Download ANÁLISIS DEL PROCESO DE FORMACIÓN DE

CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD IRAPUATO
“ANÁLISIS DE LA FORMACIÓN DE BULBILOS EN Agave tequilana
A NIVEL HISTOLÓGICO Y MOLECULAR”
TESIS QUE PRESENTA
Ing. María Jazmín Abraham Juárez
PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORA EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE
BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS
DIRECCIÓN DE TESIS:
Dra. June K. Simpson Williamson
Dra. Aída Martínez Hernández
Irapuato, Gto.
Agosto 2010
La presente investigación se desarrolló en el Laboratorio de Genética Molecular del
Departamento de Ingeniería Genética en el Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional Unidad Irapuato, bajo la codirección de
la Dra. June K. Simpson Williamson, investigadora titular de esta institución y de la
Dra. Aída Martínez Hernández, investigadora titular del Colegio de Postgraduados
Campus Campeche.
1
DEDICATORIA
A Dios
por estar siempre conmigo
A mi esposo Alfredo Guzmán
por su amor y apoyo incondicional
A mis padres Jesús Abraham y Juana Juárez
por darme todo lo que tengo y apoyarme siempre
A mis hermanos Sanjuana, Rosario, Maricela, Dulce Elena y Jesús Horacio
por ayudarme a lograr mis metas
i
AGRADECIMIENTOS
Al CONACYT por el apoyo financiero que me otorgó para la realización de este trabajo con la
beca N° 191408.
Al Cinvestav por todas las facilidades otorgadas para la realización del posgrado.
A la Dra. June Simpson por su apoyo, asesoría y por permitirme ser parte de su grupo de
trabajo.
A la Dra. Aída Martínez Hernández por toda su colaboración en este trabajo como codirectora.
A los doctores Jean Philippe Vielle Calzada, Octavio Martínez de la Vega, Alfredo Herrera
Estrella y Neftalí Ochoa Alejo por sus acertadas sugerencias durante toda realización de este
trabajo como parte del comité tutorial.
A la Dra. Patricia León por sus sugerencias como sinodal externo.
Al Dr. Luis Herrera Estrella por su valiosa colaboración y sugerencias en los experimentos de
expresión heteróloga.
A la QFB Aurora Verver por su asesoría en las técnicas de microscopía.
A Marco Antonio Leyva González por todo su apoyo en los experimentos realizados con
Arabidopsis y por su amistad.
A Ilenia Rentería por su ayuda en los experimentos de hibridación in situ.
A los doctores Stefan de Folter y Nayelli Marsch por los recursos de Arabidopsis que nos
proporcionaron y por sus valiosas sugerencias.
A mi esposo Alfredo Guzmán por su apoyo incondicional, su opinión y sugerencias que
contribuyeron a la realización de este trabajo.
A mi amiga Katia Gil por el apoyo que me ha brindado siempre para lograr mis objetivos.
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Genética Molecular: Katia, Emi, Silvia,
Rocío, Celso, Miriam, Francisco y César que comparten conmigo el crédito de este trabajo.
A Fernando Hernández (Güero) por su amistad y su ayuda durante la realización de este
trabajo.
A mi amigo César Aza por su apoyo desde el inicio de mi estancia en Cinvestav.
A todo el personal administrativo y de apoyo del Cinvestav Unidad Irapuato por su
colaboración que contribuyó a llevar a cabo este proyecto.
ii
ÍNDICE GENERAL
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
Dedicatoria
Agradecimientos
Índice general
Índice de tablas
Índice de figuras
Resumen
Abstract
Introducción
Antecedentes
II.1. Importancia del género Agave
II.2. Agave tequilana Weber var. Azul
II.3. Descripción botánica
II.4. Clasificación taxonómica
II.5. Formas de propagación
II.6. Floración en Agave
II.7. Formación de bulbilos en Agave
II.8. Formación de bulbilos en otras especies
II.9. Reversión floral y reversión de la inflorescencia
II.10. Genes potencialmente involucrados en la reversión floral
II.11. Control genético del mantenimiento de meristemos
II.12. El papel de los genes KNOX en el inicio y mantenimiento
de meristemos
II.13. Análisis de expresión de genes involucrados en procesos de
desarrollo
Hipótesis
Objetivo general
Objetivos particulares
Materiales y métodos
VI.1. Inducción de la formación de bulbilos
VI.2. Colecta de muestras
VI.3. Análisis histológico
VI.3.1. Fijación en FAA
VI.3.2. Deshidratación en series de etanol
VI.3.3. Inclusión en parafina
VI.3.4. Cortes en microtomo
VI.3.5. Tinción
VI.4. Extracción de RNA total
VI.5. Purificación de mRNA (poli A)
VI.6. Elaboración de bibliotecas de cDNA
VI.6.1. Síntesis de la primera cadena de cDNA
VI.6.2. Síntesis de la segunda cadena de cDNA
VI.6.3. Ligación del adaptador attB1
VI.6.4. Fraccionamiento del cDNA por cromatografía en columna
VI.6.5. Recombinación BP en el vector Gateway pDONR 222
VI.6.6. Transformación de células de E. coli ElectroMAX DH10B
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24
25
25
iii
VII.
VI.6.7. Determinación del título de las bibliotecas
26
VI.6.8. Determinación de la calidad de las bibliotecas
26
VI.7. Secuenciación de las bibliotecas de cDNA
27
VI.8. Análisis de secuencias
27
VI.8.1 Análisis BLAST
27
VII.8.2 Análisis estadísticos
27
VII.8.3 Búsqueda de genes potencialmente involucrados en la formación de
bulbilos
29
VI.9. Análisis de expresión
30
VI.9.1. RT-PCR
30
VI.9.1.1. Síntesis del cDNA
30
VI.9.1.2. PCR
30
VI.9.2. RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
32
VI.9.3. Hibridación in situ
33
VI.9.3.1. Elaboración de ribosondas
33
VI.9.3.1.1. Preparación del templado de DNA
33
VI.9.3.1.2. Síntesis y marcaje de la ribosonda
34
VI.9.3.1.3. Remoción del templado de DNA
34
VI.9.3.2. Hibridación
35
VI.9.3.2.1. Pretratamiento del tejido
35
VI.9.3.2.2. Prehibridación
35
VI.9.3.2.3. Hibridación de ribosondas
36
VI.9.3.3. Lavados
36
VI.9.3.4. Bloqueo y adición del anticuerpo
36
VI.9.3.5. Lavados y adición de sustrato
37
VI.9.3.6. Lavados
37
VI.9.3.7 Montaje de las laminillas
37
VI.9.3.8. Observación al microscopio
37
VI.10. Búsqueda de genes ortólogos a los genes de
A. tequilana seleccionados para el análisis
37
VI.11. Análisis funcional por expresión heteróloga en
Arabidopsis thaliana
38
VI.11.1. Recombinación en el vector de expresión
38
VI.11.2. Transformación de Agrobacterium tumefaciens
40
VI.11.3. Siembra de A. thaliana wt Col 0 y mutantes del Stock Center
40
VI.11.4. Infiltración con A. tumefaciens
40
VI.11.5. Selección de líneas transformadas
41
VI.12. Análisis de expresión de genes de interés en las líneas transformadas 41
Resultados
42
VII.1. Inducción de la formación de bulbilos en A. tequilana
42
VII.2. Análisis morfológico e histológico
43
VII.3. Elaboración de bibliotecas de cDNA y búsqueda de genes
de interés
45
VII.4. Análisis de expresión por RT-PCR
51
iv
VII.5. Análisis de secuencias para determinar identidad a
genes reportados
VII.6. Análisis de expresión de los genes seleccionados
VII.6.1. RT-PCR en tiempo real
VII.6.2. Hibridación in situ
VII.7. Expresión heteróloga de los genes de A. tequilana en
A. thaliana
VII.7.1. Expresión constitutiva en plantas wt
VII.7.2. Complementación de la mutante knat1 de A. thaliana
con los genes KNOXI de A. tequilana
VII.7.3. Análisis de expresión de los genes KNAT1, KNAT6 y AS1 por
RT-PCR en las plantas transformantes
VIII.
Discusión
VIII.1. La formación de bulbilos tiene características de organogénesis
VIII.2. Identificación de genes potencialmente involucrados en la formación
de bulbilos
VIII.3. Los genes KNOXI son candidatos para conferir identidad
meristemática
VIII.4. Los dos genes KNOXI de A. tequilana actúan de forma
diferente sobre genes KNAT1, KNAT6 y AS1 de A. thaliana
VIII.5. Asociación de los genes KNOXI de A. tequilana con el inicio
de la formación de bulbilos
IX.
Conclusiones
X.
Perspectivas
XI.
Referencias bibliográficas
XII.
