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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS
AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD IRAPUATO
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA GENÉTICA
Estudio de la biología reproductiva y análisis molecular de
la reproducción sexual y asexual de Agave tequilana
Weber var. azul
Tesis que presenta
M.C. ROCIO ELIZABETH ESCOBAR GUZMÁN
Para Obtener el Grado de
Doctora en Ciencias
En la Especialidad de
Biotecnología de Plantas
Directora de la Tesis: Dra. June Simpson Williamson
Irapuato, Guanajuato.
Julio del 2009
DEDICATORIA
A Dios:
Por permitirme emprender esta gran aventura.
A mi esposo:
José Prado Pérez
Porque gracias a su apoyo, su amor incondicional, su esfuerzo y su confianza, he logrado
una meta más en mi vida profesional. Muchas gracias amor por ser como eres.
A mis hijas:
Daniela Andrea, Katherine Nicoll y Alejandra
El tesoro más grade que tengo, son la luz que me impulsa a seguir adelante y fuente de mi
inspiración.
A mis padres:
Santiago Escobar Pérez
Elsa Guzmán Morales
Muchas gracias por toda la ayuda incondicional, aunque separados por miles de kilómetros,
nuestros corazones siempre permanecieron juntos. Papitos este logro también es suyo.
A mis hermanos:
Ivan, Carla, Claudia y Ramiro
Gracias por su cariño y por estar siempre cerca de mi.
i
AGRADECIMIENTOS
Agradezco el apoyo financiero brindado por el CONACYT con la beca nº 139917 para la
realización de este trabajo de investigación.
Al CINVESTAV por la oportunidad que me dieron para realizar mis estudios dentro de la
institución y permitirme forjar la pasión por la investigación.
A la Dra. June Simpson Williamson, mi directora de tesis, por permitirme trabajar en su
laboratorio, por los consejos y sugerencias, por la paciencia y las enseñanzas compartidas.
A los Doctores Luis Herrera Estrella, Jean Philippe Vielle Calzada, John Délano Frier y
Abisaí García Mendoza, mis sinodales, por sus valiosas y acertadas sugerencias.
A la Dra. Guadalupe Palomino, por la colaboración desinteresada en parte de este trabajo.
A mis compañeros de laboratorio, Mónica, Katia, Corina, Miriam, Silvia, Jazmín, Francisco,
Celso y Alfredo por la amistad y ayuda brindada, sin duda fueron buenos los momentos de
diversión y alegrías que compartimos. En especial a Flor Zamudio por realizar parte del
trabajo de este proyecto y a Emigdia Alfaro por la asistencia técnica brindada.
También deseo agradecer a todo el personal administrativo del CINVESTAV – UNIDAD
IRAPUATO por las acciones de operación y mantenimiento que apoyaron esta
investigación.
A todas y cada una de las personas que de alguna manera hicieron posible la realización de
este trabajo.
ii
ÍNDICE
Dedicatoria .……………………………………………………………………………… i
Agradecimientos…………………………………………………………………………. ii
Índice………………………………………………………………………………..……
iii
Índice de tablas…………………………………………………………………………... vi
Índice de figuras………………………………………………………………………….
vii
Resumen…………………………………………………………………………….……
ix
Abstract……………………………………………………………………….........…….
x
1.INTRODUCCIÓN…………………………………………………...………………… 1
2.ANTECEDENTES………………………………………………………………...…… 3
2.1. Historia……………………………………………………………………… 3
2.2. Clasificación taxonómica……………………………………………………. 4
2.3. Descripción del género Agave……………………………………………….. 5
2.4. Diversidad genética………………………………………………………….. 7
2.5. Biología reproductiva en el género Agave………………………….……….. 9
2.6. Agave tequilana F.A.C.Weber var. azul……………………………………… 11
2.6.1. Propagación de Agave tequilana Weber var. Azul…...……...……
13
2.6.2. Reproducción sexual………………………………………………
13
2.6.2.1. Desarrollo del gametofito femenino…………………….
13
2.6.2.2. Desarrollo del gametofito masculino……………………
15
2.6.3.Reproducción asexual………………………………………….…..
17
2.6.4. Citogenética de Agave tequilana………………………………….
18
2.6.5. Bioquímica de Agave tequilana……………………………….......
19
2.6.6. Estudios moleculares en Agave tequilana ………………………...
19
2.6.7. Retrotransposones en Agave tequilana……………………………. 19
2.7. Agave americana var. Americana……………………………………...……
20
2.7.1. Reproducción de Agave americana……………………………….
20
2.8. Marcadores moleculares…………………………………………………….
20
2.8.1. AFLP………………………………………………………………… 22
iii
2.8.2. SSAP…………………………………………………………........... 23
2.8.3. IRAP………………………………………………………………… 23
2.9. Elementos móviles en plantas……………………………………………….
24
3.OBJETIVOS……………………………………………………………………...……
25
3.1. Objetivo general……………………………………………………………..
25
3.2. Objetivos específicos………………………………………………………..
25
4. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………..........................
26
4.1. Material vegetal……………………………………………………...……… 26
4.2. Determinación de flores, frutos y semillas………………………………….
26
4.3. Procedimientos de polinización……………………………………………..
28
4.4. Germinación de semillas…………………………………………………….
29
4.5. Estudios histológicos………………………………………………..……....
29
4.6. Viabilidad del polen…………………………………………………………
30
4.7. Análisis por citometría de flujo……………………………………………...
30
4.8. Extracción de DNA genómico………………………………………………
31
4.9. AFLP………………………………………………………………………...
32
4.10. Análisis de datos……………………………………………………...……
35
4.11. IRAP…………………………………………………………………….....
35
4.12. Aislamiento, clonación y transformación de productos
amplificados por IRAP….………………………………………....……….........
36
4.13. SSAP………………………………………………………………………
36
4.14. Búsqueda de retrotransposones en la base de datos de Agave……………..
37
5. RESULTADOS…………………………………………………………...…………..
38
5.1. Producción de frutos y semillas en polinización abierta…………………….
38
5.2. Producción de frutos y semillas obtenidos por cruzas………………………
41
5.3. Viabilidad de semillas………………………………………………………
42
5.4. Análisis histológico del desarrollo de los gametofitos…………………...…
45
5.4.1. Desarrollo del gametofito femenino………………………………
45
5.4.2. Desarrollo del gametofito masculino…………………………...…
49
5.5. Viabilidad de los granos de polen…………………………………...………
50
5.6. Análisis morfológico y genético de cruzas inter e intraespecíficas.…...........
51
iv
5.7. Análisis por citometría de flujo……………………………………………...
53
5.8. Variación genética sexual en Agave tequilana………………………...……
55
5.8.1. Análisis genético de cruzas inter e intraespecíficas………………
59
5.9. Variación genética asexual en Agave tequilana…………………………….
63
5.9.1. Variación genética en hijuelos de rizoma…………………………
63
5.9.2. Variación genética en bulbilos…………………………………….
64
5.10. IRAP……………………………………………………………………….
67
5.11. SSAP……………………………………………………………………...
70
5.12. Elementos transponibles en la base de datos de Agave tequilana…...……
72
6. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………..
77
6.1. Producción de frutos y semillas en Agave tequilana y Agave americana…..
77
6.2. Análisis histológico del desarrollo de los gametos en Agave tequilana…….
81
6.3. Análisis del contenido de DNA de Agave tequilana……………………......
84
6.4. Variación genética sexual y asexual en Agave tequilana…………………...
85
6.5. Análisis de retrotransposones en Agave tequilana…………………………..
88
7. CONCLUSIONES…………………………………………………………………….
90
8. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………...
91
9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………...……
93
v
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Combinación de oligonucleótidos usados en los AFLP…………………............ 34
Tabla 2. Producción de frutos y semillas en polinización abierta
de Agave tequilana y Agave Americana……………………………..……………. 39
Tabla 3. Producción de frutos y semillas en
autopolinización de Agave tequilana and Agave americana………….…………… 42
Tabla 4. Producción de frutos y semillas obtenidos
por cruzas de Agave tequilana and Agave americana …………………………..... 42
Tabla 5. Porcentaje de germinación del tubo polínico……………………………………. 51
Tabla 6. Contenido de DNA nuclear en hojas de
Agave tequilana analizadas por citometría de flujo………….…………………… 55
Tabla 7. Estimación del tamaño del genoma de Agave tequilana…………………............ 55
Tabla 8. Proporción de polimorfismos obtenidos de cruzas
intraespecíficas e interespecíficas…………………………………………………. 59
Tabla 9. Tamaños de secuencias clonadas y primera
correlación de BLAST a nucleótidos realizado
en la base de datos del NBCI……………………………………………………… 69
Tabla 10. Secuencias encontradas en la base de datos de
Agave con similitud significativa a retrotransposones.............................................. 72
Tabla 11. Proporción de secuencias en diferentes tejidos de
A. tequilana que dieron similitud a retrotransposones…………….………........... 74
Tabla 12. Secuencias encontradas en la base de datos
de Agave con similitud significativa a transposones............................................... 75
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Diosa Mayahuel…………………………………………................................... 3
Figura 2. Inflorescencias de Agave tequilana y Agave americana……………………….. 6
Figura 3. Representación esquemática del desarrollo
del gametofito femenino ………………………………………………………...... 14
Figura 4. Representación esquemática del desarrollo
del gametofito masculino ………………………………………………………..... 16
Figura 5. Croquis de localización de las plantas progenitoras…………………………….. 27
Figura 6. Semillas de Agave tequilana y Agave americana………………………………. 40
Figura 7. Germinación de semillas ……………………………..…..…………………….. 44
Figura 8. Desarrollo del gametofito femenino en A.tequilana…………………………….. 47
Figura 9. Óvulos con tubos polínicos en A.tequilana ……………………………...……… 48
Figura 10. Desarrollo del gametofito femenino en A.americana………………………….. 48
Figura 11. Desarrollo del gametofito masculino………………………………………….. 49
Figura 12. Granos de polen de A. americana……………………………………………… 50
Figura 13. Germinación de los granos de polen de A. tequilana………………………….. 51
Figura 14. Análisis de AFLP mostrando genotipos recombinantes…………………......... 52
Figura 15. Plantas de Agave tequilana obtenidas de semillas con
diferentes eventos de polinización………………………………………............... 53
Figura 16. Estimación del contenido de DNA nuclear en plantas
de cultivo de Agave tequilana ……………………………………………………. 54
Figura 17. Dendrograma de semillas de polinización abierta plantas At1, At2 .………… 57
Figura 18. Dendrograma de semillas de polinización abierta
plantas At1, At2, At3 y At4………………………………………………….…… 58
Figura 19. Dendrograma de cruzas intra e interespecíficos ……………………………… 61
Figura 20. Dendrograma de cruzas intra e interespecíficos
obtenido con el programa de NTSYS 2.0…………………………………………. 62
Figura 21. Dendrograma de hijuelos y su progenitor……………………………………... 64
Figura 22. Bulbilos de Agave tequilana mostrando lista amarilla………………………… 65
Figura 23. Dendrograma de bulbilos ……………….…………………………………
66
vii
Figura 24. Productos de amplificación obtenidos por IRAP-PCR…………………….
67
Figura 25. Clonación de productos de amplificación generados por IRAP-PCR…….
68
Figura 26. Gel de poliacrilamida mostrando los productos de
amplificación generados por SSAP……………………………………………
71
viii
RESUMEN
Agave tequilana Weber var. Azul es la única especie permitida por la norma oficial como
materia prima para la producción de la bebida mexicana más conocida, el tequila.
A pesar de la enorme importancia económica y cultural que representa esta especie son
pocos los estudios realizados tanto a nivel de su fisiología, bioquímica y genética.
El objetivo principal de este trabajo fue estudiar diferentes aspectos de la biología
reproductiva en plantas de A. tequilana y A. americana incluyendo formación de
gametofitos, eficiencia de polinización, germinación de semillas y niveles de variabilidad
bajo reproducción sexual y asexual. Se determinó que el desarrollo del gametófito femenino
en A. tequilana y A. americana es de tipo Polygonum monospórico mientras que el
desarrollo del gametofito masculino termina con la formación de granos de polen que
muestran una ornamentación reticulada y disulcada con una viabilidad hasta del 36% para
A.tequilana y 79% para A. americana. Semillas obtenidas por polinización abierta en A.
tequilana mostraron niveles de germinación de hasta un 40% mientras los de A. americana
mostraron porcentajes más altos de germinación (>80%). Las semillas producidas por
autofecundaciones tanto de A. tequilana como de A. americana también mostraron altos
niveles de viabilidad (>60% para At y >90% para Aa). Por medio de cruzas interespecificas
se obtuvieron semillas híbridas con una viabilidad que va desde 58 al 73% cuando A.
tequilana es el progenitor paterno y del 1 al 10% cuando A. tequilana es progenitor materno.
La variabilidad genética en reproducción sexual determinada por AFLP en promedio fue de
62%, mientras que en las cruzas interespecificas la variabilidad genética alcanzó un 69% y
en cruzas intraespecíficas llego hasta el 64%. En reproducción asexual tanto en hijuelos de
rizoma como en bulbilos el nivel de polimorfismo encontrado fue alto, sugiriendo que
existen mecanismos que generan variabilidad genética en reproducción asexual. Por medio
de marcadores moleculares basados en retrotransposones tipo IRAP y SSAP se determinó la
presencia de retrotransposones del tipo copia Ty1 en el genoma de A. tequilana y se
confirmó la presencia de elementos transponibles activos en el genoma de A. tequilana
encontrandose estos en la base de datos de su transcriptoma.
ix
ABSTRACT
Agave tequilana Weber var. “azul” is the only species allowed under the denomination of
origin as the raw material for the production of the most well-known Mexican drink around
the world, tequila. In spite of the enormous economic and cultural importance that this
species represents, few studies have been carried out concerning it´s physiology,
biochemistry and genetics. The primary objective of this work was to study different aspects
of reproductive biology in plants of A. tequilana and A. americana including formation of
gametophytes, efficiency of pollination and germination of seeds and levels of variability
under sexual and asexual reproduction. In this work it was determined that the development
of the female gametophyte in A. tequilana and A. americana is of the monosporic
Polygonum type whereas the development of the male gametophyte culminates with the
formation of pollen grains that shows a reticulate and disulcate architecture with a viability
of up to 36% for A.tequilana and 79% for A. americana. Seeds obtained by open pollination
in A. tequilana showed an efficiency of germination of up to 40% while those of A.
americana showed a higher percentage of germination (> 80%). The seeds produced by selffertilization in both A. tequilana and A. americana also showed high levels of viability (>
60% for At and > 90% for Aa). From interspecific crosses, hybrid seeds were obtained with
a viability of 58 to 73% when A. tequilana is the male progenitor and 1 to 10% when A.
tequilana is the female progenitor. The genetic variability observed for sexual reproduction
as determined by AFLP on average was 62%, whereas in interspecific crosses the genetic
variability reached 69% and in intraspecific crosses up to 64%. In asexual reproduction
either in offsets of rhizomes or in bulbils the level of polymorphism found was relatively
high, suggesting that mechanisms exist that generate genetic variability during this process.
From analysis of molecular markers based on retrotransposons type IRAP and SSAP the
presence of retrotransposons copia Ty1 type was determined in the genome of A. tequilana
and
confirmed
by
analysis
of
the
transcriptome
data
base.
x
1. INTRODUCCIÓN
La familia Agavaceae con nueve géneros y 330 especies es endémica de América. México
es el centro de origen y diversidad del género, donde se localizan 251 especies, de las cuales
177 son endémicas, lo que significa que el 70% de las especies sólo se encuentran en
México (García-Mendoza, 2004). Las plantas de agave han sido utilizadas desde tiempos
prehispánicos para una gran variedad de aplicaciones. Actualmente los Agaves o magueyes
son explotados comercialmente para la producción de fibras y bebidas alcohólicas tales
como tequila y mezcal (Colunga-García y Zizumbo-Villarreal. 2007).
La preparación de bebidas alcohólicas es la actividad económica más importante asociada al
cultivo de agave. Aunque el mezcal puede ser preparado a partir de una amplia variedad de
especies de agave, bajo la “Denominación de Origen” (Diario Oficial, 1993), al menos el
51% de los azúcares usados para producir tequila deben provenir de Agave tequilana Weber
variedad azul. El Consejo Regulador del Tequila (CRT), organismo no gubernamental
dedicado a promover la calidad, la cultura y el prestigio del tequila reporta que en México se
plantan alrededor de 120,000 hectáreas con agave y se estima que más de 600,000 familias
dependen directa o indirectamente de su cultivo y procesamiento.
A pesar de la importancia económica de A. tequilana, existe muy poca información en
términos de genética, mejoramiento y fisiología de ésta especie, especialmente en relación a
su proceso de reproducción. Esto se debe principalmente al ciclo de vida largo de la planta y
al difícil acceso a las inflorescencias. Aunado a esto, la práctica agronómica en plantaciones
comerciales de agave de cortar el eje floral tan pronto como éste emerge para conservar las
reservas de azúcar en el tallo, conocido comúnmente como piña.
Las plantas de A. tequilana son monocárpicas perennes que producen flores una sola vez al
final de su ciclo de vida después del cual mueren. A. tequilana Weber var. azul es propagado
normalmente en forma asexual a través de hijuelos de rizoma y es muy raro encontrar
plantas en floración en campos de cultivo.
1
Por las razones antes mencionadas, hasta el momento no existen reportes sobre la
reproducción sexual en A. tequilana, ni análisis moleculares de plantas obtenidas de
semillas. La formación de híbridos entre A. tequilana y otras especies de agave tampoco ha
sido documentado. Dicha información es necesaria para desarrollar investigación en
genética y mejoramiento del Agave en términos de resistencia a enfermedades, acumulación
de azúcares, producción de hijuelos y precocidad en este importante cultivo.
Este es el primer estudio que revela información detallada sobre el desarrollo del gametofito
tanto femenino como masculino en A. tequilana, así como información básica relacionada a
la biología reproductiva sexual, desarrollo de semillas y frutos, porcentajes de germinación
de los granos de polen y eficiencia en producción y viabilidad de semillas, así como el
análisis de la variabilidad genética tanto en la reproducción sexual como asexual por medio
de marcadores moleculares en A. tequilana.
En este trabajo de tesis se realizaron análisis tanto teóricos como experimentales para
identificar la fuente de variación genética en reproducción asexual y se demuestra la
presencia de retrotransposones genéticamente activos tanto por medio de marcadores
moleculares tipo IRAP y SSAP como por búsquedas informáticas en la base de datos del
transcriptoma de A. tequilana.
2
2. ANTECEDENTES
2.1. Historia
El Agave no es sólo una planta; también supone una cultura y tradición e implica una forma
de vida y en tiempos prehispánicos, una forma de supervivencia. Mesoamérica y
Aridoamérica, han sido escenario del origen y evolución del maguey (Agave spp.). En
ambas regiones esta planta ha sido utilizada, desde los primeros pobladores hasta la
actualidad, para satisfacer y complementar una serie de necesidades básicas como alimento,
forraje, medicamentos y construcción, entre otros
(Granados, 1993). Una de las especies con registros
arqueológicos más antiguos de uso es el maguey
pulquero Agave salmiana, cuya importancia era tal
que fue deificado por los mexicas como la diosa
Mayahuel (Figura 1), la diosa del maguey, por todas
las bondades que ésta les brindaba y se encuentra
representado
en
pinturas,
murales
y
códices
provenientes de ésta y otras culturas indígenas del
centro de México (García-Mendoza, 2004). Según los
Figura 1. Diosa Mayahuel
códices mexicas, los Aztecas durante su migración al
Valle de México, extrajeron el aguamiel y elaboraron el pulque entre 1172 y 1291 D.C.,
aunque evidencias arqueológicas muestran que las personas que habitaban este lugar antes
de la llegada de los Aztecas habían usado el maguey previamente por miles de años (Gentry,
1982). Se conoce que los mexicas extendieron el cultivo del maguey y sus productos;
también se sabe que nuevas variedades podrían haber sido introducidas de fuentes silvestres,
por medio de selección de las mejores plantas. Los mexicas conocían a los magueyes con el
nombre genérico de metl y no fue hasta 1753 que Linneo ubica a éstas plantas en el género
Agave. La palabra Agave proviene de la raíz griega que significa “admirable” y describe no
sólo su rara apariencia sino también su longitud y floración que ocurre sólo una vez en el
ciclo de vida de la planta para después morir. Las culturas prehispánicas utilizaron los
3
magueyes de manera integral desde las raíces hasta las semillas, recibiendo cada órgano un
nombre especial.
2.2. Clasificación taxonómica
La delimitación genérica de la familia Agavaceae y su reconocimiento han variado a través
del tiempo. En la actualidad la circunscripción familiar más aceptada es la propuesta por
Dahlgren et al. (1985), quienes delimitan la familia con 8 géneros. Actualmente se considera
un noveno género (Hesperoyucca), segregado de Yucca.
