Download i. abreviaturas

BENEMERITA UNIVERSIDAD
AUTONOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
LABORATORIO DE NEUROFARMACOLOGIA
TESIS PROFESIONAL
Efecto de la administración del fragmento C-terminal de la toxina
tetánica en un modelo de discinesias y asimetría motora en ratas,
sobre los niveles de tirosina hidroxilasa en el estriado y sustancia
nigra pars compacta
Que para obtener el titulo de
QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
Presenta
Victoria Palafox Sánchez
Directores de Tesis
Dr. Ilhuicamina Daniel Limón Pérez de León
M.C. Félix Luna Morales
ABRIL 2010
INDICE
I. ABREVIATURAS ...................................................................................................... 4
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 6
1.1 Las discinesias inducidas por un tratamiento con L-DOPA ............................... 8
1.2 Fibras dopaminérgicas en el sistema nervioso central ...................................... 9
1.3 Síntesis de dopamina y su regulación ............................................................. 10
1.3.1Regulación de la tirosina hidroxilasa ............................................................. 11
1.3.2. La enzima Descarboxilasa de L-aminoácidos aromáticos ........................... 14
1.4 Modelo experimental para el estudio de las discinesias .................................. 15
1.4.1 Lesión dopaminérgica con 6-hidroxidopamina en rata ................................. 15
1.4.2 Inducción de discinesias en ratas con lesión dopaminérgica. ...................... 17
1.5 La L-DOPA induce discinesias: Cambios pre-sinápticos ................................. 18
1.6 Las discinesias están relacionadas con cambios en la expresión de genes ... 20
1.6.1 La señalización de los receptores D1 implicada en el desarrollo de las
discinesias ............................................................................................................. 21
1.7 Tratamiento de las discinesias inducidas con L-DOPA .................................. 24
1.8 Función de los factores de crecimiento en el sistema nervioso central .......... 26
1.8.1 Los factores de crecimiento como terapéutica para la enfermedad de
Parkinson ............................................................................................................... 27
1.9 La estructura molecular y síntesis de la toxina tetánica .................................. 29
1.9.1 El fragmento C-terminal de la cadena H de la toxina tetánica ...................... 29
1.9.2 Unión del fragmento Hc-TeTx a los ganglíosidos de membrana. ................. 30
1.9.3 Transporte retrogrado del fragmento Hc-TeTx ............................................. 31
1.9.4 El fragmento Hc-TeTx como una alternativa terapéutica para la enfermedad
de Parkinson .......................................................................................................... 32
2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 35
3. HIPÓTESIS ........................................................................................................... 37
4. OBJETIVO GENERAL........................................................................................... 37
4.1 Objetivos particulares ...................................................................................... 37
5. DIAGRAMA DE TRABAJO .................................................................................... 38
6. DESARROLLO EXPERIMENTAL ......................................................................... 39
6.1 Sujetos de experimentación ............................................................................ 39
6.2 Sustancias ....................................................................................................... 39
6.3 Material............................................................................................................ 39
6.4 Cirugía estereotáxica....................................................................................... 39
6.5 Conducta de giro ............................................................................................. 40
6.6 Tratamiento con L-DOPA ................................................................................ 40
6.7 Administración del fragmento Hc-TeTx ........................................................... 41
2
6.8 Videograbación de las ratas durante el tratamiento con L-DOPA ................... 41
6.8.1 Cuantificación de movimientos involuntarios anormales .............................. 42
6.9 Evaluación de la asimetría motora en el cilindro ............................................. 44
6.10. Inmunorreactividad a la tirosina hidroxilasa fosforilada ser 31 .................... 45
7. RESULTADOS ...................................................................................................... 47
7.1 Localización del sitio de inyección ................................................................... 47
7.2 Efecto de la inyección unilateral de la 6-OHDA en las vías nigroestriatales de
rata ......................................................................................................................... 48
7.3 Efecto de la administración de L-DOPA+Carbidopa sobre los movimientos
involuntarios anormales en ratas con lesión dopaminérgica .................................. 50
7.3.1 Efecto de la administración del Hc-TeTx más L-DOPA sobre el giro
contralateral ........................................................................................................... 55
7.3.2 Efecto de la administración del Hc-TeTx más L-DOPA sobre el movimiento
axial........................................................................................................................ 55
7.3.4 Efecto de la administración del Hc-TeTx más L-DOPA sobre el movimiento
de miembro ............................................................................................................ 56
7.3.5 Efecto de la administración del Hc-TeTx más L-DOPA sobre el movimiento
orolingual ............................................................................................................... 56
7.4 Efecto de la administración del Hc-TeTx mas L-DOPA sobre la asimetría