Apéndice
XII.1. Apéndice 1. Curvas de fusión para comprobar la especificidad de los
oligonucleótidos usados para los análisis de RT-PCR en tiempo real
de los genes de A. tequilana
XII.2. Apéndice 2. Artículo publicado en la revista Journal of Experimental
Botany
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106
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108
v
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para los RT-PCR y la hibridación in situ de los
genes seleccionados
31
Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados para los RT-PCR en tiempo real de los genes
de Agave tequilana y de Arabidopsis thaliana
33
Tabla 3. Estadísticas básicas de las bibliotecas de cDNA
46
Tabla 4. Resultados de la anotación de las secuencias de las bibliotecas por Gene
Ontology Arabidopsis
48
Tabla 5. Genes seleccionados potencialmente involucrados en la formación de
bulbilos
50
Tabla 6. Porcentajes de identidad entre las secuencias en aminoácidos de los genes
KNOXI de A. thaliana y A. tequilana
59
Tabla 7. Cálculos para determinar la expresión relativa del gen UNK1de Agave
60
Tabla 8. Números de accesión de las secuencias de A. tequilana depositadas en
el GenBank
70
Tabla 9. Líneas transformantes que presentaron segregación 3:1
73
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de una planta del subgénero Agave
Página
3
Figura 2. Agave tequilana Weber var. Azul
5
Figura 3. Esquema mostrando las formas de propagación en Agave tequilana
6
Figura 4. Meristemos
14
Figura 5. Estructura del meristemo apical del tallo
15
Figura 6. Vectores Gateway utilizados para clonación y expresión heteróloga
39
Figura 7. Inducción de la formación de bulbilos
43
Figura 8. Etapas de desarrollo analizadas durante la formación de bulbilos
44
Figura 9. Etapas de la elaboración de bibliotecas de cDNA
45
Figura 10. Gráficas de categorización correspondientes a los datos de la Tabla 3
de la anotación de secuencias del total de Agave y del total de bulbilos
49
Figura 11. Análisis de expresión por RT-PCR de los 11 genes potencialmente
involucrados en la formación de bulbilos
52
Figura 12. Alineamiento de UNK1
53
Figura 13. Alineamiento de UNK2
53
Figura 14. Alineamiento de WIP
54
Figura 15. Árbol de relaciones genéticas de la familia WIP de factores de
transcripción de dedos de zinc del grupo A1
55
Figura 16. Alineamiento de las dos secuencias GlsA de A. tequilana y la proteína GlsA
de L. longiflorum
56
Figura 17. Árbol de relaciones genéticas de las secuencias GlsA de A. tequilana,
L. longiflorum y A. thaliana
57
Figura 18. Alineamiento de las proteínas KNOXI de A. thaliana y de A. tequilana
58
Figura 19. Árbol de relaciones genéticas de varios miembros de la familia KNOX
de diferentes plantas
59
vii
Figura 20. Análisis por RT-PCR en tiempo real de los genes de A. tequilana
seleccionados durante las etapas de la formación de bulbilos
61
Figura 21. Esquema de los tejidos disectados para la hibridación in situ
62
Figura 22. Localización del mRNA de los genes UNK1, UNK2, AtqKNOX1 y
AtqKNOX2 por hibridación in situ
63
Figura 23. DNA plasmídico y PCR de las clonas de E. coli con AtqKNOX2
70
Figura 24. DNA plasmídico y PCR de las clonas de A. tumefaciens con AtqKNOX2
71
Figura 25. Expresión de GFP en las plantas transformantes
72
Figura 26. Fenotipos de las plantas de A. thaliana expresando constitutivamente
los genes de A. tequilana y análisis de expresión por RT-PCR
74
Figura 27. Fenotipos producidos por la expresión constitutiva de los genes KNOX de
A. tequilana en A. thaliana
75
Figura 28. RT-PCR en tiempo real de AtqKNOX1 y AtqKNOX2 en tres líneas
transformantes independientes, homocigotas
76
Figura 29. Fenotipo de floración tardía de las transformantes 35S::AtqKNOX
78
Figura 30. Fenotipo de la mutante knat1 complementada con los genes KNOXI
de A. tequilana
79
Figura 31. Análisis por RT-PCR del efecto de la expresión de los genes KNOXI de
A. tequilana sobre los genes endógenos de A. thaliana KNAT1, KNAT6
y AS1
81
Figura 32. Análisis de expresión por RT-PCR en tiempo real de los genes de A. thaliana
KNAT1, KNAT6 y AS1 por efecto de la expresión constitutiva de AtqKNOX1
y AtqKNOX2
82
Figura 33. RT-PCR de KNAT1 y KNAT6 en tejido de tallos (T) y nodos (N) de la
inflorescencia de plantas wt, knat1 y knat1 complementadas con
AtqKNOX1 y AtqKNOX2
83
Figura 34. Modelo de estrategias de reproducción en Agave tequilana
92
Figura 35. Modelo de dominios de expresión de genes en la formación de bulbilos
92
viii
RESUMEN
En la familia Agavaceae, un proceso alternativo en la forma de reproducción es la formación de
bulbilos, el cual no es muy frecuente en la naturaleza, ha sido poco estudiado en los agaves y casi es
desconocido en Agave tequilana debido a que se cortan las inflorescencias como parte del manejo
agronómico del cultivo. En este trabajo fue analizada la formación de bulbilos en A. tequilana con el
objetivo de entender este fenómeno a nivel histológico y molecular. Los bulbilos se formaron de 14 a
45 días después de la inducción y se asociaron con rearreglos en la estructura del tejido y
multiplicación celular acelerada. Los cambios a nivel celular durante el desarrollo de bulbilos fueron
documentados por un análisis histológico. En adición se elaboraron varias bibliotecas de cDNA
proveniente de diferentes estados del desarrollo de bulbilos y fueron parcialmente secuenciadas. El
análisis de las secuencias condujo a la identificación de genes potencialmente involucrados en el inicio
y desarrollo de bulbilos en Agave, incluyendo dos secuencias para las que no se encontró identidad a
genes caracterizados previamente, un posible factor de transcripción de tipo dedos de zinc de la familia
WIP y dos posibles genes de la clase KNOXI (nombrados AtqKNOX1 y AtqKNOX2). Análisis de RTPCR en tiempo real y de hibridación in situ revelaron que la expresión de los genes candidatos ocurre
en el inicio de la formación de bulbilos y específicamente en el tejido donde se desarrollarán los
meristemos. Los cinco genes candidatos fueron expresados en Arabidopsis thaliana para el análisis
funcional. Cuatro de los cinco genes provocaron alteración en la forma de las hojas, los genes
AtqKNOX1 y AtqKNOX2 mostraron el fenotipo lobulado característico de la expresión ectópica de
KNOXI en hojas, aunque se observó un fenotipo ligeramente diferente en las transformantes de
arabidopsis para cada uno de ellos. Una línea mutante KNOXI de A. thaliana fue exitosamente
complementada con AtqKNOX2 de A. tequilana y parcialmente complementada por AtqKNOX1. El
análisis de expresión de los genes endógenos de A. thaliana KNAT1, KNAT6 y AS1 en las líneas
transformadas expresando ectópicamente los genes KNOXI de A. tequilana o complementadas mostró
diferentes patrones regulatorios para cada gen de Agave. Estos resultados muestran que los genes
KNOX de A. tequilana son funcionalmente similares a los genes de la Clase KNOXI y sugieren que el
control espacial y temporal de su expresión es esencial durante la formación de bulbilos en A.
tequilana. Con este trabajo se logró identificar un grupo de genes potencialmente involucrados en la
formación de bulbilos en A. tequilana, posteriormente se llevará a cabo el análisis de la interacción
molecular entre ellos y la caracterización de los genes para los que no se encontró homología a genes
reportados en otras plantas.
ix
ABSTRACT
In the Agavaceae family an alternative reproductive strategy is bulbil formation, which is not frequent
in nature, has been poorly studied in agaves and is almost unknown in Agave tequilana due to the
agricultural practice of removing the inflorescences soon after emergence. In this work bulbil
formation in A. tequilana was analyzed with the objective of understanding this phenomenon at the
histological and molecular level. Bulbils formed 14-45 days after induction, and were associated with
rearrangements in tissue structure and accelerated cell multiplication. Changes at the cellular level
during bulbil development were documented by histological analysis. In addition several cDNA
libraries produced from different stages of bulbil development were generated and partially sequenced.
Sequence analysis led to the identification of genes potentially involved in the initiation and
development of bulbils in A. tequilana, including two sequences for which no identity to genes
characterized previously was found, a putative zinc finger transcription factor of the WIP family and
two putative Class I KNOX genes (named AtqKNOX1 and AtqKNOX2). Real time RT-PCR and in situ
hybridization revealed that expression of the candidate genes occurs at bulbil initiation and specifically
in tissue where meristems will develop. The five candidate genes were expressed in Arabidopsis
thaliana for functional analysis. Four of the five genes caused alteration in leaf form, AtqKNOX1 and
AtqKNOX2 showed the characteristic lobed phenotype of KNOXI ectopic expression in leaves,
although a slightly different phenotype was observed in transformant arabidopsis for each of them. An
A. thaliana KNOXI (knat1) mutant line was successfully complemented with AtqKNOX2 and partially
complemented by AtqKNOX1. Analysis of the expression of the endogenous A. thaliana genes KNAT1,
KNAT6 and AS1 in the transformed lines ectopically expressing or complemented by the A. tequilana
KNOX genes again showed different regulatory patterns for each Agave gene. These results show that
Agave KNOX genes are functionally similar to Class I KNOX genes and suggest that spatial and
temporal control of their expression is essential during bulbil formation in A. tequilana. This work
identified a group of genes potentially involved in bulbil formation in A. tequilana. Future work will
focus on the analysis of the molecular interactions between them and the characterization of the genes
for which no homology to genes reported in other plants was found.
x
I.
INTRODUCCIÓN
La familia Agavaceae con 9 géneros y 330 especies es endémica de América y su
centro de origen y diversidad se encuentra en México donde se localizan 76% de las especies
descritas en el mundo (García-Mendoza, 2004). El hombre ha aprovechado las especies de
Agave como alimento, bebidas, herramientas, fibras, medicamentos y como material de
construcción desde tiempos prehistóricos. Actualmente su importancia económica se deriva
principalmente de la obtención de fibras y bebidas alcohólicas
como tequila y mezcal
(Valenzuela, 1997).
La mayoría de los agaves son semélparos (sólo florecen una vez) y tienen un ciclo de
vida largo (en
A. tequilana es de 6 – 8 años). Se pueden reproducir en forma sexual por
semillas y en forma asexual por hijuelos de rizoma y por bulbilos de la inflorescencia. La vía
sexual no es utilizada para la propagación en campo y debido a que se suprime la floración por
las prácticas agronómicas, prácticamente nunca se ven plantas floreciendo. Los bulbilos son
hijuelos pequeños que emergen de los tallos florales cuando no tiene éxito la formación de
semillas, y cada tallo floral produce alrededor de 20 bulbilos, por lo que una planta puede
producir una gran cantidad de estos (Arizaga y Ezcurra, 1995; Valenzuela, 1997).
En ambientes extremos como en los que se desarrollan las especies de Agave y otras
plantas semélparas, la propagación vegetativa funciona como una estrategia segura para
perpetuar el genotipo, ya que la reproducción sexual parece involucrar grandes riesgos y la
probabilidad de éxito en el establecimiento
de nuevas plántulas con frecuencia es
extremadamente baja por estar sujeta a la limitada oportunidad en espacio y tiempo. En
contraste, los propágulos vegetativos tienen la ventaja de estar unidos a la planta madre
durante las etapas tempranas de su ciclo de vida, un hecho que les da una probabilidad mucho
más alta de sobrevivir en condiciones ambientales desfavorables (Arizaga y Ezcurra, 2002).
La formación de bulbilos es un proceso poco frecuente en la naturaleza y ha sido muy
poco estudiado, por lo que no se conocen con exactitud cuáles son las condiciones que lo
inducen. En base a los pocos reportes descriptivos que existen, parece ser que implica una
1
reversión de la fase reproductiva a la fase vegetativa, por lo que se puede relacionar con la
reversión de la inflorescencia. Su estudio puede ser de gran utilidad para identificar genes
involucrados que probablemente se encuentren conservados en las especies formadoras de
bulbilos y se puedan manipular para conducir las señales necesarias para lograr la propagación
vegetativa de especies que presentan dificultad para reproducirse por otros medios.