La familia Agavaceae es endémica de América. Se encuentra en un amplio rango de hábitats
y se distribuye desde el sur de Canadá hasta Bolivia, incluyendo las islas del Caribe, desde
las Bahamas hasta Aruba y Trinidad y Tobago (García-Mendoza, 2004).
División:
Angiospermae
Clase:
Monocotyledonae
Orden:
Asparagales
Familia:
Agavaceae
Subfamilia:
Agavoideae
Género:
Agave
Subgénero:
Agave
Especie:
Agave tequilana F.A.C.Weber
Variedad:
azul
El género Agave, según el tipo de inflorescencia que presenta, se divide en dos subgéneros;
el subgénero Agave que tiene una inflorescencia en panícula, en el cual se encuentran las
especies de importancia económica tales como A. tequilana, A. fourcroydes y
A.
angustifolia, y el subgénero Littaea que presenta una inflorescencia en forma de espiga
(Irish, 2000).
4
2.3. Descripción del género Agave
La primera especie de Agave que fue descrita científicamente fue Agave americana. Las
plantas de agave, las cuales algunas veces son confundidas con cactos, pertenecen a la
familia Agavaceae y son plantas suculentas con hojas arregladas en forma de espiral
formando una roseta, del cual las hojas emergen de un mismo punto de crecimiento sobre el
tallo formando una cabeza radialmente simétrica (Irish, 2000).
Los agaves pueden ser considerados como rosetas perennes porque requieren muchos años
para crecer y florecer; el crecimiento y la acumulación de reservas duran entre 8 a 20 años,
hasta conseguir el cambio del meristemo apical por meristemo floral, surgiendo una
superestructura, la inflorescencia. Algunos de ellos son poliploides estériles que rara vez o
nunca consiguen formar semillas viables; como es el caso de A. fourcroydes. El desarrollo de
hijuelos de rizoma a partir del tallo se presentan en la base y alrededor de las rosetas en la
mayoría de las especies. Otras especies nunca proliferan por hijuelos, algunas sólo cuando la
roseta es joven, mientras que otras lo hacen a lo largo de su vida, y aún otras sólo durante la
maduración, con la emergencia de la inflorescencia (Gentry, 1982).
Sin embargo, muchas de las poblaciones silvestres de agave se reproducen sexualmente con
la consecuente formación de semillas. Algunas veces en conjunción con bulbilos e hijuelos,
como en el caso de A. tequilana. Entonces, ambos tipos de reproducción tanto sexual como
asexual están disponibles en cada generación. Las flores protándricas indican
entrecruzamiento, pero algunas plantas han demostrado autofertilidad, como en el caso de A.
funkiana Koch and Bouche (Gentry, 1982).
Los agaves son plantas rizomatosas, de tallos acaules, de hojas grandes suculentas y fibrosas
que terminan en una espina, los márgenes de las hojas presentan pequeñas espinas
conocidas como dientes y de orientación variable; inflorescencia en espiga o panícula, con
escapo largo semileñoso; las flores son de color amarillo verdoso, protándricas con perianto
infundibuliforme de tubo de longitud variable y seis segmentos casi iguales, seis estambres
filiformes, con anteras amarillas, ovario ínfero, trilocular, tricarpelar, con placentación
5
axilar, multiovulado, fruto capsular leñoso alargado, dehiscente; con 3 alas con numerosas
semillas aplanadas algo triangulares y de testa negra. Los agaves son monocárpicos,
semélparos, esto es que sólo tienen una floración al final de la cual la planta muere. Son
plantas adaptadas a condiciones de aridez; las raíces someras y ramificadas, cutícula gruesa,
suculencia, estomas hundidos y metabolismo fotosintético del tipo CAM, son algunos de los
atributos que le permiten establecerse en zonas carentes de agua (Granados, 1993).
Figura 2. Inflorescencias de A. americana (arriba) y A. tequilana (abajo).
6
2.4. Diversidad genética
En Mesoamérica las especies de Agave fueron seleccionadas por el hombre, dando lugar a
nuevas combinaciones genéticas que pudieron analizar empíricamente enfocando sus
ventajas a la producción y calidad de fibra, alimento, bebida, y otros productos especiales. A
medida que se especializó la civilización, se especializó también al agave, seleccionando
características acorde a sus necesidades. Aunque no se conocía de genética, se fomentó en
gran medida la diversificación del agave (Gentry, 1982).
La familia Agavaceae con nueve géneros y 330 especies, es endémica de América; se
distribuye desde los límites entre Canadá y Estados Unidos hasta Bolivia, incluyendo las
islas del Caribe. El centro de mayor riqueza y diversidad del género Agave se encuentra en
México, donde se identificaron 251 especies, 76% de las descritas en el mundo, de las cuales
177 son endémicas, lo que corresponde al 70% (García-Mendoza, 2004). Los estados en los
que se encuentran representados al menos seis géneros de Agave son Oaxaca, Jalisco, Puebla
y Querétaro, siendo Oaxaca el estado más rico con 58 especies (García-Mendoza, 2004).
Con el transcurso del tiempo los agaves fueron seleccionados según las necesidades del
hombre, así algunas especies se convirtieron en fuente de materia prima para diferentes
industrias como el A. fourcroydes para la industria cordelera, el A. tequilana en la
producción de tequila y A. angustifolia, A.
americana y A. salmiana entre otros se
convirtieron importantes como materia prima para la producción de bebidas alcohólicas
como el mezcal.
En comparación con otros géneros y especies, el nivel de conocimiento de la diversidad
genética en Agave spp es limitado y se basa principalmente en características morfológicas y
citológicas (Gil-Vega et al., 2001). Los datos genéticos-moleculares que consideran la
estructura y variabilidad existente en las poblaciones de Agave son escasos.
Sin embargo, en un reciente estudio de la diversidad genética en seis poblaciones de agaves
pulqueros tales como A. salmiana var. Salmiana (manso), A. salmiana var. Ayoteco
(ayoteco), A. mapisaga (verde), del Nororiente del Estado de México, analizados por RAPD,
7
se encontró que el porcentaje total de loci polimórficos fue de 73.2%, pero dentro de las
poblaciones hubo una reducida variabilidad genética, con porcentajes de loci polimórficos
que variaron de 12.2% para el maguey ´Verde´ hasta 32.5% en los magueyes ´Manso´ y
´Ayoteco´ (Alfaro et al., 2007). En un estudio similar en A. angustifolia
Haw., la
variabilidad genética encontrada en tres poblaciones de maguey por medio de marcadores
moleculares tipo AFLP,
fue del 82.8% generando en promedio 78.6 marcadores por
combinación, el mayor polimorfismo se observó con la combinación ACG/CTT, alcanzando
un 96.1% de polimorfismo (Barraza-Morales et al., 2006).
En otro estudio de diversidad genética donde se utilizaron isoenzimas en A. victoriaereginae, se encontró un promedio de polimorfismo del 83 % en cada población, mientras
que entre diferentes poblaciones el nivel de diversidad era más alto. Este tipo de agaves son
especies diploides reproducidas principalmente por semillas (Martínez-Palacios et al., 1999).
En A. schotii la estructura genética está mantenida por efectos combinados de reproducción
clonal, longevidad clonal y limitada dispersión de semillas, lo que reduce considerablemente
la diversidad genética de la población (Trame et al., 1995). Por otro lado, se estimó una
depresión por endogamia del 25% para la producción de semillas, con una estructura
genética estrecha debido a la dispersión limitada y clonalidad en las poblaciones.
También, se realizaron estudios que sugieren variabilidad genética en las plántulas de agave
propagadas por reproducción asexual, en un estudio de diversidad genética realizado en A.
fourcroydes (Henequén) utilizando marcadores moleculares tipo AFLP demostraron que
existen diferencias en el genoma de la población; esta diferencia fue medida como cambios
en el patrón de bandas de AFLP de plantas de diversas poblaciones de la península de
Yucatán. Comparando el patrón de AFLP de dos plantas madre y de sus hijuelos, se
encuentra variabilidad genética en reproducción asexual. Se reportó un 83% de
polimorfismo entre hijuelos de rizoma de diferentes campos, y un 20.67% de polimorfismo
entre hijuelos de rizoma de la misma planta, debida posiblemente a mutaciones somáticas
que fueron acumuladas formando mosaicos sin relevancia ontogénica, pero que durante la
reproducción asexual fueron fijadas y transmitidas a la descendencia (Infante et al., 2003).
8
En un estudio posterior, González y colaboradores (2003), demostraron para A. fourcroydes
la conservación de las características morfológicas y los patrones de AFLP en plantas
micropropagadas por embriogénesis somática, concluyendo que las plantas micropropagadas
conservaron las características superiores de las plantas madre, aunque si reportaron un
19.99% de bandas polimórficas en las plantas micropropagadas. Se ha estudiado la
estructura genética de varias especies de este género, y los niveles de variación genética
parecen ser elevados dentro de cada población.
Sin embargo, se han realizado otros estudios que contrastan con los anteriormente
reportados. Gil-Vega y colaboradores (2001), realizaron estudios de diversidad genética en
A. tequilana azul usando RAPD. Encontraron una diversidad genética casi nula en una
población muestreada en el estado de Jalisco. La baja diversidad genética en los plantíos de
A. tequilana azul en el estado de Jalisco podría deberse a varias causas, según reporta
Valenzuela (1994): el uso de plantas propagadas asexualmente (súrculos o vástagos) para
establecer nuevas plantaciones y la preferencia por la variedad “azul”.
Respecto a la genética de poblaciones del género Agave, los datos disponibles indican que
en poblaciones silvestres los niveles de variación son elevados, y la endogamia es baja, y la
diferenciación entre poblaciones puede ser alta. En contraste, las especies cultivadas
prácticamente no presentan variación genética, seguramente resultado de las prácticas de
propagación vegetativa que se utilizan (Eguiarte et al., 2000)
2. 5. Biología reproductiva en el género Agave
La familia Agavaceae abarca nueve géneros con biologías de reproducción contrastantes, ya
que algunas especies pueden ser iteróparas (policárpicas) y los individuos se pueden
reproducir cada año, mientras otros son semélparas (monocárpicos) produciendo sólo una
inflorescencia espectacular en su vida, para después morir. Se ha sugerido que varias
especies de agave no presentan reproducción sexual, solo propagación vegetativa (Gentry,
1982). Esto es posible ya que algunas especies, principalmente del subgénero Agave del
9
norte de México y del sur de Estados Unidos, son poliploides. Sin embargo, existen otras
especies, como Agave vilmoriniana, que produce un número alto de bulbilos y semillas
viables (Szarek et al., 1996); otras son especies híbridas generadas por padres de diferentes
especies (Gentry, 1982).
La floración en el género Agave se reconoce por algunos cambios en la estructura foliar de
la roseta, que se extiende para captar más luz y empieza a perder turgencia por la pérdida de
humedad (Valenzuela, 1997) y se inicia el crecimiento rápido del eje floral como resultado
de la elongación del meristemo apical. En A. deserti desde que emerge la inflorescencia a
principios de marzo hasta el desarrollo de semillas viables a mediados de agosto, la
inflorescencia llega a crecer más de 16 cm por día, y alcanzar en promedio 3.6 metros de
altura y 1.25 kg de peso seco. La materia necesaria para generar la inflorescencia se
moviliza desde las hojas, las cuales pierden el 36% de su peso seco y 77% de su peso
húmedo, además de esto, se dan pérdidas de agua también por las ramas laterales de la
inflorescencia, así como por las flores cuando producen abundante néctar. Por lo tanto, la
pérdida de agua constante es alta en la reproducción sexual, comparada con la pérdida de
ésta en plantas con reproducción vegetativa.
Nobel (1977, 1988) estudió la capacidad fotosintética de las plantas al llegar el momento de
la reproducción y comparó las demandas de la inflorescencia en crecimiento, el movimiento
masivo de carbohidratos y otros materiales desde las hojas provoca la muerte de la planta
debido al tremendo gasto energético y de agua en un sólo periodo sexual.
Las especies estudiadas en el género comparten las siguientes características florales: 1) Sus
flores son grandes usualmente blanquecino-verdosas, amarillentas o a veces rojizas; 2) Los
tubos de las flores son más o menos cerrados; 3) El polen se produce al anochecer y los
estambres son exertos; 4) Se produce néctar abundante y diluido, principalmente de noche
con el cual atraen a diferentes polinizadores de acuerdo a la especie (Arizaga et al., 2000b);
5) Las flores duran varios días y son protándricas, en el primer día producen polen y en los
siguientes el estigma es receptivo y 6) Las especies son autocompatibles, pero presentan
intensa depresión por endogamia (Eguiarte, et al., 2000).
10
En Agave palmeri, las flores son nocturnas, y la dehiscencia de las anteras ocurre entre las
20 y las 22 horas. Howell y Roth (1981) consideran que su principal polinizador es el
murciélago nectarívoro Leptonycteris curasoae, además de otros insectos y aves. Sus datos
de polinizaciones controladas junto con los de Sutherland (1987) indican que la especie es
autocompatible, pero presentan una fuerte depresión por endogamia y está limitada por
polinizadores, ya que las polinizaciones manuales aumentan la fecundidad. Esta especie
tiene una producción de frutos del 16.6%. Otra especie en la que se ha estudiado la biología
reproductiva es A. macroacantha. La floración ocurre de mayo a julio y tiene una duración
promedio de 29 días en las rosetas individuales (Arizaga y Ezcurra, 2002). Las flores son
protándricas y la antesis ocurre en la tarde, después del tercer día de la apertura floral y los
pistilos maduran después del quinto día. La formación de frutos por autopolinización en ésta
especie es de 1.6%, mientras que en las cruzas intraespecíficas la producción de frutos
alcanzó un 19.5%. Por lo tanto, esta especie produce frutos y semillas casi exclusivamente
por entrecruzamiento y presenta un alto grado de autoincompatibilidad con una marcada
dependencia de los polinizadores nocturnos para su éxito reproductivo (Arizaga et al.,
2000a).
En un reciente estudio en A. angustifolia y A. subsimplex, Molina-Freaner y Eguiarte,
(2003) reportan que el éxito en establecimiento de frutos es en promedio de 30%, existiendo
una relación inversa con la producción de bulbilos. En los tratamientos de polinizaciones
reportan que los entrecruzamientos generan un mayor establecimiento de frutos y semillas
que los controles y las autofecundaciones manuales no generan fruto ni semillas, sugiriendo
que los polinizadores nocturnos como los murciélagos de la especie Leptonycteris curasoae
son importantes para el éxito reproductivo de A. angustifolia. A la fecha no se cuenta con
estudios sobre la biología reproductiva de A. tequilana ni A. americana.
2.6. Agave tequilana F.A.C.Weber var. azul
Es una de las especies que más importancia tiene en la agricultura del estado de Jalisco y por
tanto de México, debido a que es materia prima para la elaboración de la bebida
mundialmente conocida como tequila. La historia del tequila y otros destilados de agave se
11
inicia en el siglo XVI, cuando la población indígena que vivía en las estribaciones de los
volcanes de Colima sometió por primera vez a las bebidas fermentadas de agave al
destilador. Durante el siglo XIX, una de estas bebidas destiladas de agave que se producía en
la ciudad de Tequila, en el estado de Jalisco, se hizo famosa con el nombre de la localidad
en donde era elaborada (Walton, 1977).
Desde 1949, las Normas Oficiales de Calidad han estipulado que sólo las bebidas destiladas
producidas por la variedad conocida como Agave tequilana F.A.C.Weber var. azul pueden
ser llamados Tequila. El explosivo crecimiento de esta industria basada en una variedad, ha
tenido un efecto negativo en el cultivo de otras especies y variedades de agave (Valenzuela,
1994; 1997).
De acuerdo con información del Consejo Regulador del Tequila (CRT), el agave de la
variedad destinada a la producción de la bebida típica mexicana, solamente se puede
sembrar en el Territorio de Denominación de Origen (TDO) que consta de 181 municipios:
125 de Jalisco, ocho de Nayarit, siete de Guanajuato, 30 de Michoacán y 11 municipios de
Tamaulipas. Actualmente se cultiva una superficie de 120 mil hectáreas con alrededor de
504 millones de plantas de agave azul en el territorio de denominación según el último
inventario de agave realizado por el CRT en enero del 2008 (www.crt.org.mx).
Agave tequilana, presenta cierta resistencia a plagas y enfermedades, debido principalmente
a las características como: cutícula gruesa y cerosa en sus hojas y el porcentaje de fibra que
poseen. Sin embargo, si las condiciones ambientales no son las adecuadas para el cultivo, la
entrada de patógenos es relativamente fácil y la gran cantidad de azúcares almacenados en el
tallo propician la proliferación de éstos (Loera, 2000). Las principales enfermedades que
afectan a este cultivo son, el marchitamiento causado por Fusarium oxysporum que afecta
tanto a hojas, cogollo y piña, la pudrición del cogollo cuyo agente causal es Erwinia
carotovora, mancha anular causada por Didymosphaeria sp que lesiona las hojas reduciendo
la capacidad fotosintética y el crecimiento de la planta y la antracnosis causada por
Colletotricum sp. que provoca manchas hundidas y chancros que secan las hojas (CRT;
CESAVEG. Manuales técnicos). Recientemente se ha reportado que Thielaviopsis paradoxa
12
causa marchitamiento y muerte en más del 23% de plantas de A. tequilana en el estado de
Jalisco, atacando principalmente raíces y tallos (Sanchez, et al., 2007).
2.6.1. Propagación de Agave tequilana Weber var. azul
A.tequilana es una de las especies que se puede reproducir por las dos formas de
reproducción: vía sexual, con la formación de semillas y vía asexual formando hijuelos de
rizoma, bulbilos o por micropropagación de tejidos. Actualmente las grandes empresas
productoras de tequila, están utilizando la técnica de cultivo de tejidos in vitro para la
propagación masiva de plantas de A. tequilana.
2.6.2. Reproducción sexual
En plantas que florecen, el ciclo de vida reproductivo inicia con el cambio en el crecimiento
del meristemo de un modo vegetativo indeterminado a un modo de floración determinado
que lleva a la producción de semillas y frutos (O’Neill y Roberts, 2002). Los óvulos son los
precursores directos de las semillas y éstos juegan un papel central en la reproducción sexual
de las plantas y la nutrición de los humanos (Gasser et al., 1998).
La doble fecundación se realiza en el óvulo; esto involucra la fusión de las células
espermáticas con dos células específicas del gametofito femenino o saco embrionario, la
célula huevo y la célula central, los cuales van a dar origen al embrión y al endospermo de la
semilla respectivamente (O’Neill y Roberts, 2002).
Un botón floral es uno de los órganos más complicados en las plantas, y muchos procesos
morfológicos y bioquímicos son únicos a este órgano reproductivo (Lim et al., 1996), los
cuales son necesarios para la propagación por semilla y la generación de diversidad
genética.
2.6.2.1. Desarrollo del gametofito femenino en plantas.
La reproducción sexual en plantas depende de la formación de los gametos femenino y
masculino los cuales son haploides. El gametofito femenino tiene una función central en la
reproducción de las angiospermas (Shimizu et al., 2008). El patrón de desarrollo del
13
gametofito femenino en Arabidopsis es del tipo Polygonum el cual está presente en el 70%
de las angiospermas (figura 3) (Coimbra et al., 2007). En el óvulo de Arabidopsis thaliana,
usualmente un sólo megasporocito entra en meiosis y produce cuatro megasporas haploides,
tres de ellas entran en el programa de muerte celular programada, mientras que la megaspora
funcional se divide mitoticamente para dar origen al saco embrionario (figura 3a). Después
de tres ciclos de divisiones nucleares se tiene ocho núcleos (figura 3b), los cuales se
celularizan y diferencian en cuatro tipos celulares (figura 3c y 3d). La célula huevo como la
célula central son fertilizados por una célula espermática cada uno, formando el embrión y el
endospermo respectivamente. Las células gaméticas están flanqueadas por células
accesorias; dos sinérgidas, ubicadas en el zona micropilar, son el punto de entrada del tubo
polínico. Las sinérgidas son necesarias para la atracción del tubo polínico e inducen también
la liberación de las células espermáticas. La zona opuesta, está ocupada por tres células
antípodas que degeneran antes de la fertilización, cuya función aún no está clara (GroßHardt, et al., 2007).
a
c
b
d
Figura 3. Representación esquemática del desarrollo del gametofito femenino del tipo
Polygonum monospórico. a. Después de la meiosis, se forma la megaspora funcional
haploide. b. Sincitio octonucleado, resultado de tres divisiones mitóticas. c. Después de la
migración nuclear y celularización, se forma el gametofito femenino con siete células: en la
zona micropilar se encuentran una célula huevo (rojo) y dos sinérgicas (verde oscuro), con
dos núcleos polares, mientras que en la zona calazal, se encuentran tres células antípodas
(verde claro). d. Antes de la fertilización, los dos núcleos polares se fusionan y las células
antípodas degeneran.
