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Replicación del ADN

La división celular requiere de la duplicación
del material genético
mitosis
meiosis
mitosis
Mecanismo general

La misma estructura del ADN
sugirió un mecanismo de
replicación de la información
◦ Cada hebra sirve como molde
para replicar la complementaria
Propiedades

Semiconservativa: cada nueva molécula esta
formada por una hebra parental y una recién
sintetizada
◦ Experimentos de Meselson y Stahl


Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio
denominado origen de replicación
A cada lado de la burbuja de replicación se forma una
horquilla de replicación

Dirección de la síntesis: 5’
3’

Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser
sintetizada de continuo
◦ Consecuencia de la direccionalidad
Replicación en procariotas
Mecanismo

Inicio
◦ Reconocimiento de orígenes de replicación.
◦ Separación de hebras.
◦ Posicionamiento de maquinaria transcripcional.

Elongación
◦ Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.
◦ Replicación semiconservativa, semidiscontinua, coordinada.

Terminación
◦ Reconocimiento de señales de terminación.
◦ Desensamble de replisomas.

ADN polimerasas:
◦
◦
◦
◦

Pol I
Pol II
Pol III (replicasa)
Pol IV y V
Necesitan 3’ OH libre
Maquinaria enzimática
ADN polimerasas: Síntesis de ADN
 Primasas: Generación 3’OH libres
 Ligasas: Unión los fragmentos de Okazaki
 Helicasas: Separación de hebras
 Topoisomerasas: Mantenimiento del grado
de superenrollamiento
 SSBs: Mantenimiento de simples hebras

Inicio

Reconocimiento del
origen y apertura de las
hebras
Elongación

Primasa:
◦ Sintetiza fragmentos de
ARN (cebadores) que
provean los 3’ OH libres
◦ Puede comenzar sin
necesidad de cebador
Replisoma
Terminación
Replicación en eucariotas
Los mecanismos son similares
 Más de un origen de replicación por cromosoma
 Es más complejo

Proteins
RPA
PCNA
RFC
Pol α/primase
Pol δ / ε
FENI
DNA2
DNA ligase I
Mcm2-7
Functions
Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases;
facilitates helicase loading
Stimulates DNA polymerases and RFC ATPase
DNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding;
stimulates DNA polymerases; PCNA loading
RNA-DNA primer synthesis
DNA polymerase; 3'-5' exonuclease
Nuclease for removal of DNA/RNA primers
Nuclease for removal of DNA/RNA primers
Ligation of DNA
DNA helicase; primosome assembly, licensing factor
ADN polimerasas
Ocurre durante la fase S
 Una única vez por ciclo celular

Horquilla eucariota
Telómeros
Son secuencias repetidas que
se encuentran en los
extremos de los
cromosomas lineales
 Entre otras funciones
resuelven los problemas de
replicar este tipo de
cromosomas

Telomerasa
Enzima capaz de resolver
el problema de
acortamiento de los
extremos
 Ribonucleoproteína

Mantenimiento de la información
hereditaria

Errores durante la replicación:
◦ Las ADN polimerasas no son 100% fieles
◦ Los errores son reparados en un alto
porcentaje de las veces
◦ Cuando los errores escapan los mecanismos
de reparación ocurren cambios en la
secuencia del ADN: Mutaciones

Las mutaciones también pueden ocurrir
por fenómenos post replicación
(mutágenos físicos, químicos, etc.)
Mecanismos de reparación

Las propias replicasas son capaces de reparar
sus errores durante la elongación:
◦ actividad correctora de prueba (proofreading)
◦ Implica una actividad exonucleasa 3’ 5’
Mecanismos de reparación
Replicación de ADN in-vitro: PCR


Permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés
Algunas aplicaciones:
◦
◦
◦
◦
◦
◦
Clonado acelular de moléculas de ADN
Detección de secuencias sin purificación previa
Análisis de expresión génica
Secuenciación de ácidos nucleicos
Amplificación de ADN para su posterior clonación celular
Aplicaciones en medicina:





Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas
Diagnóstico parental (amniocentesis, vellosidades coriónicas)
Tipado de tejidos para transplantes
Detección de células tumorales
Estudios de asociación genotipo-fenotipo
◦ Técnicas forenses: huellas genéticas (Identificación de polimorfismos)
 Identificación individual
 Tests de paternidad
◦ Filogenia
◦ Análisis de genética poblacional
Reacción de replicación in-vitro:
Molde
 ADN polimerasa: Taq polimerasa (termoestable)
 Cebadores:

◦ 3’ OH libre
◦ Definen la región a amplificar
dNTPs (A, C, G, T)
 Condiciones para el funcionamiento de la enzima:

◦ Buffer
◦ Mg++ (cofactor de la enzima)
Procedimiento
Desnaturalización del
ADN (94ºC)
 Agregado e
hibridación de los
cebadores (50ºC65ºC dependiendo de
los cebadores)
 Elongación (72ºC)
 Repetición de estas
etapas (25-35 ciclos)

Luego de terminados los ciclos se obtienen
millones de moléculas de la región blanco
 La hace una técnica extremadamente sensible

◦ Ventaja: se puede amplificar ADN partiendo de
muy poco material
◦ Desventaja: Contaminaciones
Variantes del método

rt- PCR:
◦ Se usa una transcriptasa reversa para pasar
una muestra de ARN a ADN obteniendose
ADN copia (ADNc)
◦ Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de
interés
◦ Estudios de expresión génica
◦ Clonado de genes eucariotas (eliminación de
intrones)

PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):
◦ Se diferencia en que en cada ciclo de amplificación
se cuantifica la cantidad de ADN obtenida
◦ Permite inferir la cantidad de moléculas de molde
que existía originalmente en la muestra:
 Cuantificación de la expresión génica
 Cuantificación de microorganismos
Secuenciación de ADN
Método de Sanger (nobel en 1980)
 Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para
terminar una reacción de síntesis de ADN invitro


Realizando 4 reacciones independientes
(una para cada base) se puede inferir la
secuencia original
Secuenciación automática





Sigue el mismo principio
A diferencia del método anterior cada ddNTP se
marca con una molecula fluorescente diferente
Esto permite realizar una unica reaccion en la cual
estan presentes los 4 ddNTPs marcados
Los fragmentos obtenidos se separan por
electroforesis capilar
La detección se realiza en un punto fijo al final de la
corrida
Secuenciación de genomas
Cada reacción de secuencia es capaz de leer
unas 500 pb
 Como se obtuvo la secuencia continua del
conjunto de los cromosomas humanos?
 Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb
(genoma completo 109)

Construcción de biblioteca de ADN genómico
fragmentado al azar
 Lectura de secuencias individuales
 Las secuencias individuales son solapadas y
ensambladas (contigs)
 Para asegurarse de que todas las secuencias estén
representadas se leen unas 10 veces la cantidad de
bases del genoma








La velocidad de producción de las secuencias ha ido
en aumento.
Recientemente se dio un salto en este sentido con el
desarrollo de los secuenciadores de “próxima
generación”
No usan terminación de cadena
Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue
incorporada a cada molécula que se esta
secuenciando
Producen en una única reacción de secuencia
millones de lecturas de fragmentos diferentes
(paralelización)
109 1011 bases por corrida (menos de 1 día)
De esta forma se secuencio el genoma entero de
Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo