de
tejido en parafina.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Chang et al. Molecular Genetics of Pediatric Soft Tissue Tumors. Review. JMD (2003) 5 (3): 143-154.
Crew A J et al. Fusion of SYT to two genes, SSX1 and SSX2, encoding proteins with homology to the
Kruppel associated box in human synovial sarcoma. The EMBO JouARNl. 1995 14 (10):2333-2340.
Kawai A et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.
The New England JouARNl of Medicine. 1998 338 (3):153-160.
Ladanyi L. Fusions of the SYT and SSX genes in synovial sarcoma. Oncogene. 2001 20: 5755-5762.
dos Santos et al. Molecular mechanism underlying human synovial sarcoma development.
Chromosomes Cancer. 2001 30 (1): 1-14.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Genes
Página 51 de 127
TRANSLOCACIÓN EWSR1-ATF1
INFORMACIÓN CLÍNICA
Los sarcomas de células claras comparten muchas características fenotípicas con los melanomas
cutáneos malignos, llegando incluso a ser difícil distinguir entre ambos histológicamente. A pesar de
estas similitudes histológicas, ambas entidades son diferentes clínicamente. Los sarcomas de células
claras se presentan frecuentemente como masas aisladas localizadas en tejidos blandos profundos sin
aparente origen en la piel. A pesar de que diferentes estudios de arrays en cADN demuestran que el
sarcoma de células claras se parece más biológicamente al melanoma cutáneo que a otros sarcomas,
aproximadamente un 75% de los sarcomas de células claras presentan una translocación cromosómica,
t(12;22)(q13;q12) que hasta el momento no se ha observado en melanoma cutáneo.
La translocación t(12;22)(q13;q12) une el gen ATF1 en el cromosoma 12 con el gen EWS en el
cromosoma 22. Esto implica que el gen EWS se une al dominio de unión del ADN de un factor de
transcripción (ATF1) como ocurre en el sarcoma de Ewing. Se cree que la fusión EWS-ATF1 funcionaría
como un activador transcripcional alterando la regulación de los genes controlados en condiciones
normales por ATF1.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza para apoyo diagnóstico de sarcoma de células claras.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ARN total a partir de la muestra a estudio y posteriormente se sintetiza cADN. Se comprueba
la calidad del ARN obtenido mediante retro-transcripción y amplificación de un segmento del gen de
actina, mediante técnicas estandarizadas en nuestro laboratorio. Para determinar la existencia de la
translocación EWS-ATF1 se utilizan oligonucleótidos diseñados de acuerdo con la información conocida
en la literatura sobre esta translocación y las secuencias conocidas y depositadas en los Bancos de datos
de genes. Éstos se utilizan para realizar distintas amplificaciones mediante PCR y con cADN sintetizado
in vitro a partir del ARN total como molde para la reacción. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa y los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento
amplificado se secuencia para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino (entre 10-100 mg
de tejido)
Biopsia de tejido en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación EWSR1-ATF1
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 52 de 127
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
Precauciones:
Es posible que no todos los puntos de translocación estén cubiertos por las parejas de oligonucleótidos
utilizadas, o la calidad de la muestra impida la amplificación correcta del producto. Por tanto, siempre
que se produce un resultado negativo mediante PCR, hay que tener en cuenta que la translocación
podría existir y no haber sido detectada.
Se recomienda enviar tejido en fresco o en congelación para realizar este tipo de estudios, en lugar de
tejido en parafina.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Ordoñez et al. The Clinical Relevance of Molecular Genetics in Soft Tissue Sarcomas. Adv Anat Pathol
(2010) 17 (3): 162-181.
Rijn M et al. Genetics of Soft Tissue Tumors. Ann. Rev. Pathol. Mech. (2006) 1: 435-466.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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TRANSLOCACIONES PAX3-FOXO1A; PAX7-FOXO1A
INFORMACIÓN CLÍNICA
El rabdomiosarcoma es el tipo más común en los tumores pediátricos de partes blandas, englobando
aproximadamente un 50% de los casos. Los subtipos se definen en función de la apariencia histológica,
presentación clínica y supervivencia. Los principales subtipos morfológicos son el rabdomiosarcoma
alveolar (20% de los casos) y rabdomiosarcoma embrionario (65%) de los casos. Las translocaciones
PAX3-FOXO1A y PAX7-FOXO1A son características del rabdomiosarcoma alveolar.
La translocación t(2;13)(q35;q14) (PAX3-FOXO1A) es el reordenamiento detectado más comúnmente,
ocurriendo aproximadamente en un 75% de los casos. Con una frecuencia menor (aproximadamente un
10% de los casos) se observa otra translocación t(1;13)(p36;q14) que implica los genes PAX7 y
FOXO1A.
PAX3 y PAX7 pertenecen a la familia de los genes PAX que codifican factores de transcripción
importantes para el desarrollo embrionario. FOXO1A pertenence a una familia de genes diferente pero
que también codifican factores de transcripción implicados en el desarrollo embrionario.
Las proteínas de fusión derivadas de ambas translocaciones son similares y poseen actividad
oncogénica, sin embargo tienen distinto valor pronóstico en los pacientes en los que se observan. PAX3FOXO1A parece tener un pronóstico adverso, mientras que PAX7-FOXO1A se asocia a pacientes con
pronóstico favorable y se observa más frecuentemente en pacientes jóvenes con una enfermedad
relativamente localizada.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza para apoyo diagnóstico de rabdomiosarcoma alveolar.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ARN a partir de la muestra a estudio y a continuación se sintentiza cADN.
Tras comprobar la amplificabilidad del cADN, se realizaran pruebas de amplificación mediante PCR
utilizando parejas de oligonucleótidos específicos que permiten amplificar los genes de fusión PAX3FOXO1 y PAX7-FOXO1, característicos del rabdomiosarcoma alveolar y descritos por Barr y cols. 2002.
Los experimentos de amplificación mediante PCR se realizan de acuerdo con técnicas standard,
utilizando siempre los correspondientes controles negativos de amplificación para cada pareja de
oligonucleótidos. Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa y los
resultados se interpretan de forma manual. El fragmento amplificado se secuencia para confirmar el
resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino (entre 10-100 mg
de tejido)
Biopsia de tejido en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 54 de 127
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación t(2;13)(q35;q14) (PAX3-FOXO1A) /
t(1;13)(p36;q14) PAX7-FOXO1A.
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
Precauciones:
Es posible que no todos los puntos de translocación estén cubiertos por las parejas de oligonucleótidos
utilizadas, o la calidad de la muestra impida la amplificación correcta del producto. Por tanto, siempre
que se produce un resultado negativo mediante PCR, hay que tener en cuenta que la translocación
podría existir y no haber sido detectada.
Se recomienda enviar tejido en fresco o en congelación para realizar este tipo de estudios, en lugar de
tejido en parafina.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Barr et al. Genetic Heterogeneity in the Alveolar Rhabdomiosarcoma Subset without Typical Gene
Fusions. CANCER RESEARCH (2002) 15: 4704-4710.
Chang et al. Molecular Genetics of Pediatric Soft Tissue Tumors. Review. JMD (2003) 5 (3): 143-154.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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TRANSLOCACION EWSR1-WT1
INFORMACIÓN CLÍNICA
El tumor desmoplásico de células redondas pequeñas es un sarcoma primitivo que afecta principalmente
a adultos jóvenes, y que tiende a localizarse mayoritariamente en la zona peritoneal. Esta asociado a
una translocación característica, t(11;22)(p13;q12), que fusiona la región 5’ del gen EWS en el
cromosoma 22, con el extremo 3’ de WT1, el supresor tumoral de Wilms, en el cromosoma 11. Ambos
genes descritos previamente como implicados en otras neoplasias.
Aunque se han descrito diferentes tipos de fusiones, el transcrito más común corresponde a la unión de
los primeros 7 exones de EWS y los tres últimos de WT1.
La oncoproteína derivada de la translocación EWS-WT1 es un factor de transcripción aberrante que
regula la expresión de genes como PDGFRA, un factor de crecimiento fibroblástico, el cual podría estar
involucrado en la fibrosis característica de esta neoplasia. Esto hace que los inhibidores de factores de
crecimiento derivados de plaquetas como imatinib puedan ser un agente terapéutico de interés para este
tumor.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza como apoyo diagnóstico del tumor desmoplásico de células redondas pequeñas.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ARN total a partir de la muestra a estudio y posteriormente sesintetiza cADN. Se comprueba
la calidad del ARN obtenido mediante retro-transcripción y amplificación de un segmento del gen de
actina, mediante técnicas estandarizadas en nuestro laboratorio. Para determinar la existencia de la
translocación EWS-WT1 se utilizan oligonucleótidos diseñados de acuerdo con la información conocida en
la literatura sobre esta translocación y las secuencias conocidas y depositadas en los Bancos de datos de
genes. Éstos se utilizan para realizar distintas amplificaciones mediante PCR y con cADN sintetizado in
vitro a partir del ARN total como molde para la reacción. Los productos de PCR se analizan mediante
electroforesis en gel de agarosa y los resultados se interpretan de forma manual. El fragmento
amplificado se secuencia para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino (entre 10-100 mg
de tejido)
Biopsia de tejido en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación t(11;22)(p13;q12) EWS-WT1.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
Precauciones:
Es posible que no todos los puntos de translocación estén cubiertos por las parejas de oligonucleótidos
utilizadas, o la calidad de la muestra impida la amplificación correcta del producto. Por tanto, siempre
que se produce un resultado negativo mediante PCR, hay que tener en cuenta que la translocación
podría existir y no haber sido detectada.
Se recomienda enviar tejido en fresco o en congelación para realizar este tipo de estudios, en lugar de
tejido en parafina.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Alava E et al. Detection of Chimeric Transcripts in Desmoplastic Small Round Cell Tumor and Related
Developmental Tumors by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction. American JouARNl of
Pathology (1995) 147 (6): 1584-1591.
Chang et al. Molecular Genetics of Pediatric Soft Tissue Tumors. Review. JMD (2003) 5 (3): 143-154.
Liu J et al. Molecular Heterogeneity and Function of EWS-WT1 Fusion Transcripts in Desmoplastic Small
Round Cell Tumors. Clinical Cancer Research (2002) 6: 3522-3529.
Ordoñez et al. The Clinical Relevance of Molecular Genetics in Soft Tissue Sarcomas. Adv Anat Pathol
(2010) 17 (3): 162-181.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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TRANSLOCACIÓN EWSR1-CHOP; TLS-CHOP
INFORMACIÓN CLÍNICA
Los genes de fusión EWS-CHOP y TLS-CHOP son marcadores característicos tanto del liposarcoma
mixoide como del liposarcoma de células redondas. El liposarcoma mixoide fue definido como un
sarcoma de bajo grado, con bajo riesgo de metástasis, supervivencia prolongada y es más común que el
liposarcoma de células redondas, que es un subtipo de alto grado. Ambos tipos de liposarcomas se
agrupan ahora en una única entidad según la clasificación de la Organización Mundial de la Salud.
En más del 90% de estos tumores se observa la translocación TLS-CHOP t(12;16)(q13;p11) como
resultado de la fusión del gen CHOP en el cromosoma 12 con el gen TLS (FUS), análogo del gen EWS, en
el cromosoma 16. Por otro lado, aproximadamente un 5% de los casos presentan la fusión EWS-CHOP
t(12;22)(q13;q12). CHOP es un factor de transcripción. En la proteína quimérica TLS-CHOP, la región de
unión al ARN de TLS está reemplazada por el dominio de unión al ADN de CHOP.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio se realiza para como apoyo diagnóstico del liposarcoma mixoide.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ARN total a partir de la muestra a estudio y posteriormente se sintetiza cADN. Se comprueba
la calidad del ARN obtenido mediante retro-transcripción y amplificación de un segmento del gen de
actina, mediante técnicas estandarizadas en nuestro laboratorio. Para determinar la existencia de las
translocaciones EWS-CHOP y TLS-CHOP se utilizan oligonucleótidos diseñados de acuerdo con la
información conocida en la literatura sobre esta translocación y las secuencias conocidas y depositadas
en los Bancos de datos de genes. Éstos se utilizan para realizar distintas amplificaciones mediante PCR y
con cADN sintetizado in vitro a partir del ARN total como molde para la reacción. Los productos de PCR
se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa y los resultados se interpretan de forma manual.
El fragmento amplificado se secuencia para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino (entre 10-100 mg
de tejido)
Biopsia de tejido en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de la translocación EWS-CHOP / TLS-CHOP.
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
Precauciones:
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Es posible que no todos los puntos de translocación estén cubiertos por las parejas de oligonucleótidos
utilizadas, o la calidad de la muestra impida la amplificación correcta del producto. Por tanto, siempre
que se produce un resultado negativo mediante PCR, hay que tener en cuenta que la translocación
podría existir y no haber sido detectada.
Se recomienda enviar tejido en fresco o en congelación para realizar este tipo de estudios, en lugar de
tejido en parafina.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Hosaka T et al. A Novel Type of EWS-CHOP Fusion Gene in Two Cases of Myxoid Liposarcoma. JouARNl
of Molecular Diagnostics (2002) 4 (3): 164-171.
Ordoñez et al. The Clinical Relevance of Molecular Genetics in Soft Tissue Sarcomas. Adv Anat Pathol
(2010) 17 (3): 162-181.
Rijn M et al. Genetics of Soft Tissue Tumors. Ann. Rev. Pathol. Mech. (2006) 1: 435-466.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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TRANSLOCACIÓN FUS-CREB3L2; FUS-CREB3L1
INFORMACIÓN CLÍNICA
El sarcoma fibromixoide de bajo grado se localiza típicamente en el tejido blando intramuscular profundo
en las extremidades superiores o el tronco en adultos jóvenes. Este tumor puede ser confundido con
tumores benignos como la fibromatosis desmoide, o con otros tumores malignos, como el
mixofibrosarcoma. El sarcoma fibromixoide tiene el potencial de producir recurrencias locales y
metástasis.
El descubrimiento de que el sarcoma fibromixoide de bajo grado tiene una translocación específica
t(7;16)(q33;p11), o en casos menos frecuentes t(11;16)(p11;p11), ha facilitado el diagnóstico en gran
medida. Por medio de estas translocaciones se producen los genes quiméricos FUS-CREB3L2 o FUSCREB3L1. EL gen FUS pertenence a la familia FET de proteínas que se unen a ARN y que están
implicadas en procesos celulares que incluyen regulación de la expresión génica, mantenimiento de la
integridad genómica y procesamiento de ARNm/microARNs. A nivel molecular, en esta translocación el
extremo 5’ de FUS, que codifica un dominio de transactivación, se fusiona con la región 3’ de CREB3L2 o
CREB3L1, que codifica un dominio de unión a ADN de tipo cremallera de leucina. Esta translocación no
está presente en el 100% de los casos; recientemente se han descrito también fusiones de EWSRCREB3L2 en el sarcoma fibromixoide de bajo grado.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil para apoyo diagnóstico en el sarcoma fibromixoide de bajo grado, que puede ser confundido con
otros tumores de partes blandas de carácter más begnino o maligno. La identificación de la translocación
t(7;16)(q33;p11) y el correspondiente gen de fusión FUS-CREB3L2 son importantes criterios
diagnósticos para este sarcoma.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ARN total a partir de la muestra a estudio y posteriormente se sintetiza cADN. Se comprueba
la calidad del ARN obtenido mediante retro-transcripción y amplificación de un segmento del gen de
actina, mediante técnicas estandarizadas en nuestro laboratorio. Para determinar la existencia de las
translocaciones FUS-CREB3L2 y FUS-CREB3L1 se utilizan oligonucleótidos diseñados de acuerdo con la
información conocida en la literatura sobre esta translocación y las secuencias conocidas y depositadas
en los Bancos de datos de genes. Éstos se utilizan para realizar distintas amplificaciones mediante PCR y
con cADN sintetizado in vitro a partir del ARN total como molde para la reacción. Los productos de PCR
se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa y los resultados se interpretan de forma manual.
El fragmento amplificado se secuencia para confirmar el resultado.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino (entre 10-100 mg
de tejido)
Biopsia de tejido en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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- La muestra es positiva para la presencia de la translocación FUS-CREB3L2 / o FUS-CREB3L1
- No se detecta la presencia de ningún transcrito correspondiente a la translocación mencionada.
Precauciones:
Es posible que no todos los puntos de translocación, ni todas las translocaciones posibles estén cubiertos
por las parejas de oligonucleótidos utilizadas, o la calidad de la muestra impida la amplificación correcta
del producto. Por tanto, siempre que se produce un resultado negativo mediante PCR, hay que tener en
cuenta que la translocación podría existir y no haber sido detectada.
Se recomienda enviar tejido en fresco o en congelación para realizar este tipo de estudios, en lugar de
tejido en parafina.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 30 días laborables. La prueba se realiza
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Folpe A et al. Low grade fibromyxoid sarcoma. Fletcher CDM, Unni KK, Mertens F, editors. World Health
Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone. Lyon,
France: IARC Press; 2002. p. 104–5
Lau PP et al. EWSR1-CREB3L1 Gene Fusion: A Novel AlteARNtive Molecular Aberration of Low-grade
Fibromyxoid Sarcoma.Am J Surg Pathol. 2013 May;37(5):734-8
Mertens F et al. Clinicopathologic and molecular genetic characterization of low-grade fibromyxoid
sarcoma, and cloning of a novel FUS/CREB3L1 fusion gene. Lab Invest 2005;85:408–15.
Möller et al. FUS-CREB3L2/L1 Positive Sarcomas Show a Specific Gene Expression Profile with
Upregulation of CD24 and FOXL1 Clin Cancer Res 2011; 17: 2646-2656
Panagopoulos I et al. The chimeric FUS/CREB3L2 gene is specific for low-grade fibromyxoid sarcoma.
Genes Chromosomes Cancer 2004;40:218–28
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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TRANSLOCACIÓN BCR/ABL P210 Y/O P190 PCR CUANTITATIVA
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia mieloide crónica (LMC) es una neoplasia de las células madre hematopoyéticas que se
incluye dentro del ámbito de las neoplasias mieloproliferativas. La LMC está asociada de manera
consistente con la translocación que fusiona el gen BCR en el cromosoma 22q11 con el gen ABL,
localizado en 9q23. Esta fusión se conoce como BCR/ABL.
El ARNm de BCR/ABL se detecta en todos los pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC) y en un
subgrupo de aquellos con leucemia linfoblástica aguda (LAL) y leucemia mieloide aguda (LAM). Aunque
los puntos de translocación en BCR y ABL pueden ocurrir en varias localizaciones, mediante el proceso
de splicing sólo se obtienen 8 variantes (e1/a2, e6/a2, e13/a2, e14/as, e19/a2, e1/a3, e13/a3, e14/a3)
que incorporan la secuencia completa de los exones a ambos lados del punto de fusión.
En LMC, >95% de los pacientes presentan una translocación de tipo e13/a2 (b2a2) o e14/a2 (b3a2), las
cuales dan lugar a una proteína de 210-kDa (p210), mientras más del 50% de los pacientes con LAL de
tipo BCR-ABL-positivo presentan la translocación e1/a2, que genera una proteína de 190-kDa (p190).
Estas proteínas de fusión poseen una actividad tirosín-kinasa anormal, asociada a las características
clínicas y patológicas leucémicas. Los agentes capaces de bloquear esa acción (inhibidores de tirosínkinasas, ITKs) han demostrado su eficacia en el tratamiento de pacientes con dicha translocación. Se ha
observado que la monitorización de los niveles del ARNm de BCR/ABL en estos pacientes durante el
tratamiento es fundamental para un correcto pronóstico y manejo de la terapia.
La PCR cuantitativa a Tiempo Real (RQ-PCR) es el método habitual más sensible para la monitorización
de los niveles de BCR/ABL durante el tratamiento. Esta prueba detecta y cuantifica las 2 variantes más
habituales de BCR/ABL en LMC (e13/a2 y e14/a2) y la e1/e2 en LAL.
UTILIDAD CLÍNICA
Monitorización de la respuesta a tratamiento de los pacientes con translocación BCR/ABL de tipo e13/a2,
e14/a2 y e1/a2.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
PCR cuantitativa a Tiempo Real con sonda tipo Taqman, utilizando los protocolos recomendados por el
consorcio BIOMED-2 (Gabert et al. 2003) mediante cuantificación absoluta.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguno en especial.
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre (10 ml) o médula ósea (5 ml) anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado.
Cantidad óptima de sangre para los estudios de PCR cuantitativa en tiempo real, 10 ml. Mínimo 5 ml.
VALORES DE REFERENCIA
Los niveles de presencia del gen de fusión son informados en forma de cociente BCR/ABL (p210 ó p190)
respecto al gen control GUS y convertido a porcentaje. Si los valores de gen control no alcanzan el
estándar de calidad requerido (>10000 copias) se informará al respecto. Si no se detecta gen de fusión
BCR/ABL en la muestra se indicará como “no detectable”.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. Esta determinación sólo detecta las
variantes habituales que generan p210 y p190 y no ha de ser usada para la detección de BCR/ABL en el
momento del diagnóstico.
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La precisión de la determinación es relativamente escasa en niveles bajos de BCR/ABL, con una
variabilidad entre pruebas estimada en 0.5 log. Sólo cambios >0.5 log deben de ser considerados
clínicamente relevantes. Por ejemplo, si se informa un resultado de ratio BCR/ABL:GUS de 0.1%,
cualquier otro resultado entre 0.05% y 05% deben ser considerados equivalente. Si los resultados se
usan para tomar decisiones terapéuticas, los cambios significativos observados en la monitorización
habrán de ser confirmados mediante una nueva muestra del paciente.
Por lo general, los resultados de esta determinación no pueden ser comparados directamente con otras
determinaciones de PCR, incluyendo idénticos ensayos en otros laboratorios, por lo que se recomienda
que la monitorización se realice utilizando el mismo método en el mismo laboratorio. Tampoco los
resultados obtenidos pueden ser comparados con los obtenidos mediante FISH, ya que esta técnica
cuantifica alelos de ADN y las pruebas basadas en PCR analizan trascritos de ARNm y dado que un único
alelo puede dar lugar a numerosos trascritos, los valores no son comparables.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Branford S, Fletcher L, Cross NCP, et al: Desirable performance characteristics for BCR-ABL
measurement on an inteARNtional reporting scale to allow consistent interpretation of individual patient
response and comparison of response rates between clinical trials. Blood 2008 October 15;111(8):33303338
Gabert et al. Standardization and quality control studies of “real-time” quantitative reverse transcriptase
polymerase Caín reaction of fusion gene trasncripts for residual disease detection in leukemia-A Europa
Against Cancer Program. Leukemia 2003; 17: 2318-2357)
Hughes TP, Kaeda J, Branford S, et al: Frequency of major molecular responses to imatinib or interferon
alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2003 October
9;349(15):1423-1432
Hughes TP, Deininger M, Hochhaus A, et al: Monitoring CML patients responding to treatment with
typrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for
detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006 July
1;108(1):28-37
Olavarria E, Kanfer E, Szydlo R, et al: Early detection of BCR-ABL transcripts by quantitative reverse
transcriptase-polymerase chain reaction predicts outcome after allogeneic stem cell transplantation for
chronic myeloid leukemia. Blood 2001 March 15;97(6):1560-1565
Radich JP, Gooley T, Bryant E, et al: The significance of BCR/ABL molecular detection in chronic myeloid
leukemia patients "late", 18 months or more after transplantation. Blood 2001 September
15;98(6):1701-1707
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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TRANSLOCACIÓN PML/RARA PCR CUANTITATIVA
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia aguda promielocítica (LAP) supone el 5-10% de los casos de leucemia mieloide aguda (LAM)
y generalmente tiene buen pronóstico con los tratamientos actuales. Las células LAP presentan un gen
de fusión generado a partir del gen RARA con el promotor y comienzo de algún otro gen, siendo el más
común (>80% de los casos) PML. En este caso, el gen de fusión se denomina PML/RARA y se denota
como t(15;17)(q22;q12). El ARNm producto del gen de fusión puede ser detectado mediante un ensayo
basado en PCR, e indica la presencia de células neoplásicas, con mucha mayor sensibilidad que los
estudios morfológicos, cariotipo o FISH.
La monitorización del número de trascritos es importante porque la mayoría de los pacientes que
permanecen PCR-positivos, o se convierten en PCR-positivos de nuevo tras el tratamiento, recaen y se
beneficiarían de una intervención temprana.
Esta técnica cuantitativa permite monitorizar de manera muy sensible los niveles de PML/RARAR, no sólo
detector su ausencia o presencia.
UTILIDAD CLÍNICA
Detección de enfermedad mínima residual y recurrencia en LAP mediante monitorización de los niveles
de PML/RARA en pacientes diagnosticados con LAP.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
PCR cuantitativa a Tiempo Real con sonda tipo Taqman utilizando los protocolos recomendados por el
consorcio BIOMED-2, mediante cuantificación absoluta.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguno en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre (10 ml) o médula ósea (5 ml) anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
Los niveles de presencia del gen de fusión son informados en forma de cociente PML/RARA respecto al
gen control ABL y convertido a porcentaje. Si los valores de gen control no alcanzan el estándar de
calidad requerido (>10000 copias) se informará al respecto. Si no se detecta gen de fusión PML/RARA en
la muestra se indicará como “no detectable”.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. Esta determinación sólo detecta las
variantes habituales de PML/RARA (bcr1, bcr2 y bcr3) y no ha de ser usada para la detección de
PML/RARA en el momento del diagnóstico.
La precisión de la determinación es relativamente escasa en niveles bajos de PML/RAR con una
variabilidad entre pruebas estimada en 0.5 log. Si los resultados se usan para tomar decisiones
terapéuticas, los cambios significativos observados en la monitorización habrán de ser confirmados
mediante una nueva muestra del paciente.
Por lo general, los resultados de esta determinación no pueden ser comparados directamente con otras
determinaciones de PCR, incluyendo idénticos ensayos en otros laboratorios, por lo que se recomienda
que la monitorización se realice utilizando el mismo método en el mismo laboratorio. Tampoco los
resultados obtenidos pueden ser comparados con los obtenidos mediante FISH, ya que esta técnica
cuantifica alelos de ADN y las pruebas basadas en PCR analizan trascritos de ARNm y dado que un único
alelo puede dar lugar a numerosos trascritos, los valores no son comparables.
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TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Gabert et al. Standardization and quality control studies of “real-time” quantitative reverse transcriptase
polymerase Caín reaction of fusion gene trasncripts for residual disease detection in leukemia-A Europa
Against Cancer Program. Leukemia 2003; 17: 2318-2357)
Tobal K, Moore H, Macheta M et al: Monitoring minimal residual disease and predicting relapse in APL by
quantitating PML-RARalpha transcripts with a sensitive competitive RT-PCR method. Leukemia 2001
Jul;15(7):1060-5
Zhang L, Cao Z, Zou Y et al: Quantification of PML/RARa transcript after induction predicts outcome in
children with acute promyelocytic leukemia. Int J Hematol. 2012 May;95(5):500-8.
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QUIMERISMO POST TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO
INFORMACIÓN CLÍNICA
Una de las herramientas clínicas más eficaces en el tratamiento de pacientes con enfermedades
hematopoyéticas es el trasplante de médula ósea, progenitores hematopoyéticos o cordón umbilical de
donantes compatibles. El éxito de esta terapia se estudia mediante monitorización en la sangre del
paciente del porcentaje de células de donante y receptor (quimerismo) durante los meses y años
posteriores al trasplante.
La valoración del quimerismo se basa en la habilidad de distinguir células del donante y del receptor,
siendo la principal herramienta para el estudio del quimerismo el análisis del ADN. Se utilizan zonas
conocidas como secuencias polimórficas repetitivas o STR (“Short Tandem Repeats”)) que tienen un alto
índice de heterozigosidad y un número elevado de alelos en la población. Estos marcadores permiten
distinguir el ADN de dos individuos aunque estén emparentados.
El estudio se realiza mediante PCR puesto que esta técnica aporta suficiente sensibilidad como para
detectar material genético de ambos individuos aún cuando la cantidad de uno de ellos esté muy poco
representada en la muestra biológica. Esta sensibilidad es aún mayor cuando el estudio se realiza en
diferentes linajes celulares.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil para determinar las cantidades relativas de donante y receptor en una muestra biológica de un
paciente trasplantado.
Es un indicador de la efectividad del trasplante. Puede servir como guía en el manejo del paciente y para
prevenir un fallo en el injerto o recaída posibilitando la administración oportuna de inmunoterapia
adicional.
La sensibilidad del estudio es mayor cuando se realiza en diferentes poblaciones de la sangre periférica.
En los pacientes sometidos a trasplante de cordón umbilical, la determinación de quimerismo en médula
ósea a los 14 dias post-trasplante ayuda a predecir el éxito o fallo en el injerto.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Primeramente se analizan los ADNs del donante y receptor previo al trasplante, y se seleccionan los
marcadores informativos para cada pareja donante/receptor, mediante el análisis de secuencias
polimórficas repetitivas (STR) utilizando el kit PowerPlex16 HS (Promega).
Para cada análisis de quimerismo postransplante, se fracciona la sangre del paciente trasplantado en un
gradiente de Ficoll (LymphoprepTM) y posteriormente se selecciona la fracción de granulocitos y la de
células mononucleadas de cada una de ellas. A partir de las células mononucleadas se obtiene la
población CD3+ mediante separación inmunomagnética (CD3 MicroBeads, Miltenyi Biotec) utilizando un
instrumento AutoMACs ProSeparator. A continuación se purifica ADN de todas las poblaciones,
granulocitos, células CD3+ y resto de células mononucleadas CD3- y se realiza el estudio de secuencias
polimórficas mediante PCR utilizando el kit PowerPlex16 HS (Promega). Los productos de PCR se separan
mediante electroforesis capilar en un instrumento ABIPrism310 (Applied Biosystems) y se analizan los
resultados utilizando el software Genemapper 4.0. En una hoja de cálculo se cuantifican los porcentajes
de los marcadores del donante y receptor que hayan sido previamente seleccionados como informativos.
Esta cuantificación se realiza esencialmente como describen Thiede et al. 2001.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
Para realizar el estudio se necesita previamente muestra biológica del paciente pretrasplante y muestra
biológica del donante.
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado. Mínimo 4 ml.
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Médula ósea anticuagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado. 0,5-2 ml.
Para el estudio previo del receptor y del donante se necesita una mínima cantidad de muestra (sangre
0,5 ml; exudado bucal en tarjeta FTA)
VALORES DE REFERENCIA
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
En el informe, los resultados son expresados de la siguiente forma, para cada una de las fracciones
celulares analizadas:
Quimerismo completo. Cuando el porcentaje de células del donante es mayor del 95%
Quimerismo mixto. Cuando el porcentaje de células del donante es menor o igual al 95%
Pérdida de injerto. Cuando el porcentaje de células del donante es menor del 5%
La sensibilidad de la técnica es aproximadamente 1-5%.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Antón et al. “Establishment of complete and mixed donor chimerism alter allogeneic
lymphohematopoietic transplantation: recommendations from a workshop at the 2001 tandem
meetings”. Biology of Blood and Marrow Transplantation (2001) 7: 473-485
Moscardó et al. “Impact of hematopoietic chimerism at day +14 on engraftment alter unrelated donor
umbilical cord blood transplantation for hematologic malignances”. Haematologica (2009) 94 (6):827832
Thiede et al. “Sequential monitoring of chimerism and detection of minimal residual disease alter
allogeneic blood steem cell transplantation (BSCT) using multiplex amplification of short tandem repeatmarkers”. Leukemia (2001) 15 (2): 293-302
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ósea”. Haematologica (ed. Esp.) (2004) 89 (1): 65-71
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN BCR-ABL
INFORMACIÓN CLÍNICA
La leucemia mieloide crónica (CML) se caracteriza por la translocación t(9:22) que de da lugar al
cromosoma philadelphia, resultando en la formación de un gen de fusión BCR/ABL. El componente ABL
de esta oncoproteína posee actividad tirosín-kinasa y desempeña un papel central en el fenotipo
proliferativo de esta leucemia.
Los avances recientes han dado como resultado el desarrollo de una serie de medicamentos que inhiben
la kinasa ABL, así como otras proteínas con una actividad similar. El mesilato de imatinib es el prototipo
de estos inhibidores (TKI), que son capaces de inducir remisiones prolongadas en la mayoría de los
pacientes. Desafortunadamente, un importante número de pacientes puede desarrollar resistencia
funcional a los TKI, debido a la adquisición de mutaciones puntuales en el dominio kinasa (KD) del gen
ABL quimérico. Hasta la fecha, se han descrito más de 50 mutaciones distintas, aunque 15 de éstas son
responsables de más del 80% de las resistencias encontradas.
La identificación de la mutación causante de la resistencia a TKI es importante en la LMC, ya que el
efecto de algunas mutaciones puede ser superado por el aumento de dosis, mientras que otras
requieren cambiar a un TKI de segunda o tercera generación o una terapia alteARNtiva. La mutación
T315I es particularmente importante, dado que esta alteración confiere resistencia a todos los
inhibidores de primera y segunda generación utilizados.
Por lo general, la resistencia a TKI se sospecha en un paciente con LMC cuando muestra pérdida de
respuesta terapéutica inicial (por ejemplo, recaída citogenética) o un aumento significativo y sostenido
en los niveles cuantitativos de BCR/ABL. Las mismas consideraciones son aplicables a los pacientes con
leucemia linfoblástica aguda con cromosoma Philadelphia positivo (Ph+), que también pueden ser
tratados con terapia a base de TKIs.
UTILIDAD CLÍNICA
Evaluación de pacientes con leucemia mieloide crónica y leucemia aguda linfoblástica Ph+ a tratamiento
con inhibidores de tirosín-kinasas (TKI), que no responden o dejar de responder al tratamiento.
Permite identificar la presencia de mutaciones en el dominio tirosín-kinasa de ABL del gen de fusión
BCR/ABL asociadas a resistencia a TKI, lo que determinará la necesidad de cambio en el tratamiento del
paciente. El tipo de mutación detectado puede ayudar a decidir el tipo de terapia más adecuada.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Las mutaciones puntuales en ABL (las únicas descritas hasta la fecha asociadas a resistencia a
tratamiento) se detectan mediante secuenciación directa de productos PCR generados por la
amplificación de la RT-PCR del ARNm del gen de fusión BCR/ABL a partir de una muestra de sangre
periférica. Es fundamental amplificar únicamente el dominio kinasa de ABL implicado en el gen de fusión
BCR/ABL y no el dominio de ABL nativo.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguno en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre (10 ml) o médula ósea (5 ml) anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
En la secuencia obtenida se analizarán los cambios respecto a la secuencia consenso de referencia para
el gen ABL en la región estudiada; se registrarán tanto las sustituciones completas de base como
aquellas parciales (indicativas del porcentaje de clon mutante sobre el total de células leucémicas).
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
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Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados. Se indicará en él la presencia o ausencia
de alteraciones en la secuencia del dominio tirosín-kinasa y, en caso de existir, la notación
correspondiente de cada una de ellas, tanto a nivel nucleotídico como aminoacídico. La presencia de 1 o
más mutaciones puntuales en la región analizada del gen de fusión BCR/ABL se considera un resultado
positivo. El análisis de la literatura ayudará a establecer la implicación de la mutación o mutaciones
encontradas en la resistencia a ITKs.
La sensibilidad de la determinación es dependiente de la sensibilidad de la técnica utilizada, por lo que
se considera que el rango de detección de mutaciones está en el 15-20% de células mutantes sobre el
total de células leucémicas.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 15 y 45 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Alikian M, Gerrard G, Subramanian PG et al: BCR-ABL1 kinase domain mutations: methodology and
clinical evaluation. Am J Hematol 2012 Mar;87(3):298-304
Santamaría I, Payer AR, Pitiot AS et al: Quantifying mutated and unmutated BCR-ABL transcripts
confirms suitability of direct sequencing sensitivity in mutation analysis of patients with chronic myeloid
leukemia with secondary resistance to tyrosine kinase inhibitors, regardless of ratio values. Leuk
Lymphoma. 2010 Feb;51(2):350-4
Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE et al: BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid
leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: recommendations from an expert panel on
behalf of European LeukemiaNet. Blood. 2011 Aug 4;118(5):1208-15
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN KRAS
INFORMACIÓN CLÍNICA
EGFR es un receptor del factor de crecimiento que se activa por la unión de ligandos específicos, lo que
resulta en la activación de la vía RAS/MAPK. La activación de esta vía induce una cascada de
señalización que regula un gran número de procesos celulares, incluyendo los relacionados con
proliferación celular. Además, la desregulación de la vía RAS/MAPK es un factor clave en la progresión
tumoral. Las terapias dirigidas contra EGFR, que inhiben la activación de la vía RAS/MAPK, han
demostrado un cierto éxito (aumento libre de progresión y supervivencia global) en pacientes con cáncer
colorrectal y cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC).
El cáncer colorrectal es actualmente una de las neoplasias más comunes diagnosticados cada año. Las
estrategias que se centran en su detección precoz y prevención reducen eficazmente el riesgo de
mortalidad asociada a la enfermedad. Además, se ha observado un aumento en la tasa de supervivencia
de pacientes con cáncer colorrectal avanzado como resultado de los avances en agentes
quimioterapéuticos estándar y del desarrollo de terapias dirigidas. Los anticuerpos monoclonales contra
el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tales como cetuximab y panitumumab,
representan un nuevo tipo de terapia dirigida para dichos pacientes. Sin embargo, los estudios han
demostrado que no todos los individuos con cáncer colorrectal responden a estos tratamientos. Debido a
que la combinación de terapia dirigida y la quimioterapia estándar conlleva un aumento de la toxicidad y
del coste, las estrategias que ayudan a identificar a los individuos con más probabilidades de
beneficiarse de tales terapias dirigidas se han convertido en fundamentales.
Por otra parte, el cáncer de pulmón no microcítico representa el 70% - 85% de todos los diagnósticos de
cáncer de pulmón, la principal causa de muerte por cáncer en el mundo. Los estudios aleatorizados han
sugerido que las terapias dirigidas, por sí solas o en combinación con quimioterapia, pueden ser
beneficiosas para estos pacientes. Al igual que ocurre en cáncer colorrectal, debido al aumento en
toxicidad y coste que supone la inclusión de terapias dirigidas en el tratamiento global de pacientes con
esta patología, se hacen necesaria la estratificación de pacientes con el fin de identificar aquellos con
más probabilidades de beneficiarse del uso de terapias contra EGFR, ya que los estudios han demostrado
que no todos los individuos con NSCLC responden a estas terapias.
Una de las alteraciones somáticas más frecuentes en el cáncer colorrectal y de pulmón no microcítico es
la presencia de mutaciones activantes en el proto-oncogén KRAS, en los exones 2 y 3 (aminoácidos 12,
13 ó 61). KRAS es reclutado por EGFR unido a ligando (activo) para iniciar la cascada de señalización
inducida por la vía RAS/MAPK. Dado que las mutaciones en KRAS activan constitutivamente la vía
RAS/MAPK en un punto inferior a la intervención de EGFR, los agentes tales como cetuximab y
panitumumab, que impiden de unión a ligando del EGFR o los inhibidores de la actividad kinasas de
EGFR no tendrían ninguna actividad inhibitoria significativa sobre la proliferación celular en presencia de
KRAS mutado.
Los datos actuales sugieren que los pacientes con tumores que tienen mutaciones en KRAS no se
benefician de las terapias anti-EGFR. Como resultado, el estado mutacional de KRAS puede ser un
marcador útil por el cual los pacientes se seleccionan para terapia anti-EGFR.
Hay que tener en cuenta que no todos los pacientes con KRAS no mutado responden a las terapias
dirigidas anti-EGFR.