II.
ANTECEDENTES
II.1. Importancia del género Agave
En México se localizan las dos subfamilias de la familia Agavaceae, los 9 géneros que
la constituyen y 251 especies, lo que representa el 76% de todas las descritas en el mundo. El
género más diverso es Agave, de sus aproximadamente 200 especies en América, 150 (75%)
se distribuyen en México con un 69% de endemismo (García-Mendoza, 2004).
El género Agave, cuyo nombre viene del griego y significa “admirable”, fue descrito
inicialmente por Carlos Linneo en 1753; éste se divide en dos subgéneros: Agave, con
inflorescencia en panícula o umbelada y Littaea, en forma de espiga; las especies de mayor
importancia económica pertenecen al subgénero Agave (Gentry, 1982), en la Figura 1 se
muestra la estructura de las plantas de este subgénero.
Durante el florecimiento de las culturas mesoamericanas, las agaváceas jugaron un
papel muy importante, proporcionándole al hombre alimento, calor, techo, vestido, medicina,
bebida, uso religioso, ornato, muebles, implementos agrícolas, forrajes y otros usos diversos;
fue el cultivo más importante después del maíz (Granados, 1993). En la actualidad aún se
señalan más de 70 formas de empleo, siendo las principales, la obtención de bebidas
fermentadas (como el pulque), bebidas destiladas (como el tequila y el mezcal) y la obtención
de fibras largas y cortas de numerosas especies (como el henequén, la lechuguilla y el espadín)
(García-Mendoza, 1992).
2
Fig. 1. Estructura de una planta del subgénero Agave. Colunga-García et al., 2007.
II.2. Agave tequilana Weber var. Azul
Agave tequilana Weber var. Azul es la variedad permitida por la Norma Oficial
Mexicana (NOM-006-SCFI-1994) para elaborar tequila y ha sido por muchos años la preferida
por los productores e industriales. Sus características distintivas son el intenso color azul de
sus hojas, lo prolífica en hijuelos de rizoma (principal vía de reproducción en campo) y sobre
todo, sus magníficas cualidades para la elaboración de tequila, como son la gran cantidad de
azúcares (20-24%) almacenados en la piña y la menor dureza de sus fibras (Valenzuela, 1997).
3
II.3. Descripción botánica
Agave tequilana es una planta suculenta de 2.2 a 2.8 metros de altura. Su tallo es
grueso y corto de 30 a 50 cm de altura al madurar. Las hojas de 90 a 120 cm son lanceoladas y
de fibras firmes, cóncavas de ascendentes a horizontales. Lo más ancho de las hojas se
encuentra hacia la mitad y son angostas y gruesas hacia la base, generalmente de color glauco
azulado a verde grisáceo. Los dientes generalmente son de 3 a 6 mm de largo, de color café
claro a oscuro, de 1 a 2 cm de separación. La espina generalmente es corta de 1 a 2 cm de
largo (Figura 2A). La inflorescencia es una panícula de 5 a 6 metros de altura y densamente
ramosa, con 20 umbelas de flores verdes y estambres rosados (Figura 2B). Las flores son de
68 a 75 mm de largo. El ovario es de 32 a 38 mm de largo, cilíndrico con cuello corto, casi
terminado en punta sobre la base. Los filamentos miden de 45 a 50 mm de largo doblados
hacia adentro junto al pistilo, insertos de 7 a 5 mm cerca de la base del tubo, las anteras son de
25 mm de largo (Figura 2C). El fruto es una cápsula ovada a brevemente cuspidada (Gentry,
1982).
II.4. Clasificación taxonómica
La clasificación taxonómica de la familia Agavaceae ha cambiado a través del tiempo,
siendo en la actualidad más aceptada la propuesta por Dahlgren et al., en 1984 (GarcíaMendoza, 2004), delimitando a la familia con 8 géneros y un noveno segregado de Yucca. La
clasificación taxonómica de Agave tequilana se describe a continuación.
División: Angiospermae
Clase: Monocotyledonae
Orden: Asparagales
Familia: Agavaceae
Subfamilia: Agavoideae
Género: Agave
Subgénero: Agave
Especie: Agave tequilana
Variedad: Azul
(García-Mendoza, 2004; Colunga-García et al., 2007).
4
A
B
C
Anteras
Pistilo
Tépalos
Ovario
Pedicelo
Fig. 2. Agave tequilana Weber var. Azul. A, planta en etapa de desarrollo
vegetativo. B, planta en etapa de desarrollo reproductivo, mostrando botones
florales. C, flor y botón floral.
II.5. Formas de propagación
El agave tequilero tiene tres formas de propagarse: por vía sexual en forma de semillas,
por hijuelos de rizomas y por bulbilos de la inflorescencia o quiote (Fig. 3); las dos últimas
formas son vías asexuales. La vía sexual, por semillas, no es utilizada comercialmente y pocas
veces se ve, ya que se suprime la floración del cultivo. Las semillas tienen bajo porcentaje de
germinación (10% aprox.), su crecimiento es lento y las plántulas
resultantes son muy
heterogéneas para ser utilizadas en el cultivo. Los hijuelos de rizoma son usados comúnmente
para el establecimiento de plantaciones. Ésta ha sido la única forma de propagación que se ha
5
practicado durante mucho tiempo (doscientos años o más). La ventaja de esta forma de
propagación es la rapidez con que se obtienen plántulas de buen tamaño (dos años
aproximadamente) y la cantidad de éstas que produce la planta (15-20). Los bulbilos son
hijuelos pequeños que emergen en el quiote, junto con las flores no fecundadas que caen
posteriormente sin formar frutos. Son poco frecuentes y casi desconocidos porque la floración
se reprime cortando el eje floral al inicio de su emergencia para evitar que la planta gaste
rápidamente sus reservas metabólicas en la formación de la inflorescencia. Estos hijuelos no se
utilizan en la propagación de material vegetativo para plantación (Valenzuela, 1997).
Fig. 3. Esquema mostrando las formas de propagación en Agave tequilana. Adaptado de
Arizaga y Ezcurra, 2002.
6
II.6. Floración en Agave
Los agaves son monocárpicos, semélparos, es decir, que solo tienen una floración al
cabo de la cual la planta muere (Granados, 1993). Agave tequilana Weber var. azul florece de
los 6 a los 12 años de edad, dependiendo del lugar donde se cultive y el manejo que se le dé.
Otros factores importantes para la floración son las características genéticas asociadas con
precocidad o retraso en floración y el tamaño del hijuelo plantado. En lugares cálidos las
plantas tardan menos tiempo en florecer que en sitios templados. Iniciado el proceso de
floración la planta muere en aproximadamente diez meses (Valenzuela, 1997).
El eje floral tiene un crecimiento semanal promedio de 3.5 cm que dura alrededor de
cuatro meses, al terminar el crecimiento del quiote (eje floral) prosigue el desarrollo de los
brazos o pedúnculos (umbelas), donde se diferencian los agrupamientos florales. Las
inflorescencias son de tipo paniculada y las flores no tienen pétalos ni sépalos, en su lugar
existen unas estructuras que tienen las características entre estos dos tipos de órganos florales,
y son conocidos como tépalos (Fig. 2). Las flores son protándricas y el proceso de floración
procede en diferentes etapas; en la primera etapa se abren los tépalos para descubrir las anteras
dobladas, en los siguientes días las anteras emergen, el polen madura y es dispersado, después
las anteras se empiezan a secar y el estigma madura. El crecimiento de los tubos polínicos y la
fertilización puede tardar hasta una semana. De 10 a 15% de las flores caen en forma natural.
Sin embargo, esto es muy variable ya que en el campo se han observado plantas que no llegan
a producir frutos, es decir, que todas sus flores caen sin fertilizar. Después de diez meses de
emergido el quiote, los frutos maduran completamente, se abren y dispersan sus semillas. En
este punto la planta alcanza su madurez fisiológica y ha gastado todas sus reservas acumuladas
por varios años (Valenzuela, 1997).
II.7. Formación de bulbilos en Agave
En los agaves un proceso alternativo a la reproducción por semillas es la formación de
bulbilos, ésta forma de reproducción es poco frecuente en la naturaleza, ha sido muy poco
estudiado y casi es desconocido en A. tequilana debido al corte de las inflorescencias en los
7
campos de cultivo. Los bulbilos son plántulas que se desarrollan en las axilas de las brácteas
de la inflorescencia, las manipulaciones que inducen su formación incluyen el corte de los
botones florales y la exclusión de polinizadores (Arizaga y Ezcurra, 1995). Su emergencia se
refleja sobre todo en las partes bajas del eje floral, esto es, en las primeras flores que logran la
antesis. Cuando los frutos maduran completamente, los bulbilos alcanzan un tamaño máximo
de seis a siete centímetros, con raíces adventicias y algunos se empiezan a desprender
(Valenzuela, 1997).
La producción de bulbilos es prolífica en A. angustifolia Haw. var. marginata, A.
fourcroydes Lem., A. murpheyi, A. sisalana y A. wercklei. Cuatro de estas especies no
producen semillas germinables y pueden representar híbridos estériles (Szarek et al., 1996).
Las plantas que producen un gran número de cápsulas con semillas, usualmente no forman
bulbilos o muy pocos y las que producen pocas cápsulas forman grandes cantidades de
bulbilos, por lo que se ha sugerido que la formación de bulbilos está inversamente relacionada
al éxito de la fructificación (Arizaga y Ezcurra, 1995).
Valenzuela en 1992 indujo con el corte de botones florales la propagación de bulbilos
y encontró que no solo los botones cortados emiten bulbilos, sino también las flores que no
reciben polen extraño. La propagación por bulbilos es una técnica utilizada en otras especies
de agave como en A. angustifolia y A. sisalana; de esta manera se obtienen tantos bulbilos
como botones florales hayan existido, de 2000 a 3000 plántulas por planta madre se han
observado en sisal. Esta técnica es relativamente más barata para la propagación masiva; sin
embargo, habría que estudiar la homogeneidad genética que se produce y tomar en cuenta el
tiempo de maduración de cada especie (Valenzuela, 1997).
