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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA.
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS.
BIOLOGIA MOLECULAR.
Replicación del ADN en Procariotas
3.2.1
JOSE ALFREDO SOTO ALONSO 212679
INDICE
Mecanismos general
 Propiedades
 Replicacion en procariotas
 Mecanismo
 Maquinaria enzimatica
 Inicio, enlongacion, replisoma y
terminacion
 Mecanismos de reparacion
 Replicacion de ADN in vitro


Es el proceso en la cuál una molécula
de ADN de doble hélice da lugar a
otras dos moléculas de ADN con la
misma secuencia de bases

La división celular requiere de la duplicación
del material genético
mitosis
meiosis
mitosis
Mecanismo general

La misma estructura del ADN
sugirió un mecanismo de
replicación de la información
◦ Cada hebra sirve como molde
para replicar la complementaria
Propiedades
La Replicación ocurre sólo una vez en cada ciclo celular y resulta esencial en la
duplicación de las cromátidas de los cromosomas.

Semiconservativa: cada nueva molécula esta
formada por una hebra parental y una recién
sintetizada
◦ Experimentos de Meselson y Stahl
 Se utilizaron bacterias
de Escherichia coli cultivadas
en medio con isótopos de
N (N15 y N14).
 Se purificó ADN
utilizando una gradiente de
densidad (CsCl)


Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio
denominado origen de replicación
A cada lado de la burbuja de replicación se forma una
horquilla de replicación

Dirección de la síntesis: 5’
3’

Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser
sintetizada de continuo
◦ Consecuencia de la direccionalidad
Replicación en procariotas
Mecanismo

Inicio
◦ Reconocimiento de orígenes de replicación.
◦ Separación de hebras.
◦ Posicionamiento de maquinaria transcripcional.

Elongación
◦ Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.
◦ Replicación semiconservativa, semidiscontinua, coordinada.

Terminación
◦ Reconocimiento de señales de terminación.
◦ Desensamble de replisomas.

ADN polimerasas:
◦
◦
◦
◦

Pol I
Pol II
Pol III (replicasa)
Pol IV y V
Necesitan 3’ OH libre
DNA POLIMERASA II
Con actividad exonucleasa 3’5’ está involucrada
en procesos de reparación de DNA frente a un
daño térmico o por radiación.
DNA POLIMERASA III
Esta es la enzima que realiza el proceso replicativo,
su función es la síntesis de DNA. También cuenta
con actividad revisora, 3’5’ exonucleasa.
Maquinaria enzimática
ADN polimerasas: Síntesis de ADN
 Primasas: Generación 3’OH libres
 Ligasas: Unión los fragmentos de Okazaki
 Helicasas: Separación de hebras
 Topoisomerasas: Mantenimiento del grado
de superenrollamiento
 SSBs: Mantenimiento de simples hebras

Inicio

Reconocimiento del
origen y apertura de las
hebras
Elongación

Primasa:
◦ Sintetiza fragmentos de
ARN (cebadores) que
provean los 3’ OH libres
◦ Puede comenzar sin
necesidad de cebador
Replisoma
Terminación
Mecanismos de reparación

Las propias replicasas son capaces de reparar
sus errores durante la elongación:
◦ actividad correctora de prueba (proofreading)
◦ Implica una actividad exonucleasa 3’ 5’
Mecanismos de reparación
Replicación de ADN in-vitro: PCR


Permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés
Algunas aplicaciones:
◦
◦
◦
◦
◦
◦
Clonado acelular de moléculas de ADN
Detección de secuencias sin purificación previa
Análisis de expresión génica
Secuenciación de ácidos nucleicos
Amplificación de ADN para su posterior clonación celular
Aplicaciones en medicina:





Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas
Diagnóstico parental (amniocentesis, vellosidades coriónicas)
Tipado de tejidos para transplantes
Detección de células tumorales
Estudios de asociación genotipo-fenotipo
◦ Técnicas forenses: huellas genéticas (Identificación de polimorfismos)
 Identificación individual
 Tests de paternidad
◦ Filogenia
◦ Análisis de genética poblacional
Reacción de replicación in-vitro:
Molde
 ADN polimerasa: Taq polimerasa (termoestable)
 Cebadores:

◦ 3’ OH libre
◦ Definen la región a amplificar
dNTPs (A, C, G, T)
 Condiciones para el funcionamiento de la enzima:

◦ Buffer
◦ Mg++ (cofactor de la enzima)
Procedimiento
Desnaturalización del
ADN (94ºC)
 Agregado e
hibridación de los
cebadores (50ºC65ºC dependiendo de
los cebadores)
 Elongación (72ºC)
 Repetición de estas
etapas (25-35 ciclos)

Luego de terminados los ciclos se obtienen
millones de moléculas de la región blanco
 La hace una técnica extremadamente sensible

◦ Ventaja: se puede amplificar ADN partiendo de
muy poco material
◦ Desventaja: Contaminaciones
Variantes del método

rt- PCR:
◦ Se usa una transcriptasa reversa para pasar
una muestra de ARN a ADN obteniendose
ADN copia (ADNc)
◦ Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de
interés
◦ Estudios de expresión génica
◦ Clonado de genes eucariotas (eliminación de
intrones)

PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):
◦ Se diferencia en que en cada ciclo de amplificación
se cuantifica la cantidad de ADN obtenida
◦ Permite inferir la cantidad de moléculas de molde
que existía originalmente en la muestra:
 Cuantificación de la expresión génica
 Cuantificación de microorganismos
Secuenciación de ADN
Método de Sanger (nobel en 1980)
 Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para
terminar una reacción de síntesis de ADN invitro


Realizando 4 reacciones independientes
(una para cada base) se puede inferir la
secuencia original
Secuenciación automática





Sigue el mismo principio
A diferencia del método anterior cada ddNTP se
marca con una molecula fluorescente diferente
Esto permite realizar una unica reaccion en la cual
estan presentes los 4 ddNTPs marcados
Los fragmentos obtenidos se separan por
electroforesis capilar
La detección se realiza en un punto fijo al final de la
corrida
Secuenciación de genomas
Cada reacción de secuencia es capaz de leer
unas 500 pb
 Como se obtuvo la secuencia continua del
conjunto de los cromosomas humanos?
 Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb
(genoma completo 109)

Construcción de biblioteca de ADN genómico
fragmentado al azar
 Lectura de secuencias individuales
 Las secuencias individuales son solapadas y
ensambladas (contigs)
 Para asegurarse de que todas las secuencias estén
representadas se leen unas 10 veces la cantidad de
bases del genoma








La velocidad de producción de las secuencias ha ido
en.
Recaumentoientemente se dio un salto en este
sentido con el desarrollo de los secuenciadores de
“próxima generación”
No usan terminación de cadena
Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue
incorporada a cada molécula que se esta
secuenciando
Producen en una única reacción de secuencia
millones de lecturas de fragmentos diferentes
(paralelización)
108 1010 bases por corrida (menos de 1 día)
De esta forma se secuencio el genoma entero de
Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo
CONCLUSION
•La capacidad de las células de mantener un elevado grado de orden
dentro de un universo caótico, depende de la información genética que
se expresa, se mantiene y a veces mejora, mediante los procesos
genéticos básicos la síntesis de proteínas y del RNA, la reparaci6n de l DNA,
la replicaci6n del DNA y la recombinaci6n genética.
•En estos procesos, que producen y mantienen las proteínas y los
ácidos nucleicos de una célula la información de una secuencia lineal
de nucleótidos se utiliza para especificar otra cadena lineal de
nucleótidos (una molécula de DNA o de RNA) o una cadena lineal de
aminoácidos (una molécula proteica).
BIBLIOGRAFIA

Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt. Fundamentos de Bioquímica. 2º
edición. Buenos Aires: Médica Panamericana.
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Thomas M. Devlin, Ph. D. Bioquímica. 4º edición. Editorial Reverté, S.A.
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M. Zafri Humayun. Department of Microbiology and Molecular Genetics, UMDNF_
New Jersey Medical School, 185 South Orange Avenue, Newark, NJ 07103-2714,
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http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-0714105180036//mjr3de9.pdf
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http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm
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http://www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema4.htm
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http://www.pakosimarro.com/paraimprimir/diversidad/ampliacionbio2bto/unidad17