motora de ratas con discinesias evaluada en el modelo del cilindro ...................... 61
7.5 Efecto de la administración del Hc-TeTx mas L-DOPA sobre la
inmunorreactividad a la enzima tirosina hidroxilasa fosforilada en serina 31 ......... 63
8. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 66
9. CONCLUSIONES .................................................................................................. 74
10.PERSPECTIVAS .................................................................................................. 75
11. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 76
12. CONGRESOS ..................................................................................................... 89
3
I. ABREVIATURAS
5-HT
Serotonina
6-OHDA
6-hidroxidopamina
AC
Adenilato ciclasa
ATV
Área tegmental ventral
Bax
Proteína X asociada a Bcl-2
BDNF
Factor neurotrófico derivado del cerebro
BH4
Tetrahidrobiopterina
CaM KII
Cinasa II dependiente de Ca +2/calmodulina
COMT
Catecol-orto-metiltransferasa
CRE
Elementos en respuesta a AMPc
DA
Dopamina
DARPP-32 Fosfoproteína de 32 KDa
DAT
Transportador de dopamina
DCAA
Enzima descarboxilasa de aminoácidos aromáticos
DOPAC
Acido-3,4-dihidrofenilacético
ERK ½
Cinasas ½ reguladas por señales extracelulares
GDNF
Factor neurotrófico derivado de células gliales
Hc-TeTx
Fragmento C-terminal de la toxina tetánica
HVA
Ácido homovanílico
L-DOPA
L-3,4-hidroxifenilamina
MAO
Monoamino oxidasa
MIAs
Movimientos involuntários anormales
4
MPP+
1-metil-4-fenilperidinio
NA
Noradrenalina
NGF
Factor de crecimiento nervioso
NMDA
N-metil-D-aspartato
NT-3
Neurotrofina 3
NT-4/5
Neurotrofina-4/5
NTC
Neurotoxinas clostriadiales
P75NTR
Receptor neurotrofico de 75 KDa
PA-1
Proteína activadora-1
PKA
Cinasa dependiente de AMPc
PKC
Proteína cinasa C
PLCγ-1
Fosfolipasa Cγ-1
PP-1
Proteina fosfatasa-1
SNC
Sistema nervioso central
SNP
Sistema nervioso periférico
SNpc
Sustancia nigra pars compacta
SSI
Solución salina isotónica
TeTx
Toxina tetânica
TH
Tirosina hidroxilasa
TrK
Receptor de tirosina cinasa
TVM-2
Transportador vesicular tipo-2 de monoaminas
5
1. INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Parkinson (EP), fue descrita por James Parkinson en 1817, la describió
como una entidad caracterizada por temblor de reposo, rigidez, bradicinesia y pérdida de los
reflejos posturales (Parkinson, 1817). En 1957, Carlsson realizó observaciones en modelos
animales de los efectos de la reserpina el alcaloide responsable de la mayor parte de los
efectos de la planta Rauwolfia reserpina. A nivel central, la reserpina produce una disminución
de noradrenalina (NA) serotonina (5-HT) y dopamina (DA) (Carlsson y cols., 1957a). Los
animales tratados con reserpina modificaban su actividad motora y perdían movilidad
espontanea, el comportamiento de estos animales le recordó a Carlsson los pacientes con EP.
Si la reserpina inducía un cuadro parkinsoniano experimental parecía probable que sus efectos
neuroquímicos tuvieran alguna relación con la EP, sin embargo la reserpina actúa sobre varios
neurotransmisores, cualquiera de ellos podría ser responsable de su efecto motor, ¿pero cuál?,
la solución la encontró el propio Carlsson, al administrar la L-3,4 dihidroxifenilalanina (L-DOPA),
el precursor de DA, la cual es capaz de revertir los efectos motores en animales que tenían
reserpina (Carlsson y cols., 1957 b)), sugiriendo que la DA era el neurotransmisor implicado en
la EP.
Oleh Hornykiewicz, encontró una disminución de DA en el estriado de pacientes postmorten con EP, incluso determinó la relación existente entre el déficit dopaminérgico y el grado
de muerte neuronal en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) (Hornykiewicz, 1970). Con
dichas evidencias por primera vez se conocía la base neuroquímica de una enfermedad
neurodegenerativa, por lo que era mucho más fácil buscar un tratamiento.
A principios de los
años sesenta, la estrategia parecía clara: había que encontrar la forma de compensar al
estriado el déficit dopaminérgico, sin embargo no era posible administrar directamente la DA
pues esta no atraviesa la barrera hematoencefálica, pero se podía probar con un precursor de
dicho neurotransmisor.
Oleh Hornykiewicz empleó L-DOPA parenteral en pacientes con EP, sus resultados iníciales
fueron prometedores: durante unas horas se observó una importante disminución de la
acinesia, puesto que se recuperaron los niveles de DA en el estriado, sin embargo en algunos
6
pacientes se presentaron náuseas y vómitos (Hornykiewicz, 1970). En 1967, Cotzias realizó un
ensayo clínico controlado con placebo, empleando altas dosis orales D-L DOPA y de
fenilalanina en pacientes parkinsonianos, observando una respuesta positiva en 10 de los 16
pacientes tratados con D-L DOPA, mientras que ningún paciente tratado con fenilalanina mejoró
(Cotzias y cols., 1967). El trabajo definitivo llegó 2 años después con el estudio de Melvin Yahr,
que empleo L-DOPA con placebo en 60 pacientes con EP. Con esto se reconoció la efectividad
del fármaco: “Cada parámetro clínico estudiado mejoró con la L-DOPA, disminuyó la rigidez,
temblor y acinesia, observamos mejoría de la marcha, postura, vocalización, deglución,
escritura y cambios autonómicos” (Yahr y cols., 1969). Aunque los efectos secundarios fueron
notorios las náuseas, los vómitos y las discinesias (>50%).
Para solucionar los efectos adversos de la L-DOPA, se probó con inhibidores periféricos de
la enzima encargada de descarboxilar a la L-DOPA y convertirla en DA; con la finalidad de
reducir las nauseas y el vómito, el compuesto denominado genéricamente benserazida (Ro 44602), fue empleado por Birkmayer asociado a la L-DOPA, y de igual forma se probo con la
carbidopa (MK-486) mostrando resultados alentadores en los que se disminuyeron las náuseas
y el vomito (Birkmayer, 1970; Calne y cols., 1971). El empleo de los inhibidores periféricos de
la descarboxilasa permitió una reducción de la dosis de L-DOPA y, aunque no se modificó
apreciablemente la aparición de las discinesias, la intolerancia gastrointestinal dejó de ser una
limitante en el tratamiento. Cabe mencionar que a pesar de las limitaciones del tratamiento y
los efectos secundarios la L-DOPA mejoró considerablemente la calidad y las expectativas de
vida de los pacientes con EP.
7