En Agave, la movilización de las reservas metabólicas mantenidas en la base de la
roseta parece ser un proceso fisiológico irreversible, una vez que el desarrollo del eje floral ha
sido disparado y las reservas empiezan a ser hidrolizadas y translocadas,
el esfuerzo
reproductivo final y la senescencia de la roseta no pueden ser revertidos. Entonces, si la
reproducción sexual falla, ya sea por condiciones ambientales desfavorables, carencia de
polinizadores o excesiva predación de flores, la planta puede aún asegurar su descendencia
8
con la formación de bulbilos, los cuales recuperan las fuentes metabólicas que han sido
movilizadas. Los bulbilos parecen ser una respuesta adaptativa a este problema, evitando así
un colapso demográfico (Arizaga y Ezcurra, 1995).
En bulbilos de Agave vilmoriniana se reportó que estos hijuelos del quiote pueden
permanecer unidos a la planta madre por un tiempo de hasta dos años después de emergidos,
debido a que son fotosintéticamente competentes gracias a la senescencia de las hojas de la
planta, absorbiendo así toda el agua y nutrimentos que capta ésta. Además, los bulbilos unidos
no abren los estomas o solo lo hacen de manera intermitente, por lo que dependen aún de la
planta madre. La liberación de los bulbilos no ocurre en un solo evento masivo; la mayoría
permanecen unidos y si no se separan cuando han alcanzado un tamaño de aproximadamente
10 cm, cuando la planta ha agotado sus reservas (en 1.5 a 2 años), los bulbilos unidos a ella
mueren. Cuando son plantados en suelo, sus características cambian rápidamente, comienza la
hidratación, el crecimiento de raíces y se observa la acidificación nocturna característica de
las plantas CAM (Metabolismo Ácido Crasuláceo); todos los bulbilos son viables si se
mantienen a una temperatura de entre 15 y 25 °C (Szarek y Holmesley, 1996).
En ambientes extremos, la propagación vegetativa funciona como una estrategia segura
para perpetuar el genotipo; los propágulos vegetativos tienen la ventaja de estar unidos a la
planta madre durante las etapas tempranas de su ciclo de vida, teniendo una probabilidad
mucho más alta de sobrevivir (Arizaga y Ezcurra, 2002). Esta hipótesis también se propuso en
Titanotrichum oldhamii, otra planta que presenta formación de bulbilos, sugiriéndose que la
transformación de meristemos florales a bulbilos es un fenómeno ocasional en las plantas en
floración, quizá basado en un mecanismo genético común en estas plantas y que ha sido
atribuido a las condiciones ambientales, así como a factores intrínsecos como la posición en la
inflorescencia (Diggle, 1997).
Los reportes existentes sobre la producción de bulbilos en Agave están basados
principalmente en observaciones hechas en campo; no hay ningún reporte en que se haya
hecho una descripción a nivel histológico detallada, y se desconocen por completo las bases
9
moleculares que determinan la formación de estos propágulos vegetativos en la inflorescencia
(evento muy poco común en la naturaleza).
II.8. Formación de bulbilos en otras especies
A pesar de que la formación de bulbilos es un proceso relativamente poco frecuente, se
sabe que su formación no es exclusiva de la familia Agavaceae, también está presente en otras
familias de monocotiledóneas como Liliaceae, Musaceae, Gramineae, Orchidaceae y aún en
dicotiledóneas como Brassicaceae, Saxifragaceae y Gesneriaceae (Arizaga y Ezcurra, 1995).
Un ejemplo de la formación de bulbilos similar a lo que se observa en el género
Agave, es Titanotrichum oldhamii que pertenece a la familia Gesneriaceae; este es uno de los
pocos estudios reportados que existen sobre bulbilos de la inflorescencia. En esta planta un
solo meristemo floral es reemplazado por un grupo de 50 a 70 bulbilos, formados en las
axilas de las brácteas. Al final de la época de floración, la mayor parte de los meristemos
florales se convierten en meristemos vegetativos, dando lugar a los bulbilos; así decenas de
miles de bulbilos pueden producirse de una sola planta y el porcentaje de viabilidad de éstos es
muy alto (alrededor de 95%) comparado con el de las semillas (75% aproximadamente), por lo
que los bulbilos son el principal medio de propagación de Titanotrichum (Wang y Cronk,
2003).
En Titanotrichum oldhamii la formación de bulbilos se ha observado al final de la
época de floración (finales de agosto) debido a que se acortan los días, cambiando de
condiciones inductivas de la floración (fotoperiodo de días largos) a condiciones no inductivas
(fotoperiodo de días cortos). Pero también se ha observado su formación cuando el ápice del
brote de las inflorescencias es cortado, aún en individuos creciendo en días largos. La
formación de bulbilos comienza de todos los meristemos axilares inmediatamente después de
la manipulación física del meristemo apical del brote (Wang y Cronk, 2003), por lo que no
solo las condiciones ambientales sino también la regulación de hormonas puede estar
involucrada en el inicio de los bulbilos (Wang et al., 2004).
10
En el caso de agave las observaciones sugieren que la eliminación de botones florales y
la exclusión de polinizadores son algunos de los factores que llevan a la formación de bulbilos
(Arizaga y Ezcurra, 1995; Valenzuela, 1997). Otros factores que podrían estar involucrados
son el fotoperiodo, el estrés ambiental y la regulación hormonal, pero aún no se ha hecho un
estudio dirigido que compruebe si esto es real. En Agave tequilana el porcentaje de
germinación de las semillas en campo es apenas de alrededor de 12% (Escobar-Guzmán et al.,
2008), lo que sugiere que requiere vías alternativas de propagación.
II.9. Reversión floral y reversión de la inflorescencia
En muchas especies, una vez que el programa floral se ha iniciado, éste continúa,
independientemente de las condiciones ambientales, lo que sugiere la existencia de
mecanismos que controlan el mantenimiento del estado floral. Sin embargo, hay excepciones,
como el caso de plantas que pueden revertir ese proceso, para seguir formando estructuras
vegetativas cuando se eliminan las condiciones inductivas.
La reversión floral es un proceso en el cual se observa la producción de hojas después
de un periodo de desarrollo de flores. Hay dos tipos: la reversión de la inflorescencia, en la
cual el desarrollo vegetativo ocurre después o entre el desarrollo de la inflorescencia, y la
reversión floral, en la cual la forma de la flor es alterada por sí misma (Battey y Lyndon,
1990).
En las plantas perennes, la reversión de la inflorescencia es un mecanismo para
asegurar un tipo de vida policárpica, ya que permite que la planta cambie repetidamente entre
desarrollo vegetativo y reproductivo. Las plantas pseudovivíparas muestran una forma de
proliferación de la inflorescencia en la cual el proceso de floración es abortado y el desarrollo
posterior
produce brotes de hojas o bulbilos (Tooke et al., 2005). Los ambientes que
favorecen la reproducción por medio de reversión de la inflorescencia incluyen: alta
precipitación y humedad, altas altitudes y latitudes, zonas frías, áridas y semiáridas. Las
especies pseudovivíparas son generalmente perennes, y se ha propuesto que esta reproducción
vegetativa, podría ser vista como un aseguramiento de éxito en la reproducción; quizá el
11
desarrollo pseudovivíparo
es una característica de las plantas que carecen de suficiente
redundancia genética para destinar la planta a la floración, como ha sido propuesto para
Impatiens balsamina, la cual presenta reversión floral (Pouteau et al., 1998). Y dada la
vulnerabilidad del desarrollo floral a condiciones ambientales se asegura que la floración
siempre resulte en la reproducción ya sea sexual o asexual (Tooke et al., 2005).
Algunos autores han clasificado la formación de bulbilos en Agave como un tipo de
reversión de la inflorescencia y como uno de los casos en que esta reversión tiene un
significado funcional en plantas perennes pseudovivíparas. Sin embargo, se debe considerar
que el término “reversión de la inflorescencia” es un concepto muy amplio y que es necesario
establecer con exactitud los eventos que ocurren en una especie determinada cuando se lleva a
cabo la propagación vegetativa después de la etapa de floración. La descripción adecuada
permitirá clasificar el fenómeno en diferentes tipos de reversión, para lo cual será de gran
utilidad conocer el mecanismo molecular por el que ocurre la reversión.
II.10. Genes potencialmente involucrados en la reversión floral
La sobreexpresión de varios de los genes responsables de conferir identidad al
meristemo floral provoca el reemplazo de brotes por flores. Han sido identificados varios
genes que son requeridos para conferir identidad floral a meristemos en formación. Entre
ellos están LEAFY (LFY), APETALA1 (AP1) y los tres genes relacionados a éstos, que son
APETALA2 (AP2), CAULIFLOWER (CAL) y FRUITFULL (FUL). La expresión finamente
regulada de estos genes es requerida para que un meristemo tome el destino de meristemo
floral y se desarrollen los órganos florales (Weigel and Nilsson, 1995; Liljegren et al., 1999).
Sin embargo, la falta de expresión de estos genes, conduce a que los meristemos florales sean
parcial o completamente reemplazados por meristemos vegetativos. Otros genes participan en
determinar la identidad del meristemo floral de forma negativa. Así por ejemplo, la actividad
de los genes de identidad del meristemo floral es contrarrestada por TERMINAL FLOWER1
(TFL1), un gen que suprime la expresión de los genes de floración en forma espacial y
temporal (Liljegren et al., 1999; Parcy, 2002).
12
Aunque se han identificado varios de los genes implicados en la identidad de
meristemo floral y el desarrollo de los órganos florales, pocos estudios se han realizado para
determinar cuáles genes están implicados en el proceso de reversión floral. Sin embargo, se ha
observado que algunos de los genes que han sido implicados en el mantenimiento de la
identidad del meristemo floral, LEAFY y AGAMOUS podrían estar involucrados
negativamente en este proceso. Se conoce poco acerca de cómo las proteínas codificadas por
LEAFY y AGAMOUS gobiernan la identidad del meristemo a nivel celular y molecular.
Estudios previos sugieren que el mantenimiento de la identidad del meristemo floral en
mutantes lfy y ag es controlado
por el fotoperiodo y por una clase de reguladores de
crecimiento de plantas, las giberelinas (por lo tanto, cambios en estos factores podrían inducir
la reversión floral). Se ha observado que bajo fotoperiodo de días cortos las flores de
mutantes heterocigotos lfy-6 y homocigotos ag-1 muestran una transformación de flores a
meristemos vegetativos en la inflorescencia, un cambio en el desarrollo llamado “reversión
del meristemo floral”, y se ha propuesto que LFY y AG funcionan juntos para mantener la
identidad del meristemo floral, en parte, regulando negativamente la expresión de genes que
promueven el desarrollo de brotes vegetativos tales como TFL1 y EMF (EMBRYONIC
FLOWER) (Okamuro et al., 1993; Okamuro et al., 1996).