UTILIDAD CLÍNICA
Determinación obligatoria para la toma de decisiones terapéuticas en los pacientes con cáncer colorrectal
metastático que vayan a ser tratados con terapias anti-EGFR.
Informativo en otros tumores, tal como en el adenocarcinoma pulmonar, ya que los pacientes que
presentan mutación en el gen KRAS no se benefician de terapias anti EGFR.
Hay que tener en cuenta en cualquier caso que no todos los pacientes con KRAS “no mutado” responden
a las terapias dirigidas anti-EGFR, ya que pueden existir alteraciones en otros genes relacionados con la
misma vía de activación (por ej. BRAF, PI3K) que pueden impedir esta respuesta.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
La metodología de rutina utilizada actualmente para la detección de mutaciones en KRAS es el kit
COBAS KRAS mutation test (Roche, USA). El método se basa en un ensayo combinado de HRM (High
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Resolution Meeting) y sondas fluorescentes, con una sensibilidad estimada en alrededor del 5% y una
especificidad superior al 99%.
Si el porcentaje de celularidad tumoral de la muestra a ensayar es inferior al límite de detección de la
técnica o la cantidad de ADN obtenida es insuficiente para este tipo de ensayo, se recurrirá a un sistema
de PCR a tiempo real basado en el empleo de oligonucleótidos escorpión y PCR específica de alelo (kit
Therascreen KRAS RGQ PCR kit; Qiagen Ltd, UK). La sensibilidad estimada de este ensayo es del 1%
pero solo detecta mutaciones en los codones 12/13.
AlteARNtivamente también se puede realizar la detección de las mutaciones en KRAS mediante
amplificación por PCR de los exones 2 y 3 y secuenciación automática (metodología Sanger), aunque la
sensibilidad de la detección es mucho menor, aproximadamente el 15-20%.
La importancia del porcentaje de la celularidad tumoral para un resultado que minimice los falsos
negativos hace imprescindible la revisión previa de la muestra por un patólogo y la selección, si es
preciso, de la zona con mayor presencia de células tumorales.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguno en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia, PAAF, BAG en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación por parte de Anatomía Patológica
del porcentaje de celularidad tumoral de la muestra.
Biopsia de tejido en fresco/congelación :10-50 mg de tejido, envío inmediato en tubo tipo eppendorf,
con indicación por parte de Anatomía Patológica del porcentaje de celularidad tumoral de la muestra.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico: Tubo de plástico sin aditivos, con indicación
por parte de Anatomía Patológica del porcentaje de celularidad tumoral de la muestra.
VALORES DE REFERENCIA
Los valores de referencia son intrínsecos a la propia prueba, tanto en el caso de HRM como de
oligonucleótidos escorpión y PCR específica de alelo. Se incluirá un informe con la interpretación de los
resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados indicarán si se ha detectado una mutación en los codones 12, 13 ó 61 del gen KRAS (sólo
12 ó 13 si el porcentaje de celularidad tumoral es inferior al 5%) o si no se ha podido detectar ninguna
de las mutaciones indicadas previamente.
Observación.
Las determinaciones realizadas con el kit COBAS KRAS mutation test no permiten conocer exactamente
cuál es la mutación ni el cambio que se produce a nivel de aminoácido, con lo que en el resultado sólo se
expresará en términos de “positivo para la presencia de mutación” en caso de detectarse alguna de las
mutaciones anteriormente comentadas.
Un resultado negativo no excluye la presencia de una mutación que pueda estar presente pero por
debajo de los límites de detección del ensayo. Un resultado negativo tampoco excluye la presencia de
otras mutaciones en el gen KRAS.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo
posible.
BIBLIOGRAFÍA
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 71 de 127
Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D et al: Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer:
the 'RASCAL II' study. Br J Cancer. 2001 Sep 1;85(5):692-6
Cheng L, Zhang S, Alexander R et al: The landscape of EGFR pathways and personalized management of
non-small-cell lung cancer. Future Oncol. 2011 Apr;7(4):519-41
Meng D, Yuan M, Li X et al: Prognostic value of K-RAS mutations in patients with non-small cell lung
cancer: A systematic review with meta-analysis. Lung Cancer. 2013 Apr 19(13): 124-4
Siena S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F et al: Biomarkers predicting clinical outcome of epidermal
growth factor receptor-targeted therapy in metastatic colorectal cancer. J Natl Cancer Inst. 2009 Oct
7;101(19):1308-24
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL DOMINO TK DE EGFR
INFORMACIÓN CLÍNICA
EGFR es un receptor del factor de crecimiento que se activa por la unión de ligandos específicos, lo que
resulta en la activación de la vía RAS/MAPK. La activación de esta vía induce una cascada de
señalización que conduce, en última instancia, a la proliferación celular. La desregulación de la vía
RAS/MAPK es un factor clave en la progresión tumoral de muchos tumores sólidos. Las terapias dirigidas
contra los tumores portadores de mutaciones activantes en el dominio tirosín kinasa de EGFR (exones
18-21) han demostrado un cierto éxito en el tratamiento de este subgrupo de pacientes con CPNM.
Los fármacos gefitinib y erlotinib, dirigidos contra estos tumores portadores de mutaciones activantes,
han sido aprobados para su uso en primera linea de tratamiento de pacientes con CPNM avanzado con
mutación en el dominio tirosin-kinasa de EGFR. Estos 2 fármacos han demostrado aumentos de la
supervivencia libre de progresión y global en los pacientes con EGFR mutado que reciben terapia
inhibitoria de la kinasa EGFR como tratamiento del CPNM.
Sin embargo, las moléculas como gefitinib y erlotinib, que impiden la unión a ATP del dominio kinasa de
EGFR, no parece tener ninguna actividad inhibitoria significativa sobre los tumores que presentan la
mutación de resistencia T790M, por lo que los datos actuales sugieren que la eficacia de las terapias
sobre EGFR en CPNM se limita a pacientes con tumores que demuestran la presencia de mutaciones
activadoras de EGFR tales como L858R, L861Q, G719A/S/C, S768I o pequeñas deleciones en el exón 19
y ausencia de la mutación T790M. De esta manera, el estado mutacional de EGFR puede ser un
marcador útil para poder seleccionar a los pacientes que se beneficiarían de terapia con inhibidores de
EGFR.
UTILIDAD CLÍNICA
Identificación de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón no microcítico que podrían beneficiarse
del tratamiento con inhibidores de EGFR.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Actualmente se utiliza el kit EGFR RGQ PCR (Qiagen Ltd, UK). Se trata de un ensayo mediante PCR a
tiempo real basado en el empleo de oligonucleótidos escorpión y la tecnología de la PCR específica de
alelo sobre el ADN obtenido de la muestra tumoral; se analizan en la prueba 29 mutaciones en los
exones 18 a 21 del gen EGFR: deleciones en el exón 19 y la mutación puntual p.L858R en el exón 21,
que comprenden más del 85% de las mutaciones detectadas en cáncer de pulmón, y 3 posibles
inserciones en el exón 20, así como las mutaciones puntuales p.T790M, p.L861Q, p.S768I, p.G719X
(UNAM referente sequence: NM_005228.3)
De forma alteARNtiva, se puede realizar el estudio mediante metodología desarrollada en nuestro
laboratorio, utilizando PCR específica de alelo con oligonucleótidos fluorescentes y análisis mediante
electroforesis capilar (Centeno et al, 2011). En este caso sólo se detectarían las mutaciones más
frecuentes, que son las deleciones del exón 19, amplificaciones del exon 20 y la mutación puntual
p.L858R. La sensibilidad de esta técnica es menor, aproximadamente un 15%. Finalmente, también se
puede realizar secuenciación de los exones 18-21 que codifican todo el dominio TK. Esta aproximación
tiene menor sensibilidad aún (aproximadamente un 20%).
La importancia del porcentaje de la celularidad tumoral para un resultado que minimice los falsos
negativos hace imprescindible la revisión previa de la muestra por un patólogo y la selección, si es
preciso, de la zona con mayor presencia de células tumorales.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguno en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia, PAAF, BAG en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación por parte de Anatomía Patológica
del porcentaje de celularidad tumoral de la muestra.
Biopsia de tejido en fresco/congelación:10-50 mg de tejido, envío inmediato en tubo tipo eppendorf, con
indicación por parte de Anatomía Patológica del porcentaje de celularidad tumoral de la muestra.
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Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. Tubo de plástico sin aditivos, con indicación
por parte de Anatomía Patológica del porcentaje de celularidad tumoral de la muestra.
VALORES DE REFERENCIA
Intrínsecos a la prueba. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados indicarán si se ha detectado una mutación activadora en el dominio tirosin-kinasa del gen
EGFR o si no se ha podido detectar ninguna de las mutaciones indicadas previamente.
Precauciones.
Un resultado negativo no excluye la presencia de una mutación que pueda estar presente pero por
debajo de los límites de detección del ensayo.
Un resultado negativo no excluye la presencia de otras mutaciones activadoras en el gen EGFR.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 5 y 20 días laborables. Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo
posible.
BIBLIOGRAFÍA
Centeno et al. Germ-line mutations in epidermal growth factor receptor (EGFR) are rare but may
contribute to oncogenesis: a novel germ-line mutation in EGFR detected in a patient with lung
adenocarcinoma. BMC Cancer 2011; 11: 172.
Gao G, Ren S, Li A, et al: Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor therapy is effective
as first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer with mutated EGFR: a meta-analysis from
six phase III randomized controlled trials. Int J Cancer 2011;131(5):E822-829
Mok TS: Personalized medicine in lung cancer: what we need to know. Nat Rev Clin Oncol 2011;8:661668
Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA: Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer.
Nat Rev Cancer 2007;7(3):169-181
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN KIT (EXONES 8, 9, 10,
11, 13, 17)
INFORMACIÓN CLÍNICA
El tumor estromal gastrointestinal (GIST) es el tumor mesenquimal más frecuente en el tracto digestivo.
La mayoría de los GIST poseen una mutación característica con ganancia de función del gen KIT, que
codifica el receptor KIT. En esta enfermedad, KIT y PDGFRA se encuentran mutadas en un ~85% y
~5%, respectivamente.
Muchos tumores además de GIST tienen KIT mutado, incluyendo mastocitosis, melanoma, seminoma,
leucemia mieloide aguda, otras neoplasias mieloproliferativos y linfomas. La frecuencia y tipo de
mutación varía entre estos tumores así como las implicaciones clínicas que tiene.
Las alteraciones del gen KIT en GIST son de diferentes tipos, pudiendo ser deleciones, inserciones y
mutaciones puntuales. Las mutaciones más frecuentes se encuentran en el exón 11 (hasta en un 92%
de los casos), seguidas del exón 9 (5-18%), exón 13 (0.8-4.1%) y exón 17 (0.6%) (Tornillo et al. 2006,
Eizaguirre et al. 2006). En mastocitosis, más del 90% de los casos tienen una mutación en el exon 17
del gen, que da lugar a la alteración p.D816V, que confiere resistencia al tratamiento con imatinib. En la
leucemia aguda mieloide se han descrito mutaciones en el gen KIT en las leucemias asociadas a
translocaciones del tipo “core binding factor”, tanto en el exon 17 (p.D816V), como en el exon 8. Este
último tipo de mutaciones, en el exon 8, podría estar relacionado con sensibilidad al tratamiento con
inhibidores del tirosin kinasa tipo imatinib.
UTILIDAD CLÍNICA
La presencia de mutaciones somáticas en los genes que codifican os receptores tirosina quinasa KIT o
PDGFRA pueden servir de apoyo diagnóstico ante la sospecha de GIST. La detección de estas
mutaciones puede tener también valor predictivo de respuesta a tratamiento con inhibidores de tirosin
quinasa tipo gefitinib, en los tumores GIST metastáticos o irresecables, y en algunos tipos de
melanoma.
Las mutaciones en el gen KIT también se determinan en los pacientes con LAM con translocación
positiva t(8;21) o inv(16) , siendo en este caso la presencia de mutación en el exón 17 un factor de peor
pronóstico que permite la estratificación de pacientes para el tratamiento, de acuerdo con los protocolos
de Pethema (Programa Español de Tratamientos en Hematología de la Sociedad Española de
Hematología y Hemoterapia) en uso.
En el caso de la mastocitosis sistémica sirve de apoyo diagnóstico.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ADN genómico de la muestra a estudio.
Se realiza una amplificación mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las
regiones exónicas a estudio. Se utiliza un control negativo en cada estudio. El producto de PCR se
analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto de PCR es secuenciado utilizando uno de
los oligonucleótidos con los que se amplificó la muestra.
Mediante esta técnica se puede detectar posibles mutaciones puntuales y pequeñas deleciones o
inserciones en este gen mediante secuenciación. Los cromatogramas de las secuencias se analizan
mediante programas informáticos y manualmente para determinar la presencia o ausencia de
mutaciones en este gen.
El ensayo para detectar mutaciones mediante secuenciación tiene una sensibilidad analítica teórica del
15-20%.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
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Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Biopsia de tejido en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados son informados como positivo para la presencia de mutación, negativo o no valorable. En
el caso de resultado positivo se incluirá una descripción de la mutación a nivel de nucleótido y la
descripción de la proteína alterada.
Existen diferencias en cuanto a la respuesta al tratamiento con imatinib entre los individuos con
mutaciones en el gen c-KIT localizadas en exones diferentes. Según el lugar donde se produzca, la
mutación afectara a distintos dominios de la proteína y esto se traduce en diferencias en la agresividad
del tumor y en la probabilidad de respuesta clínica al imatinib.
Puesto que la frecuencia e implicación de las mutaciones puede ser diferente según su localización en el
gen y según la enfermedad de que se trate, los resultados deber ser siempre interpretados en el
contexto de otros datos clínicos y patológicos, para determinar la significación de los mismos.
Precauciones
El ensayo funciona de forma óptima en muestras al diagnóstico con importante carga tumoral. La
sensibilidad del ensayo no es suficiente para utilizarlo para determinar enfermedad mínima residual
durante la terapia, ni confirmatorio de diagnóstico en patologías como la mastocitosis, si el porcentaje
de celularidad tumoral es menor del 20%.
Un resultado negativo no excluye la presencia de una mutación que pueda estar presente pero por
debajo de los límites de detección del ensayo, o en otros exones no estudiados.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 30 y 50 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Cammenga J et al. Extracellular KIT receptor mutants, commonly found in core binding factor AML, are
constitutively active and respond to imatinib mesylate. Blood (2005): 106: 3958-3961
Kohl TM et al. KIT exon 8 mutations associated with core-binding factor (CBF)–acute myeloid leukemia
(AML) cause hyperactivation of the receptor in response to stem cell factor. Blood (2005) 105:33193321
Malaise M. et al. Clinical Implications of c-Kit Mutations in Acute Myelogenous Leukemia. Current
Hematologic Malignancy Reports 2009, 4:77–82
Paschka P et al. Adverse Prognostic Significance of KIT Mutations in Adult Acute Myeloid Leukemia with
inv(16) and t(8;21): A Cancer and Leukemia Group B Study. J Clin Oncol (2006) vol. 24: 3904-3911
Rubin BP et al. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet (2007) 369: 1731-1741
Tornillo et al. An update on molecular genetics of gastrointestinal stromal tumours. J. Clin. Pathol. 2006;
59:557-563
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES V600E EN EL GEN BRAF
INFORMACIÓN CLÍNICA
BRAF es una serina-treonina protein kinasa perteneciente a la familia RAF. Esta familia está consitutida
por tres miembros, ARAF, CRAF (RAF-1) y BRAF, de los cuales BRAF es la proteína que más se expresa
de forma basal. BRAF regula la vía de señalización intracelular MAPK/ERK, una cascada se señalización
muy conservada en eucariotas, implicada en la regulación de la proliferación celular, la diferenciación y
la supervivencia en respuesta a señales extracelulares, tales como las procedentes de EGF. BRAF es el
más potente activador de esta vía.
El complejo de señalización intracelular RAS/BRAF/MEK/ERK está mutado en aproximadamente el 30%
de los tumores, estando BRAF mutado en aproximadamente el 7% de los cánceres. La mutación más
predominante implica una transversión de T a A en el nucleótido 1799 (en el exón 15 del gen), que da
lugar a la sustitución de una valina por ácido glutámico en posición 600 de la proteín (p.V600E). Esta
mutación activadora se ha observado en el 90% de los casos con mutación en BRAF, aunque se han
descrito ya más de 40 mutaciones diferentes en el gen BRAF en tumores humanos. La proteína BRAF
mutada en V600E tiene una actividad incrementada en más de 500 veces respecto a su actividad
normal, implicando la activación continua de la cascada de señalización intracelular MEK/ERK incluso en
ausencia de señales extracelulares, y su papel como carcinógeno es cada vez mejor conocido y
entendido. En los ultimos años, la proteína BRAF mutada en V600E se ha convertido en un blanco
atractivo para el desarrollo de terapias moleculares dirigidas y se han desarrollado inhibidores
específicos, como el vemurafenib, que están siendo evaluados para su utilización en la clínica,
especialmente en melanoma.
Los tres tipos tumorales con mayor incidencia de mutaciones en BRAF son el melanoma, el cáncer
colorrectal y el cáncer de tiroides papilar. En melanoma, la vía RAS/RAF/MEK/ERK se encuentra
frecuentemente mutada, con un 15-30% de mutaciones en NRAS, y hasta un 70% de mutaciones en
BRAF. En el cáncer colorrectal, existen también alteraciones en la vía RAS/RAF/MEK/ERK. KRAS está
mutado en aproximadamente el 51% de los tumores y BRAF en el 10%, siendo mutuamente excluyentes
estas mutaciones. Existe además una cierta relación entre la presencia de la mutación V600E de BRAF y
deficiencias en los sistemas de reparación de daño en el ADN en cáncer de colon. La presencia de
mutaciones en BRAF está también asociada a un fenotipo de islas CpG metiladas (CIMP) y que
implicaría entre otros al gen MLH1, que forma parte del sistema de reparación de daño genético. Por
último, en el cáncer de tiroides cuyo tipo más frecuente es el cáncer papilar de tiroides (CPT), hasta un
45% de tumores presentan mutaciones en BRAF. Otras alteraciones del CPT son reordenamientos del
gen RET, en hasta un 30% de los casos, siendo estas alteraciones mutuamente excluyentes con las
mutacioesn en BRAF y RAS.
UTILIDAD CLÍNICA
El conocer la presencia de la mutación V600E de BRAF puede tener varias utilidades clínicas
alteARNtivas. BRAF es parte de la cascada de señalización intracellular de la vía de EGFR, importante en
la proliferación celular. La desregulación de esta vía es clave en la progression tumoral. Las terapias
dirigidas contra componentes de esta vía, tales como las terapias anti-EGFR han demostrado un cierto
éxito en el tratamiento de algunos pacientes, por ejemplo con tumores colorectales. La eficacia de estas
terapias depende en parte de que la vía intracelular no se encuentre alterada en los pasos posteriores.
Por tanto, los pacientes con mutaciones en BRAF, al igual que se ha demostrado con las mutaciones en
KRAS, no parecen beneficiarse de tratamientos anti EGFR.
Por otra parte, se están desarrollando terapias anti BRAF-V600E, por lo que la determinación de la
presencia de esta mutación puede tener valor en la toma de decisiones terapéuticas.
Finalmente, el estudio de la presencia de mutación en BRAF es útil para discernir, en los casos de
sospecha de síndrome de Lynch por pérdida de expression de la proteína MLH1, si el tumor puede ser
esporádico, cuando junto a la presencia de la mutación en BRAF se detecta hipermetilación en el
promotor de MLH1, o es de origen familiar.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se realiza una PCR específica de alelos utilizando oligonucleótidos diseñados en este laboratorio, y
análisis del resultado mediante electroforesis capilar. El método permite detectar la presencia de la
mutación V600E y V600L. La sensibilidad del método es de al menos 15%.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Biopsia de tejido en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado.
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- Se obtuvo amplificación del fragmento correspondiente a la presencia de la mutación que da lugar al
cambio de aminoácido V600E en el gen BRAF. La muestra es positiva para la presencia de la mutación
V600E en el gen BRAF.
- No se obtuvo amplificación del fragmento correspondiente a la mutación. No se detecta la mutación
que da lugar al cambio de aminoácido V600E en el gen BRAF en la muestra estudiada.
Precauciones.
La sensibilidad de la técnica permite detectar la presencia de mutación si hay al menos un 10-15% de
células con la mutación presentes en la muestra.
Un resultado negativo no garantiza la ausencia de mutaciones en BRAF, ya que la técnica solamente
detecta la presencia de la mutación V600E y aunque en menor frecuencia, pueden existir otras
mutaciones en el gen BRAF.
No todos los pacientes de cancer colorectal con BRAF y KRAS no mutados responderán a terapias anti
EGFR.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 7 y 20 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Cantwell-Dorris ER et al. BRAFV600E: Implications for carcinogenesis and molecular therapy. Molecular
Cancer therapeutics (2011) 10: 385-394
Domingo E et al. BRAF screening as a low-cost effective strategy for simplifying HNPCC genetic testing. J
med Genet (2004) 41: 664-668
Flaherty KT et al. Inhibition of Mutated, Activated BRAF in Metastatic Melanoma. New Engl J Med (2010)
363: 809-819
Sosman JA et al. Survival in BRAF V600–Mutant Advanced Melanoma Treated with Vemurafenib. New
Engl J Med (2012) 366:707-14.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 78 de 127
Weisenberger D et al. CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and
is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer. Nat Genet. (2006) 38: 787-793
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 79 de 127
DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA DE BRAZOS CROMOSÓMICOS 1P Y
19Q
INFORMACIÓN CLÍNICA
La pérdida de los brazos cromosómicos 1p y 19q es uno de los marcadores genéticos característicos de
los tumores oligodendrogliales. La frecuencia de detección de esta alteración varía debido a la dificultad
que existe en la distinción entre oligoastrocitomas, oligodendrogliomas y astrocitomas y también a las
distintas técnicas que se han utilizado para detectar la misma. En general, las pérdidas de 1p y 19q se
detectan en hasta el 80% de los oligodendrogliomas (grado II OMS) y aproximadamente en el 60% de
los oligodendrogliomas anaplásicos (grado III OMS), mientras que entre el 30-50% de
oligoastrocitomas, del 20-30% de oligoastrocitomas anaplásicos y menos del 10% de los gliomas
astrocíticos difusos, incluyendo el glioblastoma multiforme, tienen esta alteración. La observación de que
frecuentemente tanto los brazos cromosómicos 1p como 19q están completamente perdidos se debe a
una translocación balanceada t(1;19)(q10;p10), en la cual el derivado 1p-19q se pierde, mientras que el
1q-19p se mantiene durante la replicación celular.
En 1998 se describió por primera vez que la pérdida de 1p, y la pérdida combinada de 1p/19q predice
mejor respuesta a quimioterapia y supervivencias más largas en pacientes con oligodendroglioma
anaplásico. Desde entonces se han llevado a cabo más estudios, incluyendo tres ensayos prospectivos
randomizados en fase III, que corroboraron que la deleción 1p/19q es un marcador pronóstico en
pacientes con gliomas grado III. Es importante resaltar, no obstante, que estos estudios indicaron que el
valor pronóstico era independiente del tipo de terapia adyuvante utilizada, ya fuera radioterapia,
quimioterapia, o quimio- y radioterapia combinada. En este sentido aún continúa abierta la discusión
sobre si este marcador es pronóstico (independiente de la terapia) o predictivo de respuesta a terapia.
Estudios retrospectivos en pacientes con tumores oligodendrogliales que no recibieron ni quimio ni
radioterapia posteriormente a la cirugía revelaron que en este caso la pérdida de 1p/19q no estaba
asociada con una supervivencia libre de progresión más larga. Estos datos sugieren que la pérdida de los
brazon cromosómicos 1p/19q caracteriza a un grupo de gliomas que es más sensible a terapia
genotóxica en general (radioterapia, quimioterapia con compuestos alquilantes) y que, cuando son
tratados, se asocia con mayor supervivencia.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil como apoyo diagnóstico de oligodendrogliomas o glioblastomas secundarios a oligodendrogliomas
e informativo de probable mejor pronóstico o mejor respuesta a tratamiento.
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de gliomas dentro de un estudio
observacional.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se realiza la técnica de amplificación múltiple con sonda dependiente de ligación (MLPA: Multiplex
Ligation-dependent Probe Amplification). Se utiliza el kit p088 (MRC-Holland, Amsterdam, Netherland)
que está diseñado para la detección de pérdidas en las regiones cromosómicas 1p y 19q, con 15 sondas
para la región 1p y 8 sondas para la region 19q.
Se lleva a cabo una hibridación del ADN genómico con las sondas marcadas con fluorescencia y
específicas para las regiones cromosómicas a estudio, así como para otras regiones cromosómicas
próximas y lejanas que se utilizan como controles. A continuación se realiza la ligación de las sondas que
han hibridado y posteriormente se lleva a cabo una PCR para amplificar las sondas ligadas que han
hibridado, analizándose los resultados mediante electroforesis capilar. En todos los casos se compara el
patrón obtenido en el paciente a estudio con el patrón obtenido a partir de ADN de individuos sanos.
La cuantificación de la amplificación o deleción de las regiones genómicas en estudio, en cada muestra
tumoral, se realiza mediante el cálculo de una relación que permite corregir las variaciones introducidas
a lo largo del procedimiento experimental, principalmente en la cantidad de ADN inicial. Así, los datos se
normalizan al comparar la amplificación generada por la hibridación de sondas utilizadas como controles
en la muestra tumoral con la amplificación de esas sondas en muestras de ADN control. En concordancia
con Jeuken et al (2006), el umbral para la detección de pérdidas y ganancias génicas se sitúa en un ratio
de 0.8 y 1.2 respectivamente (con una desviación estándar, entre réplicas, menor del 20%).
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
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Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco/ congelación: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado. Muestra para utilizar como control.
Envío opcional.
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados se expresarán de la siguiente forma:
- Se observa deleción en todas las sondas correspondientes a los 15 marcadores de la región
cromosómica 1p y a los 8 marcadores correspondientes a la región 19q. La interpretación de los
resultados es compatible con que la muestra presenta deleción de 1p y 19q.
- No se detecta deleción de ninguna sonda. La interpretación de los resultados es compatible con que la
muestra no presenta deleción de 1p y 19q.
Precauciones.
Pueden observarse deleciones parciales de algunas de las sondas. Se informará de la presencia de estas
deleciones parciales. La interpretación de este resultado en términos clínicos es conflictiva.
La relevancia pronóstica de la deleción de 1p/19q puede perderse en presencia de otras alteraciones
genéticas en el tumor que sean desfavorables.
Aunque se ha observado en algunos estudios que la presencia de las deleciones en 1p y 19q predice
mejor respuesta a a tratamiento, estos estudios no están suficientemente validados clínicamente y no se
deberían utilizar para la toma de decisiones terapéuticas. Los resultados han de considerarse únicamente
en el plano investigativo.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 30 y 50 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Cairncross JG et al. Specific genetic predictors of chemotherapeutic response and survival in patients
with anaplastia oligodendroglioma. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 1473-1479
Cairncross G et al. Phase III trial of chemotherapy plus radiotherapy compared with radiotherapy alone
for pure and mixed anaplastic oligodendroglioma: Intergroup Radiation Therapy Oncology Group Trial
9402. J Clin Oncol 2006; 24:2707–2714
Idbaih A et al. Two types of chromosome 1p losses with opposite significance in gliomas. Ann Neurol
2005; 58: 483-487
Jeuken, J., S. Cornelissen, et al. "Multiplex ligation-dependent probe amplification: a diagnostic tool for
simultaneous identification of different genetic markers in glial tumors." J Mol Diagn 2006; 8(4): 433443.
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Página 81 de 127
Lassman AB y Holland EC. Incorporating molecular tools into clinical trialas and treatment for gliomas?
Current Opin Neurol 2007; 20: 708-711.
Smith JS et al Alterations of chromosome arms 1p and 19q as predictors of survival in
oligodendrogliomas, astrocytomas and mixed oligoastrocytomas. J Clin Oncol 2000; 18:636-645
Weller M et al. Combined 1p/19q loss in oligodendroglial tumors: predictive or prognostic biomarker?
Clin Cancer Res 2007; 13:6933–6937
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 82 de 127
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN IDH1 (R132) E IDH2 (R172)
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las isocitrato deshidrogenasas son enzimas dependientes de NADP que catalizan la descarboxilación
oxidativa del isocitrato al alfa-cetoglutarato. En humanos, existen cinco genes que codifican isocitrato
deshidrogenasas: IDH1, IDH2, IDH3A, IDH3B, y IDH3G. IDH1 e IDH2 funcionan como homodímeros,
estando ubicada IDH1 en el citoplasma y los peroxisomas e IDH2 en la mitocondria. La primera vez que
se relacionaron mutaciones en estos genes del metabolismo celular con cáncer fue en 2008. Parsons et
al, en un estudio de secuenciación de más de 20000 genes en 22 glioblastomas, utilizando métodos
clásicos de secuenciación, detectaron hasta un 12% de casos con mutaciones en el gen IDH1,
implicando así una nueva vía metabólica en la tumorigénesis de los gliomas. Estudios posteriores han
revelado las características de los tumores con mutaciones en IDH1: esta alteración parece ser un
evento temprano en la tumorigénesis, está asociada con astrocitomas y oligodendrogliomas de bajo
grado y con glioblastomas secundarios, pero no con los glioblastoma multiforme primarios. La mutación
detectada fue siempre una mutación puntual en heterocigosis, que afecta al aminoácido R132. La
incidencia de esta mutación es de hasta el 75% en gliomas de grado II y grado III. Los pacientes con
esta mutación en sus tumores parecen tener mejor pronóstico, con una supervivencia más prolongada.
Se han detectado asimismo mutaciones en el gen homólogo IDH2 y en una posición equivalente a la
R132, en este caso R172.
Estudios adicionales en numerosos tipos tumorales han revelado que las mutaciones en IDH1 o IDH2 son
frecuentes solamente en gliomas y en leucemia aguda mieloide, donde también se ha revelado como
una mutación asociada con mejor pronóstico.
Las mutaciones en IDH1 o IDH2 tienen como consecuencia una actividad reducida sobre el sustrato
original, el isocitrato, catalizando sin embargo una nueva reacción que implica la formación de 2hidroxiglutarato a partir del alfa-cetoglutarato. Las consecuencias funcionales de este cambio de
actividad se están empezando a conocer, e implican importantes cambios fenotípicos tales como la
aparición de un fenotipo metilador de islas CpG.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil como apoyo diagnóstico en gliomas de bajo grado o glioblastoma multiforme secundario y posible
marcador de mejor pronóstico. El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de
gliomas dentro de un estudio observacional.
En leucemia aguda mieloide se ha descrito como factor de mejor pronóstico en aquellas leucemias con
NPM1 mutado y ausencia de mutación en FLT3, aunque en estos momentos no se está determinando
oficialmente en los protocolos de estudio de PETHEMA.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
La detección de mutaciones en IDH1 e IDH2 se realiza mediante amplificación por PCR de los exones
correspondientes a las regiones donde se encuentran el codon R132 en IDH1 y R172 en IDH2
respectivamente, que son los más frecuentemente mutados. Se analizan mediante secuenciación
(método de Sanger).
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Biopsia en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Sangre, médula ósea anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Líquidos Biológicos: ascítico, pleural, sinovial, pericárdico. (Contenedor): Tubo de plástico sin aditivos.
VALORES DE REFERENCIA
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No aplica. Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados se expresarán de la siguiente manera:
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en IDH1 o IDH2, con descripción de la mutación.
- La muestra es negativa para la presencia de mutaciones en IDH1 e IDH2
Precauciones.
Solamente se determina la presencia de mutaciones en uno de los exones de IDH1 e IDH2.
El ensayo funciona de forma óptima en muestras al diagnóstico con importante carga tumoral. La
sensibilidad del ensayo no es suficiente para utilizarlo para determinar enfermedad mínima residual
durante la terapia, ya que la sensibilidad es baja, alrededor del 15-20%.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 30 y 50 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Dang L, White DW, Gross S, et al. Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate.
Nature 2009; 462: 739–44.
Figueroa M eta al. Leukemic IDH1 and IDH2 Mutations Result in a Hypermethylation Phenotype, Disrupt
TET2 Function, and Impair Hematopoietic Differentiation. Cencer Cell 2010; 18: 553–567.
Hartmann C et al. Patients with IDH1 wild type anaplastic astrocytomas exhibit worse prognosis than
IDH1-mutated glioblastomas, and IDH1 mutation status accounts for the unfavorable prognostic effect of
higher age: implications for classification of gliomas. Acta Neuropath 2010; 120: 707-18
Mardis ER, Ding L, Dooling DJ, et al. Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid
leukemia genome. N Engl J Med 2009; 361: 1058–66.
Parsons DW et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme. Science 2008;
321: 1807-12
Patel JP et al. Prognostic Relevance of Integrated Genetic Profiling in Acute Myeloid Leukemia. New Engl
J Med (2012) 366:2321-2322.
Sanson M et al. Isocitrate dehydrogenase 1 codon 132 mutation is an important prognostic biomarker in
gliomas. J Clin Oncol 2009; 27: 4150-4
Watanabe T et al. IDH1 mutations are early events in the development of astrocytomas and
oligodendrogliomas. Am J Pathol 2009; 174: 1149-53
Yan H et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. New Engl J Med 2009; 360: 765-73
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 84 de 127
DETERMINACIÓN DE ESTATUS DE METILACIÓN DEL PROMOTOR DE
MGMT
INFORMACIÓN CLÍNICA
Los agentes alquilantes están entre las moléculas más ampliamente utilizadas como quimioterápicos en
el tratamiento del cáncer. Se han descrito varios puntos de metilación en el ADN provocados por este
tipo de compuestos. El sitio más frecuente es la posición O-6 de la guanina. Esta modificación puede
producir entrecruzamientos entre las hebras del ADN y parece ser el punto de ataque de numerosos
agentes quimioterápicos, como los que continenen nitrosoureas (BCNU, ACNU, CCNU, la procarbazina, la
streptozotocina y la temozolomida). Sin embargo, la toxicidad de los agentes alquilantes parece
reducirse en presencia de la O6-metiguanina metiltransferasa (MGMT), una proteína que revierte las
formación de aductos en la posición O-6 de la guanina, y por tanto evita la formación de los
entrecruzamientos del ADN, dañinos para la célula tumoral. Así, la presencia de aciividad MGMT parece
ser un mecanismo importante en la resistencia a la quimioterapia con compuestos alquilantes.
En algunos tumores, el silenciamiento epigenético del gen MGMT, por metilación de su región promotora,
impide la expresión de la proteína y como consecuencia, estos tumores parecen más sensibles a los
agentes alquilantes. Inversamente, la presencia de MGMT en los tumores, o la falta de metilación del
promotor del gen MGMT predice peor respuesta a estos agentes quimioterápicos. Esta relación se ha
visto especialmente en los gliomas, aunque también se ha observado en algunos casos en cáncer
colorectal metastásico.
UTILIDAD CLÍNICA
Es útil para conocer si un tumor podrá ser más sensible a terapia con agentes alquilantes debido a la
presencia de metilación en el promotor del gen MGMT, aunque esta relación no se ha demostrado de
forma definitiva. AlteARNtivamente, la metilación del promotor de MGMT podria considerarse un factor
de mejor pronóstico en gliomas anaplásicos.
El estudio se realiza dentro del protocolo de caracterización molecular de gliomas dentro de un estudio
observacional.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
El estatus de metilación de MGMT se determina mediante PCR específica de metilación (MSP en sus
siglas en inglés) a partir del ADN de la muestra tumoral. En primer lugar, el ADN genómico se modifica
químicamente mediante el tratamiento con bisulfito sódico. El ADN modificado se somete a amplificación
mediante PCR con oligonucleótidos específicos diseñados para amplificar regiones metiladas o nometiladas del promotor de MGMT. Los oligonucleótidos utilizados son los descritos por Esteller et al
(2000). Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa, comparándolos con
controles metilados y no metilados que se incluyen siempre en la reacción.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial.
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biopsia de tejido en fresco/congelación: envío inmediato en tubo tipo eppendorf o en suero salino
Biopsia en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación de la celularidad tumoral.
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
ausencia de metilación). Envío opcional.
(para utilizar como control de
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 85 de 127
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados se expresarán de la siguiente manera:
- Los resultados obtenidos son compatibles con presencia de metilación en el promotor de MGMT.
Metilación positiva.
- Los resultados obtenidos son compatibles con ausencia de metilación en el promotor de MGMT.
Metilación negativa.
Precauciones.
El resultado de la prueba es cualitativo. No permite distinguir porcentajes de metilación. Los resultados
pueden ser interpretados de forma subjetiva, ya que en algunos casos la intensidad de la banda
amplificada puede estar al borde de la significación.
El método no ha sido validado clínicamente para la toma de decisiones terapéuticas. Los resultados han
de considerarse en el plano investigativo.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 30 y 50 días laborables.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Esteller M et al. Inactivation of the ADN-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to
alkylating agents. New Engl J Med 2000; 343(19): 1350-4
Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. New Engl J Med
2005; 352: 997-1003
Herman, J. G., J. R. Graff, et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of
CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93(18): 9821-9826.
Paz, M. F., R. Yaya-Tur, et al. CpG island hypermethylation of the ADN repair enzyme methyltransferase
predicts response to temozolomide in primary gliomas. Clin Cancer Res 2004; 10(15): 4933-4938.
Shacham-Shmueli et al.Response to Temozolomide in Patients With Metastatic Colorectal Cancer With
Loss of MGMT Expression: A New Approach in the Era of Personalized Medicine? J Clin Oncol 2011; vol.
29: e262-e265
Weller M et al. MGMT promoter methylation in malignant gliomas: ready for personalized medicine? Nat
Rev Neurol 2010;6: 39-51
Wick W et al. NOA-04 randomized phase III trial of sequential radiochemotherapy of anaplastic glioma
with procarbazine, lomustine, and vincristine or temozolomide. J Clin Oncol 2009; 27: 5874-80
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 86 de 127
ESTUDIO DE GENOTIPADO EN EL GEN UGT1A1 (VARIANTE
UGT1A1*28)
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las alteraciones en las secuencias de los nucleótidos del promotor del gen que codifica la uridin
5`difosfato glucuronosil transferasa 1A isoforma 1 (UGT1A1) se asocian con toxicidad severa, incluyendo
diarrea y neutropenia, en pacientes que reciben irinotecan. El irinotecan es un análogo de camptotecina
y se utiliza para el tratamiento de cáncer colorectal, pulmón, y otros tumores sólidos. Los efectos tóxicos
de éste se asocian con una formación excesiva de su forma activa, el metaolito SN-38, que se inactiva
por glucoronidación estando implicado en este proceso el enzima UGT1A1.
La repetición del dinucleótido TATA en el promotor del gen UGT1A1 altera la expresión de UGT1A1. El
número de repeticiones varía de cinco a ocho copias. El alelo más común en la población caucásica es el
que contiene la repetición de seis TA (alelo UGT1A1*1).
Varios estudios demostraron la asociación entre pacientes con el alelo UGT1A1*28 (con siete
repeticiones TA) en homocigosis y disminución de la expresión de UGT1A1 y, en consecuencia
disminución de la glucoronidación de SN-38. Esto produce un riesgo elevado (aproximadamente cuatro
veces) de toxicidad severa con irinotecan.
UTILIDAD CLÍNICA
La evaluación de la presencia del alelo UGT1A1*28 en homocigosis, previo a la administración del
irinotecan puede predecir el riesgo de toxicidad severa, permitiendo seleccionar dosis menores u otras
opciones de manejo.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se lisan los eritrocitos mediante lisis osmótica. Se obtiene ADN genómico de la muestra.