14
2.6.2.2. Desarrollo del gametofito masculino en plantas.
Las principales características del desarrollo del polen se muestran en la figura 4, el cual se
basa en un análisis ultraestructural de la microesporogénesis en Arabidopsis (Owen y
Makaroff, 1995). El gametofito masculino o grano de polen, es un organismo tricelular
derivado de divisiones celulares. Su historia comienza dentro la antera, cuando las células
madre del polen entran en meiosis para formar tétradas, cada tétrada está unida por una
pared de callosa. Las microsporas son liberadas por la acción de la calasa, una enzima
producida por el tapetum, después del cual cada microspora entra en mitosis asimétrica,
porque el núcleo que se divide está adyacente a la pared, de tal manera que después de la
división, una célula es mucho más pequeña que la otra. Las dos células de este grano de
polen bicelular tienen distintos destinos celulares (McCormick, 2004). La célula más grande
es llamada célula vegetativa, y la pequeña es la célula generativa. La célula vegetativa no
vuelve a dividirse, mientras que célula generativa entra en mitosis para formar las céluas
espermáticas. El tiempo de la segunda mitosis varia en diferentes familias de plantas,
algunas veces ocurre dentro de las anteras (como en pastos y crucíferas), aunque más
comúnmente ocurre durante el crecimiento del tubo polínico.
15
Figura 4. Representación esquemática del desarrollo del gametofito masculino.
A. tequilana no se reproduce por via sexual, debido a su bajo porcentaje de germinación,
información que obedece a observaciones hechas en campo, no existen investigaciones
formales sobre la reproducción sexual y la generación de plantas a partir de semillas
(Valenzuela, 1997). Por otro lado las condiciones de germinación no son siempre adecuadas,
16
por lo que su reproducción es principalmente en forma asexual por hijuelos del rizoma
(Granados Sánchez, 1993).
A. tequilana Weber var. azul florece de los 6 a los 8 años de edad, dependiendo del lugar
donde se cultive, sus características genéticas y el tamaño del hijuelo plantado (Valenzuela,
1997). A la fecha no existen datos sobre la relación de frutos y semillas que producen, ni la
viabilidad de las semillas producidas.
Entre los pocos estudios que existe sobre el desarrollo de gametos tanto femenino como
masculino en agaves se encuentra el realizado por Piven et al. (2001) en A. fourcroydes y
A. angustifolia, quienes reportan que el gametofito femenino en estas especies se forma a
partir de dos megasporas viables ubicadas en la región micropilar (tipo bispórico). También
observaron que durante la megasporogénesis cuando la célula madre de la megaspora entra
en meiosis ocurre fragmentación cromosomal. Mientras que el gametofito masculino genera
granos de polen binucleares con baja viabilidad, que sólo llega al 0.5% y en medio de
cultivo ajustado con vitaminas incrementa al 1% en A. fourcroydes y al 3% en A.
angustifolia.
Por otro lado Ruvalcaba-Ruiz y Rodríguez-Garay (2002) observaron que las células madre
del polen de A. tequilana presentaban irregularidades meióticas que sugerían aberraciones
cromosómicas tales como deleciones y duplicaciones, intercambios entre cromátidas
hermanas e inversiones los cuales se ven reflejadas en la baja viabilidad de los granos de
polen.
2.6.3. Reproducción asexual
Es aquella que no implica el proceso sexual, tanto las hojas como los tallos y las raíces
pueden llevar a cabo la reproducción vegetativa en varios tipos de plantas. Los individuos
obtenidos de este tipo de reproducción constituyen un clon, y estos clones a excepción de las
mutaciones espontáneas, son genéticamente idénticas a la planta madre (Loera, 2000). La
forma más conocida de reproducción asexual en agave es mediante la formación de hijuelos
17
de rizoma, usada ampliamente por los agricultores. Existe otra forma de reproducción
asexual, que es la formación de bulbilos en las inflorescencias que se desarrollan cuando la
producción de frutos es baja o nula (Valenzuela, 1997).
Existen siete especies que producen bulbilos en forma silvestre: A. angustifolia, A.
fourcroydes, A. murpheyi, A. sisalana, A. wercklei, A. vilmoriniana y A. macroatanta de
éstas, cuatro especies además producen semillas no germinables, (Szarek et al., 1996), una
quinta especie A. vilmoriniana además de producir gran cantidad de bulbilos produce
copiosas cantidades de semilla viable pero no produce hijuelos de rizoma. Por otro lado, A.
tequilana sólo produce bulbilos cuando se inducen por medio de la eliminación de sus
flores, en condiciones naturales sólo produce frutos con semillas. Hasta el momento se
desconoce la fisiología y la biología del desarrollo de bulbilos, que podrían ser importantes
para evaluar su impacto en la reproducción del género Agave.
2.6.4. Citogenética de Agave tequilana
Existen varios estudios sobre citogenética del género Agave (Doughty, 1936; Palomino, et
al., 2003); sin embargo, son pocos los estudios realizados específicamente en A. tequilana.
El primer análisis citogenético de A. tequilana fue realizado por Banerjee y Sharma (1987),
quienes estimaron el DNA nuclear en diferentes especies y variedades de agave incluido el
de A. tequilana reportando el número somático de cromosomas como 2n=90. Sin embargo,
en estudios posteriores Castorena-Sánchez et al., (1991) y Cavallini et al., (1996) reportaron
que A. tequilana era una especie diploide con 60 cromosomas. Años después esto fue
confirmado por Palomino et al., (2003) quienes estimaron el tamaño del genoma nuclear en
diferentes variedades de A. tequilana incluido la variedad azul, confirmando que es diploide
(2n=2x=60) y que variedades de la misma especie tienen diferentes niveles de ploidía; tal es
el caso de la variedad bermejo que es triploide y chato que es tetraploide.
18
2.6.5. Bioquímica del Agave tequilana
Agave tequilana Weber presenta un metabolismo ácido de las crasuláceas (CAM) al igual
que otros agaves. Cerca del 87% de la fijación del
CO2 ocurre en la noche y está
acompañada por un incremento en la acidificación de los tejidos. La máxima acumulación
ácida nocturna se da cuando las temperaturas día/noche fluctúan entre 25ºC/15ºC
aproximadamente. También existe un incremento en la acidez nocturna cuando incrementa
la radiación fotosintéticamente activa sobre las hojas, logrando hasta un 90% de acidez. Por
otro lado la sequía reduce la acumulación ácida en 50% después de 7 días y hasta 90%
después de 30 días. Esta especie tiene poca tolerancia a las temperaturas bajas y limitada
capacidad de aclimatación a estas temperaturas (Pimienta-Barrios et al., 2007).
2.6.6. Estudios moleculares en Agave tequilana
Recientemente se están realizando estudios a nivel molecular para entender las bases
genético moleculares de esta especie en diferentes campos, como es la identificación de
genes involucrados en la síntesis de fructanos, como la sacarosa 1-fructosiltransferasa,
enzima clave en formación de azucares de reserva, que fue identificado y caracterizado por
Ávila Fernández et al. (2007). Por otro lado se tiene secuenciado alrededor de 30 mil ESTs
de diferentes órganos de A. tequilana como son las hojas, el tallo o piña, la raíz, el
meristemo apical, los ovarios, las anteras y los bulbilos, (http://mazorka.ira.cinvestav.mx)
los cuales son parte de varios proyectos de investigación que tienen la finalidad de
identificar y caracterizar genes involucrados en diferentes funciones biológicas que realiza
esta especie.
2.6.7. Retrotransposones en Agave tequilana
Recientemente ha sido publicado un reporte sobre el aislamiento y la caracterización de
retrotransposones tipo Ty1-copia en A. tequilana Weber var. azul para el desarrollo de
marcadores moleculares tipo SSAP aplicado al análisis filogenético de esta especie,
encontrando un 96% de polimorfismo dentro de agave con el cebador Teq1 y un 41%
19
representan inserciones únicas en las accesiones de Agave. También se encontró la
existencia de bandas únicas para una accesión en particular, sugiriendo que Teq1 ha estado
activo a través de la evolución de Agave de un antecesor común (Bousios et al. 2007).
2.7. Agave americana L. var. americana
Agave americana, que es cultivado en distintos climas alrededor del mundo, fue la primera
especie de Agave que fue descrita científicamente (Granados, 1993). Las flores de A.
americana, son caracterizadas por un ovario corto afilado; los tépalos externos son gruesos,
carnosos y alargados, y los tépalos ligeramente internos más pequeños (Gentry, 1982).
2.7.1. Reproducción de Agave americana L. var. americana
El tipo de reproducción que presenta esta especie es por medio de hijuelos de rizoma y
algunas veces por semillas y no existen reportes de bulbilos (Gentry, 1982; Granados, 1993;
Arizaga 2002). A. americana florece después de 10 años de crecimiento en tierras con
climas cálidos y puede tardar de 35 años o más en florecer si se encuentra en climas fríos
(Irish e Irish, 2000).
2.8. Marcadores moleculares como herramientas para detectar variabilidad genética
En sentido amplio, un marcador molecular es cualquier característica química o molecular
medible, que es heredada según un modelo Mendeliano simple. En sentido más restringido,
los marcadores moleculares son segmentos de ADN que se consideran como marcas o
puntos de referencia para el análisis del genoma. Estos segmentos usualmente tienen
variantes o sitios polimórficos que pueden ser identificados empleando diferentes estrategias
y técnicas. Los marcadores moleculares o marcadores del ADN revelan sitios de variación
de la secuencia de ADN. A diferencia de los marcadores morfológicos, las variaciones no se
muestran por sí mismas en el fenotipo, porque pueden tener diferencias en un sólo
nucleótido del gen en una secuencia repetitiva del ADN. El uso de técnicas moleculares
permite la estimación de la diversidad genética dentro de especies y entre ellas para estudios
20
poblacionales, clasificación de germoplasma y mejoramiento e identificación de genes
(Rodríguez y Arencibia, 2002).
El desarrollo y subsiguiente aplicación de marcadores moleculares ha incrementado
grandemente el número de marcadores que pueden ser identificados entre dos progenitores y
por consecuencia aumentar el poder del análisis genético en plantas como en animales. Los
marcadores moleculares han revolucionado el análisis genético de plantas de cultivo donde
juegan un rol central en el análisis de ligamientos, mapeos físicos, análisis de QTL (de
quantitative trait loci) y selección asistida por marcadores (Syed, et al., 2005).
La detección y análisis de la variación genética puede ayudar a entender las bases
moleculares de varios fenómenos biológicos en plantas. Debido a que muchas especies de
plantas no son cubiertas por proyectos de secuenciación, los marcadores moleculares y su
correlación a fenotipos proveen información para la elucidación de la variación genética.
Dentro de los diferentes tipos de marcadores moleculares que existen están los RFLP (de
restriction fragment length polymorphism), los RAPD (de random amplified polymorphic
DNA), los SSR (de simple sequence repeats) y los AFLP (de amplified fragment length
polymorphism), las cuales son técnicas usadas rutinariamente en estudios genéticos de
ecología, evolución, taxonomía y filogenia en plantas. Estas técnicas están bien establecidas
y sus ventajas como desventajas han sido analizadas. En años recientes, nuevas clases de
técnicas avanzadas están emergiendo principalmente de la combinación de técnicas básicas,
aumentando su sensibilidad y la resolución. Las nuevas técnicas de marcadores también
utilizan nuevas clases de elementos de DNA tales como los retrotransposones,
microsatélites, y marcadores basados en DNA de mitocondrias y cloroplastos, revelando
variación genética incrementada del genoma (Agarwal, et al., 2008).
Recientemente uno de los marcadores más ampliamente usando está basado en
retrotransposones
y
conocido
como
SSAP
(de
sequence-specific
amplification
polymorphism); este sistema explota el polimorfismo insercional de los fragmentos repetidos
terminales (LTR) de los retrotransposones presentes en todo el genoma.
21
2.8.1. Polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP)
AFLP es una técnica que combina PCR y análisis de fragmentos de restricción para detectar
polimorfismos debidos a cambios en el genoma (Simpson, 1997).
La técnica consiste en la amplificación de múltiples regiones arbitrarias del genoma (Vos et
al., 1995). Se basa en la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción de ADN
ligados a adaptadores; utiliza cebadores con la secuencia complementaria al adaptador en el
extremo 5’e involucra cinco etapas: 1. Digestión del ADN genómico con dos enzimas de
restricción: una de corte raro EcoRI (que reconoce secuencias de 6 nucleótidos) y otra de
corte frecuente MseI (que reconoce secuencias de 4 nucleótidos) generando pequeños
fragmentos de ADN. 2. Ligación de adaptadores específicos de doble cadena a los extremos
de los fragmentos de ADN generados por digestión. 3. Pre-amplificación, en el cual dos
oligonucleótidos complementarios a los extremos de los adaptadores-ligados con un
nucleótido preseleccionado en el extremo 3’es empleado para amplificar las regiones que
contienen el sitio de unión al oligonucleótido y al sitio de restricción. 4. Amplificación
selectiva en el cual los oligonucleótidos complementarios con tres o cuatro nucleótidos extra
en el extremo 3’ de los oligonucleótidos de la pre-amplificación, son empleados para
amplificar subgrupos de los templados pre-amplificados. 5. Los fragmentos resultantes de la
segunda amplificación, se desnaturalizan para que puedan ser visualizados por electroforesis
en geles de poliacrilamida.
El polimorfismo detectado por la presencia o ausencia de bandas es debido a las mutaciones
en los sitios de restricción ó por inserciones o deleciones dentro de los fragmentos
amplificados.
Los AFLP son marcadores moleculares confiables y reproducibles. El número de
polimorfismos por reacción identificado por AFLP es mucho más alto que aquéllos
realizados por RFLP o RAPD. Además, no es necesario predeterminar las secuencias de
ADN genómico y se puede usar para organismos procarióticos y eucarióticos (Lin y Kuo,
1995).
Las ventajas que ofrece la técnica (Gil-Vega, 1997) sobre otras son:
22

Reproducibilidad y robustez

No requiere conocimiento previo del genoma

El número de polimorfismos detectado por esta técnica es mucho mayor que en
otras.
2.8.2. Polimorfismo en la amplificación de secuencias específicas (SSAP).
Los retrotransposones con repetidos terminales largos (LTR) de son una clase de elementos
genéticos móviles que han sido aprovechados para el desarrollo de marcadores moleculares
en plantas. Los retrotransposones se mueven y replican en todo el genoma del hospedero vía
intermediarios de ARN. Los LTR de retrotransposones están presentes como poblaciones
heterogéneas grandes en todos los genomas de la plantas y muestran grandes variaciones en
el número de copias y en la localización del genoma entre especies estrechamente
relacionadas. El polimorfismo en la amplificación de secuencias específicas (SSAP) es el
método de marcadores moleculares basado en transposones más usado actualmente (Waugh
et al., 1997). Este método explota la variación generada por el movimiento de los
retrotransposones y revela más altos niveles de polimorfismo entre individuos que los
marcadores tipo AFLP en cebada, chicharos, trigo y alfalfa (Waugh et al., 1997; Kalendar et
al., 1999; Queen et al., 2004). El método SSAP es similar a los AFLP pero usa sólo un
cebador adaptador y el otro es un cebador anclado a una secuencia de un LTR de un
retrotransposon (Kalendar et al., 1999).
2.8.3. Polimorfismo en la amplificación de regiones Inter-Retrotransposon (IRAP).
Otro método que aprovecha la inserción y la dispersión de los retrotransposones en el
genoma de las plantas es el conocido como IRAP. Este método, a diferencia del anterior, no
requiere la digestión del genoma por enzimas de restricción; por lo tanto, se basa en la
amplificación de secuencias que se encuentran entre dos retrotransposones, lo
suficientemente cerca para ser amplificados. Este método tiene muchas ventajas sobre los
23
AFLP, se obtiene mayor distribución cromosomal y además permite detectar ambos alelos
en individuos heterocigotos (Kalendar et al., 1999).
2.9. Elementos transponibles en plantas
Los elementos transponibles fueron descubiertos en plantas debido a los fuertes efectos
sobre la estructura del genoma y función genética. Aunque sólo pocos o ninguno de los
elementos están activos en el genoma, ellos pueden causar cambios en su estructura cuando
se activan. Todos los tipos de elementos están presentes en todas las especies de plantas,
pero sus contribuciones cuantitativas y cualitativas son enormemente variables entre linajes
muy relacionados. En algunas plantas con genomas grandes, los elementos móviles
componen la mayoría del genoma nuclear. Ellos pueden rearreglar genomas y alterar la
estructura genética individual y regular algunas funciones que ellos promueven como la
transposición, inserción, escisión, cambios cromosómicos y recombinación ectópica.
Muchos genes pueden haber sido sobre-expresados o amplificados por la acción de los
elementos transponibles y por lo tanto la mayoria de los genes tienen el legado de múltiples
elementos transponibles (Bennetzen, 2000). Los cambios cromosómicos puede llevar a la
infertilidad en la progenie heterozigótica; los elementos transponibles pueden ser también
responsables de la incompatibilidad que se genera en diferentes poblaciones de plantas.
Todos los elementos transponibles comparten dos propiedades básicas: la primera es la
habilidad para moverse de un lugar a otro en el genoma y la segunda es la habilidad para
amplificar el número de copias dentro el genoma vía su transposición. Existen dos grandes
clases de elementos transponibles: los transposones y los retrotransposones (Bennetzen,
2000) y más recientemente otro grupo de elementos móviles llamados helitrones, que se
replican por círculo rodante (Kapitonov y Jurka, 2001).
24
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Estudiar la biología reproductiva y analizar la variabilidad genética producida por
reproducción sexual y asexual en Agave tequilana Weber var. azul.
3.2. Objetivos específicos
•
Generar plantas híbridas por medio de cruzas interespecíficas entre A. tequilana y A.
americana, así como cruzas intraespecíficas.
•
Caracterizar los diferentes estados de desarrollo del gametofíto femenino y
masculino de A. tequilana y A. americana.
•
Analizar y comparar la diversidad genética de plantas generadas de semillas de
polinización abierta con plantas híbridas por medio de AFLP.
•
Analizar la diversidad genética de ambos tipos de reproducción asexual.
•
Explorar la actividad de elementos móviles como un posible mecanismo para
producir variación somática en individuos propagados asexualmente.
25
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Material vegetal.
Se trabajó con seis plantas de A. tequilana (At1, At2, At3, At4, At5, At8) provenientes de un
campo de cultivo ubicado en Pénjamo y una planta de A. americana (Aa), las cuales
alcanzaron la madurez y desarrollaron la inflorescencia simultáneamente hasta la formación
de semillas. Las plantas se encontraban localizadas en el jardín del CINVESTAV, Campus
Irapuato, a una distancia de 2 a 15 m. entre las plantas de A. tequilana y 100 m. de distancia
de éstas con A. americana (ver croquis, figura 5). Los tratamientos de polinización se
realizaron entre los meses de junio y julio del 2003 y 2004. Los datos del número de
umbelas, cápsulas y semillas por planta fueron posteriormente recolectados entre los meses
de noviembre y diciembre antes de la dispersión de las semillas.
Bulbilos. Se trabajó con bulbilos que se indujeron en la planta At8 cortando los botones
florales antes de su apertura. Los bulbilos emergen de los meristemos de pedúnculos florales
hasta desarrollar plántulas que van desde 5 a 15 cm de longitud. Estos fueron colectados,
plantados en macetas y mantenidos en invernadero.
Hijuelos. Se recolectaron muestras de hijuelos de la planta At8, los cuales se encontraban
próximos a la planta progenitora, se congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a -80°
C.
4.2. Determinación del número de flores, frutos y semillas en plantas de polinización
abierta de A. tequilana y A. americana.
El número total de flores, frutos y semillas fue estimado para cada planta polinizada
naturalmente. El número de flores formados en cinco umbelas para A. tequilana y de 3
umbelas para A. americana fueron contados. Todas las umbelas se encontraban en la parte
media de la inflorescencia. Después de las polinizaciones abiertas, los frutos producidos
también fueron contados. Basados en el número de umbelas de cada planta, se realizó una
estimación del número total de flores y frutos para cada planta. Los frutos fueron dejados en
la inflorescencia hasta estar completamente secos y de color café; sólo entonces fueron
26
N
PLANTA
At4
15 m
PLANTA
At5
PLANTA
At2
3.2 m
PLANTA
At3
2.1 m
PLANTA
At1
CAMINO DE ENTRADA A CINVESTAV U.I.
Figura 5. Croquis de localización de las plantas progenitoras en el jardín del CINVESTAV - UNIDAD IRAPUATO
27
recogidos. La estimación del número de semillas negras por planta fue realizada contando el
número de semillas negras de diferentes frutos tomados al azar para cada planta dejada a la
polinización abierta.