En Titanotrichum oldhamii se propuso que el gen GFLO (homólogo de FLORICAULA
de Antirrhinum y LEAFY de Arabidopsis) es un posible candidato para la regulación de la
transición del meristemo floral a meristemo vegetativo que da origen a los bulbilos. Para
investigar esta hipótesis, fue aislado el gen GFLO y su análisis de expresión mostró que es
fuertemente expresado en el meristemo apical de la inflorescencia y en flores jóvenes. Sin
embargo en meristemos que habían iniciado la formación de bulbilos su expresión fue muy
reducida, por lo que se infirió que GFLO puede ser parte de la ruta regulatoria de la transición
de flores a bulbilos (Wang et al., 2004), probablemente regulando negativamente los genes
que promueven el desarrollo de brotes vegetativos como TFL1 (Okamuro et al., 1996).
13
II.11. Control genético del mantenimiento de meristemos
Los meristemos son poblaciones de células indiferenciadas que proliferan
continuamente para generar tejidos y órganos. Dado que pueden modular su actividad en
respuesta a estímulos externos, dan la flexibilidad en el desarrollo, que permite a las plantas
controlar su forma y crecimiento dependiendo de las condiciones en que se encuentran (Aida y
Tasaka, 2006). Existen diferentes tipos de meristemos en las plantas: los meristemos apicales
que están posicionados en la punta del tallo y de la raíz, y a partir de ellos se generan los
órganos aéreos y subterráneos, respectivamente. A lo largo de los tallos y raíces se encuentran
dispersos otros meristemos, que son responsables del crecimiento de órganos y tejidos
secundarios (Traas y Hamant, 2009) (Figura 4).
Fig. 4. Meristemos. A, diagrama de una planta completa mostrando los diferentes tipos de
meristemos. B, micrografía electrónica de un meristemo apical de maíz, P, primordios de
hojas, CF, células fundadoras. Adaptado de Kerstetter y Hake, 1997; Tsiantis y Hay, 2003.
14
El meristemo apical del tallo (SAM) tiene distintas capas celulares, la túnica (L1) que
cubre los tejidos internos, ésta se divide más frecuentemente en orientación anticlinal; la
segunda de afuera hacia adentro es la L2, que desaparece usualmente durante el inicio de la
formación de órganos cuando las células de esta comienzan a dividirse al azar, anticlinal y
periclinal; estas dos capas cubren la parte interna del meristemo llamada corpus, que está
dividido en zonas con funciones particulares. En el centro, se encuentra un pequeño grupo de
células que se dividen lentamente llamado zona central (ZC), ésta asegura el mantenimiento
del meristemo. En la zona periférica (ZP) la proliferación celular es más rápida, en esta zona
es donde se inician los órganos laterales (Figura 5) (Rast y Simon, 2008).
Fig. 5. Estructura del meristemo apical del tallo.
Existen análisis genéticos que han identificado una serie de reguladores
transcripcionales involucrados en el funcionamiento del meristemo y el inicio y crecimiento
de órganos. Dentro de ellos que se encuentran: el factor de transcripción WUSHEL (WUS) que
es requerido para mantener el meristemo, pues la mutante correspondiente inicia un SAM pero
se detiene después de la producción de unos cuantos órganos (Mayer et al., 1998). Sus genes
blanco y reguladores son desconocidos, aunque se sabe que promueve la expresión del péptido
de señalización CLAVATA3 y reprime varios factores de respuesta a citocininas
pertenecientes al tipo “A” de reguladores de respuesta en A. thaliana (Leibfried et al., 2005).
En la periferia del meristemo, el reclutamiento de células fundadoras de órganos parece ser
resultado de dos procesos antagonistas. Primero, el factor de transcripción de la familia
KNOXI, SHOOT MERISTEMLESS (STM) en combinación con varios miembros de la familia
CUP SHAPED COTYLEDON (CUC) define la identidad meristemática, previniendo que las
células sean reclutadas para iniciar órganos (Long et al., 1996; Vroemen et al., 2003). Cuando
15
un nuevo órgano inicia, estos genes de identidad meristemática son apagados. Se han
reportado varios reguladores negativos de estos genes incluyendo ASYMMETRIC LEAVES 1
(AS1), el cual se ha reportado que tiene la función de iniciar órganos laterales como hojas
(Byrne et al., 2000). La identidad de los órganos laterales depende de la actividad de LEAFY
(LFY) el cual interactúa con diferentes factores de transcripción como WUS y AG para definir
la arquitectura de la flor en la planta (Lenhard et al., 2001).
II.12. El papel de los genes KNOX en el inicio y mantenimiento de meristemos
En Arabidopsis thaliana los genes de la familia KNOX pertenecen a un grupo de
factores de transcripción de tipo Homeodominio y se divide en dos grupos que están
conservados en angiospermas entre eudicotiledóneas y monocotiledóneas: genes de la Clase I
que incluye STM, BP/KNAT1, KNAT2 y KNAT6, tienen un patrón de expresión abundante en
meristemos y genes de la Clase II que se expresan en todos los tejidos de la planta, pero su
papel en el desarrollo aún no ha sido definido (Scofield and Murray, 2006). Los genes KNOX
de la Clase I son de particular interés en el estudio de eventos relacionados con la
organogénesis. Se ha reportado que estos genes actúan controlando la indeterminación de las
células en zonas meristemáticas a través de la acción de citocininas y giberelinas (Jasinski et
al., 2006). Cambios en la expresión de estos genes producen morfologías alteradas, ya sea por
la inducción de un programa de desarrollo o por interacciones con diferentes genes blanco
(Reiser et al., 2000). Además del Homeodominio, el cual está involucrado en la unión a DNA,
las proteínas KNOX tienen otros tres dominios: el MEINOX involucrado en actividad de
dimerización, el GSE en degradación de proteínas y el ELK en una señal de localización
nuclear (Bellaoui et al., 2001). Análisis de mutantes con pérdida de función han mostrado que
homocigotos stm no forman el meristemo apical del tallo (SAM) (Long et al., 1996), pero stm
sobreexpresando KNAT1 recupera la formación del SAM (Scofield et al., 2008). Plantas knat1
muestran tamaño pequeño, pedicelos más cortos y apuntando hacia abajo (Douglas et al.,
2002, Venglat et al., 2002). Las mutantes de los genes KNAT2 y KNAT6 no tienen un fenotipo
característico. Por lo tanto, las mutaciones por pérdida de función de los genes KNOXI
muestran su papel en la determinación del destino celular en el meristemo, mientras que las
16
mutaciones por ganancia de función demuestran su habilidad para alterar profundamente la
morfología de la planta (Hake et al., 2004).
II.13. Análisis de expresión de genes involucrados en procesos de desarrollo en
Agave
Los agaves están dentro del grupo de plantas que tienen plasticidad para presentar
diferentes tipos de reproducción, dependiendo de las condiciones y estímulos ambientales. La
formación de bulbilos después de la etapa de floración, es un proceso similar al proceso de
reversión de la inflorescencia descrito en otras especies, aunque no se conocen con exactitud
las diferencias que existen, ni los factores que determinan este cambio (Arizaga y Ezcurra,
1995; Valenzuela, 1997). Algunos de los aspectos importantes a determinar respecto a la
formación de bulbilos en Agave, es si el meristemo que los origina está formado antes de que
ocurra la emergencia de brotes vegetativos o se forma de novo. Esto permitiría deducir si este
fenómeno ocurre de igual o diferente manera que en las especies en las que se ha descrito. Este
aspecto se podría abordar por medio de un análisis a nivel histológico.
Otro punto importante es tratar de encontrar el grupo de genes que se expresa para que
se lleve a cabo la inducción de los bulbilos, para esto se pueden utilizar estrategias como la
construcción de bibliotecas de genes; así como analizar la potencial participación de los genes
reportados en otras plantas que estén involucrados en inicio y formación de meristemos y
brotes vegetativos.
Considerando que se tiene poca información a nivel molecular en los agaves y ninguna
información a este nivel sobre la formación de bulbilos en esta especie, una alternativa para
poder clonar y posteriormente identificar y caracterizar genes involucrados en el proceso, es la
construcción de bibliotecas de cDNA conteniendo transcritos expresados diferencialmente.
Estas bibliotecas podrían ser utilizadas directamente para análisis de expresión masiva de
clonas anónimas, o bien para la generación de un banco de ESTs (Etiquetas de Secuencias
Expresadas). La secuenciación de ESTs permite estimar los niveles de expresión e identificar
genes que no han sido reportados previamente (Meyers et al., 2004). El análisis de los datos
proporcionados por ESTs
puede dar información desde el simple reconocimiento de la
17
expresión diferencial hasta la identificación de subgrupos de genes que tengan patrones de
expresión coordinados en tejidos específicos (Ewing et al., 1999). La base de este método es
que el nivel de una especie de mRNA en un tejido específico es reflejado por la frecuencia de
su EST correspondiente en una biblioteca de cDNA. La tecnología es atractiva porque no
requiere tener la secuencia del organismo bajo estudio, por lo que se puede usar para el
análisis de organismos poco estudiados a nivel genómico (Donson et al., 2002).
Para el análisis de expresión de los genes identificados por el análisis de las bibliotecas
de cDNA, se pueden utilizar técnicas convencionales como el RT-PCR cuantitativo y no
cuantitativo, ésta es una tecnología útil para el análisis de expresión génica, gracias a su
sensibilidad, especificidad y capacidad de manejo para una gran cantidad de muestras. Sin
embargo no proporciona información de la expresión a nivel espacial detallado. Para este fin
existen otras técnicas, como la hibridación in situ.
El uso de técnicas histológicas en combinación con técnicas moleculares, como es el
caso de la hibridación in situ, permite llevar a cabo la localización de mRNAs en un órgano
particular, tejido o capa celular de interés. En el caso del estudio de genes de desarrollo, como
es el caso de los expresados durante la formación de bulbilos, esta técnica es de gran utilidad.
Los genes involucrados en procesos de desarrollo generalmente presentan bajos niveles
de expresión, así como patrones de expresión específicos en tiempo y espacio; por lo que una
forma de abordarlos es a través de la combinación de RT-PCR en tiempo real y el uso de la
hibridación in situ.
En este trabajo se utilizaron estas técnicas para la caracterización de los patrones de
expresión de los genes seleccionados a partir de los datos obtenidos de las bibliotecas de
cDNA y posteriormente se llevó a cabo el análisis funcional de algunos de ellos por expresión
heteróloga en Arabidopsis thaliana.
18
III.
HIPÓTESIS
La formación de bulbilos en Agave tequilana implica un cambio en la regulación y
expresión de genes asociados con el inicio y desarrollo de meristemos.
IV.
OBJETIVO GENERAL
Analizar el proceso de formación de bulbilos en Agave tequilana a nivel histológico y
de expresión génica.
V.
OBJETIVOS PARTICULARES
•
Describir el proceso de formación de bulbilos a nivel histológico.
•
Determinar si el meristemo que da origen a los bulbilos está preformado o se forma de
novo.
•
Elaborar bibliotecas de cDNA de diferentes etapas de la formación de bulbilos.
•
Analizar las bibliotecas de cDNA de diferentes tejidos de Agave tequilana para la
identificación de genes potencialmente involucrados en este proceso.
•
Analizar los patrones de expresión de los genes seleccionados, por RT- PCR
e
hibridación in situ durante la formación de bulbilos.
•
Llevar a cabo la expresión heteróloga en Arabidopsis thaliana de al menos uno de los
genes potencialmente involucrados.
19
VI.
MATERIALES Y MÉTODOS
VI.1. Inducción de la formación de bulbilos
Se llevó a cabo en base a reportes previos (Valenzuela, 1997; Arizaga y Ezcurra, 1995)
en los que la inducción de bulbilos en Agave tequilana y Agave macroacantha se logró con
mayor eficiencia cortando los botones florales. Se utilizaron tres plantas de Agave tequilana en
estado de floración, cada año, durante cuatro años consecutivos. La inflorescencia de cada
planta se dividió en dos partes de manera vertical, en la mitad se llevó a cabo el corte de los
botones florales y la otra mitad se dejó con botones intactos, para la formación de semillas
(Fig. 2).
VI.2. Colecta de muestras
En base a estudios preliminares, se tomaron muestras de pedicelos florales en los que
se hizo la inducción, a intervalos espaciados desde el día del corte de los botones hasta que los
brotes vegetativos fueron visibles. Los tiempos a los que se hizo la colecta de muestras
fueron: 0, 14, 28, 35, 42 y 49 días después del corte de los botones. En la Fig. 3 se muestran
los tejidos colectados en las etapas correspondientes. El tiempo cero (S0) es el estado de
referencia, corresponde al tejido tomado inmediatamente al corte del botón floral. Para el
análisis histológico las muestras se dejaron en fijación en el buffer correspondiente y para las
bibliotecas de cDNA se almacenaron a -70 °C hasta su uso. Además de estas muestras de
pedicelos florales durante la formación de bulbilos, también se colectaron muestras de otros
tejidos de la planta, como hoja, raíz, meristemo apical, anteras, ovarios y tépalos para ser
usados en los análisis de RT-PCR.
20
VI.3. Análisis histológico
El método utilizado está basado en el protocolo reportado por Jackson (1992) y
fue adaptado por Aurora Verver del Lab. de Microscopía en el Cinvestav Unidad Irapuato. En
este trabajo se realizó la modificación del tiempo de fijación en FAA de un día a siete días, por
la naturaleza del tejido de Agave.
VI.3.1. Fijación en FAA
Los tejidos en secciones de máximo 5 mm de lado y 2 mm de grosor se incubaron en
FAA (formaldehído 3.7%, etanol 50% y ácido acético glacial 5%) en un tubo eppendorf con
una relación de volumen de tejido: FAA de 1:10, durante siete días.
VI.3.2. Deshidratación en series de etanol
Para remover el agua del tejido se deshidrató en series de etanol aumentando
progresivamente la concentración, como se muestra a continuación:
Etanol 50%, 30 min
Etanol 50%, 30 min
Etanol 60%, 30 min
Etanol 70%, 30 min
Etanol 80%, 30 min
Etanol 90%, 30 min
Etanol 95%, 30 min
Etanol 100%, 30 min
Etanol : Citrisolv 3:1, 30 min
Etanol : Citrisolv 1:1, 30 min
Etanol : Citrisolv 1:3, 30 min
Citrisolv 100%, 1 hora
VI.3.3. Inclusión en parafina
A cada tubo eppendorf con muestras, hasta la mitad del volumen con citrisolv 100%, se
completó el volumen total del tubo con parafina (Paraplast) derretida y se incubó en un horno
a 56°C toda la noche.
21
La parafina se reemplazó por parafina nueva cada 12 horas durante 7 días para que los
tejidos quedaran completamente incluidos.
VI.3.4. Cortes en microtomo
Cada tejido se colocó en un molde que fue rellenado con parafina, los tejidos se
orientaron en forma longitudinal con respecto a la superficie del molde. Se guardaron a 4°C
durante una semana para endurecer la parafina y después se procedió a hacer los cortes con un
grosor de 8 µm en un microtomo retráctil (LKB BROMMA). Las tiras con los cortes se fijaron
en portaobjetos dejándolos sobre una plancha a 42°C durante 16 horas.
VI.3.5. Tinción
Para teñir los cortes, se utilizó la técnica de Darrow (1944) descrita por Clark (1981).
Su aplicación es para observación de tejidos meristemáticos; el resultado muestra las paredes
celulares lignificadas en color rojo y las células meristemáticas en azul. Consistió en lo
siguiente:
Desparafinar los tejidos en los portaobjetos con Citrisolv 100% durante 30 minutos,
Citrisolv: etanol 3:1 por 30 min, Citrisolv: etanol 1:1 por 30 min, Citrisolv: etanol 1:3 por 30
min, etanol 100% por 30 min, etanol 95% por 30 min, etanol 85% por 30 min, etanol 70% por
30 min. Para la tinción se usó safranina O al 0.1% por 18 horas, etanol 50% por 20 segundos,
azul de anilina al 0.1% por 10 min, etanol 95% por 3 segundos, etanol 100% por 1.5 min y
xileno por 6 minutos, para montar los tejidos se cubrieron con Citoseal 60 y cubreobjetos.
Después de dejar secar durante 16 horas se observaron en un microscopio OLYMPUS BX60 y
las fotografías fueron tomadas con la cámara OLYMPUS DP71 acoplada al microscopio.
VI.4. Extracción de RNA total
El RNA total fue aislado de todos los tejidos colectados con el sistema de purificación
PureLinkTM Micro-to-Midi Total RNA (Invitrogen) Cat. No. 12183-018, con la modificación
de previa extracción con Trizol (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Este
RNA fue usado tanto para la purificación de mRNA para la elaboración de las bibliotecas de
cDNA, como para los análisis de RT-PCR.
22
VI.5. Purificación de mRNA (poli A)
Se utilizó el Kit de Dynabeads Oligo dT (Dynal Biotech) Cat. No. 610.12, el cual a
partir de RNA total purifica mRNA utilizando partículas metálicas cubiertas con oligo dT (25
T) que por complementariedad de bases se une a los mRNA que tienen una cola de poli A. Se
siguieron las instrucciones del fabricante.
VI.6. Elaboración de bibliotecas de cDNA
Se elaboraron tres bibliotecas de cDNA cada una incluyendo mRNA de dos etapas
colectadas de tejido de pedicelos florales durante la inducción de bulbilos (Biblioteca 1: T0T1, Biblioteca 2: T2-T3 y Biblioteca 3: T4-T5), utilizando el Kit CloneMiner cDNA Library
Construction (Invitrogen) Cat No. 18249-029 que utiliza el sistema de recombinación
GatewayR para crear bibliotecas Gateway de entrada que pueden ser fácilmente transferidas a
vectores Gateway de salida para llevar a cabo expresión y análisis funcional de las clonas. El
protocolo consistió de las siguientes etapas:
VI.6.1. Síntesis de la primera cadena de cDNA
Se diluyeron 500 ng de mRNA con H2O DEPC en un volumen de 11 µL, se les agregó
1 µL de Oligo dT suplementado por el fabricante, el cual tiene acoplado el adaptador attB2 y
biotina para crear cDNAs con extremos att que funcionan como sitios de recombinación en el
sistema Gateway, 1 µL de dNTPs (10 mM cada uno) se mezclaron los componentes y se
incubaron en el termociclador en un programa de 65°C por 5 min seguido por 90 min a 45°C.
Después de los 65°C cuando el tubo tenía 2 min a 45°C, se le agregaron 4 µL de Buffer 5X de
primera cadena de la Super Script II RT (transcriptasa reversa) y 2 µL de DTT (0.1 M), se
dejaron otros 2 min a 45°C y se le agregó 1 µL de Super Script II RT (200 U/µL); el volumen
total fue de 20 µL. Se incubó a 45°C el resto del tiempo del programa.
Se verificó el tamaño de los fragmentos del cDNA cargando 0.5 µL de la reacción en
un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
23
VI.6.2. Síntesis de la segunda cadena de cDNA
Al tubo con los 19.5 µL de cDNA de primera cadena en hielo, se agregaron los
siguientes reactivos: 92 µL de H2O DEPC, 30 µL de buffer 5X de la segunda cadena, 3 µL de
dNTPs 10mM, 1 µL de DNA ligasa de E. coli (10 U/ µL), 4 µL de DNA polimerasa I de E.
coli (10 U/ µL) y 1 µL de RNasa H de E. coli (2 U/ µL), se mezcló y se incubó a 16°C por 2
horas. Después se adicionó 2 µL de DNA polimerasa T4 para crear extremos romos, se mezcló
e incubó a 16°C por 5 minutos más, se adicionó 10 µL de EDTA 0.5 M pH 8.0 para detener la
reacción. Posteriormente se realizó una extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico
(25:24:1), la fase acuosa se precipitó con 1 µL de glicógeno (20 µg/µL), 80 µL de NH4OAc
7.5 M y 600 µL de etanol al 100%, se incubó a -80°C por 10 minutos y se centrifugó a 14 000
rpm durante 25 minutos a 4°C, se lavó la pastilla de DNA con etanol al 70% y se resuspendió
en 18 µL de H2O DEPC.
VI.6.3. Ligación del adaptador attB1
Para ligar el adaptador attB1 al extremo 5´del cDNA de doble cadena se agregaron los
siguientes reactivos al tubo con los 18 µL de DNA: 10 µL del Buffer 5X del adaptador, 10 µL
del adaptador attB1 (1 µg/ µL), 7 µL de DTT 0.1 M y 5 µL de ligasa DNA T4 (1U/ µL), se
mezclaron y se incubaron a 16°C por 17 horas y 10 min a 70°C para inactivar la ligasa.