El estudio mediante PCR se realiza a partir de ADN genómico. Para la detección de las variantes, se
realiza PCR utilizando oligonucleótidos que flanquean la región a estudio y se analiza mediante
electroforesis capilar en un ABIPRism310 utilizando software Genemapper 4.0. En función del tamaño
del pico o picos observados se determina el número de repeticiones TA en UGT1A1*28, al compararlo
con un control cuyo genotipo es conocido. Se confirma mediante secuenciación.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
En el informe se incluirá una descripción de la variante observada.
Precauciones
No se conoce con claridad el papel que pueden tener otras variantes diferentes de UGT1A1*28, tales
como las variantes con repeticiones de 5(TA) o de 8(TA) en relación con la toxicidad del irinotecan.
Existen otros factores genéticos y no genéticos que pueden influir en la toxicidad del irinotecan.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Existen otras variantes en el gen UGT1A1 que o se detectan mediante esta técnica.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 4 y 6 semanas.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Shulman K et al. Clinical implications of
patients.Cancer. 2011; 117 (14) :3156-3162.
UGT1A1*28
genotype
testing
in
colorectal
cancer
Stewart CF et al. UGT1A1 promoter genotype correlates with SN-38 pharmacokinetics, but not severe
toxicity in patients receiving low-dose irinotecan. J Clin Oncol. 2007; 25 (18) :2594-2600.
Innocenti et al. Genetic variants in the UDP-glucoronosyltransferase 1A1 gene predict the risk of severe
neutropenia of Irinotecan. JouARNl of Clinical Oncolog (2004) 22 (8): 1382-1388.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 88 de 127
DETERMINACIÓN DE INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES
INFORMACIÓN CLÍNICA
El carcinoma colorectal es una de los tumores mas frecuentes y ocupa el segundo puesto en cuanto a
mortalidad asociada a cáncer. Tiene su origen tanto en factores genéticos como ambientales. El tumor
hereditario más común relacionado con el carcinoma colorrectal es el Síndrome de Lynch (OMIM
120435), también conocido como cáncer de colon hereditario no polipósico (CCHNP) caracterizado por
una mutación en línea germinal en los genes del sistema de reparación de desapareamiento de bases del
ADN (MMR “mismatch repair”).
El sistema MMR es uno de los mecanismos implicados en la corrección de mutaciones que ocurren como
resultado de la acción de mutágenos exógenos o endógenos o de la incorporación de bases
desapareadas durante la replicación del ADN. MMR requiere la acción conjunta de varias proteínas. En
humanos los genes que codifican esas proteínas y en los que se han descrito mutaciones asociadas con
Síndrome de Lynch incluyen hMSH2, hMLH1, hMSH6, y hPMS2. Los pacientes portadores de una
mutación en uno de estos genes tienen una función de MMR fenotípicamente normal, pero una nueva
mutación somática en el gen alterado producirá una perdida de función en la reparación del ADN.
El análisis de la inestabilidad de microsatélites (IMS) es un método de cribado en pacientes con sospecha
de Síndrome de Lynch. Los microsatélites son repeticiones en tandem de pequeñas secuencias de ADN
de entre 1 y 6 bases de longitud y repartidas a lo largo de todo el genoma. Generalmente varían en
longitud entre distintos individuos debido a diferencias en el número de repeticiones en tandem en cada
locus. La inestabilidad de microsatélites es un cambio en la longitud de un alelo del microsatélite debido
a inserción o deleción de unidades de repetición causadas por un fallo en la replicación del ADN que no
corrige el sistema de reparación de ADN. Por tanto, la presencia de IMS puede ser el reflejo de un
defecto en los genes de reparación del ADN en el tumor.
La IMS se puede observar además en aproximadamente un 15% de los casos de cáncer de colon
esporádico. En estos casos la causa suele ser una falta de expresión de MLH1 causada por
hipermetilación de su promotor. Existen numerosos estudios que sugieren que los tumores de colon con
IMS positiva difieren de los que no tienen inestabilidad, en términos de pronóstico y de respuesta a
varios tratamientos, siendo en general de mejor pronóstico los tumores con IMS, si bien los datos no
están validados clínicamente de forma definitiva.
UTILIDAD CLÍNICA
La prueba se realiza actualmente como complemento a estudios mediante técnicas inmunohistoquímicas
en anatomía patológica. La ausencia de expresión de en las proteínas MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2 y la
presencia de inestabilidad de microsatélites (MSI) en una muestra tumoral de cáncer de colon puede
indicar la presencia de un síndrome de Lynch y la posible presencia de alteraciones en línea germinal en
alguno de los genes implicados en la reparación del ADN. En ese caso se continuará con el estudio
genético si se considera oportuno desde la consulta de la Unidad de Cáncer Familiar.
La detección temprana de este síndrome es importante para reducir la morbilidad y mortalidad
especialmente en los pacientes portadores no sintomáticos.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se prepara ADN genómico del tejido tumoral embebido en parafina a partir de un bloque de la biopsia y
de la sangre periférica.
Se realiza la determinación de inestabilidad de los microsatélites mediante una PCR múltiple con
oligonucleótidos marcados con fluorescencia, utilizando el kit MSI Análisis System v1.2 (Promega).
Se estudia un panel de cinco marcadores de microsatélites mononucleares (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR24 y MONO-27) que tienen gran sensibilidad y especificidad en la detección de MSI y se han considerado
para ser utilizados en una revisión de los criterios de Bethesda (Umar et al. 2004, JCNI 96: 261).
Los resultados de la amplificación mediante PCR se analizan mediante electroforesis capilar en un
instrumento ABIPrism310 y software Genemapper (Applied Biosystems) y se comparan con la muestra
de ADN obtenida de sangre periférica.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 89 de 127
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Biopsia en parafina: 5 cortes de 5 micras, con indicación por parte de Anatomía Patológica del
porcentaje de celularidad tumoral de la muestra, siendo el porcentaje óptimo de un 40% o mayor.
VALORES DE REFERENCIA
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se observa inestabilidad de microsatélites en la muestra estudiada. MSI negativo.
- Se observa inestabilidad en varios o todos los microsatélites estudiados, por lo que se puede
considerar que la muestra es positiva para inestabilidad de microsatélites.
Precauciones
El ensayo funciona de forma óptima en muestras al diagnóstico con importante carga tumoral.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 4 semanas.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Suraweera et al. “Evaluation of tumor microsatellite instability using five quasimonomorphic
mononucleotide repeats and pentaplex PCR” Gastroenterology (2002) 123: 1804-1811.
Umar et al. “Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch
syndrome) and microsatellite instability” JouARNl of National Cancer Institute (2004) 96 (4): 181-197.
van Lier et al. “A review on the molecular diagnosis of Lynch syndrome: a central role for the pathology
laboratory” J. Cell. Mol. Med. (2010) 14: 181-197.
Zaanan A et al. Microsatellite instability in colorectal cancer: from molecular oncogenic mechanisms to
clinical implications. Cell Oncol (2011) 34:155-176
Manual técnico Promega “MSI Analysis System” Version 1.2 Referencia TM255
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 90 de 127
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN LOS GENES SDHD Y SDHB
INFORMACIÓN CLÍNICA
Mutaciones en los genes SDHB y SDHC y SDHD predisponen para el síndrome Feocromocitoma/
Paraganglioma (F/ PGL) familiar. Se detectan mutaciones en estos genes en aproximadamente un 70%
de los casos de origen familiar, siendo aproximadamente un 30% localizadas en SDHD, un 22-38% en
SDHB y un 4-8% en SDHC.
Según la Sociedad Española de Oncología Médica, los criterios que debe cumplir un F/ PGL familiar para
ser diagnosticado son los siguientes:
1. Feocromocitoma bilateral
2. Más de un caso en la familia
3. El cáncer medular de tiroides debe estar excluido
(Deben cumplirse todos los criterios)
SDHD (formado por 4 exones) y SDHB (formado por 8 exones), codifican unas proteínas de 159 y 280
aminoácidos respectivamente, que forman parte del complejo II de la succinato deshidrogenada (SDH)
mitocondrial implicado en el ciclo de Krebs.
Las mutaciones en el caso de SDHD se extienden a lo largo de sus 4 exones, mientras que en SDHB se
localizan principalmente en los exones 2, 3, 4, 6 y 7. Se han descrito mutaciones sin sentido, de cambio
de aminoácido, pequeñas deleciones e inserciones, así como grandes deleciones que abarcan un 6.411.5% de las alteraciones.
Es importante utilizar presentaciones clínicas que pueden orientar hacia un gen u otro para reducir el
coste del screening genético. De este modo y en lineas muy generales, se debe comenzar el estudio con
SDHB en caso de tumores desarrollados en el abdomen y torax y con comportamiento agresivo, y por
SDHD en caso de antecedentes de paraganglioma familiar y en tumores desarrollados en cabeza y
cuello.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de síndrome feocromocitoma/ paraganglioma familiar (OMIM 193300).
Detección temprana de este síndrome en pacientes portadores asintomáticos. Se debe tener en cuenta
las diferencias en penetrabilidad y la variabilidad en la expresión clínica de la enfermedad, lo que obliga
a plantear un seguimiento clínico exhaustivo del paciente.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ARN y ADN genómico a partir de la sangre periférica tras la lisis de los eritrocitos.
Se realiza una amplificación mediante PCR de todos los exones constituyentes de los genes SDHB y
SDHD, utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las regiones a estudio. Se utiliza un control
negativo en cada estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se
secuencia en un instrumento ABI310 utilizando uno o los dos oligonucleótidos con los que se amplificó
la muestra. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos y
manualmente para determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen. Este protocolo analiza
la secuencia genómica y permite detectar posibles mutaciones puntuales y pequeñas deleciones o
inserciones en este gen mediante secuenciación.
De forma adicional, en los casos en los que no se encuentra mutación en SDHB o SDHD, se realiza un
estudio de detección de grandes deleciones en estos genes, y en el gen SDHC, mediante la técnica MLPA
(“Multiplex ligation-dependent probe amplification”), utilizando el kit p266B1 (MRC-Holland). Para el
estudio se lleva a cabo una hibridación con sondas marcadas con fluorescencia y específicas para cada
uno de los exones, así como para regiones cromosómica próximas y lejanas al gen que se utilizan como
controles. Se realiza una PCR para amplificar las sondas que han hibridado y han sido ligadas, y se
analiza mediante electroforesis capilar. En todos los casos se compara el patrón obtenido en el paciente
a estudio con el patrón obtenido a partir de ADN de individuos sanos.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 91 de 127
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para
determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detectó ninguna alteración en el análisis de la secuencia de los genes SDHB y SDHD. No se
detectó ninguna alteración en el análisis mediante MLPA. Conclusión: No se puede demostrar la
presencia de alteraciones en la muestra estudiada.
- El análisis de secuencia reveló la presencia de una mutación en SDHB/ SDHD. Se incluirá una
descripción de la mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 2 y 4 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Badenhop et al. “The prevalence of SDHB, SDHC, and SDHD mutations in patients with head and neck
paraganglioma and association of mutations with clinical features” J Med Genet (2004) 41.
Cascón et al. “Genetics of pheochomocytoma and paraganglioma in spanish patients” J Clin Endocrinol
Metab (2009) 94 (5): 1701-1705.
Gene reviews. NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1548/
MLPA ADN protocol version MDP-v001. MRC-Holland. disponible en www.mlpa.com
Neumann et al. “Clinical predictors for germline mutations in head and neck paraganglioma patients:
cost reduction strategy in genetic diagnostic process as fall-out” Cancer Res (2009) 69 (8): 3650-3656.
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN VHL
INFORMACIÓN CLÍNICA
La enfermedad de Von Hippel-Lindau (VHL) (OMIM 193300) es un síndrome hereditario autosómico
dominante con una prevalencia de 1:36000, expresividad clínica variable y penetrancia dependiente de
la edad. El diagnóstico de enfermedad VHL se basa principalmente en criterios clínicos. La enfermedad
se clasifica en dos grupos, VHL tipo 1, con riesgo bajo de feocromocitoma pero que pueden desarrollar el
resto de tumores asociados a la enfermedad, y VHL tipo 2 que desarrollan feocromocitoma y que
muestran además un bajo (tipo 2A) o alto riesgo (tipo 2B) de desarrollar CRCC. Las familias
encuadradas en el tipo 2C dólo desarrollna feocromocitoma.
Se considera enfermedad de VHL, en caso de presencia de historia familiar, si se cumple al menos uno
de los siguientes criterios:
1. Hemangioblastoma único de retina
2. Hemangioblastoma único de cerebelo
3. Carcinoma renal de células claras (CRCC).
4. Feocromocitoma
5. Cistoadenoma seroso microquístico en el páncreas.
En caso de ausencia de historia familiar se debe cumplir al menos uno de los siguientes criterios:
1. Dos o más hemangioblastomas retinianos o cerebelares.
2. Hemangioblastoma retiniano o cerebelar único en presencia de otro tumor visceral asociado.
La enfermedad está ocasionada por mutación en el gen VHL, localizado en 3p25-26. VHL tiene tres
exones y codifica dos proteínas de 159 y 213 aminoácidos. Es un gen supresor de tumores por lo que,
en un paciente portador de una mutación en línea germinal, es necesario que ocurra una segunda
mutación somática para que se desarrolle tumor en el tejido diana. Hasta la fecha hay descritas más de
500 alteraciones en VHL, aproximadamente un 80% de las mutaciones son de tipo puntual o
inserciones/ deleciones, y un 20% son grandes deleciones. Las familias VHL tipo 1 se correlacionan con
pequeñas inserciones y deleciones, mutaciones sin sentido o grandes reordenamientos, mientras que las
familias clasificadas como tipo 2, muestran fundamentalmente mutaciones que generan cambio de
aminoácido.
Esta enfermedad tiene una penetrancia muy alta, por lo que prácticamente todos los pacientes
portadores en línea germinal desarrollarán la enfermedad antes de los 65 años.
El estudio genético realizado en pacientessin antecedentes familiares y con sospecha clínica de la
enfermedad ha permitido identificar que hasta un 20% de los casos se debe a mutación de novo.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de enfermedad de Von Hippel-Lindau (VHL) (OMIM 193300).
Detección temprana de este síndrome en pacientes portadores asintomáticos. Se debe tener en cuenta
la alta penetrabilidad y la variabilidad en la expresión clínica de la enfermedad, lo que obliga a plantear
un seguimiento clínico exhaustivo del paciente.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN genómico a partir de la sangre periférica tras la lisis de los eritrocitos.
Se realiza una amplificación mediante PCR de parte del promotor y los tres exones constituyentes del
gen VHL, utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las regiones a estudio. Se utiliza un
control negativo en cada estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de
agarosa y se secuencia en un instrumento ABI310 utilizando uno o los dos oligonucleótidos con los que
se amplificó la muestra. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas
informáticos y manualmente para determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen. Este
protocolo analiza la secuencia genómica y permite detectar posibles mutaciones puntuales y pequeñas
deleciones o inserciones en este gen mediante secuenciación.
Por otra parte, se estudia de la presencia de grandes deleciones en mediante la técnica MLPA (“Multiplex
ligation-dependent probe amplification”), utilizando el kit MLPA-P016 (MRC-Holland). Para el estudio se
lleva a cabo una hibridación con sondas marcadas con fluorescencia y específicas para cada uno de los
exones, así como para regiones cromosómica próximas y lejanas al gen que se utilizan como controles.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Se realiza una PCR para amplificar las sondas que han hibridado y han sido ligadas y se analiza
mediante electroforesis capilar. En todos los casos se compara el patrón obtenido en el paciente a
estudio con el patrón obtenido a partir de ADN de individuos sanos.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para
determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detectó ninguna alteración en el análisis de la secuencia del gen VHL. No se detectó ninguna
alteración en el análisis mediante MLPA. Conclusión: No se puede demostrar la presencia de alteraciones
en el gen VHL en la muestra estudiada.
- El análisis de secuencia reveló la presencia de una mutación en VHL. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 2 y 4 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Gene reviews. NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1463/
MLPA ADN protocol version MDP-v001. MRC-Holland. disponible en www.mlpa.com
“Molecular Pathology in Clinacal Practice: Oncology” (2009) Ed. Springer
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 94 de 127
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN RET (EXONES 10, 11, 13, 14,
15 Y 16)
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las mutaciones germinales en el gen RET están presentes en aproximadamente un 95% de los pacientes
con Neoplasia Endocrina Múltiple tipo 2 (MEN2) (OMIM 171400). MEN2 es un síndrome hereditario
autosómico dominante con penetrancia casi completa y expresividad variable. Se clasifica en tres
subtipos, MEN2a, MEN2b y CMTf (carcinoma medular de tiroides familiar). A continuación se describen
los criterios especificados por la Sociedad Española de Oncología Médica que se deben cumplir para su
diagnóstico.
En caso de MEN2a:
1. Carcinoma medular de tiroides
2. Feocromocitoma uni o bilateral
3. Tumores paratiroideos
En caso de MEN2b:
1. Carcinoma medular de tiroides
2. Feocromocitoma
3. Hábito marfanoide
4. Ganglioneuromatosis mucosa e intestinal
En caso de CMTf:
1. Más de 10 miembros afectos de cáncer medular de tiroides y que se hayan descartado otros tumores
de MEN2.
El proto-oncogén responsable de la enfermedad (RET) se localiza en 10p11.2, tiene 21 exones y un
tamaño aproximado de 52 kilobases. Codifica una proteína tirosín quinasa con tres variantes de 1114,
1106 y 1072 aminoácidos. Hasta la fecha hay descritas unas 40 mutaciones germinales localizadas entre
los exones 8 y 16 del gen que se pueden asociar con uno o dos subtipos de MEN2 y con un riesgo
determinado de desarrollo de los signos de la enfermedad.
Aunque el 75% de los CMT se presenta sin antecedentes familiares y sin ningún dato que pueda sugerir
la presencia de heredabilidad, un 3-7% de estos casos presenta mutaciones en línea germinal en RET.
En relación al feocromocitoma, aproximadamente un 1% de los pacientes con un único tumor y sin
antecedentes familiares ni otros datos relacionados con MEN2 presenta mutaciones en RET.
Las mutaciones asociadas al desarrollo de MEN2a afectan fundamentalmente a residuos cisteína en los
exones 10 y 11, destacando sustituciones y duplicaciones en los residuos 630 en el exón 10 y 790 en el
exón 13. Muchas de estas mutaciones son también responsables del CMTf, destacando en este caso
sustituciones en los residuos 609, 611, 618, 620 y 634. En el caso de MEN2b, esta enfermedad está
asociada un número reducido de mutaciones (M918T en un 95% de los casos). En función del subtipo de
la enfermedad y del tipo de alteración que presente en RET, se pueden agrupar los pacientes en grupos
de riesgo como apoyo para la decisión terapéutica y estimar la edad óptima en la que realizar una
tiroidectomía profiláctica.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de Neoplasia Endocrina Múltiple tipo 2 (MEN2) (OMIM 171400), donde RET esta mutado en
un 98% de los casos MEN2a, un 99% casos MEN2b y un 85% de los casos CMTf. Cabe destacar que se
pueden encontrar mutaciones en este gen en un 3-7% de los casos de CMT sin antecedentes familiares y
en un un 1% de los feocromocitomas aparentemente esporádicos.
Detección temprana de este síndrome en pacientes portadores asintomáticos. Se debe tener en cuenta
la alta penetrabilidad y la variabilidad en la expresión clínica de la enfermedad, lo que obliga a plantear
un seguimiento clínico exhaustivo del paciente.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN genómico a partir de la sangre periférica tras la lisis de los eritrocitos.