4.3. Procedimientos de polinización
Se realizaron cuatro diferentes tratamientos a cada una de las plantas escogidas tanto en A.
tequilana y A. americana.
a. Autopolinización. Las anteras fueron removidas de botones florales cerrados los cuales
fueron inmediatamente cubiertos con bolsas de papel hasta que los estigmas fueran
receptivos lo cual ocurre en un periodo entre 5 y 6 días después de la emasculación. Después
de este periodo de tiempo, se colectaron anteras con granos de polen maduros de alrededor
de 10 flores de la misma planta inmediatamente antes de la polinización y usando un pincel
el polen fue transferido a los estigmas maduros los que se caracterizan por presentar las
papilas húmedas y los lóbulos abiertos. Las flores polinizadas fueron nuevamente cubiertas
y dejadas hasta el desarrollo de frutos. El mismo procedimiento fue llevado a cabo tanto
para A. tequilana como para A. americana.
b. Polinización cruzada. Las cruzas intraespecíficas fueron llevadas a cabo entre diferentes
plantas de A. tequilana en ambos sentidos, directas como recíprocas de la siguiente manera:
At3 como progenitor materno por At5 como progenitor paterno y su recíproco, At5 como
progenitor materno y At4 como progenitor paterno. Las cruzas interespecificas fueron
llevadas a cabo entre plantas de A. tequilana y una planta de A. americana.
El procedimiento fue esencialmente el mismo que las cruzas intraespecíficas, con la
excepción del uso de granos de polen de otra especie.
c. Polinización abierta. En este grupo, las umbelas fueron marcadas y dejadas para la
polinización natural.
28
d. Emasculación sin polinización. Como control, en este experimento las anteras fueron
removidas de botones florales cerrados los cuales luego fueron cubiertos con bolsas de papel
para evitar la polinización.
4.4. Germinación de semillas.
Las semillas negras de los experimentos anteriores fueron lavadas con agua destilada tres
veces con agitación suave y dejadas remojando por 30 min. Luego fueron escarificadas
cortando la región micropilar con un bisturí para aumentar la eficiencia de germinación; en
estas condiciones, las semillas fueron puestas sobre algodón húmedo e incubadas a 28° C en
oscuridad por 3 a 4 semanas. Las semillas de la planta At1 se germinaron sin escarificación.
Las plántulas obtenidas por semilla, fueron puestas en macetas y mantenidas en invernadero
bajo condiciones controladas. El número de semillas germinadas para cada tratamiento de
polinización varió. En el caso de las polinizaciones abiertas, había muchos frutos
disponibles por lo tanto se escogieron al azar 20 frutos de cada planta y sus semillas fueron
germinadas por separado permitiendo la comparación de la viabilidad de semillas de
diferentes frutos al igual que para las autofecundaciones. Para las cruzas inter e
intraespecíficas, las semillas de todos los frutos disponibles fueron germinadas juntas y la
viabilidad de semillas de diferentes frutos no fue comparada.
4.5. Estudios histológicos
Se colectaron botones florales de entre 20 mm a 60 mm de desarrollo y se dividieron en dos
partes. La parte superior que contiene las anteras fue usada para estudiar el desarrollo del
gametofito masculino y la parte inferior que contiene los óvulos, fue usada para el análisis
de los gametos femeninos en desarrollo.
Los óvulos fueron extraídos individualmente bajo un estereo-microscopio y fijados por 24 h
en solución FAA conteniendo los 10: 50: 5: 35 volúmenes de formaldehído al 40%, etanol
al 95%, ácido acético glacial y agua destilada, respectivamente. Luego fueron transferidos a
etanol al 70%, para posteriormente ser clareados con soluciones de metil salicilato y etanol
por periodos sucesivos de una hora en los siguientes volúmenes 3:1, 1:1, 1:3 y metil
29
salicilato concentrado al final, respectivamente. Luego los óvulos fueron observados y
fotografiados usando un microscopio de contraste de interferencia Leica DMR.
Las anteras fueron obtenidas de botones florales de entre 20 mm a 30 mm de desarrollo, por
la técnica de “squash”, mediante la cual los granos de polen fueron teñidos con DAPI (4’, 6Diamidina-2-fenilindol) y observados usando un microscopio de fluorescencia Olympus
BX60.
Un total de 100 anteras y 100 óvulos de diferentes flores y de diferentes plantas fueron
analizados.
4.6. Viabilidad del polen
La viabilidad fue evaluada por la germinación in vitro de los granos de polen por el método
de la gota colgante. Para esto, los granos de polen recolectados el mismo día fueron puestos
sobre el medio conteniendo 2% de glucosa, 200 mg/L cloruro de calcio, 0.06% de ácido
bórico, 2 mg/L de glicina y adicionado con las siguientes vitaminas: 0.05 mg/L de ácido
fólico, 0.5 mg/L de tiamina, 0.5 mg/L de ácido nicotínico, 0.5 mg/L de piridoxina y 0.05
mg/L de biotina ( Piven et al., 2001), e incubadas a temperatura ambiente.
Los granos de polen fueron observados al microscopio cada 15 min hasta determinar el
tiempo en el que empiezan a germinar y sólo los tubos polínicos largos fueron considerados
viables.
4.7. Análisis por citometría de flujo
Con el propósito de confirmar el nivel de ploidía de plantas de A. tequilana por medio de su
contenido genómico se realizó el análisis de citometría de flujo en 4 plantas de un campo de
cultivo ubicado en el municipio de Irapuato; para esto se muestrearon 3 hojas de la parte
más externa a la interna con el fin de estimar el contenido de ADN nuclear y el nivel de
ploídia que estas presentaran. El análisis fue realizado según Otto (1990) con las mismas
modificaciones descritas por Dolezel y Göhde (1995).
El citómetro de flujo usado para estimar el contenido de ADN fue un Partec CA II (Partec
GmbH, Münster, Germany). Se pesaron 120 mg de hoja de agave y 25 mg de hoja de maíz
30
el cual se utilizó como control; estas cantidades se depositaron en una caja Petri con 1 ml de
solución Otto 1 (Otto, 1990) inmediatamente se picaron finamente ambos tejidos con una
hoja de afeitar, la suspensión se filtró en mallas de 50 µm, se incubó por 10 min a
temperatura ambiente y se centrifugó a 1000 rpm por 3 minutos. Después de decantar, los
núcleos que se depositaron en la pastilla se lavaron con 1 ml de solución de Otto 1 y se
volvieron a centrifugar como arriba se menciona. Finalmente los núcleos fueron mezclados
con 500 µl de solución Otto 1, 2 ml de solución Otto 2 (Otto F., 1990), 125 µl de ARNasa
1mg/ml y se tiñeron con yoduro de propidio. Esta mezcla se filtró y se leyó en el citómetro
de flujo; entre 11000 y 16000 núcleos fueron analizados en cada muestra. Los promedios de
los picos, las áreas y los coeficientes de variación fueron calculados usando el software
DPAC (Partec). El tamaño del genoma nuclear fue calculado con la siguiente fórmula:
Promedio pico Go/G1 muestra
Contenido de 2C ADN muestra = ----------------------------------------- x contenido de 2C ADN estándar (pg)
Promedio pico Go/G1 estándar
El estándar interno fue seleccionado de acuerdo al nivel de ploidía de la variedad azul, en
este caso fue maíz con 2C ADN = 5.433 pg para A. tequilana var. azul. Para saber si
existieron diferencias significativas entre las distintas plantas o entre las hojas de la misma
planta se realizó un análisis de varianza.
El estudio se realizó en 4 plantas y de cada planta se analizó 3 hojas con 3 réplicas cada una.
4.8. Extracción de ADN genómico de hojas de agave
La extracción de ADN de hojas de A. tequilana es por si dificultosa por el hecho de
presentar altas concentraciones de azúcares y fibra junto con otras sustancias como
saponinas y esteroides. Sin embargo, basados en el protocolo descrito por Doyle y Doyle
(1989) y con algunas modificaciones pudimos obtener un ADN de buena calidad para
empezar con el análisis molecular. Una de las modificaciones fue empezar la extracción con
3.5% de CTAB en vez de 2.5% y posteriormente precipitar el ADN con 500 µL de acetato
de amonio 7M y 500 µL de isopropanol en vez de isopropanol sólo. Los lavados finales
también deben de hacerse con una mezcla de etanol al 70% con acetato de amonio, seguidos
31
de dos lavados sólo con etanol al 70%, de ésta manera se obtendrá un ADN libre de
sustancias indeseadas, esto se comprueba corriendo el ADN en un gel de agarosa al 1% y
teniendo la relación de absorbancia a 260/280 nm de longitud de onda, obtenido al ajustar la
concentración a 100 ng/µL en el Nanodrop®.
4.9. Análisis por marcadores moleculares tipo AFLP (Polimorfismo en la Longitud de
los Fragmentos Amplificados)
Los análisis moleculares para estudiar la variabilidad genética sexual (semillas) como
asexual (hijuelos y bulbilos) de A. tequilana fueron realizados por la técnica de AFLP de
acuerdo a Vos et al. (1995), con algunas modificaciones que se detallan abajo y usando el
analizador de ácidos nucleícos LI-COR Biosciences, IRDye™ Fluorescent.
La técnica consta de los siguientes pasos:
1) Digestión de ADN genómico
Para la digestión se tomó1 µL de ADN a una concentración de 100 ng/µL, 0.5 µL de Eco RI
10U/µL, 0.3 µL de Mse I 10U/µL, 1.25 µL de buffer RL 10X y se llevó con agua
desionizada estéril a un volumen final de 12.5 µL, se mezcló y se incubó a 37° C por 3
horas. Luego, se inactivaron las enzimas a 70° C por 15 min.
2) Ligación de adaptadores
Los fragmentos resultantes de la digestión se ligaron en ambos extremos a unos adaptadores
específicos, añadiendo 0.3 µL del adaptador EcoRI /EcoRI a una concentración de 5 pmol,
0.3 µL del adaptador MseI/MseI a una concentración de 50 pmol, 1.2 µL de ATP 10 mM,
1.2 µL de buffer RL 10 X, 0.5 µL de la enzima T4 ligasa 10 U/µL y finalmente se ajustó a
un volumen total de 12.5 µL con agua desionizada estéril. La reacción se realizó a 16° C
toda la noche.
32
3) Preamplificación
Se realizaron diluciones 1:10 de las ligaciones anteriores y se transfirieron 2.5 µL de la
dilución a tubos de PCR en hielo; a éstos se adicionaron oligonucleótidos más una base
selectiva Eco RI + A y Mse I + A de 50 ng/µL cada uno, dNTPs 0.2 mM, 0.2 µL de Taq
ADN polimerasa 10U/µL, 2.5µL de buffer 10 X de la taq ADN polimerasa, 0.75 µL de
MgCl2 (50 mM), y agua desionizada estéril hasta alcanzar un volumen total de 23.5 µL. Las
condiciones de PCR fueron las siguientes: 94° C por 30s, 56° C por 1min y 72° C por 1 min
y una temperatura final de mantenimiento de 4° C.
4) Amplificación selectiva
Se realizaron diluciones 1:40 de la amplificación previa y se transfirieron 2 µL de esta
dilución a tubos de PCR, donde se añadieron dNTPs 0.2 mM, 0.2 µL de Taq ADN
polimerasa 10U/µL, 1µL de buffer 10 X de la Taq ADN polimerasa, 0.3 µL de MgCl2 (50
mM) y oligonucleótidos más cuatro bases selectivas para MseI el cual no estaba marcado y
más tres bases selectivas para Eco RI marcado con IRDye que emite fluorescencia a 700 nm
y otro que emite fluorescencia a 800 nm; se añadió agua desionizada estéril para alcanzar un
volumen final de 11 µL y se mezcló cuidadosamente, trabajando siempre en este paso en
oscuridad para evitar la exposición de la luz a los oligonucleótidos que son fotosensibles.
Las combinaciones de oligonucleótidos se especifican en la Tabla 1.
33
Tabla 1. Combinación de oligonucleótidos usados en los AFLP
OLIGONUCLEÓTIDO SIN
OLIGONUCLEÓTIDO
MARCAR
MARCADO
Mse I + AGTC
Eco RI + ACA (700 nm)
Mse I + AGTC
Eco RI + AGC (800 nm)
Mse I + ACCC
Eco RI + ACA (700 nm)
Mse I + ACCC
Eco RI + AGC (800 nm)
Las condiciones de PCR fueron: 94° C por 30 s, 65° C por 30 s y 72° C por 1 min (1 ciclo).
94° C por 30 s, seguido por un gradiente que empieza en 65° C y baja cada ciclo 0.7° C, 72°
C por 1 min, esto por 12 ciclos. Luego, 94° C por 30 s, 56° C por 30 s y 72° C por 1 min
hasta alcanzar 23 ciclos.
5) Desnaturalización
Se adicionaron 3 µL de muestra y 2 µL de “blue stop”, se incubaron a 94° C por 3 min con
una temperatura final de mantenimiento de 4° C, inmediatamente se pusieron las muestras
en hielo y se corrió un gel de poliacrilamida al 6.5%; las imágenes se capturaron
automáticamente en la computadora.
6) Gel de poliacrilamida
Se preparó un gel de poliacrilamida al 6.5%, con urea 8 M y TBE 1 X (Tris 1 M, ácido
bórico 1 M, EDTA 20 mM pH 7.0); la separación de los fragmentos se realizó en la cámara
de electroforesis del secuenciador de ADN marca LI-COR. Los tiempos y las condiciones de
pre-corrida y corrida fueron los siguientes: pre-corrida de 13 a 20 minutos aproximadamente
34
a 200 V con el amortiguador TBE 0.5 X hasta alcanzar 30 mA. Después se cargó 0.2 µL de
cada muestra desnaturalizada, en los carriles de los extremos se cargó la misma cantidad de
marcador de peso molecular de 50 pb. La corrida se llevó a cabo en un tiempo de 3 horas a
1500 V, 40 W y 40 mA.
4.10. Análisis de datos
Los fragmentos o bandas obtenidos por medio del software SAGA del secuenciador fueron
reportados en una matriz de signos (+) y (-) con la cual se identificó la presencia de banda
como (+) y la ausencia de banda como (-), posteriormente se realizó un reemplazo de los
signos (+) por (1) y (-) por (0), con la ayuda del programa Microsoft® Word 2000;
finalmente se importó esta matriz al programa Microsoft® Excel 2000, con el formato
requerido para continuar con el análisis.
Los datos obtenidos fueron analizados calculando la similitud genética con los índices de
Simple Matching y Sokal y Sneath 1, (Skroch et al., 1992) y el análisis de agrupamiento para
construir el dendrograma a partir de esta matriz de similitud genética se realizó utilizando el
método de promedio aritmético de grupos de pares no ponderados (UPGMA) con la ayuda
del programa de computo FreeTree (Hampl et al., 2001) con el cual también se realizó un
análisis de remuestreo para obtener los índices de confianza “bootstrap” realizando 1000
réplicas.
4.11. Análisis por marcadores moleculares tipo IRAP (Inter-Retrotransposon Amplifed
Polimorfism).
Para identificar la presencia de retrotransposones en A. tequilana, se realizaron análisis
moleculares tipo IRAP (Kalendar et al., 1999), para lo cual se partió de 50 ng/µL de ADN
genómico para realizar un IRAP-PCR utilizando 0.12 µM del oligonucleótido 3’LTR
específico de BARE (cebador específico de retrotransposon) de cebada del grupo copia Ty 1
de retrotransposones, cuya secuencia es 5’-TGTTTCCCATGCGACGTTCCCCAACA-3’
35
0.2 mM dNTPs, 0.2 µL de Taq ADN polimerasa 10 U/µL, 2 µL de buffer 10 X de la Taq
ADN polimerasa, 0.75 µL de Mg Cl2 (50 mM), y agua desionizada estéril hasta alcanzar un
volumen total de 23.5 µL. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94° C por 2 min,
94° C por 30 s, 40° C por 1 min con un aumento de 0.5° C en cada ciclo y 72° C por 2 min
con un incremento de 0.3 s por ciclo y 72° C por 10 min, con una temperatura final de
mantenimiento de 4° C. Los productos de amplificación fueron observados en geles de
agarosa al 1%.
4.12. Aislamiento, clonación y transformación de productos de amplificación
procedentes de IRAP.
Para el aislamiento de las secuencias amplificadas por IRAP se utilizó el protocolo del kit
Qiaquick Gel Extracción de Quiagen. La clonación se realizó en el vector PCR II-TOPO 4
de Invitrogen y se transformó en células de E. coli DH5 electrocompetentes. La extracción
de ADN plasmídico se realizó siguiendo el protocolo de Birnboim clásico (Birnboim y
Dolly, 1979). Se secuenciaron 10 clonas de este ADN plasmídico y se realizaron los análisis
bioinformáticos para encontrar homologías en la base de datos del NBCI por medio de
“BLAST” a nivel nucleótidos y proteínas.
4.13. Análisis por marcadores moleculares tipo SSAP (Specific Sequence Amplified
Polymorphisms)
Para determinar el nivel de polimorfismo en base a la distribución de retrotransposones en el
genoma de bulbilos de A. tequilana, se realizaron análisis tipo SSAP como se describe en
Syed y Flavell (2006) con algunas modificaciones; para esto se partió de 600 ng/µL de ADN
genómico de buena calidad, el cual fue digerido con 10 U/µL de las enzimas de restricción
Eco RI y Mse I, se dejó incubando toda la noche a 37° C. Para inactivar las enzimas se
incubó a 80º C por 20 min. Para verificar los patrones de digestión se corrió un gel de
agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Para ser válidas, todas las muestras deben
mostrar patrones de digestión completos y similares. Si existen patrones de digestión
diferentes, es necesario revisar la calidad del ADN y repurificar el ADN.
36
La ligación de adaptadores se realizó para cada muestra del ADN digerido de la siguiente
manera, a 25 µL de ADN digerido se añadió 0.5 µL de adaptador Eco RI/Eco RI de 5
pmol/µL y 0.5 µL de adaptador Mse I/Mse I de 50 pmol/µL, 3 µL de ATP 10 mM y 10
U/µL de T4 ADN ligasa. Se dejó incubando a 16º C toda la noche. Se inactivó la ligasa a 65º
C por 10 min. El ADN ligado se almacenó a -20º C.
Utilizando estos fragmentos de ligación de secuencia conocida como templados se realizó la
primera amplificación con el primer Eco RI/A con una base selectiva y Mse I/A también con
una base selectiva a una concentración de 100 ng de ADN, 2.5 µL de buffer PCR (10 X), 0.5
µL de dNTPs 10 mM ,0.2 µL de taq ADN polimerasa de 5 U/µL , 0.75 µL de cloruro de
magnesio y agua destilada estéril lo suficiente para completar a 23 µL más 2 µL del ADN
digerido y ligado.
Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 1 min a 95º C, 1 ciclo; 1 min a 94º C, 1
minuto a 60º C, 1 min a 72º C por 30 ciclos. Para finalizar se incubó la reacción por 7 min a
72º C. Se verificó la presencia de los productos de amplificación usando una alícuota de 5
μl.
De los productos amplificados se realizó una dilución 1:20 la cual
se utilizó para la
amplificación selectiva con el cebador específico para amplificar retrotransposones marcado
con fluorescencia Teq1 (5´-GATTGTAACCTTGGGCCAACAG-3´) a una concentración de
1 pmol/μl, y el primer sin marcar fue Eco RI con dos bases selectivas (Eco RI/AA). Las
condiciones de PCR utilizadas fueron las mismas de Vos et.al. (1995). Los fragmentos
amplificados fueron separados en gel de secuenciación de poliacrilamida al 6.5% y
visualizados por medio del software SAGA del secuenciador.
4.14. Búsqueda de retrotransposones en la base de datos de Agave
Se realizó la búsqueda de retrotransposones en la base de datos de ESTs de Agave tequilana
depositados en Mazorka. Esto se realizó con el lenguaje MySQL, por medio de variables
que se introducen en la sección consultar la base de datos. Esto nos permite buscar la
información en las tablas blast-hit y blastclu, proporcionando información sobre todos los
hits encontrados en la base de datos de Agave.
37
5. RESULTADOS
5.1. Producción de frutos y semillas en plantas de polinización abierta de A. tequilana y
A. americana
El número de umbelas por planta fue determinado y con base en los datos de 5 umbelas de
cada planta para el caso de A. tequilana (At) y 3 umbelas para A. americana (Aa), el número
de flores, frutos y semillas por planta fue estimado. El número estimado de flores por
umbela varió entre las 3 plantas de At estudiadas, de 283 ± 100.9 para At2 hasta 444 ± 43.4
para At3 con una media general de 352.6 ± 82.6 flores por umbela. El número de flores por
planta para At fue estimado en promedio en 12,341 con un intervalo entre (9,450-15,232).