VI.6.4. Fraccionamiento del cDNA por cromatografía en columna
A los 50 µL de la reacción de ligación, se le adicionaron 100 µL de buffer TEN (TrisHCl 10 mM pH 7.5, EDTA 0.1 mM, NaCl 25 mM) y la mezcla se aplicó a una columna de
cromatografía de exclusión, suplementada por el Kit, previamente equilibrada con buffer TEN,
y se dejó drenar para colectar el flujo en un tubo de 1.5 mL, se le fue agregando buffer TEN y
colectando una gota en cada tubo de 1.5 mL hasta completar 20 tubos, de tal manera que los
primeros tubos contenían cDNA de mayor tamaño y los últimos tubos contenían cDNA de
pequeño tamaño y los adaptadores que no se ligaron. Se midió el volumen de cada gota y se
hizo un registro de las fracciones. Para seleccionar las fracciones que se usarían para la
24
recombinación del cDNA en el vector pDONR 222 se cargaron en un gel de agarosa al 1%
teñido con bromuro de etidio 4 µL de cada fracción con un marcador de peso molecular de 1
Kb y se seleccionaron solamente las fracciones que tenían un tamaño mayor a 500 pb. Se
midió su concentración para completar 60 ng con los mayores tamaños de cDNA. Se hizo una
precipitación del cDNA seleccionado con: 1 µL de glicógeno, 0.5 volúmenes de NH4OAc 7.5
M y 2.5 volúmenes de etanol al 100%; se incubó a -80°C por 10 minutos, se centrifugó a
14 000 rpm por 25 minutos a 4°C, se lavó la pastilla con etanol al 70% y se resuspendió en 4
µL de buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM).
VI.6.5. Recombinación BP en el vector Gateway pDONR 222
Se usaron 40 ng de cDNA seleccionado de las fracciones, en un volumen de 4 µL y se
le adicionaron los siguientes reactivos: 1 µL de pDONR 222 (250 ng/µL), 2 µL de buffer de
reacción 5X de la Clonasa BP, buffer TE pH 8.0 para llevar la reacción a un volumen de 7 µL
y 3 µL de Clonasa BP, se mezclaron y se incubaron a 25°C durante 17 horas. Para inactivar la
enzima se le agregaron 2 µL de proteinasa K y se incubó a 37°C por 15 minutos y después a
75°C por 10 minutos. Se precipitó la muestra adicionando los siguientes reactivos: 90 µL de
H2O desionizada estéril, 1 µL de glicógeno, 50 µL de NH4OAc 7.5 M y 375 NH4OAc 7.5 M
de etanol al 100%, se incubó a -80°C por 10 minutos, se centrifugó a 14 000 rpm por 25
minutos a 4°C, se lavó la pastilla con etanol al 70% y se resuspendió en 9 µL de buffer TE.
VI.6.6. Transformación de células de E. coli ElectroMAX DH10B
Los 9 µL de reacción se dividieron en 6 alícuotas de 1.5 µL, se transformaron 6
alícuotas de 50 µL de células de E. coli electrocompetentes suplementadas por el Kit, con 1.5
µL de la reacción de recombinación cada una, usando el siguiente protocolo:
A un tubo con una alícuota de DNA, se le agregaron 50 µL de células
electrocompetentes ElectroMAX DH10B, se mezclaron y se transfirieron a una celda de
electroporación de 1 mm, se electroporó usando las siguientes condiciones: 2.0 kV de voltaje,
200 Ω de resistencia y 25 µF de capacitancia. Inmediatamente se adicionó a la celda 1 mL de
25
medio SOC, se mezcló y se transfirió todo el volumen a un tubo de 1.5 mL, se incubó a 37°C
durante 1 hora en agitación a 250 rpm para permitir la expresión del marcador de resistencia a
kanamicina y se sembró en placas de LB sólido con km (50 µg/mL).
VI.6.7. Determinación del título de las bibliotecas
Se determinó el título de la biblioteca sembrando por duplicado 100 µL de cada
dilución 10-2, 10-3 y 10 -4 de las células transformadas en medio sólido LB con kanamicina (50
µg/mL), se contaron las colonias en cada dilución y se determinó el título de cada placa usado
la siguiente fórmula:
UFC/mL = colonias en la placa x factor de dilución
volumen sembrado (mL)
Se calculó el título promedio de la biblioteca con los títulos de las seis placas
sembradas usando la siguiente fórmula:
UFC total = título promedio (UFC/mL) x volumen total de la biblioteca (mL)
VI.6.8. Determinación de la calidad de las bibliotecas
Se determinó el tamaño promedio de los insertos y el porcentaje de recombinantes.
Para esto se realizó la extracción de DNA plasmídico de 24 colonias de la biblioteca utilizando
el método de Birnboim. Para determinar el tamaño promedio de insertos se llevó a cabo una
digestión de los 24 DNAs con la enzima BsrGI que corta en los sitios att y libera el inserto de
DNA clonado; estas digestiones y el marcador de peso molecular de 1 Kb se cargaron en un
gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Después se determinó el tamaño de los
insertos y se calculó el promedio. El porcentaje de recombinantes fue calculado contando las
clonas con inserto en relación al total de las clonas analizadas.
El volumen total de las células transformadas se dividió en alícuotas y se hicieron
diluciones al 50% con glicerol, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.
26
VI.7. Secuenciación de las bibliotecas de cDNA
Se mandaron secuenciar aproximadamente 2000 clonas al azar de cada biblioteca, por
el extremo 5´ usando el oligo universal M13 Forward, con el método de Sanger en un
secuenciador Applied Biosystems Sequencer Modelo 3730XL, en el Laboratorio Nacional de
Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO).
VI.8. Análisis de secuencias
VI.8.1 Análisis BLAST
El análisis de las secuencias se realizó en el LANGEBIO, con los protocolos
desarrollados por Martínez de la Vega (2005) como parte del proyecto de análisis del
Transcriptoma de Agave, utilizando la base de datos MAZORKA. En forma general, el
proceso consistió en remover secuencias de baja calidad (vector, poli A, secuencias cortas),
agrupar las secuencias de EST (Expressed Sequence Tags) producidas, estimar la redundancia
en las diferentes bibliotecas y análisis BLAST por comparación de las secuencias de las
bibliotecas a nivel de nucleótidos y proteínas con las bases de datos NT, NR, Péptidos de
Arroz, Péptidos de Arabidopsis, TIGR de Maíz y categorización por Gene Ontology (GO).
Los resultados de la depuración de ESTs, tablas derivadas de la depuración y el análisis
bioinformático de los ESTs se depositaron en MAZORKA en forma de tablas consultables por
MYSQL.
VII.8.2 Análisis estadísticos
Después de este análisis toda la información se depositó en MAZORKA y utilizando la
interfase de esta base de datos en la dirección http://mazorka.langebio.CINVESTAV.mx se
procedió a realizar los análisis estadísticos de las tres bibliotecas de bulbilos, como la
redundancia por biblioteca, categorización funcional, abundancia de transcritos diferenciales
entre las tres bibliotecas, así como la búsqueda de secuencias homólogas a genes reportados en
27
otras plantas. Para esto se utilizó la búsqueda con los siguientes enunciados del lenguaje
MySQL:
-
Para la determinación del número de gi y el número de Hits de toda la base de
datos de Agave, para calcular la redundancia:
SELECT hit_numero, count(*) as "#Hits", count(distinct gi) as "#Genes" from blast_hit where
hit_numero<2 and blast_db='nr' group by hit_numero
-
Redundancia = (#Hits - #Genes) / #Hits X 100
-
Para la determinación del número de gi y el número de Hits de cada biblioteca
de bulbilos, para calcular la redundancia:
SELECT substring(sec_nombre,1,9) as "Banco", count(*) as "#Hits", count(distinct gi) as
"#Genes"
from
blast_hit
where
hit_numero=1
and
blast_db='nr'
group
by
substring(sec_nombre,1,9)
-
Para la categorización funcional por Gene Ontology Arabidopsis de la base de
datos de Agave:
SELECT
aspect,
go_slim_term,
count(distinct
sec_nombre)
as
"Frecuencia",
round(100*count(distinct sec_nombre)/35796) as "Porcentaje" from go_anot_arabidopsis
where go_slim_term not like '%unknown%' and go_slim_term not like '%other%' group by
aspect, go_slim_term
-
Para la categorización functional por Gene Ontology Arabidopsis de las
bibliotecas de bulbilos:
SELECT
Biblioteca 1
aspect,
go_slim_term,
count(distinct
sec_nombre)
as
"Frecuencia",
round(100*count(distinct sec_nombre)/2007) as "Porcentaje" from go_anot_arabidopsis where
sec_nombre like '%ble01%' and go_slim_term not like '%unknown%' and go_slim_term not
like '%other%' group by aspect, go_slim_term
SELECT
Biblioteca 2
aspect,
go_slim_term,
count(distinct
sec_nombre)
as
"Frecuencia",
round(100*count(distinct sec_nombre)/2028) as "Porcentaje" from go_anot_arabidopsis where
sec_nombre like '%ble02%' and go_slim_term not like '%unknown%' and go_slim_term not
like '%other%' group by aspect, go_slim_term
28
SELECT
Biblioteca 3
aspect,
go_slim_term,
count(distinct
sec_nombre)
as
"Frecuencia",
round(100*count(distinct sec_nombre)/2022) as "Porcentaje" from go_anot_arabidopsis where
sec_nombre like '%ble03%' and go_slim_term not like '%unknown%' and go_slim_term not
like '%other%' group by aspect, go_slim_term
-
Para determinar cDNAs con abundancia diferencial en las tres bibliotecas de
bulbilos: se construyó una tabla con todos los gi de la base se datos y el numero de
secuencias correspondientes a cada gi en cada biblioteca, con esto se pudieron
identificar secuencias exclusivas a cada una o con patrón ascendente o descendente
con respecto a las tres bibliotecas.
VII.8.3 Búsqueda de genes potencialmente involucrados en la formación de
bulbilos
A partir de este análisis se seleccionó un grupo de genes candidatos usando dos
criterios:
1. Secuencias que fueron identificadas solamente en bibliotecas de bulbilos en
comparación con todas las bibliotecas de los diferentes tejidos analizados en el
proyecto del Transcriptoma de Agave.
2. Secuencias con homología a genes reportados en otras plantas con función relacionada
a inicio y formación de meristemos.