Se realiza una amplificación mediante PCR de los exones 10, 11, 13, 14, 15 y 16, que son los más
frecuentemente mutados, utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las regiones a estudio.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 95 de 127
Se utiliza un control negativo en cada estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en
gel de agarosa y se secuencia en un instrumento ABI310 utilizando uno o los dos oligonucleótidos con
los que se amplificó la muestra. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas
informáticos y manualmente para determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen. Este
protocolo analiza la secuencia genómica y permite detectar posibles mutaciones puntuales y pequeñas
deleciones o inserciones en este gen mediante secuenciación.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para
determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detectó ninguna alteración en el análisis de la secuencia de los exones mencionados del gen RET.
- El análisis de secuencia reveló la presencia de una mutación en RET. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Precaución:
Se realiza secuenciación de las regiones más frecuentemente mutadas del gen RET, pero podrían existir
mutaciones en otros exones del gen no incluidos actualmente en este estudio.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Gene reviews. NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1257/
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 96 de 127
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN MYH (Y165C Y G382C)
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las mutaciones germinales en MYH (MUTYH) están presentes en la poliposis asociada el gen MYH (MAP)
(OMIM 608456). Esta enfermedad tiene un fenotipo colónico similar al de la poliposis adenomatosa
familar (PAF) atenuada o leve, presenta herencia autonómica recesiva y se deriva de mutaciones
bialélicas del gen MYH.
Según la SEOM, para el diagnostico de PAF atenuada se debe cumplir al menos uno de los siguientes
criterios:
1. Más de 15 pólipos adenomatosos colorrectales.
2. Más de 5 pólipos adenomatosos colónicos con edad menor de 60 años e historia familiar de cáncer de
colon.
El gen MUTYH (MYH) codifica una proteína glicosilasa que forma parte del mecanismo celular de
reparación de escisión de bases. Las mutaciones bialélicas en este gen llevan a la ausencia de actividad
de la proteína y causan un exceso de mutaciones G:C>T:A en genes como APC y KRAS
(excepcionalmente todas las mutaciones en KRAS resultan ser idénticas, GGT>TGT, p.G12C).
Los alelos más frecuentemente mutados en relación con esta enfermedad son Y165C y G382C (p.Y179C
y p.G396D segúnla nomenclatura del gen de referencia NG_008189.1), observándose la mutación en
homocigosis o bialélica. Puesto que estas dos mutaciones son las responsables del 85-90% de los casos
de poliposis asociada al gen MYH en la población caucásica, el estudio de alteraciones en el gen MYH se
restringe inicialmente a estas dos alteraciones.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio molecular de alteraciones el gen MYH esta indicado en pacientes con poliposis múltiple y CCR,
con historia familiar de cáncer de colon polipósico y en el que no se han encontrado alteraciones en el
gen APC.
Detección temprana de este síndrome en pacientes portadores asintomáticos.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN genómico a partir de la sangre periférica tras la lisis de los eritrocitos.
A partir del ADN genómico obtenido se amplifican mediante PCR con oligonucleótidos específicos los
exones 7 y 13 del gen MUTYH (MYH), donde se localizan las regiones que codifican para los aminoácidos
Y165 y G382 respectivamente. Los fragmentos amplificados se someten a secuenciación. Se utiliza un
control negativo en cada estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de
agarosa y se secuencia en un instrumento ABI310 utilizando uno o los dos oligonucleótidos con los que
se amplificó la muestra. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas
informáticos y manualmente para determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 97 de 127
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos y patológicos, para
determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta ninguna alteración en la región que codifica los aminoácidos Y165 y G382 del gen MYH
en la muestra estudiada
- Se ha detectado la mutación que da lugar al cambio Y165C/ G382D en heterocigosis/ homocigosis en
el gen MYH.
Consideraciones:
Si no se detecta ninguna mutación y existe una sospecha clínica alta de presencia de enfermedad
genética o sólo se observa un alelo mutado, se analizarán los 16 exones del gen mediante amplificación
por PCR con oligonucleótidos específicos para cada exón y secuenciación, a petición del clínico.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 2 y 4 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 98 de 127
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN TP53
INFORMACIÓN CLÍNICA
Entre los genes supresores tumorales, el más importante en cuanto a funcionalidad e importancia es
TP53, conocido como “el guardián del genoma”. Las mutaciones en este gen son la alteración más
común en cáncer, habiendo sido observadas en más del 50% de los tumores humanos. Aparte de las
mutaciones somáticas de TP53, también pueden ocurrir mutaciones en línea germinal, que están
relacionadas con el síndrome de Li-Fraumeni. En general las alteraciones consisten en mutaciones
puntuales, principalmente entre los exones 4 a, 9 que provocan la sustitución de un aminoácido, aunque
también se han observado otro tipo de daños, como mutaciones sin sentido, deleciones, inserciones y
reordenamientos.
El síndrome de Li-Fraumeni es un síndrome hereditario poco frecuente de herencia autosómica
dominante, caracterizado por la presencia de un amplio espectro de neoplasias que se pueden presentar
a edades jóvenes, incluso en la infancia, múltiples tumores primarios en un mismo individuo y varios
miembros afectos en una familia. La localización tumoral puede presentar una amplia variedad. Los
tumores que más frecuentemente se asocian al síndrome de Li-Faumeni son sarcomas de partes blandas
y osteosarcomas, tumores de mama, tumores cerebrales, carcinoma de la glándula suprarrenal y
leucemias. Cuando los criterios clínicos de definición del síndrome son estrictos, más del 70% de estos
pacientes presentan mutación germinal en TP53.
Los criterios para un síndrome de Li-Fraumeni clásico son:
1. Probando con un sarcoma diagnosticado antes de los 45 años.
2. Un familiar de primer grado con cualquier cáncer antes de los 45 años.
3. Un familiarde primer o segundo grado con cáncer antes de los 45 años o sarcoma a cualquier edad.
Deben cumplirse todos los criterios para el diagnóstico
Al observarse que existen familias portadoras de mutación en TP53 que no cumplen estrictamente los
criterios clásicos, se han ido refinando estos criterios, siendo los criterios de Chompret actualizados en
2009 los siguientes:
-
-
Probando con tumor asociado al Síndrome de Li-Fraumeni (sarcoma óseo, sarcoma de partes
blandas, cáncer de mama, cáncer adrenocortical, leucemia, cáncer broncoalveolar de pulmón)
antes de los 46 años y al menos un familiar de primero o segundo grado con un tumor asociado al
síndrome de Li-Fraumeni (excepto cáncer de mama, si el probando tiene cáncer de mama) antes
de los 56 años o con múltiples tumores primario; o
Probando con múltiples tumores (excepto múltiples tumores de mama), dos de los cuales
pertenezcan al grupo asociado a Li-Fraumeni y el primero se presentó antes de los 46 años; o
Paciente con carcinoma adrenocortical o con carcinoma de plexos coroideos, independientemente
de la historia familiar.
Se detectan mutaciones en un 29% de las familias que cumplen estos criterios.
UTILIDAD CLÍNICA
Apoyo diagnóstico de síndrome de Li-Fraumeni en probando que cumpla criterios. Su determinación en
los pacientes afectados permitirá el estudio en otros miembros de la misma familia para determinar su
riesgo de susceptibilidad al cáncer.
En algunos tumores el estudio de alteraciones somáticas en TP53 puede tener valor pronóstico.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
En este protocolo se analiza mediante secuenciación los exones 4-11 del gen TP53. La secuencia de
referencia del gen TP53 es NG_017013.2, que cubre el transcrito NM_000546.4.
Se obtiene ADN genómico a partir de la sangre periférica o médula ósea tras la lisis de los eritrocitos.
Se realiza una amplificación mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean las
regiones a estudio. Se utiliza un control negativo en cada estudio. El producto de PCR se analiza
mediante electroforesis en gel de agarosa y secuenciado utilizando uno de los oligonucleótidos con los
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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que se amplificó la muestra. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas
informáticos y manualmente para determinar la presencia o ausencia de mutaciones en este gen.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre, médula ósa anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos para determinar la
significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- La muestra es negativa para la presencia de mutación en TP53.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en TP53. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 2 y 4 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Li FP, Fraumeni JF et al. A cáncer family syndrome in twenty-four kindreds. Cancer Res 1988; 48: 53585362
Malkin D et al. Germ line p53 mutations in familial syndrome of breast cancer, sarcomas and other
neoplasms. Science 1990; 250: 1233-1238
Srivastava et al.Germ-line transmission of a mutated p53 gene in cancer-prone family with Li-Fraumeni
Syndrome. Nature 1990; 348: 747-749
Olivier M et al. Li-Fraumeni and related syndromes:correlation between tumor type,family structure and
TP53 genotype. Cancer Res 2003; 63: 6643-6650
Tinat J et al. 2009 version of the Chompret criteria for Li-Fraumeni syndrome. J Clin Oncol 2009; 27:
e108-e109
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN BRCA1
INFORMACIÓN CLÍNICA
El gen BRCA1 fue el primero en asociarse con el síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario
(CMOH). Posteriormente se asoció un segundo gen, BRCA2, implicado además en el cáncer de mama
masculino. Ambos son responsables de más de un 60% de los casos familiares y de aproximadamente
un 5% de todos los casos. Estos genes se caracterizan por tener herencia autosómica dominante, alta
penetrancia y baja frecuencia.
Según el grupo de trabajo de Cáncer Hereditario de la SEOM, para el estuidio genético relacionado con el
diagnóstico de síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario se debe cumplir al menos uno de los
siguientes criterios:
1. Un caso de cáncer de mama menor o igual a 40 años.
2. Diagnóstico de cáncer de mama y ovario en el mismo individuo.
3. Dos o más casos de cáncer de mama, uno de los cuales en menor de 50 años o bilateral.
4. Un caso de cáncer de mama a edad menor o igual a 50 años o bilateral y un caso de cáncer de ovario
en familiares de primer o segundo grado.
5. Tres casos de cáncer de mama y ovario (al menos un caso de ovario) en familiares de primer o
segundo grado.
6. Dos casos de cáncer de ovario en familiares de primer o segundo grado.
7. Un caso de cáncer de mama en un varón y familiar de primer o segundo grado con cáncer de mama u
ovario.
BRCA1 es un gen de gran tamaño, consta de 5.592 nucleótidos repartidos en 24 exones, que se
extienden a lo largo de 100 kb de ADN genómico en el cromosoma 17q21 y que codifican una proteína
de 1.863 residuos. Entre sus funciones destaca su papel en el mantenimiento de la integridad genómica,
la ubiquitinación de proteínas, la remodelación de la cromatina, la replicación del ADN y la reparación del
ADN.
Se han registrado más de mil mutaciones distintas tanto en BRCA1 como en BRCA2. Exceptuando un
pequeño grupo de mutaciones recurrentes, la mayoría son específicas de cada familia. Más del 70% de
las mutaciones en ambos genes son pequeñas inserciones o deleciones, que provocan un cambio en el
marco de lectura de la secuencia de ADN, dando lugar a la aparición de un codón de parada prematuro,
cuya consecuencia es una proteína truncada. Otros alteraciones descritas son, sustituciones, alteración
del proceso de eliminación de intrones (splicing), y grandes deleciones, duplicaciones o
reordenamientos.
Algunas mutaciones se observan repetidamente en familias no emparentadas, y en ciertas poblaciones
unas pocas mutaciones se presentan con una frecuencia inusualmente alta. Recientemente hemos
publicado el espectro mutacional de BRCA1 y 2 en la población asturiana, que refleja la presencia de un
pequeño número de mutaciones, algunas de ellas no descritas en ninguna otra población, en casi el 50%
de los casos positivos.
El análisis molecular completo de BRCA1 y BRCA2 resulta complejo, debido tanto al tamaño de los dos
genes como a la distribución aleatoria de mutaciones que se observa en la mayoría de poblaciones. Este
proceso es costoso, tanto en recursos humanos y como económicos. El conocimiento de la distribución
geográfica de las mutaciones permite iniciar el análisis por aquellos fragmentos que contengan con
mayor frecuencia alteraciones o mutaciones recurrentes conocidas dependiendo del lugar de origen de la
familia afectada.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario.
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio está indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN de la muestra de sangre periférica.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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En el probando con sospecha de mutación, el ADN se envía a un laboratorio externo, donde se procede a
la secuenciación completa del gen BRCA1. Esta técnica no permite detectar grandes deleciones, que se
analizaran previamente mediante otra técnica.
En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la región a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta ninguna mutación en el gen BRCA1 considerada patogénica en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en BRCA1. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
- Se pueden detectar cambios en la secuencia considerados polimórficos y sin significado clínico en la
actualidad o cambios que dan lugar a alteraciones de significado incierto, en los que no se puede
asegurar el papel patogénico de dicha alteración. Los cambios polimórficos no se mencionarán
detalladamente en el informe, a no ser que sean solicitados específicamente por el clínico. Las
mutaciones de significado incierto se mencionarán como tales y con las posibles evidencias a favor o en
contra de su patogenicidad.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Baiget et al. “Analysis of BRCA1 and BRCA2 Genes in Spanish Breast/ Ovarian Cancer Patients: A High
Proportion of Mutations Unique to Spain and Evidence of Founder Effects”. Human Mutation (2003) 22:
301-312.
Blay et al. Mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 in hereditary breast and ovarian cancer families
from Asturias (Northern Spain). BMC Cancer 2013, 13:243
Diez et al. Analysis of BRCA1 and BRCA2 Genes in Spanish Breast/Ovarian Cancer Patients: A High
Proportion of Mutations Unique to Spain and Evidence of Founder EffectsHuman Mutation 2003; 22:301312
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 102 de 127
Narod et al. “BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond” Nature Reviews Cancer (2004) 4: 665-676.
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 103 de 127
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN BRCA2
INFORMACIÓN CLÍNICA
BRCA2 fue el segundo gen en asociarse con Cáncer de mama y ovario hereditario (CMOH) después de
BRCA1. Ambos son responsables de más de un 60% de los casos familiares y de aproximadamente un
5% de todos los casos, estando BRCA2 especialmente asociado a cáncer de mama masculino. Estos
genes se caracterizan por tener herencia autosómica dominante, alta penetrancia y baja frecuencia.
Según el grupo de trabajo de Cáncer Hereditario de la SEOM, para el diagnóstico de Cáncer de mama y
ovario hereditario se debe cumplir al menos uno de los siguientes criterios:
1. Un caso de cáncer de mama menor o igual a 40 años.
2. Diagnóstico de cáncer de mama y ovario en el mismo individuo.
3. Dos o más casos de cáncer de mama, uno de los cuales en menor de 50 años o bilateral.
4. Un caso de cáncer de mama a edad menor o igual a 50 años o bilateral y un caso de cáncer de ovario
en familiares de primer o segundo grado.
5. Tres casos de cáncer de mama y ovario (al menos un caso de ovario) en familiares de primer o
segundo grado.
6. Dos casos de cáncer de ovario en familiares de primer o segundo grado.
7. Un caso de cáncer de mama en un varón y familiar de primer o segundo grado con cáncer de mama u
ovario.
BRCA2 es un gen de gran tamaño, localizado en 13q12. Consta de 11.385 nucleótidos repartidos en 27
exones a lo largo de unas 70kb de ADN genómico y que codifican una proteína de 3.418 residuos. A
pesar de que BRCA1 y BRCA2 tienen secuencias muy diferentes, hay muchas evidencias que demuestran
que poseen funciones biológicas comunes, entre las que destaca su papel en el mantenimiento de la
integridad genómica y la reparación del ADN mediante recombinación homóloga. Las funciones de
BRCA2 parecen más limitadas que las de BRCA1, aunque también parece participar en remodelación
cromatínica y el control del ciclo celular en G2/M.
Se han registrado más de mil mutaciones distintas tanto en BRCA1 como en BRCA2. Exceptuando un
pequeño grupo de mutaciones recurrentes, la mayoría son específicas de cada familia. Más del 70% de
las mutaciones en ambos genes son pequeñas inserciones o deleciones, que provocan un cambio en el
marco de lectura de la secuencia de ADN, dando lugar a la aparición de un codón de parada prematuro,
cuya consecuencia es una proteína truncada. Otros alteraciones descritas son, sustituciones, alteración
del proceso de eliminación de intrones (splicing), y grandes deleciones, duplicaciones o
reordenamientos.
Algunas mutaciones se observan repetidamente en familias no emparentadas, y en ciertas poblaciones
unas pocas mutaciones se presentan con una frecuencia inusualmente alta. Recientemente hemos
publicado el espectro mutacional de BRCA1 y 2 en la población asturiana, que refleja la presencia de un
pequeño número de mutaciones, algunas de ellas no descritas en ninguna otra población, en casi el 50%
de los casos positivos.
El análisis molecular completo de BRCA1 y BRCA2 resulta complejo, debido tanto al tamaño de los dos
genes como a la distribución aleatoria de mutaciones que se observa en la mayoría de poblaciones. Este
proceso es costoso, tanto en recursos humanos y como económicos. El conocimiento de la distribución
geográfica de las mutaciones permite iniciar el análisis por aquellos fragmentos que contengan con
mayor frecuencia alteraciones o mutaciones recurrentes conocidas dependiendo del lugar de origen de la
familia afectada.
UTILIDAD CLÍNICA
Dioagnóstico de síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario.
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
En el probando con sospecha de mutación, el ADN se envía a un laboratorio externo, donde se procede a
la secuenciación completa del gen BRCA2. Esta técnica no permite detectar grandes deleciones, que se
analizarán previamente mediante otra técnica (MLPA).
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la región a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta ninguna mutación en el gen BRCA2 considerada patogénica en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en BRCA2. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
- Se pueden detectar cambios en la secuencia considerados polimórficos y sin significado clínico en la
actualidad o cambios que dan lugar a alteraciones de significado incierto, en los que no se puede
asegurar el papel patogénico de dicha alteración. Los cambios polimórficos no se mencionarán
detalladamente en el informe, a no ser que sean solicitados específicamente por el clínico. Las
mutaciones de significado incierto se mencionarán como tales y con las posibles evidencias a favor o en
contra de su patogenicidad.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Baiget et al. “Analysis of BRCA1 and BRCA2 Genes in Spanish Breast/ Ovarian Cancer Patients: A High
Proportion of Mutations Unique to Spain and Evidence of Founder Effects”. Human Mutation (2003) 22:
301-312.
Blay et al. Mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 in hereditary breast and ovarian cancer families
from Asturias (Northern Spain). BMC Cancer 2013, 13:243
Diez et al. Analysis of BRCA1 and BRCA2 Genes in Spanish Breast/Ovarian Cancer Patients: A High
Proportion of Mutations Unique to Spain and Evidence of Founder EffectsHuman Mutation 2003; 22:301312
Narod et al. “BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond” Nature Reviews (2004) 4: 665-676.
Varios autores. “Molecular Pathology in Clinical Paractice: Oncology” (2009) Ed. Springer
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN MLH1
INFORMACIÓN CLÍNICA
El carcinoma colorectal es una de los tumores mas frecuentes y ocupa el segundo puesto en cuanto a
mortalidad asociada a cáncer. Tiene su origen tanto en factores genéticos como ambientales. La causa
genética más común es el Síndrome de Lynch (OMIM 120435), también conocido como cáncer de colon
hereditario no polipósico (CCHNP) caracterizado por una mutación en línea germinal en los genes del
sistema de reparación de desapareamiento de bases del ADN (MMR “mismatch repair”). Este síndrome
engloba entre un 5 y un 10% de los cánceres colorrectales que se diagnostican en la actualidad.
El sistema MMR es uno de los mecanismos implicados en la corrección de mutaciones que ocurren como
resultado de la acción de mutágenos exógenos o endógenos o de la incorporación de bases
desapareadas durante la replicación del ADN. MMR requiere la acción conjunta de varias proteínas. En
humanos los genes que codifican esas proteínas y en los que se han descrito mutaciones asociadas con
Síndrome de Lynch incluyen hMLH1, hMSH2, hMSH6, y hPMS2.