En el caso de Aa el número de flores por umbela fue de 295.3 ± 51.6 y el estimado de flores
por planta fue en promedio en 8,268 con un intervalo de variación de 6,823 hasta 9,712
flores/planta.
Los datos presentados en la tabla 2 muestran que, sólo en promedio el 17.24% de las flores
dejadas para la polinización abierta son convertidas en fruto en At y el 8.80% en Aa
(asumiendo que cada flor tiene el potencial para desarrollar un fruto). No se encontraron
diferencias estadísticamente significativas en el número de semillas por fruto entre las 3
plantas de At estudiadas F = 0.37, df = 2, P = 0.68, mientras que entre polinizaciones
abiertas y autofecundaciones en el número de semillas por fruto, las diferencias son muy
significativas F = 17.82, df = 3 P<0.00001. Lo mismo ocurre en el caso de Aa cuando
comparamos el número de semillas obtenidas de polinización abierta con las obtenidas por
autofecundaciones, existen diferencias altamente significativas F = 12.02, df = 1, P =
0.00084. Los frutos de At de polinización abierta, contenían principalmente semillas
abortivas, arrugadas y blancas, con una pequeña proporción de aproximadamente 10% de
semillas negras de apariencia normal como se muestra en la figura 6a. Los frutos de Aa
también contenían una alta proporción de semillas blancas de tamaño y forma normal los
cuales se encontraban vacíos, con solo un 11% de semillas negras de apariencia normal
(figura 6b).
38
Tabla 2. Producción de frutos y semillas en polinización abierta de Agave tequilana (At) y Agave americana (Aa). Los datos son
promedios ± SD. N = número de umbelas; n = número de frutos.
Plantas
Flores/umbela
Flores/planta
At2 N = 5
283.0 ± 100.9
9,056 (5,827-12,284)
At3 N = 5
444.0 ± 43.4
16,428 (14,822-18,033)
At4 N = 5
330.8 ± 32.6
11,908 (10,735-13,082)
Media
At
352.6 ± 82.6
12,341 (9,450-15,232)
295.3 ± 51.6
8,268 (6,823-9,712)
Aa N = 3
Fruitos/planta
Producción
Frutos (%)
1,299 (883-1,715)
14.34 %
3,071 (2,216-3,925)
18.69 %
2,116 (1,429-2,804)
17.76 %
60.8 ± 21.2
2,128 (1,386-2,870)
17.24 %
26 ± 5,5
728 (574-882)
8.80 %
Frutos/umbela
40.6 ± 13.0
83.0 ± 23.1
58.8 ± 19.1
Semillas/fruto
24.33 ± 9.04
n = 18
26.76 ± 9.35
n = 17
27.22 ± 13.10
n = 18
26.10 ± 1.55
36.70 ± 9.28
n = 78
Semillas/planta
31,604 (19,485-42,867)
82,179 (49,136-110,556)
57,597 (29,624-84,640)
55,540 (52,241-58,838)
26,936 (16,744-37,128)
39
No se observaron frutos que contuvieran sólo semillas blancas y arrugadas, parece ser
necesaria para el desarrollo del fruto, tanto en At como en Aa, que se desarrolle al menos
una semilla negra. Las semillas de At son opacas a diferencia de las semillas de Aa que son
Figura 6. Semillas de agave. a. Fruto y semillas de Agave tequilana. b.
Fruto y semilla de Agave americana. c. Semillas opacas de Agave
tequilana (izquierda) y semillas brilantes de Agave americana (derecha).
d. Comparación de semillas sin embrión ni endospermo (izquierda) y
semillas normales (derecha).
brillantes (figura 6c). Las semillas lisas y brillantes de Aa tienen elevados niveles de
germinación en comparación a las semillas negras de At que presentan bajos niveles de
germinación debido principalmente a que sus semillas se encuentran vacías, es decir, sin
embrión ni endospermo (figura 6d).
40
5.2. Producción de frutos y semillas obtenidos por medio de cruzas.
Para determinar la eficiencia de producción de semillas bajo diferentes condiciones de
polinización, cuatro diferentes eventos de polinización fueron estudiados. Una umbela por
planta fue usada para cada tratamiento de polinización y los porcentajes de frutos formados
fueron determinados con base en el número de flores por umbela (ver tabla 3 y 4). Cuando
las flores fueron emasculadas y cubiertas para evitar la polinización, ningún fruto fue
formado en At ni en Aa, las flores sin polinización abortaron masivamente indicando que la
polinización manual estuvo bien controlada y que éstas especies no desarrollan semillas sin
polinización.
Las autofecundaciones tanto en At como en Aa presentaron bajos niveles de frutos, como de
semillas por fruto (tabla 3). Los porcentajes de frutos formados en relación al número de
flores observadas en cada umbela el número de semillas negras por fruto para cada cruza
fueron bajos, en comparación con las muestras de polinización abierta como se muestra en la
tabla 4. La cruza At5 × At4 dío los porcentajes más altos de frutos (15.78%) de todos los
eventos de polinización, mientras que la cruza At3 × Aa formó el número más alto de
semillas negras por fruto de todas las cruzas realizadas (23.70 ± 11.14).
Todas las cruzas interespecíficas con At como progenitor materno formaron mayor número
de semillas negras por fruto en comparación con las cruzas intraespecíficas (tabla 4). En
contraste, el porcentaje de frutos y el número de semillas negras formadas con Aa como
progenitor materno fueron los más bajos comparados con su cruza recíproca existiendo
diferencias significativas F = 13.06, df = 1, P = 0.0035 en el número se semillas por fruto
entre At3 × Aa y Aa × At3.
41
Tabla 3. Porcentaje de producción de frutos y semillas por fruto formados en
autopolinización en Agave tequilana (At) y Agave americana (Aa). Los datos son promedios
± SD. N = número de flores autopolinizadas; n = número de frutos.
Autopolinización
Frutos (%)
At5 N = 315
6,66
Aa N = 94
4,25
Semillas/fruto
8.55 ± 2.92
n = 20
12.25 ± 9.42
n=4
Tabla 4. Porcentaje de producción de frutos y semillas por fruto formados en diferentes
eventos de polinización en Agave tequilana (At) y Agave americana (Aa). Los datos son
promedios ± SD. N = número de flores con polinización manual; n = número de frutos.
Cruzas
Intraespecificas
Frutos
(%)
At3×At5 N = 206
9.70
At5×At3 N = 139
13.66
At5×At4 N = 57
15.78
Semillas/fruto
13.60 ± 3.30
n =10
5.20 ± 1.61
n = 10
4.66 ± 1.58
n=9
Cruzas
Interespecificas
Frutos
(%)
At3×Aa N = 328
12.19
At4×Aa N = 81
9.87
At5×Aa N = 263
9.12
Aa×At3 N = 168
2,38
Aa×At4 N = 91
2,19
Semillas/fruto
23.70 ±11.14
n = 10
12.62 ± 5.60
n=8
16.50 ± 6.70
n = 10
3.00 ± 1.40
n=4
5.50 ± 6.00
n=2
5.3. Viabilidad de las semillas
Por otro lado, para determinar si las semillas negras obtenidas de los diferentes tratamientos
de polinización y las obtenidas por polinización abierta eran viables, se escogieron al azar
semillas de diferentes frutos las cuales fueron germinadas. En principio se germinaron
semillas provenientes de polinización abierta de A. tequilana (At1) dando una eficiencia de
germinación del 9.1%. Basados en previos reportes donde Peña-Valdivia et al. (2006)
42
describen los efectos de la vernalización y escarificación sobre la eficiencia de germinación,
se decidió escarificar las semillas, cortando la testa de la zona micropilar para las plantas
At2, At3 y At4. Durante el proceso de escarificación observamos que ciertas semillas negras
de At se encontraban vacías, es decir, no presentaban embrión ni endospermo, ver figura 6d.
Esta fue la principal causa de los niveles de viabilidad tan bajos presentados en At; sin
embargo, también se encontraron semillas negras que contenían embrión y endospermo pero
fueron inviables y no germinaron.
En este trabajo mostramos el incremento de la germinación, en semillas de polinización
abierta de At hasta un 40% con la escarificación, siendo que sólo el 9.1% de las semillas
germinan sin escarificar en At1 (figura 7a). Por otro lado, las semillas de Aa mostraron
porcentajes altos de germinación (>80%) comparados con las semillas de At provenientes de
polinización abierta, como se muestra en la figura 7a.
Las semillas producidas por autofecundaciones tanto de At5 como de Aa mostraron altos
niveles de viabilidad (>60% para At5 y >90% para Aa, figura 7a). Para las cruzas
intraespecíficas, la cruza reciproca entre At3 y At5 produjo números similares de semillas
viables, vacías e inviables; sin embargo, en la cruza At5 × At4 aumentó ligeramente la
viabilidad de las semillas con respecto a las anteriores cruzas (figura 7b). Para las cruzas
interespecíficas, se observó una marcada diferencia en la viabilidad de las semillas
dependiendo de que especie sea usada como progenitor femenino. En todas las cruzas que
tienen como progenitor femenino a At, más del 80% de las semillas se encontraban vacías y
bajos niveles de viabilidad fueron observados. Sin embargo, cuando la planta de Aa fue
progenitor femenino, bajos niveles de semillas vacías e inviables fueron encontrados y los
niveles de germinación alcanzaron hasta 60% (figura 7b). Esto demuestra, que la relación
directa o inversa de las cruzas interespecíficas altera fuertemente la viabilidad de las
semillas.
43
120
a
100
80
Semillas viables
60
Semillas vacias
Semillas inviables
40
20
0
At1
n=469
At2
n=443
At3
n=492
At4
n=479
Polinización Abierta
Aa
n=709
At5
n=91
Aa
n=49
Autopolinización
120
100
b
80
Semillas viables
Semillas vacias
60
Semillas inviables
40
20
0
At3xAt5 At5xAt3 At5xAt4 At3xAa At4xAa At5xAa AaxAt3 AaxAt4
n=100 n=98
n=36 n=196 n=93 n=197 n=11
n=12
Cruzas intraespecíficas
Cruzas Interespecíficas
Figura 7. Porcentaje de germinación de semillas y porcentaje de semillas vacías e inviables
bajo diferentes eventos de polinización en Agave tequilana y Agave americana. a. En
polinización abierta y autofecundaciones. b. En cruzas intraespecíficas e interespecíficas.
n = número de semillas que se germinaron.
44
5.4. Análisis histológico del desarrollo de los gametofitos
Para determinar si la producción de semillas vacías o sin embrión en At y Aa se debía al no
desarrollo de los gametos nos dimos a la tarea de estudiar el desarrollo del gameto femenino
y masculino. Previamente, el desarrollo de los gametos de Agave ha sido estudiado por
Wunderlinch (1950) y posteriormente Dalgren y colaboradores (1985) reportan el tipo de
desarrollo de gametos femenino y masculino en el género Agave en forma general, más
recientemente Piven y colaboradores (2001) describen el desarrollo de los gametos en A.
fourcroydes y A. angustifolia. Para proveer información y para intentar identificar posibles
errores en el desarrollo de los gametos femeninos como masculinos, se realizó un estudio
histológico tanto en At como en Aa, así como la determinación de la viabilidad de los granos
de polen.
5.4.1. Desarrollo del gametofito femenino.
El proceso de desarrollo del gametofito femenino en At y Aa empieza con la diferenciación
de la célula madre de la megaspora del tejido nucelar (figura 8a y b), la cual entra en
divisiones meióticas para dar lugar a una tétrada de megasporas haploides (figura 8c), donde
las tres megasporas de la zona micropilar degeneran y sólo se desarrolla la que se encuentra
en la zona calazal llegando a ser la megaspora funcional (figura 8d). Por lo tanto, dado su
desarrollo el gametofito femenino en At y Aa se considera como de tipo Polygonum
monospórico. Posteriormente el núcleo de la megaspora funcional sufre tres rondas de
divisiones mitóticas (figura 8e-f) con la consecuente formación de la pared celular,
formando las 7 células típicas del desarrollo del gametofito femenino tipo Polygonum.
En este estudio también se observó que entre 2-5% de los óvulos de At no producen
gametofito maduro. En lugar de este se observaron células nucelares alargadas (figura 8g).
Por el contrario, este fenómeno no fue observado en Aa. Por otro lado, en un intento por
estudiar el patrón de desarrollo del embrión en At, nos dimos a la tarea de realizar
polinizaciones y observar los óvulos fertilizados en diferentes
estados de desarrollo,
constatando de esta manera que el tubo polínico penetra por la zona micropilar al óvulo,
45
llevando consigo las células espermáticas (figura 9a). Al cabo de 72 horas se observa un
proembrión en la zona micropilar del saco embrionario (figura 9b). Esto nos sugiere que los
óvulos son fecundados; sin embargo, después de las 72 horas no se logró observar
desarrollo del embrión, por el contrario, se vieron sacos embrionarios con evidente
degeneración posiblemente debido a aberraciones cromosómicas que generan el desarrollo
de semillas sin embrión ni endospermo; esto se debe posiblemente al aborto de éstas en
etapas tempranas del desarrollo, esto fue observado al escarificar las semillas, en la zona
micropilar se encontraban vestigios de lo que seria el endospermo.
El desarrollo del gametofito femenino en A. americana también se lo puede clasificar como
tipo Polygonum monospórico, debido a la presencia de tétradas después de la segunda
división meiótica, condición que sólo se da en el desarrollo monospórico (figura 10).
46
Figura 8. Megasporogénesis y desarrollo del saco embrionario de A. tequilana. a. Óvulo
mostrando integumento interno (Ii), integumento externo (Oi), saco embrionario (Es), nucela
(N). b. Célula madre de la megaspora (Mmc). c. Tétrada linear (T). d. Desarrollo de la
megaspora funcional (Fm) y megasporas degeneradas (Dm). e. Saco embrionario mostrando
los núcleos polares (Pc). f. Saco embrionario mostrando las sinérgidas (S) y célula huevo
(Ec). g. Óvulo sin saco embrionario.
47
a
b
Figura 9. Óvulos de At con tubos polínicos. a. Introducción del tubo polínico en la zona
micropilar del óvulo. b. Formación del proembrión después de 72 horas de fecundación.
Figura 10. Desarrollo del gametofito femenino en A. americana. a. Tétrada (T). b. Saco
embrionario después de la primera mitosis. c. Saco embrionario mostrando 2 sinérgidas (S)
y la célula huevo (Ch) en zona micropilar. d. Zona calazal con 3 antípodas (A) y 2 núcleos
polares (Np).
48
5.4.2. Desarrollo del gametofito masculino.
El desarrollo del gametofito masculino en At
como en Aa es esencialmente el mismo.
Después de las divisiones meióticas de las
células madre del polen, se forman tétradas en
forma tetragonal, lo que demuestra que la
microsporogénesis
es
el
tipo
sucesivo,
formando células haploides (figura 11a, b, d),
las
cuales
al
estar
separadas
forman
microsporas uninucleadas (figura 11c), después
los núcleos de las microsporas entran en
sucesivos ciclos de divisiones mitóticas.
Como resultado de la primera división mitótica
se forman dos células, la célula generativa que
está muy cercana al núcleo vegetativo (figura
11e). Los granos de polen de A. tequilana
presentan abertura disulcada y ornamentación
reticulada (figura 11f) al igual que los granos de
polen de A. americana. En una segunda división
mitótica la célula generativa da lugar a dos células espermáticas. Esto ocurre dentro del tubo
polínico en desarrollo de granos de polen maduros.
Figura 11. Desarrollo del gametofito masculino. a. Primera división meiótica de una célula
madre del polen donde se observan los cromosomas (c). b y d. Formación de tétradas
haploides tetragonales (t), se observa microsporas disulcadas (s). c. Microsporas
uninucleadas (Mu). e. Microspora binucleada con el núcleo vegetativo (Vn) estrechamente
relacionado a la célula generativa (Gc). f. Granos de polen maduros disulcados con
ornamentación reticulada.
En el caso de A. americana, se puede observar microsporas unicleadas haploides como
resultado de divisiones meióticas y granos de polen binucleadas resultado de la primera
mitosis (figura 12).
49
Figura 12. Granos de polen de A. americana. a. Microspora uninucleada. b y c. Granos de
polen binucleados. d. Grano de polen mostrando ornamentación reticulada y disulcada con
germinación del tubo polínico.
5.5. Viabilidad de los granos de polen
Para determinar la viabilidad de los granos de polen producidos por las plantas de At y Aa,
se realizaron ensayos de germinación del tubo polínico in vitro. Los granos de polen
empiezan a desarrollar el tubo polínico a los 30 minutos en medio de germinación tanto para
At como Aa (figura 13a). Alrededor del 36 ± 5.9 % de los granos de polen de At y 79.5 ±
3.6 % de Aa germinaron en estas condiciones (tabla 5). Después de 1.5 horas de crecimiento
en medio de germinación, los tubos polínicos empezaron a eliminar todo el contenido
citoplasmático (figura 13b). Por otro lado cuando se germinaron granos de polen
almacenados por más de 24 horas, se observaron tubos polínicos aberrantes (figuras 13c y d)
50
que dieron porcentajes de germinación mucho
más bajos comparado con polen fresco, que
oscilaron entre 11% y 54% para At y Aa,
respectivamente. En la figura 13e se puede
observar el tubo polínico en crecimiento
llevando
en
su
interior
las
células
espermáticas.
Figura 13. Germinación de los granos de
polen de A. tequilana. a. Grano de polen
germinando a los 30 minutos. b. Granos de
polen después de 1.5 horas. c y d. Granos de
polen aberrantes. e. Grano de polen
germinado y mostrando las células
espermáticas. Tubo polínico (Pt), células
espermáticas (Sc).
Tabla 5. Porcentajes de germinación de tubos polínicos de A. tequilana (At) y A. americana
(Aa) in vitro
Conteo 1
Conteo 2
Conteo 3
Promedio
Polen con
germinación
At
Polen sin
germinación
At
% de
germinación
en At
Polen con
germinación
Aa
Polen sin
germinación
Aa
% de
germinación
en Aa
109
142
89
113.33
237
187
169
197.66
31.5
43.0
34.5
36.33±5.9
87
97
92
92.00
28
20
23
23.66
75.6
82.9
80.0
79.5±3.6
5.6. Análisis morfológico y genético de las cruzas inter e intraespecíficas
Los experimentos de polinización descritos anteriormente sugieren que los niveles de
contaminación con polen desconocido fueron nulos, debido a que las flores emasculadas y
sin polinización abortaron. Sin embargo, para confirmar que las cruzas intra e
interespecificas fueron exitosas se realizó un análisis de marcadores moleculares usando
51
AFLP de las plantas progenitoras y las muestras de la progenie F1. Un ejemplo de estos
resultados para la cruza At5 × Aa se muestra en la figura 14. Como se puede observar,
nuevas combinaciones de bandas exclusivas de uno u otro progenitor se encuentran
presentes en la progenie, indicando que ellos llevan información genética de ambos
progenitores debido al éxito de la reproducción sexual.
Por otro lado, las plántulas obtenidas de cruzas intra e interespecíficas, autofecundaciones y
polinización abierta, han sido crecidas en condiciones de invernadero alrededor de 3 años.
En general, las plantas obtenidas por autofecundaciones son más pequeñas y menos
vigorosas comparadas a las obtenidas por polinización abierta o de cruzas.
Las plantas provenientes de semillas de
polinización abierta y crecidas en
invernadero presentaron 2 fenotipos
bien marcados: uno propio de A.
tequilana,
donde
las
hojas
son
lanceoladas (largas y delgadas) de
color verde azulado, con espinas
pequeñas retrorsas (dirigidas hacia la
base); el otro, muestra el fenotipo de
A. americana con hojas anchas de
color verde claro y espinas rojas
grandes, principalmente la espina
Figura 14. Análisis de AFLP mostrando genotipos recombinantes de plantas obtenidas de
semilla. a. Cruza interespecífica entre A. tequilana (At5) y A. americana (Aa). C6, C7, C9 y
C11 indican las plantas obtenidas de diferentes semillas. b. Cruza intraespecífica entre A.
tequilana (At5) y A. tequilana (At4). C1, C2 y C4 indican las plantas obtenidas de diferentes
semillas. Las flechas blancas indican alelos paternos y las fechas negras alelos maternos.
terminal. Estos resultados demuestran que en la polinización abierta las flores de A.
tequilana pueden ser polinizadas con polen de A. americana y de esta manera formar
semillas híbridas en forma natural. Al igual que otras especies de Agave, A. tequilana
52
combina la hibridación y la reproducción asexual como estrategias evolutivas y de
adaptación.
Todas las plantas obtenidas de cruzas intraespecíficas, presentaron el fenotipo característico
de A. tequilana, donde las hojas son lanceoladas de color verde azulado; por el contrario,
todas las plantas provenientes de cruzas interespecíficas presentaron rasgos fenotípicos
característicos de A. americana, incluyendo las cruzas ínterespecificas donde At es el
progenitor materno, lo que confirma que se puede obtener semillas híbridas de la cruza de
At con Aa (figura 15).
Figura 15. Plantas de Agave tequilana de tres años crecidas de semillas de plantas
polinizadas por diferentes tratamientos. a. Plantas mostrando los siguientes fenotipos: 1.
Planta de A. tequilana obtenida por auto-polinización. 2. Planta de A. tequilana obtenida por
polinización abierta. 3. Cruza inter-especifica A. tequilana × A. americana. 4. Cruza intraespecífica A. tequilana × A. tequilana. b. Acercamiento del tratamiento 3 mostrando las
hojas anchas y la espina terminal robusta características de A. americana; Tt, espina
terminal.
5.7. Análisis por citometría de flujo
Debido a la confusión en el nivel de ploidia que presentaba A. tequilana donde los escasos
reportes difieren (Banerjee y Sharma, 1987; Castorena-Sánchez et al., 1991; Cavallini et al.,
1996; Palomino et al., 2003) y donde las aberraciones cromosómicas durante la meiosis han
sido reportadas en varias especies (Piven et al., 2001, Ruvalcaba y Rodríguez, 2002),
podrían explicar los bajos porcentajes de semillas viables observados en nuestro estudio. Por
tal motivo, realizamos el análisis del nivel de ploidía que presentaba esta especie.
53
El análisis por citometría de flujo confirma que A. tequilana es una especie diploide. El
análisis simultáneo de núcleos aislados de hojas de Agave, así como del control interno, en
este caso de maíz, generó un histograma del contenido relativo del ADN, en el que nos
muestra la generación de dos picos G1 dominantes (picos1 y 2) los cuales corresponden a
maíz y agave respectivamente; el pico 3 representa los núcleos que se encuentran en la fase
G2 de maíz, la fase G2 de agave prácticamente no existe debido a que las divisiones
celulares en Agave son muy lentas (Palomino et al., 2003) (figura 16). La cantidad de 2C
ADN, calculada con base en el promedio de picos de las tres hojas de cada planta se
resumen en la tabla 6. Mediante estas mediciones pudimos determinar que no existen
diferencias significativas en el contenido de ADN nuclear entre diferentes plantas de un
campo de cultivo, ni en la posición que presentan las hojas en una planta. Por otro lado, con
base en el contenido de ADN nuclear también se pudo estimar el tamaño del genoma de A.
Número de núcleos
tequilana, que en promedio es de 4077 Mpb (tabla 7).
Contenido relativo de ADN
Figura 16. Estimación del contenido de ADN nuclear en plantas de cultivo de Agave
tequilana usando citometría de flujo. Se muestra un análisis simultáneo de núcleos aislados
de Agave tequilana y maíz el cual fue usado como un control interno. Los picos 1 y 2
representan los núcleos en fase G1 de maíz y Agave tequilana. El pico 3 representa los
núcleos en fase G2 de maíz.
54
Tabla 6. Contenido de ADN nuclear en hojas de Agave tequilana analizadas por
citometría de flujo. Los datos corresponden a promedios ± E.S.
Contenido de ADN nuclear 2C (pg) (x±e.s.)
Planta/Hoja
Hoja1
Hoja2
Hoja3
Planta-1
8.256 ± 0.196
8.187 ± 0.114
8.290 ± 0.079
Planta-2
8.402 ± 0.166
8.203 ± 0.001
8.365 ± 0.097
Planta-3
8.220 ± 0.032
8.201 ± 0.107
8.447 ± 0.037
Planta-4
8.425 ± 0.172
8.382 ± 0.112
8.475 ± 0.054
Tabla 7. Estimación del tamaño del genoma de Agave tequilana con base en su
contenido de ADN nuclear por medio de citometría de flujo. Los datos corresponden
a promedios ± E.S.
Planta
Nivel de ploidia
Contenido de ADN
nuclear 2C(pg)(x±e.s.)
¹
Tamaño del genoma
(Mpb)¹
Planta1
2x
8.2443 ± 0.129
4039
Planta2
2x
8.3236 ± 0.088
4078
Planta3
2x
8.2894 ± 0.071
4061
Planta4
2x
8.4277 ± 0.112
4129
1pg = 980 Mbp¹ (Bennett et al., 2000)
5.8. Variación genética sexual de Agave tequilana Weber var. azul analizado por AFLP
Para determinar el nivel de diversidad genética y el nivel de entrecruzamiento que existe
entre los individuos provenientes de semillas obtenidas de polinización abierta, se analizaron
55
cuatro plantas progenitoras de A. tequilana con su respectiva progenie. Las plántulas
germinadas de semillas fueron tomadas al azar y analizadas; se estudiaron 17 plántulas de la
planta progenitora 1 (At1), 14 plántulas de la planta progenitora 2 (At2), 16 de la planta
progenitora 3 (At3) y finalmente de la planta progenitora 4 (At4), se analizaron 15 plántulas.
Los AFLP nos muestran perfiles de variación entre individuos de diferentes plantas
progenitoras. Para At1 se analizaron 385 marcadores de los cuales 257 fueron polimórficos
con un 67% de polimorfismo; esta planta se encontraba a 2.1 metros de distancia de la planta
At2 la cual presentaba el mismo estado de floración que At1. Sin embargo, At2, mostró que
de los 385 marcadores obtenidos, solo un 56% de ellos fueron polimórficos, indicando que
en esta planta la autofecundación fue evidente, como se muestra en la figura 17 donde las
distancias genéticas son estrechas entre las plántulas S18, S9, S7, S6, S13, S12 y su
progenitor At2. Por otro lado, las plantas progenitoras At3 y At4 las cuales se ubicaban a 3.2
m de distancia entre ellas y 15 m de distancia de At1 y At2 presentaron patrones similares de
polimorfismo, ya que de los 324 marcadores analizados para cada planta progenitora, 186
fueron polimórficos para el caso de At3 (57% de polimorfismo) y 219 para At4 (67% de
polimorfismo).
Como se puede ver en la figura 18 (dendograma general), la progenie de las 4 plantas se
encuentra distribuida de manera dispersa entre ellas sin haber un claro agrupamiento por
planta progenitora, lo que indica que en A. tequilana se favorece fuertemente la polinización
cruzada, a excepción de At2, que se encuentra agrupada con algunos individuos
provenientes de ésta, lo que sugiere que también ocurren autofecundaciones. En la figura 18,
se observa dos agrupamientos bien definidos con distancias genéticas similares: el grupo I,
donde se encuentra la progenie de At1 y At2 y el grupo II, donde se encuentra la progenie de
At3 y At4, lo que demuestra que en condiciones de polinización abierta la cercanía de
plantas de A. tequilana que se encuentran en sincronía de floración garantizan la formación
de semillas por entrecruzamiento entre diferentes individuos.
56
P1S17
P1S6
P2S102
P1S3
S8P2S
P1S5
10
100
62
58
60
P1S1
P2S17
P1S9
P1S11
P1S4
42
36
28
34
P1S12
P1S10
P2S3
P2S15
P1S2
P2S5
P1S16
P2S8
21
P1S20
P2S12
P2S13
44
44
30
63
P2S1
P2S2
P1S7
P1S8
58
58
0.7
0.8
P2S6
P2S7
P2S9
P2S18
PM2
P1S18
P1S19
0.9
1.0
Coeficiente de similitud
Figura 17. Dendrograma de semillas de polinización abierta plantas At1 y At2 obtenido con
el programa FreeTree y utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con
análisis de remuestreo bootstrap. P1S1-20, P2S1-19: progenie obtenida de semillas de At1 y
At2. PM2-Muestra directa de At2 (ver croquis figura 5).
57
PM3
P1S17
P4S8
P3S3
P4S17
P1S5
P1S11
100
P1S12
P1S4
P1S10
13
P1S2
P1S20
P1S16
P2S12
100
P2S13
I
P2S6
35
36
47
16
P2S7
P2S9
P1S18
40
P1S19
P2S18
44
PM2
24
P1S7
P2S8
P2S1
55
P2S2
56
P2S3
25
25
P2S5
P2S15
37
P2S17
P1S8
25
P1S9
P1S1
21
P1S3
P4S5
P4S2
35
P3S10
P3S1
30
P4S6
P3S8
P4S4
PM4
42
II
P3S15
23
P3S14
P3S2
P4S16
23
P3S6
P3S9
20
P3S12
17
P3S17
P3S7
13
34
P4S1
P3S13
P4S3
22
23
P3S11
32
P3S18
P4S12
96
62
47
P4S15
P1S6
15
P2S10
P4S18
68
0.7
P4S13
P4S9
P3S16
0.8
P4S20
0.9
1.0
58
Figura 18. Dendrograma de semillas de polinización abierta plantas At1, At2, At3 y At4
obtenido con el programa FreeTree utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al.,
1992) con análisis de remuestreo bootstrap. P1S1-20, P2S1-19, P3S1-18, P4S1-20:
progenie obtenidos de semillas de At1, 2, 3 y 4. PM2, 3, 4-Muestra directa de At2, 3y 4 (ver
croquis figura 5).
5.8.1. Análisis genético de cruzas intra e interespecíficas.
Para el análisis genético de los híbridos obtenidos a través de las cruzas dirigidas, se
tomaron al azar muestras de plántulas de 2 meses de edad. Se obtuvieron las huellas
genéticas de las siguientes cruzas intraespecíficas: At5 × At3, At3 × At5 y At5 × At4
mientras las cruzas interespecíficas fueron At5 × Aa y At3 × Aa, usando cuatro
combinaciones de oligonucleótidos, se obtuvieron un total de 253 marcadores moleculares
en un rango de 50 a 300 pb, de los cuales 200 fragmentos fueron polimórficos lo que
representa un 79 % de polimorfismo total. En la tabla 8 se muestra la proporción de
polimorfismos para cada cruza en forma individual.
Tabla 8. Proporción de polimorfismos obtenidos de cruzas intraespecíficas e
interespecíficas
Cruzas
Marcadores
Marcadores
Proporción de
obtenidos
polimórficos
polimorfismo (%)
At5 ×At3
234
149
64
At3 × At5
234
144
62
At5 × At4
247
138
56
At5 × Aa
252
157
62
At3 × Aa
251
172
69
Global
253
200
79
59
En la cruza At5 × At3 como en su inversa At3 × At5 el nivel de polimorfismo fue muy
similar, lo que sugiere que a nivel genético la relación directa o inversa de las cruzas no
altera el nivel de polimorfismo. En las dos cruzas interespecíficas el nivel de polimorfismo
que presentan son similares.
El dendrograma obtenido con el programa FreeTree utilizando el índice de similaridad
Sokal y Sneath 1 (figura 19), nos muestra el agrupamiento de las cruzas intraespecificas
(grupo A) formando 2 subgrupos en las cuales se encuentran las cruzas intraespecificas
realizadas en diferentes sentidos y por otro lado, las cruzas interespecificas (grupo B) (figura
19).
El análisis de remuestreo bootstrap, en el cual se realizaron 1000 replicas, nos indica el nivel
de confianza en cada nodo o agrupamiento, presentando valores mayores a 50 en los nodos
A y B (figura 19).
Del mismo modo en el dendrograma obtenido con el programa NTSYS 2.0 utilizando el
índice de similitud Simple Matching se puede ver claramente la formación de dos grupos, en
los cuales se encuentran las cruzas intraespecificas (grupo A) que al igual que en el anterior
programa, forma a su vez 2 subgrupos que agrupan las cruzas intraespecificas en los
diferentes sentidos realizados, mientras las cruzas interespecificas (grupo B) forma una sola
agrupación sin distinguir la procedencia del progenitor materno (figura 20).
Es importante mencionar, que sin importar el índice de similitud utilizado ni los diferentes
programas utilizados, las distancias genéticas existentes entre los individuos analizados se
mantienen, lo que también nos demuestra la verosimilitud de los datos.
60
72
1
91
A
100
94
17
33
31
27
79
97
39
56
2
56
80
29
48
91
20
90
3
B
60
32
27
39
30
33
89
100
0.7
0.8
0.9
P5
P5 X P4 (3)
P3
P3 X Aa (5)
P5 X Aa (3)
P3 X P5 (1)
P5 X P4 (1)
P5 X P4 (2)
P3 X P5 (2)
P3 X P5 (3)
P5 X P3 (1)
P5 X P3 (2)
P5 X P3 (4)
P5 X P3 (3)
P5 X P3 (5)
P5 X Aa (1)
P3 X Aa (3)
P3 X Aa (1)
P3 X Aa (8)
P3 X Aa (4)
P3 X Aa (6)
P3 X Aa (7)
P3 X Aa (2)
P5 X Aa (2)
Aa
P4
P3 X P5 (4)
P5 X P4 (5)
1.0
Coeficiente de similitud
Figura 19. Dendrograma obtenido con el programa FreeTree utilizando el índice de Sokal y
Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con análisis de remuestreo bootstrap. P3, 4, 5 y Aa
progenitores; P3 × P5 (1-4), P5 × P3 (1-5), P5 × P4 (1,2,3,5), P3 × Aa (1-8), P5 × Aa (1-3)
progenie de las diferentes cruzas.
61
P5 X P3 (1)
P5 X P3 (2)
P5 X P3 (4)
P5 XP 3 (3)
P5 X P3 (5)
P3 X P5 (1)
P3 X P5 (4)
P3 X P5 (2)
P3 X P5 (3)
P5 X P4 (1)
P5 X P4 (2)
P5 X P4 (3)
P5 X P4 (5)
P5 X Aa (1)
P5 X Aa (2)
P3 X Aa (2)
P3 X Aa (1)
P3 X Aa (8)
P3 X Aa (3)
P3 X Aa (4)
P3 X Aa (6)
P3 X Aa (7)
P5 X Aa (3)
P4
P3 X Aa (5)
P3
Aa
1
A
B
2
3
P5
0.51
0.63
0.76
0.88
1.00
Coeficiente de similitud
Figura 20. Dendrograma obtenido con el programa de NTSYS 2.0 utilizando el índice de Simple Matching (Skroch et al., 1992).
62
5.9. Variación genética asexual de Agave tequilana Weber var. azul analizado por
AFLP
Como se describió anteriormente, A. tequilana es una especie que presenta reproducción
sexual como asexual y esta última no sólo está dada por hijuelos de rizoma, sino también por
la formación de bulbilos cuando la producción de semillas es baja. Analizamos la
variabilidad genética que presentan tanto hijuelos de rizoma como bulbilos con relación a su
progenitor y la variabilidad genética que presentan entre ellas por medio de marcadores
moleculares tipo AFLP.
5.9.1. Hijuelos de rizoma
De los 7 hijuelos de rizoma provenientes de la planta At8, todos mostraron alto grado de
variación genética con relación a su progenitor y también entre ellos. Con la combinación de
cuatro oligonucleótidos obtuvimos 393 loci, de los cuales, 167 fueron polimórficos,
presentando un 42% de polimorfismo y compartiendo 58% de los marcadores entre hijuelos
y su progenitor.
Estos resultados sugieren que ocurren cambios a nivel genómico durante la etapa vegetativa
de las plantas de agave los cuales podemos detectar en los individuos generados a través de
la reproducción asexual. Estos cambios pueden ocurrir debido a mutaciones puntuales,
rearreglos en el genoma, actividad de transposones y retrotranspones, entre otros. Por lo
tanto, los datos de AFLP en estas condiciones son capaces de discriminar las variaciones que
existen a nivel genómico entre hijuelos de rizoma provenientes de un progenitor común. Los
altos valores bootstrap (>50%) en todos los nodos de las ramificaciones del dendrograma
nos demuestran la consistencia de los datos, mientras los controles externos están separados
de las muestras, los cuales fueron plantas de frijol como se muestra en figura 21.
63
PM8
100
H8
H4
98
H6
76
H1
56
54
100
H2
74
H10
71
H9
F3
100
F1
50
F2
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Coeficiente de similitud
Figura 21. Dendrograma de hijuelos y su progenitor obtenido con el programa FreeTree
utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con análisis de remuestreo.
PM8 (progenitor), H (hijuelos), F (control-externo).
5.9.2. Bulbilos
Este tipo de reproducción asexual está limitado a ciertas especies del género Agave, entre
ellas A. tequilana. Se han observado cambios fenotípicos en algunos bulbilos obtenidos de
un sólo progenitor, como la presencia de listas amarillas en hojas (figura 22), lo que sugiere
eventos de mutación que ocurren en el desarrollo de brotes obtenidos por vía asexual. A
nivel molecular, se obtuvieron 329 loci usando iniciadores Eco RI con 4 oligonucleótidos
selectivos de los cuales 132 fueron polimórficos, alcanzando un nivel de polimorfismo del
40%. En la figura 23 se puede ver que ningún bulbilo es geneticamente idéntico a su
64
progenitor y a su vez varían entre ellos. Los altos niveles de los valores bootstrap obtenidos
para cada nodo nos indica la robustez del dendrograma obtenido. Los niveles de variabilidad
genética comparados con los hijuelos son ligeramente menores.
Figura 22. Bulbilos de Agave tequilana mostrando
lista amarilla en el envés de una hoja de un bulbilo.
65
B1
100
B6
84
B3
91
B2
PM8
42
B4
50
B7
57
B15
45
60
98
C-3
100
35
C-1
C-2
B12
46
0.8
0.9
B13
1.0
Coeficiente de similitud
Figura 23. Dendrograma de bulbilos con su progenitor obtenido con el programa FreeTree
utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con análisis de remuestreo.
PM8 (progenitor), B (bulbilos), C (control).
Los resultados obtenidos con los bulbilos confirman la ocurrencia de cambios genéticos
durante la etapa vegetativa en Agave. Basados en reportes recientes (Bousios, et al., 2007)
sobre la presencia de retrotransposones en diferentes variedades de A. tequilana y también
en otras especies de Agave, se investigó la posibilidad de que la actividad de
retrotransposones pudiera ser al menos en parte responsable de la variabilidad observada en
plantas reproducidas asexualmente. Para ello, analizamos bulbilos de la planta At8 por
66
medio de diferentes marcadores moleculares que se basan en retrotransposones, como IRAP
y SSAP.
5.10. Análisis por marcadores moleculares tipo IRAP
Por medio de esta técnica utilizando oligonucleótidos específicos para retrotransposones
pudimos generar múltiples fragmentos aledaños a retrotransposones de ADN genómico
tanto en bulbilos como en hijuelos de A. tequilana. Los fragmentos amplificados
se
encuentran en un rango comprendido entre 500 pb y 2 kb (figura 24).
B2 B3 B7 B12 H1 H4 H6
H7 H8 M
1Kb
Figura 24. Productos de amplificación obtenidos por IRAP-PCR
de bulbilos e hijuelos de Agave tequilana usando el primer 3´LTR
de cebada. B (bulbilos), H (hijuelos), M (marcador de peso
molecular de 1Kb)
El patrón de amplificación por esta técnica, no detectó polimorfismo ni entre hijuelos de
rizoma ni entre bulbilos; sin embargo, la amplificación de secuencias de ADN aledañas a
retrotransposones nos indica la presencia de retrotransposones tipo copia Ty1 en Agave. Para
identificar el tipo de secuencias que se encuentran contiguas a los retrotransposones, se
67
clonaron 10 secuencias de diferentes tamaños, las cuales se pueden ver en la figura 25. Las
secuencias clonadas se encuentran entre 700 pb y 1 kb. De estas
se escogieron 10
secuencias en base a su tamaño las cuales se mandaron a secuenciar y posteriormente se
realizaron los análisis bioinformáticos. El alineamiento multiple realizado con las secuencias
escogidas no presentó identidad entre ellas lo cual nos confirma que las secuencias
escogidas todas son diferentes y que los retrotransposones se encuentran insertados en
diferentes regiones del genoma.
M
1
2
3
4
13
14
5
6
15
16
7
8
9
10 11
1.6K
b
1K
b
500p
b
M
12
17
18
19
20
1.6K
b
1Kb
500pb
Figura 25. Clonación de productos de amplificación generados por IRAP-PCR
68
Al realizar BLAST a nucleótidos de cada secuencia a la base de datos del NCBI, se encontró
secuencias con altos porcentajes de identidad, en la tabla 9 se muestra las mejores
correlaciones de cada BLAST con valores esperados menores a e-5 lo cual nos muestra
identidad altamente significativa. Del mismo modo, se realizaron BLAST a proteínas sin
encontrar identidades significativas, lo que nos sugiere que los retrotransposones analizados
se encuentran insertados en regiones no codificantes.
Tabla 9. Tamaños de secuencias clonadas y primera correlación de BLAST a nucleótidos
realizado en la base de datos del NCBI.