Los pacientes portadores de una mutación en uno de estos genes tienen una función de MMR
fenotípicamente normal, pero una nueva mutación somática en el gen alterado producirá una perdida de
función en la proteína que codifica. Esta alteración se correlaciona en el tumor originado con ausencia de
expresión de la proteína por inmunohistoquímica, y por un fenómeno conocido como inestabilidad de
microsatélites (IMS). Ambas características sirven como cribado previo para conocer los pacientes con
cáncer de colon susceptibles de ser portadores de una mutación en línea germinal.
MLH1 se localiza en el cromosoma 3p21 y tiene 19 exones que codifican una proteína de 756
aminoácidos. Hasta la fecha se han detectado más de 250 mutaciones germinales diferentes, incluyendo
grandes deleciones, que hacen que sea el gen más importante en este síndrome, estando alterado en un
50% de los casos con mutaciones en la línea germinal en los genes reparadores.
UTILIDAD CLÍNICA
En pacientes con cáncer de colon, el estudio de alteraciones en línea germinal en MLH1 está indicado
aquellos donde tras el análisis de los datos familiares, y cumpliendo criterios de Bethesda o Ámsterdam,
los estudios de inestabilidad de microsatélites e inmunohistoquímica en el tumor sugieren posibles
alteraciones en este gen.
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad. Por otra parte, los familiares de los pacientes portadores de mutación en los que resulte
negativa la presencia de mutación no necesitarán seguimiento específico ya que su riesgo de padecer
cáncer de colon será entonces similar al de la población general.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN y ARN de la muestra de sangre periférica.
En los pacientes con sospecha de mutación, el ADN se envía a un laboratorio externo, donde se procede
a la secuenciación completa del gen MLH1. Esta técnica no permite detectar grandes deleciones, que se
analizarán previamente mediante otro método (MLPA).
En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la región a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 107 de 127
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta mutación en el gen MLH1 en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en MLH1. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Precauciones:
Las mutaciones en MLH1 están distribuidas a lo largo de todo el gen no existiendo “puntos calientes”
por lo que el análisis genético precisa del estudio del gen completo. Por lo tanto los pacientes deben ser
cuidadosamente seleccionados y se debe realizar primero un estudio de grandes deleciones que, aunque
son alteraciones menos frecuentes, son mucho más sencillas y rápidas de analizar.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Cavalcanti et al. “Mismatch pair genes in Lynch syndrome: a review” Sao Paulo Med J. (2009) 127 (1):
46-51.
Umar et al. “Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch
syndrome) and microsatellite instability” JouARNl of National Cancer Institute (2004) 96 (4): 181-197.
van Lier et al. “A review on the molecular diagnosis of Lynch syndrome: a central role for the pathology
laboratory” J. Cell. Mol. Med. (2010) 14: 181-197.
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 108 de 127
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN MSH2
INFORMACIÓN CLÍNICA
El carcinoma colorectal es una de los tumores mas frecuentes y ocupa el segundo puesto en cuanto a
mortalidad asociada a cáncer. Tiene su origen tanto en factores genéticos como ambientales. La causa
genética más común es el Síndrome de Lynch (OMIM 120435), también conocido como cáncer de colon
hereditario no polipósico (CCHNP) caracterizado por una mutación en línea germinal en los genes del
sistema de reparación de desapareamiento de bases del ADN (MMR “mismatch repair”). Este síndrome
engloba entre un 5 y un 10% de los cánceres colorrectales que se diagnostican en la actualidad.
El sistema MMR es uno de los mecanismos implicados en la corrección de mutaciones que ocurren como
resultado de la acción de mutágenos exógenos o endógenos o de la incorporación de bases
desapareadas durante la replicación del ADN. MMR requiere la acción conjunta de varias proteínas. En
humanos los genes que codifican esas proteínas y en los que se han descrito mutaciones asociadas con
Síndrome de Lynch incluyen hMLH1, hMSH2, hMSH6, y hPMS2.
Los pacientes portadores de una mutación en uno de estos genes tienen una función de MMR
fenotípicamente normal, pero una nueva mutación somática en el gen alterado producirá una perdida de
función en la proteína que codifica. Esta alteración se correlaciona en el tumor originado con ausencia de
expresión de la proteína por inmunohistoquímica, y por un fenómeno conocido como inestabilidad de
microsatélites (IMS). Ambas características sirven como cribado previo para conocer los pacientes con
cáncer de colon susceptibles de ser portadores de una mutación en línea germinal.
MSH2 se localiza en el cromosoma 2p16 y tiene 16 exones que codifican una proteína de 934
aminoácidos. Está alterado en aproximadamente un 40% de los casos con mutaciones en la línea
germinal en los genes reparadores, lo que hace que junto con MLH1 sea uno de los genes más
relevantes en el síndrome de Lynch.
UTILIDAD CLÍNICA
En pacientes con cáncer de colon, el estudio de alteraciones en línea germinal en MSH2 está indicado
aquellos donde tras el análisis de los datos familiares, y cumpliendo criterios de Bethesda o Ámsterdam,
los estudios de inestabilidad de microsatélites e inmunohistoquímica en el tumor sugieren posibles
alteraciones en este gen.
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad. Por otra parte, los familiares de los pacientes portadores de mutación en los que resulte
negativa la presencia de mutación no necesitarán seguimiento específico ya que su riesgo de padecer
cáncer de colon será entonces similar al de la población general.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN y ARN de la muestra de sangre periférica.
En los pacientes con sospecha de mutación, el ADN se envía a un laboratorio externo, donde se procede
a la secuenciación completa del gen MSH2. Esta técnica no permite detectar grandes deleciones, que se
analizarán previamente mediante otro método (MLPA).
En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la region a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 109 de 127
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta mutación en el gen MSH2 en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en MSH2. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Precauciones:
Las mutaciones en MSH2 están distribuidas a lo largo de todo el gen no existiendo “puntos calientes”
por lo que el análisis genético es complejo, y precisa el estudio del gen completo. Por lo tanto los
pacientes deben ser cuidadosamente seleccionados y se debe realizar primero un estudio de grandes
deleciones que, aunque son alteraciones menos frecuentes, son mucho más sencillas y rápidas de
analizar.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Cavalcanti et al. “Mismatch pair genes in Lynch syndrome: a review” Sao Paulo Med J. (2009) 127 (1):
46-51.
Umar et al. “Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch
syndrome) and microsatellite instability” JouARNl of National Cancer Institute (2004) 96 (4): 181-197.
van Lier et al. “A review on the molecular diagnosis of Lynch syndrome: a central role for the pathology
laboratory” J. Cell. Mol. Med. (2010) 14: 181-197.
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 110 de 127
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN MSH6
INFORMACIÓN CLÍNICA
El carcinoma colorectal es una de los tumores mas frecuentes y ocupa el segundo puesto en cuanto a
mortalidad asociada a cáncer. Tiene su origen tanto en factores genéticos como ambientales. La causa
genética más común es el Síndrome de Lynch (OMIM 120435), también conocido como cáncer de colon
hereditario no polipósico (CCHNP) caracterizado por una mutación en línea germinal en los genes del
sistema de reparación de desapareamiento de bases del ADN (MMR “mismatch repair”). Este síndrome
engloba entre un 5 y un 10% de los cánceres colorrectales que se diagnostican en la actualidad.
El sistema MMR es uno de los mecanismos implicados en la corrección de mutaciones que ocurren como
resultado de la acción de mutágenos exógenos o endógenos o de la incorporación de bases
desapareadas durante la replicación del ADN. MMR requiere la acción conjunta de varias proteínas. En
humanos los genes que codifican esas proteínas y en los que se han descrito mutaciones asociadas con
Síndrome de Lynch incluyen hMLH1, hMSH2, hMSH6, y hPMS2.
Los pacientes portadores de una mutación en uno de estos genes tienen una función de MMR
fenotípicamente normal, pero una nueva mutación somática en el gen alterado producirá una perdida de
función en la proteína que codifica. Esta alteración se correlaciona en el tumor originado con ausencia de
expresión de la proteína por inmunohistoquímica, y por un fenómeno conocido como inestabilidad de
microsatélites (IMS). Ambas características sirven como cribado previo para conocer los pacientes con
cáncer de colon susceptibles de ser portadores de una mutación en línea germinal.
MSH6 se localiza en el cromosoma 2p16 y tiene 10 exones que codifican una proteína de 1360
aminoácidos. Hasta la fecha se han detectado más de 30 mutaciones germinales diferentes estando
alterado en un 5% de los casos con mutaciones en la línea germinal en los genes reparadores. El perfil
fenotípico de familias con mutaciones en este gen suele estar caracterizado por una edad más avanzada
de diagnóstico del cáncer colorrectal (alrededor de 60 años, y no 45 años de aquellos portadores de
mutaciones en MLH1 o MSH2), hay mayor incidencia de cáncer de endometrio y la inestabilidad suele ser
baja.
UTILIDAD CLÍNICA
En pacientes con cáncer de colon, el estudio de alteraciones en línea germinal en MSH6 está indicado
aquellos donde estudios de inestabilidad de microsatélites e inmunohistoquímica en el tumor sugieren
posibles alteraciones en este gen.
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN de la muestra de sangre periférica.
En los pacientes con sospecha de mutación, el ADN se envía a un laboratorio externo, donde se procede
a la secuenciación completa del gen MSH6. Esta técnica no permite detectar grandes deleciones, que se
analizaran previamente mediante otro método (MLPA).
En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la region a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 111 de 127
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta mutación en el gen MSH6 en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en MSH6. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Precauciones:
Las mutaciones en MSH6 están distribuidas a lo largo de todo el gen no existiendo “puntos calientes”
por lo que el análisis genético es complejo, largo y caro. Por lo tanto los pacientes deben ser
cuidadosamente seleccionados y se debe realizar primero un estudio de grandes deleciones que, aunque
son alteraciones menos frecuentes, son mucho más sencillas y rápidas de analizar.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Cavalcanti et al. “Mismatch pair genes in Lynch syndrome: a review” Sao Paulo Med J. (2009) 127 (1):
46-51.
Umar et al. “Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch
syndrome) and microsatellite instability” JouARNl of National Cancer Institute (2004) 96 (4): 181-197.
van Lier et al. “A review on the molecular diagnosis of Lynch syndrome: a central role for the pathology
laboratory” J. Cell. Mol. Med. (2010) 14: 181-197.
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN PMS2
INFORMACIÓN CLÍNICA
El carcinoma colorectal es una de los tumores mas frecuentes y ocupa el segundo puesto en cuanto a
mortalidad asociada a cáncer. Tiene su origen tanto en factores genéticos como ambientales. La causa
genética más común es el Síndrome de Lynch (OMIM 120435), también conocido como cáncer de colon
hereditario no polipósico (CCHNP) caracterizado por una mutación en línea germinal en los genes del
sistema de reparación de desapareamiento de bases del ADN (MMR “mismatch repair”).
El sistema MMR es uno de los mecanismos implicados en la corrección de mutaciones que ocurren como
resultado de la acción de mutágenos exógenos o endógenos o de la incorporación de bases
desapareadas durante la replicación del ADN. MMR requiere la acción conjunta de varias proteínas. En
humanos los genes que codifican esas proteínas y en los que se han descrito mutaciones asociadas con
Síndrome de Lynch incluyen hMLH1, hMSH2, hMSH6, y hPMS2.
Los pacientes portadores de una mutación en uno de estos genes tienen una función de MMR
fenotípicamente normal, pero una nueva mutación somática en el gen alterado producirá una perdida de
función en la proteína que codifica. Esta alteración se correlaciona en el tumor originado con ausencia de
expresión de la proteína por inmunohistoquímica, y por un fenómeno conocido como inestabilidad de
microsatélites (IMS). Ambas características sirven como cribado previo para conocer los pacientes con
cáncer de colon susceptibles de ser portadores de una mutación en línea germinal.
PMS2 se localiza en el cromosoma 7p22 y tiene 15 exones que codifican una proteína de 862
aminoácidos. Las mutaciones germinales en este gen son muy raras (5% de los casos) e incluyen
mutaciones puntuales y grandes deleciones. Aunque PMS2 es crucial en el sistema MMR, no está claro si
mutaciones en este gen pueden predisponer al desarrollo de cáncer. Las mutaciones en PMS2 son raras
en familias clásicas y suelen asociarse a cuadro de síndrome de Turcot.
UTILIDAD CLÍNICA
En pacientes con cáncer de colon, el estudio de alteraciones en línea germinal en PMS2 esta indicado
aquellos donde estudios de inestabilidad de microsatélites e inmunohistoquímica en el tumor sugieren
posibles alteraciones en este gen.
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN de la muestra de sangre periférica.
En los pacientes con sospecha de mutación, el ADN se envía a un laboratorio externo, donde se procede
a la secuenciación completa del gen PMS2. Esta técnica no permite detectar grandes deleciones, que se
analizaran previamente mediante otro método.
En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la region a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
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No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta mutación en el gen PMS2 en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en PMS2. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Precauciones:
Las mutaciones en PMS2 están distribuidas a lo largo de todo el gen no existiendo “puntos calientes”
por lo que el análisis genético es complejo, largo y caro. Por lo tanto los pacientes deben ser
cuidadosamente seleccionados y se debe realizar primero un estudio de grandes deleciones que, aunque
son alteraciones menos frecuentes, son mucho más sencillas y rápidas de analizar.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Cavalcanti et al. “Mismatch pair genes in Lynch syndrome: a review” Sao Paulo Med J. (2009) 127 (1):
46-51.
Umar et al. “Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch
syndrome) and microsatellite instability” JouARNl of National Cancer Institute (2004) 96 (4): 181-197.
van Lier et al. “A review on the molecular diagnosis of Lynch syndrome: a central role for the pathology
laboratory” J. Cell. Mol. Med. (2010) 14: 181-197.
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN APC
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las mutaciones germinales en APC están presentes en la poliposis adenomatosa familiar (PAF) clásica y
atenuada (OMIM 175100) que es el síndrome polipósico más frecuente y que se hereda con un carácter
autosómico dominante. De forma general se caracteriza por presentar de cientos a miles de pólipos
adenomatosos intestinales, que aparecen en la tercera o cuarta década de vida. El riesgo acumulado a
desarrollar carcinoma colorrectal a los 50 años es del 95% y presenta una penetrancia completa. La
edad media de diagnóstico de cáncer colorrectal en los pacientes con este síndrome es de 39 años.
Según la SEOM, para el diagnostico de PAF clásica se debe cumplir al menos uno de los siguientes
criterios:
1. Más de 100 pólipos adenomatosos colorrectales.
2. En menores de 20 años, más de 20 pólipos adenomatosos y un progenitor afecto.
Para el diagnóstico de PAF atenuada se debe cumplir al menos uno de los siguientes criterios:
1. Más de 15 pólipos adenomatosos colorrectales.
2. Más de 5 pólipos adenomatosos colónicos con edad menor de 60 años e historia familiar de cáncer de
colon.
APC es un gen supresor de tumores localizado en la región cromosómica 5q21-q22. Está compuesto por
15 exones y codifica una proteína grande, cuya isoforma más frecuente comprende 2.843 aminoácidos,
implicada en procesos de migración y adhesión celular, regulación del ciclo celular e inestabilidad
genómica. Los pacientes portadores de una mutación en este gen son susceptibles de una nueva
mutación somática que producirá una pérdida de función en la proteína que codifica.
Se han descrito más de 800 mutaciones en línea germinal mayoritariamente en la región central del gen
y que resultan en una proteína truncada en el extremo COOH-terminal. También puede haber deleciones
exónicas o del gen completo. Alrededor de un 20% de las mutaciones son de novo. Hay dos puntos
calientes de mutación (hotspots) en los codones 1.061 y 1.309. Existe una asociación genotipo/fenotipo
de forma que: las mutaciones cercanas al codón 1.309 están asociadas con poliposis exuberante (varios
miles de adenomas) e inicio precoz del cáncer colorrectal; en portadores de mutaciones situadas
después del codón 1.400 se ha descrito una poliposis más grave en el tracto gastrointestinal superior y
casos de enfermedad desmoide; y finalmente, en los pacientes con PAF atenuada las mutaciones en
línea germinal se centran en tres regiones: antes del codón 168, exón 9, y después del codón 1.580.
UTILIDAD CLÍNICA
El estudio molecular de alteraciones el gen APC esta indicado en pacientes con poliposis múltiple y CCR,
con historia familiar de cáncer de colon polipósico.
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN y ARN de la muestra de sangre periférica.
En los pacientes con sospecha de mutación, el ADN se envía a un laboratorio externo, donde se procede
a la secuenciación completa del gen APC. Esta técnica no permite detectar grandes deleciones, que se
analizaran previamente mediante otra técnica (MLPA).
En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la región a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
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REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta mutación en el gen APC en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en APC. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Recomendaciones:
En los casos negativos para mutaciones en el gen APC, se recomienda el estudio del gen MUTYH, ya que
dobles mutaciones en este gen están asociadas con un 10-30% de los casos con PAF clásica y atenuada.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Gene reviews. NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1345/ (APC-associtated polyposis)
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN NF1
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las mutaciones germinales en el gen NF1 están presentes en la Neurofibromatosis 1 (NF1) (OMIM
162200) que es una enfermedad de herencia autosómica dominante, con una alta penetrancia y una
extremadamente variable expresividad, destacando la presencia de manchas de color café con leche,
pecosidad intertriginosa, neurofibromas cutáneos y plexiformes y nódulos de Lisch. En concreto, para el
diagnóstico de NF1, se deben cumplir al menos dos de los siguientes criterios, según los Institutos
Nacionales de Sanidad de EEUU:
1. Seis o más manchas café con leche mayores de 5 mm en su diámetro máximo en niños prepúberes y
mayores de 15 mm en postpúberes.
2. Dos o más neurofibromas de cualquier tipo o un neurofibroma plexiforme.
3. Presencia de pecas axilares o inguinales.
4. Glioma óptico.
5. Dos o más hamartomas del iris (nódulos de Lisch)
6. Una lesión ósea definida (por ej. displasia del esfenoides o adelgazamiento de la cortical de huesos
largos con o sin pseudoartrosis).
7. Un familiar de primer grado con neurofibromatosis diagnosticada.
NF1 es un gen supresor de tumores localizado en la región cromosómica 17q11.2. Está compuesto por
60 exones a lo largo de más de 300kb de ADN genómico, y codifica una proteína grande,
neurofibromina, que contiene 2.818 aminoácidos y que está implicada en la regulación negativa del
encogen RAS. Los pacientes con una mutación en línea germinal son susceptibles de una nueva
mutación somática que producirá una pérdida de función en la proteína que codifica, provocando un
aumento de RAS activado y el desarrollo de neurofibromas y otros tumores asociados a NF1.
Las mutaciones en NF1 ocurren a lo largo de todo el gen aunque hay mayor concentración en algunos de
los exones. Las alteraciones incluyen mutaciones sin sentido, de splicing y sustituciones, aunque
aproximadamente un 2-5% corresponden a grandes deleciones que abarcan con frecuencia el gen
completo.
Aproximadamente la mitad de los casos son familiares, heredados de uno de los parentales afectado, y
la mitad esporádicos, resultando de una mutación en NF1 “de novo”.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de Neurofibromatosis 1 (NF1) (OMIM 162200)
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN y ARN de la muestra de sangre periférica.
En los pacientes con sospecha de mutación, el ADN y ARN se envía a un laboratorio externo, donde se
procede a la secuenciación completa del gen NF1.
En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la región a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 117 de 127
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta mutación en el gen NF1 en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en NF1. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Precauciones:
Esta técnica no permite detectar grandes deleciones.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Varios Autores “Molecular Pathology in Clinical Practice: Oncology” (2009) Ed. Springer
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN NF2
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las mutaciones germinales en el gen NF2 están presentes en la Neurofibromatosis 2 (NF2) (OMIM
101000) que es una enfermedad de herencia autosómica dominante, caracterizada principalmente por el
desarrollo de schwannoma vestibular bilateral. Según la SEOM, para el diagnostico de NF2 se debe
cumplir al menos uno de los siguientes criterios, modificados de los Institutos Nacionales de Sanidad de
EEUU:
1. Schwannomas vestibulares bilaterales.
2. Un familiar de primer grado con NF2 y/o un schwannoma vestibular unilateral, o dos de los siguientes
tumores: meningioma, schwannoma, glioma, neurofibroma, cataratas.