Nombre
Tamaño
Secuencia
Dany1
831 pb
Secuencia genómica de Mus musculus, cromosoma 17
2e-21
Dany2
1026 pb
Clon VV78X109580.4 de Vitis vinifera,
2e-34
Dany3
679 pb
Sin hit significativo
Dany4
739 pb
Transposon Rim2-M325 de Oryza sativa
0.056
Dany5
843 pb
Clon VV78X015273.10 de Vitis vinifera
2e-08
Dany6
895 pb
Clon POPOO6-NO1 de Populus trichocarpa
6e-53
Dany7
726 pb
Hordeum vulgare subsp. vulgare clone BAC 673I14
2e-3
Dany8
724 pb
Hordeum vulgare subsp. vulgare clone BAC 635P2
chromosome 5H
1e-6
Dany9
862 pb
Sin hit significativo
Dany10
824 pb
Sin hit significativo
Valor E
69
5.11. Análisis genético por marcadores moleculares tipo SSAP
El perfil de bandeo generado por SSAP dio un patrón con elevado polimorfismo. Se
obtuvieron marcadores desde 50 pb hasta 530 pb, mientras que con sólo una combinación de
oligonucleótidos se obtuvieron un total de 55 marcadores lo que indica que estos elementos
están en un alto número de copias, Sin embargo, también se puede observar que varios
marcadores están siendo compartidos entre todos los bulbilos, lo que sugiere que estos
elementos móviles se heredan de generación en generación; por lo tanto, los bulbilos
comparten elementos móviles con su antecesor. Por otro lado, también se puede observar
marcadores que sólo se encuentran en bulbilos y no en su progenitor, lo que sugiere que
estos se activan en el proceso de formación de cada bulbilo. (figura 26).
Por el perfil generado en los SSAP podemos afirmar que los retrotransposones del tipo copia
Ty1 se encuentran en un alto número de copias por el polimorfismo insercional que
generaron y que están distribuidos ampliamente en el genoma de A.tequilana. Sin embargo
las inconsistencias entre las repeticiones de las muestras no permitieron llegar a unas
conclusiones definitivas sobre la variabilidad entre bulbilos y su antecesor.
Con estos resultados se demostró la presencia de retrotransposones del tipo copia Ty1 que
probablemente se encuentran activos en el genoma de A. tequilana e incrementan su
actividad en el proceso reproductivo asexual asegurando de esta manera su reproducción y la
variabilidad genética requerida para adaptarse al medio ambiente árido donde se desarrollan.
70
M
P
P B1 B1 B2 B2 B3 B3 B4 B4 B5 B5
565
500
530
+
460
400
364
350
+
*
300
255
204
200
-
+
+
145
100
50
-
Figura 26. Gel de poliacrilamida mostrando los productos de amplificación
generados por SSAP en bulbilos de Agave tequilana. M. marcador de peso
molecular, P progenitores, B bulbilos. (*)indica marcadores en bulbilos y no en su
progenitor. (+) indica marcadores tanto en bulbilos como en su progenitor. (-) indica
polimorfismo entre bulbilos.
71
5.12. Elementos transponibles en la base de datos de Agave.
En la base de datos de EST de Agave se encontraron diferentes tipos de elementos
transponibles como transposones y diferentes clases de retrotransposones con valores
esperados tan bajos de hasta e-97, lo que significa que los transcritos tienen muy alta
significancia. Este dato confirma la presencia de transposones y retrotransposones activos en
el genoma de agave que se encuentran expresando al menos algunos genes de estos
elementos en los diferentes órganos de la planta como hojas, tallos, raíz, bulbilos,
meristemos, anteras y ovarios (tabla 10). Se encontró un total de 24 secuencias con similitud
a retrotransposones de un total de 23 825 EST. La relación por el tipo de tejido se puede ver
en la tabla 11.
Tabla 10. Secuencias encontradas en la base de datos de Agave con similitud significativa a
retrotransposones.
Nombre de la
secuencia
Hit
esperado
Hit_nombre
gi|34334112|gb|AY357214.1| Cucumis melo mitochondrial
ajswinirp015_e08
1e-97
ajswinirp002_c11
1e-45
Ty1/copia retrotransposon pol polyprotein pseudogene
At2g19830 copia-like retroelement pol polyprotein
gi|21553484|gb|AAM62577.1| copia-like retroelement pol
ajswinirp023_e02
5e-13
aamhmqmeq010_b01
3e-05
polyprotein [Arabidopsis thaliana]
gi|9294088|dbj|BAB01940.1| non-LTR retrolelement reverse
transcriptase-like protein [Arabidopsis thaliana]
gi|10998138|dbj|BAB03109.1| retroelement pol polyprotein
aamhmqmeq007_c23
1e-58
[Arabidopsis
thaliana]
gypsy/Ty-3
retroelement
gi|12322008|gb|AAG51046.1|
polyprotein;
69905-74404
[Arabidopsis thaliana]
gi|46200512|gb|AF466200.2| putative non-LTR retroelement
ajswininm007_h03
4e-4
ajswnvnov005_c03
5e-34
reverse transcriptase
gi|48209910|gb|AAT40504.1| putative polyprotein [Solanum
72
demissum]
gi|31431495|gb|AAP53268.1| putative
ajswnvnov006_e07
3e-06
22
kDa
kafirin
cluster; Ty3-Gypsy type [Oryza sativa (japonica cultivargroup)]
gi|21594892|gb|AAM66053.1| copia-like retroelement pol
aamhhphoc002_i15
2e-43
aamhhphoc022_d08
3e-14
polyprotein [Arabidopsis thaliana]
gi|18390096|gb|AF466199.1 putative copia polyprotein|
gi|21594892|gb|AAM66053.1| copia-like retroelement pol
aamhhphoc032_l23
1e-40
aamhhphoc032_l19
1e-40
polyprotein [Arabidopsis thaliana]
gi|21594892|gb|AAM66053.1| copia-like retroelement pol
polyprotein [Arabidopsis thaliana]
gi|18568260|gb|AF466646.1| Zea mays putative polyprotein,
aamhhphoc032_l07
3e-08
ajswflant008_a10
1e-32
putative retrotransposon protein
gi|48209910|gb|AAT40504.1| putative polyprotein [Solanum
demissum]
gi|55168096|gb|AAV43964.1| putative polyprotein [Oryza
aamhflovo005_a01
3e-63
aamhflovo003_p23
2.6e-2
aamhflovo006_j14
3e-31
sativa (japonica cultivar-group)]
TR:Q9SJC1 Q9SJC1 putative retroelement pol polyprotein,
mARN sequence
gi|18390096|gb|AF466199.1| putative GAG-POL precursor.
gi|4755191|gb|AAD29058.1| putative non-LTR retroelement
aamhflovo006_e09
1e-02
ajswble01018_a08
9e-23
reverse transcriptase [Arabidopsis thaliana]
gi|9755737|emb|CAC01849.1|
telomerase
reverse
transcriptase [Arabidopsis thaliana]
gi|27901709|gb|AAO26690.1| gag-pol polyprotein [Vitis
ajswble02011_d04
2e-17
ajswble02011_b10
4e-27
aamhhppib014_e05
1e-05
vinifera]
gi|60920257|gb|AAX37310.1|
polyprotein
[Verbena
canadensis potyvirus MA-2005]
gi|46200512|gb|AF466200.2| putative non-LTR retroelement
73
reverse transcriptase
gi|478218|pir||G47759
aamhhppib018_k15
2e-03
retrovirus-related
reverse
transcriptase homolog - maize retrotransposon copia-like
(fragment) gi|168449|gb|AAA33449.1| reverse transcriptase
gi|31430568|gb|AAP52462.1| putative gag-pol polyprotein
aamhraraz019_f02
1e-05
[Oryza sativa (japonica cultivar-group)]
Como se puede ver en la tabla 11, las secuencias que dieron similitud significativa a
retrotransposones provienen de diferentes tejidos, encontrándose en mayor proporción en
hoja, lo que sugiere que los retrotransposones se están transcribiendo activamente a lo largo
del desarrollo de las plantas. La presencia de retrotransposones en alta proporción en piña y
ovarios también sugiere que estos elementos se encuentran en zonas de crecimiento y
diferenciación y pudieran estar jugando algún rol en el desarrollo y diferenciación de tejidos.
Tabla 11. Proporción de secuencias en diferentes tejidos de A. tequilana que dieron
similitud a retrotransposones.
Tejido
Cantidad
Nº total de secuencias
Proporción (%)
Meristemo
8
7337
0.10
Hojas
5
3353
0.15
Ovarios
4
3400
0.11
Anteras
1
1966
0.05
Bulbilos
3
4035
0.074
Piña
2
1763
0.11
Raíz
1
1971
0.05
Total
24
23825
0.10
74
Otros elementos móviles que se encuentran activos en el genoma de A. tequilana son los
transposones, los cuales fueron también identificados en la base de datos de EST y que
presentan similitudes altamente significativas que van de 1e-155 a 3e-8. En la tabla 12 se
muestra la relación en la que se encuentran estos elementos. Al igual que los
retrotransposones, los genes de los transposones se encuentran expresados en todos los
tejidos y están más representados en el meristemo. De las 12 secuencias encontradas, 4 se
encuentran en el meristemo apical en estado de inmadurez sin señales de inicio de
emergencia de la estructura floral, con un porcentaje de 0.23, el más elevado de todos los
tejidos. Esto sugiere que durante el desarrollo de las hojas los transposones están activos y
las mutaciones que causan pueden fijarse y pasar a la descendencia.
Tabla 12. Secuencias encontradas en la base de datos de Agave con similitud significativa a
transposones.
Nombre de la
secuencia
Hit
esperado
ajswininm011_g08 1e-155
ajswininm005_h10 3e-88
ajswininm008_c04 6e-85
aamhraraz001_e09 3e-84
ajswble02012_e01 9e-79
ajswflant002_f08
1e-58
ajswble01011_d01 1e-42
aamhhppib022_e06 1e-39
ajswininm003_e08 3e-27
aamhhphoc020_h08 3e-18
Nombre del hit
gi|5738083|gb|AF162223.1| Shigella flexneri transposon
Tn10
gi|57434477|emb|CAI43894.1| transposase for IS10
gi|10957274|ref|NP_058298.1| IS10 transposase
[Salmonella typhi]
gi|6175165|gb|AAF04891.1| Mutator-like transposase
[Arabidopsis thaliana]
gi|20465953|gb|AAM20162.1| putative mutator
transposase [Arabidopsis thaliana]
gi|6175165|gb|AAF04891.1| Mutator-like transposase
[Arabidopsis thaliana]
gi|6175165|gb|AAF04891.1| Mutator-like transposase
[Arabidopsis thaliana]
gi|50918347|ref|XP_469570.1| putative transposase
[Oryza sativa (japonica cultivar-group)]
gi|50918347|ref|XP_469570.1| putative transposase
[Oryza sativa (japonica cultivar-group)]
gi|50920375|ref|XP_470548.1| Putative transposase
[Oryza sativa (japonica cultivar-group)]
75
aamhflovo005_c19 3e-17
aamhhphoc032_l07 3e-08
gi|31433604|gb|AAP55096.1| putative transposase [Oryza
sativa (japonica cultivar-group)]
gi|18568260|gb|AF466646.1| Zea mays clone
ZMMBBb_Z195D10 putative transposase gene,
Por otro lado, en la base de datos de agave se encontró 2 secuencias que dieron similitud a
proteínas codificadas por helitrones, como replicasa/helicasa/endonucleasa que sirven para
la replicación por círculo rodante. En el primer caso, el transcrito se encuentra en el
meristemo con el nombre de (aamhmqmeq003o04) y tiene un valor esperado de 4e-11, lo
que significa que es significativo; el segundo transcrito se encuentra en piña designado como
(aamhhppib026_p06) con un valor esperado no significativo de 6.6.
76
6. DISCUSIÓN
Para discutir más ampliamente los resultados de este trabajo, se dividió la discusión en cinco
partes: 1) Producción de frutos y semillas bajo diferentes eventos de polinización en Agave
tequilana y Agave americana. 2) Análisis histológico del desarrollo de los gametos. 3)
Análisis por citometría de flujo. 4) Niveles de variación genética sexual y asexual de Agave
tequilana. 5) Análisis de transposones en Agave tequilana
6.1. Producción de frutos y semillas bajo diferentes eventos de polinización en Agave
tequilana y Agave americana.
El género Agave tiene mecanismos de reproducción tan complejos que varían de especie a
especie y que fueron evolucionando para adaptarse a las condiciones del medio ambiente
donde se desarrollan. De esta manera muchas especies tienen reproducción sexual y asexual
incluyendo a A. tequilana y A. americana.
En general, los resultados del desarrollo de frutos y semillas en las flores de polinización
abierta están dentro del rango reportado para otras especies de Agave, (Arizaga et al., 2000a,
b; Molina- Freaner y Eguiarte, 2003; Rocha et al., 2005).
Como ha sido reportado para otras especies de Agave (Sutherland, 1987; Arrizaga et al.,
2000a, b) las plantas de A. tequilana y A. americana analizadas en este estudio produjeron
un número de flores mucho más grande que frutos cuando las flores fueron polinizadas en
forma natural. Sutherland (1987) sugirió, basado en estudios en A. mckelveyana, que esta
situación permite un incremento en las formas masculinas y que el exceso de flores
contribuye a la producción y dispersión de polen, pero no a la producción de frutos maduros
(una indicación de formas femeninas) lo cual ocurre también en A. tequilana y A. americana
al haber un exceso de flores comparado con la cantidad de frutos producidos.
Los porcentajes de frutos producidos por polinización natural fueron bajos comparados con
estudios realizados en A. angustifolia (Molina-Freaner y Eguiarte, 2003) donde se reportan
porcentajes entre el 20 y el 34 %. La baja producción de frutos pudiera deberse a varios
77
factores, tales como la carencia de polinizadores (Slauson, 2000), errores durante el
desarrollo de los gametos o durante la fertilización. Sin embargo, durante la realización de
las polinizaciones manuales se observaron colibríes y una variedad de insectos como abejas,
abejorros y avispas que visitan las flores durante el día. Además, los murciélagos son
comunes en el área de estudio durante la noche. Por lo tanto, debido a que en las
polinizaciones naturales la formación de frutos fue mayor que en las polinizaciones
controladas descartamos la carencia de polinizadores efectivos. Estos bajos porcentajes en la
formación de frutos en polinizaciones controladas se debieron principalmente a que éstas
fueron realizadas sólo una vez durante la mañana, debido a la inaccesibilidad a las
inflorescencias.
Los porcentajes de frutos obtenidos en las cruzas intraespecíficas de A. tequilana (tabla 3 y
4) son similares a los observados en cruzas reportadas para A. macroacantha tanto para
frutos generados por cruzas entre diferentes plantas como por autofecundación donde se
reportan valores muy bajos del 1.6% (Arizaga y Ezcurra, 2002). Aquí se reporta 6.6% para
A. tequilana y 4.2% para A. americana, lo que sugiere que las dos especies estudiadas en
este trabajo sufren de depresión por endogamia y el éxito reproductivo sexual se da por
entrecruzamientos.
Previos reportes consideraron a las semillas negras equivalentes a semillas fértiles y el
fenómeno de semillas vacías o semillas sin embrión no ha sido reportado previamente para
otras especies de Agave, aunque Trame et al. (1995) mostraron una reducción de alrededor
de 40 a 50% entre el número de semillas maduras por fruto y el número promedio de
semillas germinadas por flor polinizada en A. schottii. Por lo tanto es posible que un
fenómeno similar esté también ocurriendo en esta especie.
Dos de las plantas autopolinizadas de A. tequilana no produgieron frutos y por lo tanto
semillas, mientras que las autofecundaciones de las plantas At5 y Aa produjeron muy pocos
frutos y semillas. Estos resultados son similares a los reportados por Molina-Freaner y
Eguiarte (2003) donde ningún fruto ni semillas fueron obtenidas de autopolinización manual
de plantas de A. angustifolia y A. subsimplex. Por otro lado, Rocha et al. (2005) reportaron
78
bajos niveles de producción de frutos por autopolinización en A. striata y Agave sp.,
sugiriendo que A. tequilana y A. americana se favorece la polinización cruzada. Una
explicación para los bajos niveles de producción de frutos y semillas es el efecto de
endogamia, donde alelos recesivos pueden tener efectos deletéreos tempranos, generando
abortos después de la fertilización.
En general encontramos una relación inversa entre el número de semillas por fruto y el
número de semillas capaces de germinar, sugiriendo que el desarrollo del embrión puede
estar afectado en etapas tempranas del desarrollo (semillas vacías), pero también se observa
en muchos casos semillas con embriones aparentemente normales incapaces de germinar
(semillas inviables).
Es posible que también existan efectos de endogamia entre las plantas At3, At4 y At5 aún en
entrecruzamientos debido a que estas plantas fueron obtenidas de la misma plantación
comercial y consecuentemente están estrechamente relacionadas geneticamente (Gil- Vega
et al. 2001, 2006). Esto puede ser un problema generalizado para A. tequilana debido a que
esta especie es propagada exclusivamente en forma asexual y distribuida masivamente en
todas las plantaciones comerciales, y esto puede contribuir a reducir la fertilidad bajo
condiciones naturales.
Por lo tanto, la generación de cruzas entre diferentes cultivares de A. tequilana puede
contribuir a mejorar el nivel de fertilidad y ayudar a mantener una base genética más amplia
del germoplasma. Sin embargo, para que estos germoplasmas sean comercialmente
aceptados, la restricción al uso solo de A. tequilana Weber var. azul para la producción del
tequila debe de ser reconsiderada.
Tanto A. tequilana como A. americana tienen un complemento cromosómico diploide de 2n
= 2x = 60 (Castorena et al., 1991; Granados, 1993; Palomino et al., 2003). Anteriormente, se
reportó al menos un híbrido producido manualmente entre A. amaniensis y A. angustifolia
(Lock, 1962; Boulanger, 1985). Sin embargo, poco se conoce acerca de la hibridación entre
especies en el género Agave bajo condiciones naturales. Los resultados presentados aquí
indican claramente que las cruzas entre A. tequilana y A. americana pueden ocurrir y
79
producir progenie viable, confirmado tanto por el fenotipo de la progenie como por
marcadores moleculares tipo AFLP. La hibridación inter-específica es otra opción para
incrementar la variabilidad genética
de A. tequilana
aunque implica implementar
programas de mejoramiento a largo plazo para desarrollar plantas comercialmente y
legalmente aceptables bajo la norma. Estos resultados también sugieren que es necesario
monitorear fenotípicamente a plantas obtenidas de A. tequilana polinizadas naturalmente en
el campo.
En la cruza At × Aa, donde At es el progenitor femenino, se produjeron más semillas negras
que en la cruza At × At, muy poco de estas semillas fueron viables, sugiriendo que aunque la
fertilización en las cruzas inter-específicas es relativamente más eficiente, el desarrollo del
embrión es pobre. Las cruzas que presentan a Aa como progenitor femenino son menos
fértiles que las cruzas que tienen alguna planta de A. tequilana como progenitor femenino,
produciendo los niveles más bajos de frutos y semillas por fruto. Estos resultados sugieren
que alguna forma de incompatibilidad genética puede afectar el desarrollo de frutos y la
producción de semillas tanto en cruzas intra como interespecíficas. La presencia de una alta
proporción de semillas vacías aparentemente normales, sugiere que otros factores tales como
la formación de gametos inviables pueden también contribuir a los bajos niveles de
fertilidad.
Como ha sido documentado en otros taxa (Haga y Channell, 1982; Saunders y Sipes, 2006)
las semillas arrugadas y blancas encontradas en los frutos de A. tequilana y las semillas
blancas encontradas en los frutos de A. americana probablemente corresponden a óvulos los
cuales no fueron fertilizados, mientras que las semillas negras podrían corresponder a óvulos
fertilizados. Por otro lado las semillas negras pero vacías pueden corresponder a óvulos los
cuales fueron fertilizados exitosamente pero los cuales abortaron en estados de desarrollo
muy tempranos. Una posible explicación para que ocurra esto, puede ser la fertilización de
óvulos por células espermáticas provenientes de granos de polen anormales. Los ensayos de
germinación de los granos de polen in vitro indican que la proporción de granos de polen
capaces de producir tubos polínicos no discrimina si las células dentro del tubo germinativo
son viables o no. Ruvalcaba-Ruiz y Rodríguez-Garay (2002), reportaron que errores en las
80
divisiones meióticas durante la formación de los granos de polen son comunes para A.
tequilana, donde arriba del 42% de los granos producidos son deformes. Por otro lado,
Piven et al. (2001) reportaron arriba del 66.4% de granos defectuosos para A. fourcroydes
una especie pentaploide. Es posible que una cierta proporción de granos aparentemente
viables puedan contener aberraciones cromosómicas menos severas las cuales pueden
producir problemas durante las subsecuentes mitosis para formar las células espermáticas o
en la fertilización, trayendo consigo problemas en estados tempranos de desarrollo. Estas
observaciones pueden en parte explicar los bajos niveles de viabilidad de los granos de
polen determinados en este trabajo por medio de la germinación in vitro del polen descritos
para A. tequilana el cual sólo alcanzó el 36% comparados con el 58% observados por
Ruvalcaba- Ruíz y Rodríguez- Garay (2002).