3. Un schwannoma vestibular unilateral y dos de los siguientes tumores: meningioma, schwannoma,
glioma, neurofibroma, cataratas.
4. Meningiomas múltiples y/o un schwannoma vestibular unilateral, o dos de los siguientes tumores:
meningioma, schwannoma, glioma, neurofibroma, cataratas.
NF2 es un gen supresor de tumores localizado en la región cromosómica 22q12.2. Esta compuesto por
17 exones y codifica una proteína, merlina o schwannomina, que contiene 595 aminoácidos y que se
asocia con proteínas del citoesqueleto. Los pacientes con una mutación en línea germinal son
susceptibles de una nueva mutación somática que producirá una pérdida de función en la proteína que
codifica.
Las mutaciones en NF2 incluyen mutaciones sin sentido, mutaciones del lugar de unión, sustituciones, y
grandes deleciones. Actualmente existen correlaciones genotipo/ fenotipo para casi todas las
manifestaciones patológicas, siendo el fenotipo más grave aquellos pacientes que presentan mutaciones
que originan una proteína truncada.
Aproximadamente la mitad de los casos son familiares, heredados de uno de los parentales afectado, y
la mitad esporádicos, resultando de una mutación en NF2 “de novo”. En un 25-30% de los casos
esporádicos, los pacientes presentan mosaicismo, es decir, la mutación ocurre en el cigoto originando
que solamente una parte de las células del individuo contengan el gen NF2 que ha sufrido mutación.
Esto implica el curso más benigno de la enfermedad, y que el riesgo de transmitir la enfermedad a los
descendientes dependa de la proporción de células germinales afectadas.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de Neurofibromatosis 2 (NF2) (OMIM 101000)
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN y ARN de la muestra de sangre periférica.
En los pacientes con sospecha de mutación, el ADN se envía a un laboratorio externo, donde se procede
a la secuenciación completa del gen NF2.
En caso de resultado positivo, la mutación se confirma en el laboratorio mediante PCR utilizando
oligonucleótidos específicos que flanquean la región a estudio. Se utiliza un control negativo en cada
estudio. El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuencia
bidireccionalmente. Los cromatogramas de las secuencias se analizan mediante programas informáticos
y manualmente. Este método será utilizado para el estudio de la mutación en familiares del paciente.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 119 de 127
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se detecta mutación en el gen NF2 en la muestra estudiada.
- La muestra es positiva para la presencia de mutación en NF2. Se incluirá una descripción de la
mutación a nivel de nucleótido y la descripción de la proteína alterada.
Precauciones:
Esta técnica no permite detectar grandes deleciones.
Puesto que hasta un 50% de los casos de NF2 surgen por mutaciones de novo y con mosaicismo, la
detección de mutaciones en NF2 en ADN procedente de sangre periférica podría ser negativa en este tipo
de pacientes con mosaicismo, por lo que ante la sospecha clínica de NF2 habría que estudiar la presencia
de la mutación en muestra tumoral, si está accesible.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 6 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Varios Autores. “Molecular Pathology in Clinical Paractice: Oncology” (2009) Ed. Springer
Sociedad Española de Oncología Médica. “Cáncer Hereditario” (2006) Ed. Dispublic, S.L.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE GRANDES DELECIONES EN BRCA1 Ó BRCA2
INFORMACIÓN CLÍNICA
El gen BRCA1 fue el primero en asociarse con Cáncer de mama y ovario hereditario (CMOH).
Posteriormente se asoció un segundo gen, BRCA2, implicado además en el cáncer de mama masculino.
Ambos son responsables de más de un 60% de los casos familiares y de aproximadamente un 5% de
todos los casos. Estos genes se caracterizan por tener herencia autosómica dominante, alta penetrancia
y baja frecuencia.
Según el grupo de trabajo de Cáncer Hereditario de la SEOM, para el diagnóstico de Cáncer de mama y
ovario hereditario se debe cumplir al menos uno de los siguientes criterios:
1. Un caso de cáncer de mama menor o igual a 40 años.
2. Diagnóstico de cáncer de mama y ovario en el mismo individuo.
3. Dos o más casos de cáncer de mama, uno de los cuales en menor de 50 años o bilateral.
4. Un caso de cáncer de mama a edad menor o igual a 50 años o bilateral y un caso de cáncer de ovario
en familiares de primer o segundo grado.
5. Tres casos de cáncer de mama y ovario (al menos un caso de ovario) en familiares de primer o
segundo grado.
6. Dos casos de cáncer de ovario en familiares de primer o segundo grado.
7. Un caso de cáncer de mama en un varón y familiar de primer o segundo grado con cáncer de mama u
ovario.
Ambos genes tienen un gran tamaño, BRCA1 consta de 5.592 nucleótidos repartidos en 24 exones y que
codifican una proteína de 1.863 residuos, y BRCA2 consta de 11.385 nucleótidos repartidos en 27
exones y que codifican una proteína de 3.418 residuos. A pesar de que BRCA1 y BRCA2 tienen
secuencias muy diferentes, hay muchas evidencias que demuestran que poseen funciones biológicas
comunes, entre las que destaca su papel en el mantenimiento de la integridad genómica y la reparación
del ADN.
Se han registrado más de mil mutaciones distintas tanto en BRCA1 como en BRCA2. Exceptuando un
pequeño grupo de mutaciones recurrentes, la mayoría son específicas de cada familia. Más del 70% de
las mutaciones en ambos genes son pequeñas inserciones o deleciones, que provocan un cambio en el
marco de lectura de la secuencia de ADN, dando lugar a la aparición de un codón de parada prematuro,
cuya consecuencia es una proteína truncada. Otros alteraciones descritas son, sustituciones, alteración
del proceso de eliminación de intrones (splicing), y grandes deleciones, duplicaciones o
reordenamientos.
La estimación de frecuencia de detección de grandes deleciones o reordenamientos es variable entre
distintas poblaciones, y puede estar en el rango de entre el 5 al 15 % de los casos positivos para
mutación. En un estudio reciente en nuestra región en el que hemos analizado alteraciones en BRCA1 y
2 en 256 familias, hemos encontrado 59 con mutación en BRCA1 y 2 (23%) y de éstas, 3 familias
tenían una gran deleción en el gen BRCA1 (5% de los casos positvos). No hemos detectado ningún gran
reordenamiento de BRCA2. Este estudio se realiza mediante la técnica de MLPA y está incluido dentro del
protocolo de estudio de alteraciones en BRCA1 y 2 en familias que cumplen los criterios anteriormente
expuestos.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario. Estudio incluído dentro del protocolo
de estudio de alteraciones en BRCA1 y 2 en familias que cumplen criterios para su determinación.
A pesar de presentarse un porcentaje menor que otras alteraciones, el estudio de grandes deleciones
está recomendado en primer lugar ya que es una técnica más rápida y menos costosa que el estudio por
secuenciación del gen.
Una vez detectada una alteración en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en portadores no sintomáticos
proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN genómico de la muestra de sangre periférica.
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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Se estudia de la presencia de grandes deleciones en mediante la técnica MLPA (“Multiplex ligationdependent probe amplification”), utilizando los kits P002 y P087 (MRC-Holland) para BRCA1; y los kits
P045 y P077 para BRCA2.
Para el estudio se lleva a cabo una hibridación con sondas marcadas con fluorescencia y específicas
para cada uno de los exones, así como para regiones cromosómica próximas y lejanas al gen que se
utilizan como controles. Tras la hibridación se procede a la ligación de las sondas hibiridadas, y
posteriormente se realiza una PCR para amplificar las sondas que han hibridado y se han ligado. El
producto de la PCR se analiza mediante electroforesis capilar. En todos los casos se compara el patrón
obtenido en el paciente a estudio con el patrón obtenido a partir de ADN de individuos sanos.
La detección de una deleción mediante MLPA se intentará confirmar mediante otra técnica, tal como el
análisis a nivel de RNA, en los casos en los que sea factible.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se ha detectado ninguna alteración en los estudios de MLPA.
- Los resultados obtenidos revelan la presencia de una deleción. Se indicará el gen y los exones o sondas
afectadas.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 4 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Baiget et al. “Analysis of BRCA1 and BRCA2 Genes in Spanish Breast/ Ovarian Cancer Patients: A High
Proportion of Mutations Unique to Spain and Evidence of Founder Effects”. Human Mutation (2003) 22:
301-312.
Blay et al. Mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 in hereditary breast and ovarian cancer families
from Asturias (Northern Spain). BMC Cancer 2013, 13:243
Engert et al. MLPA Screening in the BRCA1 Gene From 1,506 German Hereditary Breast Cancer Cases:
Novel Deletions, Frequent Involvement of Exon 17, and Occurrence in Single Early-Onset Cases. Human
Mutation 2008; 0:1-11
MLPA ADN protocol version MDP-v001. MRC-Holland. disponible en www.mlpa.com
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
Página 122 de 127
Unger, M.A. et al. Am.J.Hum.Genet. 67: 841-850, 2000
Woodward et al Large genomic rearrangements of both BRCA2 and BRCA1 are a feature of the inherited
breast/ovarian cancer phenotype in selected families. J Med Genet 2005; 42:e31
Biblioteca de Pruebas Oncología Molecular. Ed.01
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DETERMINACIÓN DE GRANDES DELECIONES EN MLH1, MSH2 Y
MSH6
INFORMACIÓN CLÍNICA
El carcinoma colorectal es una de los tumores mas frecuentes y ocupa el segundo puesto en cuanto a
mortalidad asociada a cáncer. Tiene su origen tanto en factores genéticos como ambientales. La causa
genética más común es el Síndrome de Lynch (OMIM 120435), también conocido como cáncer de colon
hereditario no polipósico (CCHNP) caracterizado por una mutación en línea germinal en los genes del
sistema de reparación de desapareamiento de bases del ADN (MMR “mismatch repair”).
El sistema MMR es uno de los mecanismos implicados en la corrección de mutaciones que ocurren como
resultado de la acción de mutágenos exógenos o endógenos o de la incorporación de bases
desapareadas durante la replicación del ADN. MMR requiere la acción conjunta de varias proteínas. En
humanos los genes que codifican esas proteínas y en los que se han descrito mutaciones asociadas con
Síndrome de Lynch incluyen hMLH1, hMSH2, hMSH6, y hPMS2.
Los pacientes portadores de una mutación en uno de estos genes tienen una función de MMR
fenotípicamente normal, pero una nueva mutación somática en el gen alterado producirá una perdida de
función en la proteína que codifica. Esta alteración se correlaciona en el tumor originado con ausencia de
expresión de la proteína por inmunohistoquímica, y por un fenómeno conocido como inestabilidad de
microsatélites (IMS). Ambas características sirven como cribado previo para conocer los pacientes con
cáncer de colon susceptibles de ser portadores de una mutación en línea germinal.
La mayoría de las mutaciones en los genes reparadores son cambios puntuales pequeñas deleciones o
inserciones, sin embargo existe un porcentaje significativo los que hay grandes deleciones no
detectables por secuenciación. En el caso de MLH1, supone un 5-10% de las mutaciones germinales,
aproximadamente un 20% en MSH2 y PMS2, y son raras en MSH6. Por ello, es necesario el estudio de
grandes deleciones mediante técnicas tales como el MLPA, útil por su facilidad de uso.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de síndrome de Lynch. Estudio incluído dentro del protocolo de estudio de alteraciones en
MLH1, MSH2 y MSH6 en familias que cumplen criterios para su determinación.
A pesar de presentarse un porcentaje menor que otras alteraciones, el estudio de grandes deleciones
está recomendado en primer lugar ya que es una técnica más rápida y menos costosa que el estudio por
secuenciación del gen.
Una vez detectada una alteración en línea germinal en un paciente, el estudio esta indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en portadores no sintomáticos
proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN genómico de la muestra de sangre periférica.
Se estudia de la presencia de grandes deleciones en mediante la técnica MLPA (“Multiplex ligationdependent probe amplification”), utilizando los kits P003 y P248 (MRC-Holland) para los genes MLH1 y
MSH2; y el kit P008 para los genes MSH6 y PMS2.
Para el estudio se lleva a cabo una hibridación con sondas marcadas con fluorescencia y específicas
para cada uno de los exones, así como para regiones cromosómica próximas y lejanas al gen que se
utilizan como controles. Tras la hibridación se procede a la ligación de las sondas hibiridadas, y
posteriormente se realiza una PCR para amplificar las sondas que han hibridado y se han ligado. El
producto de la PCR se analiza mediante electroforesis capilar. En todos los casos se compara el patrón
obtenido en el paciente a estudio con el patrón obtenido a partir de ADN de individuos sanos.
La detección de una deleción mediante MLPA se intentará confirmar mediante otra técnica, tal como el
análisis a nivel de RNA, en los casos en los que sea factible.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
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REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se ha detectado ninguna alteración en los estudios de MLPA.
- Los resultados obtenidos revelan la presencia de una deleción. Se indicará el gen y los exones o sondas
afectadas.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 4 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Gene reviews. NCBI. NBK1211. Lynch Syndrome. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1211/
MLPA ADN protocol version MDP-v001. MRC-Holland. disponible en www.mlpa.com
Cavalcanti et al. “Mismatch pair genes in Lynch syndrome: a review” Sao Paulo Med J. (2009) 127 (1):
46-51.
Grabowski et al. Deletions Account for 17% of Pathogenic Germline Alterations in MLH1 and MSH2 in
Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC) Families. Geneti Testing 2005; Volume 9: 138-147
Taylor et al. Genomic Deletions in MSH2 or MLH1 Are a Frequent Cause of Hereditary Non-polyposis
Colorectal Cancer: Identification of Novel and Recurrent Deletions by MLPA. Human Mutation (2003)
22:428-433
van Lier et al. “A review on the molecular diagnosis of Lynch syndrome: a central role for the pathology
laboratory” J. Cell. Mol. Med. (2010) 14: 181-197.
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DETERMINACIÓN DE GRANDES DELECIONES EN APC
INFORMACIÓN CLÍNICA
Las mutaciones germinales en APC están presentes en la poliposis adenomatosa familiar (PAF) clásica y
atenuada (OMIM 175100) que es el síndrome polipósico más frecuente y que se hereda con un carácter
autosómico dominante. De forma general se caracteriza por presentar de cientos a miles de pólipos
adenomatosos intestinales, que aparecen en la tercera o cuarta década de vida. El riesgo acumulado a
desarrollar carcinoma colorrectal a los 50 años es del 95% y presenta una penetrancia completa. La
edad media de diagnóstico de cáncer colorrectal en los pacientes con este síndrome es de 39 años.
Según la SEOM, para el diagnostico de PAF clásica se debe cumplir al menos uno de los siguientes
criterios:
1. Más de 100 pólipos adenomatosos colorrectales.
2. En menores de 20 años, más de 20 pólipos adenomatosos y un progenitor afecto.
Para el diagnóstico de PAF atenuada se debe cumplir al menos uno de los siguientes criterios:
1. Más de 15 pólipos adenomatosos colorrectales.
2. Más de 5 pólipos adenomatosos colónicos con edad menor de 60 años e historia familiar de cáncer de
colon.
APC es un gen supresor de tumores localizado en la región cromosómica 5q21-q22. Está compuesto por
15 exones y codifica una proteína grande, cuya isoforma más frecuente comprende 2.843 aminoácidos,
implicada en procesos de migración y adhesión celular, regulación del ciclo celular e inestabilidad
genómica. Los pacientes portadores de una mutación en este gen son susceptibles de una nueva
mutación somática que producirá una pérdida de función en la proteína que codifica.
Se han descrito más de 800 mutaciones en línea germinal mayoritariamente en la región central del gen
y que resultan en una proteína truncada en el extremo COOH-terminal. También puede haber deleciones
exónicas o del gen completo. Alrededor de un 20% de las mutaciones son de novo. Hay dos puntos
calientes de mutación (hotspots) en los codones 1.061 y 1.309. La detección de deleciones exónicas o
de grandes deleciones no es posible actualmente mediante secuenciación, por lo que se realiza una
técnica complementaria para su estudio, el MLPA.
UTILIDAD CLÍNICA
Diagnóstico de poliposis adenomatosa familiar. El estudio mediante la técnica de MLPA permite la
detección de grandes deleciones o duplicaciones y de las dos mutaciones más frecuentes en APC. Está
incluido dentro del protocolo de caracterización genética de la poliposis adenomatosa familiar o de la
poliposis atenuada. Está recomendado en primer lugar ya que es una técnica más rápida y menos
costosa que el estudio por secuenciación del gen.
El estudio molecular de alteraciones el gen APC está indicado en pacientes con poliposis múltiple y CCR,
con historia familiar de cáncer de colon polipósico.
Una vez detectada una mutación en línea germinal en un paciente, el estudio está indicado en los
familiares directos puesto que la detección temprana de este síndrome en los pacientes portadores no
sintomáticos proporciona información para optimizar su manejo clínico y reducir la morbilidad y
mortalidad.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Se obtiene ADN genómico de la muestra de sangre periférica.
Se estudia de la presencia de grandes deleciones o duplicaciones y de mutaciones en los codones 1.061
y 1.309 en APC mediante la técnica MLPA (“Multiplex ligation-dependent probe amplification”), utilizando
el kit P043 (MRC-Holland).
Para el estudio se lleva a cabo una hibridación con sondas marcadas con fluorescencia y específicas
para cada uno de los exones, así como para regiones cromosómicas próximas y lejanas al gen, que se
utilizan como controles. Tras la hibridación se procede a la ligación de las sondas hibiridadas, y
posteriormente se realiza una PCR para amplificar las sondas que han hibridado y se han ligado. El
producto de la PCR se analiza mediante electroforesis capilar. En todos los casos se compara el patrón
obtenido en el paciente a estudio con el patrón obtenido a partir de ADN de individuos sanos.
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La detección de una deleción mediante MLPA se intentará confirmar mediante otra técnica, tal como el
análisis a nivel de RNA, en los casos en los que sea factible.
REQUERIMIENTOS DEL PACIENTE
Ninguna en especial
REQUISITOS DE LA MUESTRA
Sangre anticoagulada EDTA (Contenedor): Tubo de tapón morado
VALORES DE REFERENCIA
No aplica.
Se incluirá un informe con la interpretación de los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados deber ser siempre interpretados en el contexto de otros datos clínicos, patológicos y de
historia familiar para determinar la significación de los mismos.
Los resultados se expresan de la siguiente manera:
- No se ha detectado ninguna alteración en los estudios de MLPA.
Los resultados obtenidos revelan la presencia de una deleción. Se indicará el gen y los exones o sondas
afectadas.
TIEMPO DE RESPUESTA
Entre 3 y 4 meses.
Consultar vía telefónica cuando se necesiten resultados en el menor tiempo posible.
BIBLIOGRAFÍA
Gene reviews. NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1345/ (APC-associtated polyposis)
MLPA ADN protocol version MDP-v001. MRC-Holland. disponible en www.mlpa.com
McCart et al.A novel exon duplication event leading to a truncating germ-line mutation of the APC gene
in a Familial Adenomatous Polyposis family. Familial Cancer (2006) 5:205–208
Michils et al. Large Deletions of the APC Gene in 15% of Mutation-Negative Patients With Classical
Polyposis (FAP): A Belgian Study Human Mutation (2005) 25:125-134
Pagenstecher et al A Complex Rearrangement in the APC Gene Uncovered by Multiplex LigationDependent Probe Amplification Journal of Molecular Diagnostics, 2007; 9:122-126
Pedace et al. Identification of a novel duplication in the APC gene using multiple ligation probe
amplification in a patient with familial adenomatous polyposis. Cancer Genetics and Cytogenetics 2008;
182: 130e135
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BIBLIOTECA DE PRUEBAS LBOM final ISR
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GLUCOSA
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