En este estudio una proporción más alta de granos de polen de A. americana lograron
germinar en comparación a A. tequilana indicando la presencia de más granos viables para
esta especie. Esto también correlaciona con las observaciones de los bajos niveles de
semillas vacías encontradas en todos los regímenes de polinización donde A. americana
fungía como progenitor paterno. Por el contrario, cuando los granos de polen A. tequilana
fueron usados como progenitor paterno, proporciones más altas de semillas vacías fueron
encontradas.
La escarificación de las semillas incrementó la eficiencia de germinación tanto para A.
tequilana como para A. americana. Peña-Valdivia et al. (2006) reportaron que la
escarificación de las semillas en A. salmiana aceleraba su germinación. Sin embargo, una
base biológica para la necesidad de escarificación bajo condiciones naturales no está clara.
Las semillas de la mayoría de las especies de Agave son normalmente dispersadas por el
viento cuando las cápsulas se abren.
6.2. Análisis histológico del desarrollo de los gametos en A. tequilana y A. americana.
Existen muy pocas especies en las cuales se han realizado estudios a nivel histológico en el
género Agave. Este es el primer reporte sobre el desarrollo del gametofito femenino como
81
masculino en A. tequilana y A. americana. Nuestros resultados demuestran que el desarrollo
del gametófito femenino en A. tequilana y A. americana es de tipo Polygonum monospórico,
siendo la megaspora funcional, que se encuentra en la zona calazal, la que da origen al saco
embrionario. Piven et al. (2001) en un estudio similar realizado en A. fourcroydes y A.
angustifolia reportan que el desarrollo del gametofito femenino en esta especie es del tipo
bispórico tipo Allium y que el gametofito femenino en henequén desarrolla directamente de
dos megasporas viables. Sin embargo, de acuerdo con Dahlgren, Clifford y Yeo (1985) los
cuales indican que el gametofito femenino de la familia Agavaceae es generado de una sóla
megaspora funcional tipo Polygonum, los resultados presentados en este trabajo indican que
al menos A. tequilana y A. americana confirman esta aseveración. Por lo tanto, es necesario
realizar más estudios de este tipo en diferentes especies para confirmar si toda la familia
Agavaceae presenta la misma estrategia en el desarrollo del gametofito femenino.
Piven et al. (2001) también reportan fallas en la meiosis, lo que conduce a la formación de
megasporas abortivas con un balance de cromosomas anormal, dando como consecuencia la
formación de sacos embrionarios vacíos. Un evento similar pudiera estar pasando en A.
tequilana debido a la presencia de óvulos sin sacos embrionarios (figura 8g), y por lo tanto
contribuyendo a los bajos niveles de fertilidad de las semillas. Sin embargo, no existe
ningúna información detallada sobre la ocurrencia de aberraciones meióticas femeninas en el
género Agave.
El desarrollo del saco embrionario en A. tequilana y A. americana termina con la formación
de siete células las cuales se encuentran ubicadas de la siguiente manera: en la zona
micropilar se encuentran 2 sinérgidas y la célula huevo, y en la zona calazal 3 antípodas y la
célula central. También es importante mencionar la presencia de tubos polínicos en la zona
micropilar de los óvulos, lo que nos sugiere fuertemente que las células espermáticas son
depositadas en el interior del saco embrionario. Sin embargo, esto no garantiza la
fecundación y el desarrollo del embrión y del endospermo.
Por otra parte, el desarrollo del gametofito masculino, tanto en A. tequilana como en A.
americana, presentan la misma estrategia de desarrollo que la reportada para A. fourcroydes,
82
del tipo sucesivo, las cuales darán origen a granos de polen con exina reticulada. Sin
embargo, las descripciones de la anatomía de los granos de polen reportados en este trabajo
contrastan con reportes previos (Ojeda 1995). El polen para el grupo Rigidae del subgénero
Agave al cual A. tequilana pertenece, se describe como monosulcado con la presencia de
sólo un sulco. Sin embargo, observaciones en este trabajo muestran una abertura disulcada.
Sin embargo, estudios realizados por Ludlow-Wiechers y Ojeda (1983) reportan diversos
tipos de variaciones en la apertura de A. fourcroydes, A. sisalana y A. angustifolia donde se
observan granos de polen disuldados, estas especies también pertenecen al grupo Rigidae y
son las que forman bulbilos.
Bajo estas condiciones, aunque la mayor parte del desarrollo de los granos de polen se ve
aparentemente normal, éstos mostraron bajos niveles de germinación in vitro para A.
tequilana (del 36%), lo que sugiere la existencia de aberraciones cromosómicas ocurridas
durante las divisiones celulares. Estas mismas observaciones fueron reportadas por
Ruvalcaba y Rodríguez (2002) en A. tequilana. Por lo tanto, la inviabilidad de los granos de
polen en A. tequilana es la principal limitante para obtener semillas y frutos en esta especie
de importancia comercial.
En contraste los granos de polen de A. americana alcanzaron el 79% de viabilidad, lo que se
vió reflejado también en los altos niveles de viabilidad de sus semillas (>80% en
polinización abierta), encontrando una correlación positiva entre la viabilidad de los granos
de polen y la viabilidad de las semillas tanto en A. tequilana como A. americana.
Aunque la germinación in vitro no reproduce exactamente las condiciones in vivo, creemos
que esto puede servir como una herramienta útil para medir la calidad del polen (viabilidad)
en otras especies del género Agave.
83
6.3. Análisis del contenido de ADN de A. tequilana.
La importancia de realizar un análisis del contenido de ADN por citometría de flujo en A.
tequilana fue principalmente para confirmar el nivel de ploidía y también para buscar
diferencias cuantitativas de ADN entre plantas de A. tequilana de un campo de cultivo.
En general, existen pocos estudios que demuestran el nivel de ploídia que presenta A.
tequilana, siendo estos contradictorios, debido principalmente a la estructura bimodal de sus
cromosomas con 5 cromosomas grandes y 25 pequeños, lo que dificulta un estudio preciso
de éstos. El primer reporte realizado por Banerjee y Sharma en (1987) indica que esta
especie es triploide con 2n = 3x = 90. Cavallini et al. (1996) encontraron un número de
cromosomas diploide 2n = 2x = 60, estando éstos de acuerdo con un trabajo previo realizado
por Castorena-Sánchez et al. (1991). Los resultados presentados en este trabajo confirman
que A. tequilana es una especie diploide (2n = 2x = 60) y que el contenido de su ADN
genómico no presenta diferencias significativas en relación a otras plantas de A. tequilana
que se encuentran en el mismo campo de cultivo al igual que lo reportado por Palomino et
al. (2003).
Por otra parte, también existe poca información disponible sobre el tamaño del genoma
nuclear. Según Cavallini et al. (1996) las plantas diploides presentaron un contenido de
ADN para 2C de 7.43 pg. Una estimación similar de 8.8 pg fue reportado para plantas
triploides (Banerjee y Sharma, 1987). En este trabajo reportamos en promedio el contenido
de ADN para A. tequilana de 8.31 pg; resultados similares fueron reportados en un estudio
previo por Palomino et al. (2003). También se estimó el tamaño de su genoma que es en
promedio de 4077 Mpb. La resolución de la carencia de información básica, como el
número de cromosomas y el tamaño de ADN nuclear, son indispensables para desarrollar
programas encaminados al mejoramiento de la diversidad genética en estas especies con
reproducción exclusivamente asexual que pueden reproducirse también sexualmente.
Es importante mencionar, que por este método no es posible identificar diferencias a nivel
estructural en el ADN de una planta como variaciones genéticas o mutaciones que podrían
existir en el genoma de una población. Sin embargo, esta técnica es utilizada para diversas
84
aplicaciones, la más utilizada siendo para determinar el nivel de ploidía, análisis del
contenido de ADN, estimación del tamaño del genoma (Palomino et al., 2003) y,
últimamente, para medir la expresión de GFP en células de plantas individuales (Halweg et
al., 2005).
6.4. Variación genética sexual y asexual de A. tequilana.
En años recientes, se han reportado varios estudios sobre la diversidad genética en diferentes
especies del género Agave. Tal es el caso de A. lechuguilla, una especie que crece en forma
silvestre y cuya variabilidad genética dentro de sus poblaciónes es alta y está estrechamente
correlacionada con la variación de las características florales y la visita de polinizadores
(Silva-Montellano y Eguiarte, 2003). De manera similarmente, altos niveles de variación
genética fueron reportados en A. victoriae-reginae una especie endémica del norte de
México (Martinez-Palacios et al. 1999). Es importante mencionar que estas especies se
reproducen principalmente por semillas. En el presente trabajo se analizó la variabilidad
genética en A. tequilana, una especie domesticada que presenta reproducción sexual como
asexual. La estimación de la variabilidad genética sexual se realizó en la progenie obtenida
tanto de polinización abierta como de cruzas intra-específicas e inter-especificas. Al igual
que en estudios previos, el nivel de variabilidad genética obtenido en la progenie de
polinización abierta fue del 67% de polimorfismo; sin embargo, no alcanza los niveles de
variabilidad genética encontrados en las especies silvestres mencionadas, probablemente
debido a la cercanía genética entre los progenitores, los cuales fueron recolectados en un
mismo campo de cultivo, donde las plantas son multiplicadas exclusivamente por
reproducción asexual. Sin embargo, realizando el análisis genético de los progenitores, éstos
no fueron idénticos ya que presentaron variabilidad genética, lo que sugiere que estas
plantas, generaron variaciones por medio de mutaciones, las cuales se ven reflejadas en el
perfil de AFLP y abre la posibilidad de adaptación a las condiciones medio ambientales en
las cuales se desarrollan los agaves.
Esto contrasta con los altos niveles de variabilidad genética presentados en especies
silvestres y que tienen éxito con la reproducción sexual (Silva-Montellano y Eguiarte, 2003).
85
El moderado polimorfismo presente en la progenie de origen sexual de At nos indica que
existe poco flujo genético debido principalmente al alto grado de homocigosis presente en la
población de esta especie al impedir la floración y facilitar las prácticas agronómicas de
cortar el eje floral para concentrar los azúcares en el tallo y evitar la muerte de la planta
hasta la jima (eliminación de las hojas y cosecha de piñas). En este trabajo se demostró que
A. tequilana puede reproducirse en forma sexual y puede obtenerse progenie viable
generando variación genética y de esta manera incrementar los bajos niveles de variación
reportados por Gil-Vega et al. (2001) en un campo de cultivo.
Por otra parte, la variabilidad genética sexual encontrada tanto en cruzas intra-específicas
como inter-específicas es similar, lo que sugiere que A. tequilana sufre depresión por
cruzamientos porque las plantas utilizadas para las cruzas intraespecificas crecieron en una
proximidad espacial muy estrecha, por lo que seguramente son plantas genéticamente
similares. En un estudio similar realizado en A. schottii, Trame et al. (1995) demostraron
que la progenie proveniente de las cruzas con plantas muy cercanas, tiende a disminuir la
eficiencia en desarrollar semillas y frutos y en la variabilidad genética. Un fenómeno similar
pudiera estar pasando con A. tequilana ya que las plantas utilizadas para las cruzas por el
tipo de reproducción que presenta (asexual) son genéticamente similares, y por lo tanto
tienden a conservar su estructura genética. Proponemos que las plantas de A. tequilana van
generando su variabilidad genética a medida que desarrollan y con el transcurso de los años
van acumulando mutaciones que son fijadas y transmitidas a las siguientes generaciones.
En este trabajo, la progenie analizada fueron plántulas con 2 a 3 hojas con poco tiempo de
desarrollo, por lo tanto sólo observamos variación debida a recombinaciones, mientras que
en plantas adultas existe mayor grado de variación por las posibles mutaciones y/o
rearreglos generados en el transcurso de su existencia que generalmente se extiende de 6 a 8
años.
La progenie de las cruzas inter-especificas interesantemente tiene los mismos niveles de
variación genética que las cruzas intra-especificas y la que resultó de la polinización abierta,
lo que significa que aun habiendo intercambio genético con otra especie no se aumenta
86
significativamente la variabilidad genética, probablemente debido a la estructura genética
estrecha que tienen y al bajo nivel de recombinación.
En contraste, en el análisis genético de la reproducción asexual de A. tequilana se encontró
altos niveles de variación, 40% de polimorfismo en el caso de bulbilos y 42% para hijuelos
de rizoma. Estos niveles de variación en bulbilos pueden haberse generado durante el
desarrollo, cuando la planta progenitora cambia el tipo de desarrollo de frutos y semillas por
bulbilos, esto ocurre cuando las flores no son polinizadas o son cortadas antes de ser
polinizadas, entonces comienza el desarrollo de bulbilos a partir de meristemos ubicados en
los pedúnculos flores, este cambio del tipo de desarrollo ocurre en un lapso de tiempo
relativamente corto el cual puede no estar bien regulado. De igual forma, el nivel de estrés
que presenta la planta induce la activación de retrotransposones
que se encuentran
distribuidos en todos los tejidos (Bousios et al., 2007) generando mutaciones y causando
cambios fenotípicos como aparición de listas amarillas en los bordes de las hojas o
formación de estructuras florales en bulbilos poco desarrollados.
En el caso de hijuelos de rizoma, el nivel de variación genética que presenta este género ha
sido reportado para especies como A. fourcroydes donde los niveles de variabilidad genética
alcanzados entre hijuelos de rizoma de diferentes campos fue del 83%, y estudios realizados
de hijuelos de la misma planta también alcanzaron altos niveles de variación con un
polimorfismo del 20.67% (Infante et al., 2003). Del mismo modo, en el complejo A. deserti,
también se han reportado altos niveles de variabilidad genética (Navarro-Quezada et al.
2003). De igual manera, reportamos que la reproducción asexual en A. tequilana presenta
altos niveles de variación genética tanto en hijuelos de rizoma como en bulbilos; esto se
explica principalmente por la pérdida de la ventaja evolutiva que le confiere la reproducción
sexual, ya que ésta especie se cultiva con propagación exclusivamente asexual, creando de
esta manera una estructura genética cerrada. Esta especie, por lo tanto, tienden a desarrollar
mecanismos para generar variación genética y adaptarse a las condiciones medio
ambientales hostiles donde crecen. Entre los mecanismos de variación genética que
desarrolla esta especie muy probablemente se encuentra la activación de elementos móviles,
tanto en hijuelos de rizoma como en bulbilos.
87
6.5. Análisis de retrotransposones en A. tequilana.
El uso de retrotransposones como marcadores moleculares para estimar diversidad y
variabilidad genética ha sido aprovechado para analizar varias especies como cebada,
cítricos, banana, tomate y otros cultivos de interes agronómico por el gran polimorfismo que
estos pueden generar (Bernet y Asíns, 2003; Vicient et al., 2005; Cheng et al., 2009).
En el único reporte realizado por Bousios et al. (2007) en el que se usaron retrotransposones
como marcadores moleculares para estimar la diversidad genética entre variedades de A.
tequilana, se demostró que estos elementos están presentes en gran cantidad en el genoma
del agave y se encuentran distribuidos ampliamente. En el presente trabajo usamos
retrotransposones del tipo copia Ty1 como marcadores para estudiar la variabilidad genética
que existe entre bulbilos e hijuelos generados de un solo progenitor. Se estima que una
planta puede generar en promedio entre 2 mil a 3 mil bulbilos dependiendo del grado de
aborto de sus flores ya que dicha relación es directamente proporcional. El grado de
variación genética generada en este tipo de reproducción puede ser estimada debido al alto
grado de polimorfismo que generan los retrotransposones. Al igual que Bousios et al. (2007)
se encontró que A. tequilana presenta retrotransposones que están activos o que
posiblemente se activan durante el rápido desarrollo de los bulbilos y de los hijuelos de
rizoma.
Por otro lado, la presencia de transcritos de elementos móviles en la base de datos de EST de
Agave, confirma que no sólo se encuentran en el genoma de A. tequilana como elementos
crípticos (inactivos) como en la mayoría de los genomas de las plantas, lo que sugiere que se
están moviendo y como consecuencia de este movimiento se generan cambios en la
estructura del genoma. También en la base de datos de Agave se encontró diferentes clases
de elementos móviles como, transposones, retrotransposones y helitrones, todos como
posibles responsables de la alta variabilidad genética encontrada en la progenie de
reproducción asexual.
88
Este es el primer reporte sobre el desarrollo de frutos y semillas y viabilidad de semillas en
A. tequilana y A. americana. También describe por primera vez el desarrollo de los
gametofitos tanto femeninos como masculinos, así como el análisis molecular de la
variación genética sexual y asexual, además de evidenciar la presencia de retrotransposones
como causa de variabilidad genética en reproducción asexual. Esto enfatiza la necesidad de
realizar mucha más investigación básica a nivel genético y fisiológico usando como modelo
una planta con un rol de gran importancia en la economía de México.
89
7. CONCLUSIONES
Se logró generar híbridos por medio de cruzas inter-específicas entre A.tequilana y A.
americana como cruzas intra-específicas logrando obtener semillas viables y plantas
híbridas mantenidas en invernadero. La formación de híbridos en forma natural es una
estrategia evolutiva y de adaptación para Agave. Sin embargo, esto puede ser explotado en
especies como A. tequilana y A. americana.
Se caracterizó por medio de estudios histológicos, que el desarrollo del gametofito femenino
en A. tequilana como en A. americana, es del tipo Polygonum monospórico y el desarrollo
del gametofito masculino es de tipo sucesivo, con la generación de granos de polen
reticulados y disulcados.
Se estimó el tamaño del genoma de A. tequilana que en promedio es de 4077 Mpb por
medio de citometría de flujo y se confirmó el nivel de ploidía, siendo A. tequilana una
especie diploide.
Se estimó por análisis de marcadores moleculares los diferentes niveles de polimorfismo
entre plantas de reproducción sexual y asexual y se mostró polimorfismo entre plantas
madre, hijuelos y bulbilos.
Se identificó la presencia de retrotransposones en el genoma de A. tequilana por medio de
SSAP y determinó la posibilidad que la actividad de estos elementos podría contribuir a la
variabilidad observada.
Se identificó ADNc de genes de retrotransposones y otros tipos de transposones en la base
de datos de Agave, lo que confirma que estos elementos están transcripcionalmente activos y
potencialmente pueden ser una de las causas más importantes de las mutaciones y rearreglos
cromosómicos presentes en Agave.
90
8. PERSPECTIVAS
Con el estudio de la biología reproductiva de A. tequilana y con la demostración que es
posible obtener semillas viables, se puede empezar a realizar mejoramiento genético para
obtener líneas más eficientes en la producción de azúcares, o con resistencia a plagas que
han sido un problema importante en el cultivo de esta especie. También se pueden
seleccionar plantas más precoces y de esta manera reducir el tiempo de crecimiento.
Además, el mejoramiento genético asociado a marcadores moleculares puede ser útil para
esta especie de interés comercial.
La generación de híbridos con otras especies abre la posibilidad de obtener líneas que tengan
valor de interés agronómico. Ésto sólo ha sido realizado una vez en Tanzania con la
obtención de la línea 11648 que resultó de la cruza de (A. angustifolia × A. amaniensis) que
producía la fibra más resistente de todos los Agaves, la cual fue utilizada en la industria
cordelera. Algo parecido puede ser realizado con A.tequilana una especie con exclusiva
reproducción asexual que puede reproducirse sexualmente.
Por otro lado, es necesario realizar más estudios de este tipo en diferentes especies para
confirmar si toda la familia Agavaceae presenta la misma estrategia en el desarrollo del
gametofito femenino y masculino.
La presencia de un número elevado de elementos móviles activos en el genoma de A.
tequilana, como transposones y retrotransposones, aun no esta clara. Sin embargo, éstos
pueden estar involucrados en la generación de la variabilidad genética y jugar un rol
importante en la evolución y especiación. Será interesante analizar el nivel de expresión de
estos elementos móviles e identificar las zonas de expresión.
Los SSAP claramente nos muestra que los retrotransposones del tipo copia Ty1 están
ampliamente distribuidos en genoma de A. tequilana y el polimorfismo insercional generado
debe de ser cuantificado para tener un punto de comparación con los AFLP.
91
Sería interesante también identificar otro tipo de retrotransposones como gypsy Ty3, en el
genoma de Agave tequilana y estimar el número de copias, para entender mejor el impacto
que estos elementos causan en el genoma de Agave.
92
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