Para buscar genes específicos que pudieran estar relacionados con inicio y formación
de meristemos, por ejemplo de la familia KNOX, se utilizó el siguiente enunciado:
SELECT
b.sec_nombre, b.hit_nombre, b.hit_expect, s.secuencia from blast_hit as b,sec as s where
b.hit_nombre like "%KNOX%" and b.sec_nombre=s.sec_nombre and b.hit_expect<1e-06
order by hit_expect
29
VI.9. Análisis de expresión
VI.9.1. RT-PCR
Se llevó a cabo para todos los genes candidatos utilizando RNA total de tejidos de
pedicelos florales colectados durante la formación de bulbilos y de otros tejidos de la planta:
raíz, hoja, meristemo apical del tallo, tépalos, anteras y ovarios. Se utilizó como control la
amplificación del gen Actina 2 de Agave tequilana. Con este análisis se identificaron los genes
expresados diferencialmente a través del desarrollo de bulbilos.
El protocolo empleado fue el siguiente:
VI.9.1.1. Síntesis del cDNA
Se agregaron los siguientes componentes a un tubo de 0.2 mL: 1 µL de Oligo (dT)12-18
(500ng/ µL), 1 µg RNA total con H2O DEPC en un volumen de 10 µL y 1 µL de Mix de
dNTPs (10mM), se mezclaron y se incubaron a 65°C por 5 min, después se puso en hielo y se
le agregaron 4 µL de Buffer 5X para la primera cadena de cDNA y 2 µL de DTT (0.1M), se
mezclaron y se incubaron a 42°C por 2 min, después se les agregó 1 µL de enzima Super
Script II RT (200 U/ µL) (Invitrogen Cat. No. 18064-014) se mezclaron y se incubaron a 42°C
por 1 hora; al final se inactivó la enzima incubando a 70°C por 15 min.
VI.9.1.2. PCR
Los oligonucleótidos utilizados para los RT-PCR de los genes candidatos
seleccionados se muestran en la Tabla 1. Para llevar a cabo el PCR se agregaron los siguientes
componentes a un tubo para PCR de 0.2 mL: 2.5 µL de Buffer 10X para PCR [Tris-HCl (pH
8.4) 200 mM, KCl 500 mM], 0.75 µL de MgCl2 (50mM), 0.5 µL de Mix de dNTPs (10 mM),
0.5 µL de oligo Directo (20 ng/ µL), 0.5 µL de oligo Reverso (20 ng/ µL), 0.2 µL de enzima
Taq DNA polimerasa (5 U/µL), 2 µL de cDNA del paso previo (200 ng/µL) y H2O
desionizada estéril hasta un volumen de 25 µL. Se mezclaron y se incubaron en el
termociclador con el siguiente programa:
94°C por 5 minutos
25 ciclos a las siguientes condiciones:
30
[94°C por 30 segundos
Temperatura de alineamiento por 30 segundos
72°C por 1 minuto]
72°C por 7 minutos
4°C por tiempo indefinido
La temperatura de alineamiento depende de la Tm de cada par de oligonucleótidos
utilizado y se indica en la Tabla 1.
Para verificar la especificidad y el tamaño del producto se cargaron 10 µL de cada
reacción de PCR y 1.5 µL de marcador de peso molecular de 100 pb (100 ng/ µL) en un gel de
agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio, y se corrieron a 70 Volts durante 40 minutos.
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para los RT-PCR y la hibridación in situ de los genes
seleccionados.
Nombre ID
UNK1-F
UNK1-R
UNK2-F
UNK2-R
UNK3-F
UNK3-R
UNK4-F
UNK4-R
UNK5-F
UNK5-R
MADSbox-F
MADSbox-R
YABBY2-F
YABBY2-R
GlsA-F
GlsA-R
KNAT2-F
KNAT2-R
KNAT1-F
KNAT1-R
WIP-F
WIP-R
ACT2-F
ACT2-R
Secuencia
5´-GCACTTCTTCAAAGCCATCTC-3´
5´-TTGCATTTGAGATGAGCACAG-3´
5´-GCTGAGGAAGGCGTATGATG-3´
5´-TCAAGTTCAAAATCACAATCC-3´
5´-ATCTGTGAGATGCGAAGCTGT-3´
5´-TGACAGATGACCAAGGAGGAG-3´
5´-CACTGCTTCAATTGCCTCCT-3´
5´-GAGATTTCTCCAGCTCTGCAA-3´
5´-TTCCCCTTCGCTACTCAATTT-3´
5´-AGCAACATCCTCTTGAAAGCA-3´
5´-AGAGAGAGATCATGGGTCGTG-3´
5´-CTATTGGCATCCTGCAACATT-3´
5´-TGGGCCGTTTTATTCTTTTGT-3´
5´-CTGGATGCATGAGCAGCTTT-3´
5´-GGGTCCGGAATCTAGTTGACA-3´
5´-TTCTTCCTTCCCCTCCATCTC-3´
5´-ATTGCCTCCCACCCTCGCTAT-3´
5´-TATCTGCTTCTGATCTAACCC-3´
5´-CCTCTGCAGGAGGCCATGAAT-3´
5´-GAGTTCGTGCCTAGGCTGCTG-3
5´-CACTTTCCTCTCGGGGCTTTC-3´
5´-GCCGTCCTCTCTCAGATCCAA-3´
5´-GCTCACACCATCACCAGAATC-3´
5´-GTGACAATGGAACTGGAATGG-3´
Tm
utilizada
58°C
56°C
58°C
58°C
58°C
56°C
58°C
58°C
58°C
60°C
58°C
58°C
Análisis
RT-PCR,
RT-PCR,
RT-PCR,
RT-PCR,
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR,
RT-PCR,
RT-PCR,
RT-PCR,
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
RT-PCR
Hibridación in situ
Hibridación in situ
Hibridación in situ
Hibridación in situ
Hibridación in situ
Hibridación in situ
Hibridación in situ
Hibridación in situ
31
VI.9.2. RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Se llevó a cabo el análisis qRT-PCR para la confirmación de los patrones de expresión
de los genes que resultaron diferenciales en el RT-PCR. El protocolo usado fue el siguiente:
Se sintetizó el cDNA usando 1 µg de RNA total, un oligo dT(20T) y la enzima
SuperScriptTM II Transcriptasa revesa (Invitrogen), como se describió en la sección anterior.
Se utilizaron tres réplicas y cada reacción de PCR se hizo por duplicado; para las reacciones
de PCR se usó el Mix Master SYBR Green y el sistema para PCR Tiempo Real (BioRad)
siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las condiciones de amplificación en el PCR
fueron las siguientes:
94°C por 5 minutos
30 ciclos
[94°C por 30 segundos
Temperatura de alineamiento por 30 segundos
72°C por 1 minuto]
72°C por 7 minutos
4°C por tiempo indefinido
La temperatura de alineamiento depende de la Tm de cada par de oligonucleótidos
utilizado y se indica en la Tabla 2.
Para la normalización se usaron oligonucleótidos específicos para UBQ11 en el caso de los
qRT-PCR de las etapas de formación de bulbilos y ACT2 de A. thaliana en el caso de los
qRT-PCR de las plantas de A. thaliana expresando los genes de A. tequilana. Los
oligonucleótidos utilizados para el qRT-PCR de los genes de A. tequilana y de A. thaliana se
muestran en la Tabla 2. La expresión de los genes fue normalizada substrayendo el valor CT
de ACT2 del valor CT del gen de interés y el nivel de expresión fue obtenido con la siguiente
ecuación (E)∆∆CT, donde ∆∆CT representa ∆CT (gen de interés en la etapa evaluada)- ∆CT (gen
de interés en la etapa T0), y E es la eficiencia del PCR, de acuerdo al protocolo reportado por
Czechowski et al. (2004).
32
Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados para los RT-PCR en tiempo real de los genes de
Agave tequilana y de Arabidopsis thaliana.
Nombre
AtqKNOX1-F
AtqKNOX1-R
AtqKNOX2-F
AtqKNOX2-R
AtqUBQ 11-F
AtqUBQ 11-R
KNAT1-F
KNAT1-R
KNAT6-F
KNAT6-R
AS1-F
AS1-R
ACT2-F
ACT2-R
Secuencia
Agave tequilana
5´-GAGGGCAGTTCATAGGTGAT-3´
5´-TTCCCACAGGAGTAGGTCTC-3´
5´-GAATGGTGGACTGCTCACTA-3´
5´-CCTCAGTCGTCGTCATAGAA-3´
5´-GACGGGCGCACCCTTGCGGATTAC-3´
5´-TCCTGGATCTTCGCCTTGACATTG-3´
Arabidopsis thaliana
5´-CGATGTTGAAGCCATGAAGG-3´
5´-GCTGTTGTCGAGCCTCAAAG-3´
5´-AAATCGCTTGTCATCCTCG-3´
5´-TCACTCTCCCGTTGAATCTCC-3´
5´-CTGCGCCTCAACCGCCAATC-3´
5´-CCTTACATTACATTACAAGTTAC-3´
5´-GTACAACCGGTATTGTGCTGGAT-3´
5´-GCTTGGTGCAAGTGCTGTGATTTC-3´
Tm
utilizada
Análisis
58°C
qRT-PCR
58°C
qRT-PCR
58°C
qRT-PCR
55°C
RT-PCR y qRT-PCR
55°C
RT-PCR y qRT-PCR
55°C
RT-PCR y qRT-PCR
55°C
RT-PCR y qRT-PCR
VI.9.3. Hibridación in situ
El protocolo que se usó está basado en el reportado por Jackson et al. (1994) y RuizMedrano et al. (1999). Fue adaptado por Rentería-Canet (2010) en el grupo del Dr. Rafael
Rivera y consistió en lo siguiente:
VI.9.3.1. Elaboración de ribosondas
VI.9.3.1.1. Preparación del templado de DNA. Se requiere tener una ribosonda en
sentido y una en antisentido para cada gen de interés, por lo que el primer paso fue amplificar
un fragmento del gen a partir de DNA plasmídico de la clona correspondiente. Este producto
de PCR específico se clonó en un vector que contiene los dos promotores T7 y SP6, en este
caso fue el pGEM-T Easy Cat. Num. A1360 (Promega). Una vez clonados se digirió el
plásmido con una enzima de sitio único de corte que permitiera utilizar el promotor T7 o SP6
para realizar la transcripción in vitro; para verificar la digestión completa se corrieron 200 ng
de la digestión en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. El DNA digerido se
33
limpió con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se precipitó con 2.5 volúmenes de
etanol al 100%, 0.2 volúmenes de NaOAc 3 M pH 5.2 y se incubó a -80°C por 30 min;
después se centrifugó 20 min a 13 000 rpm a 4°C, se lavó tres veces con etanol al 70% y se
resuspendió en 10 µL de H2O libre de nucleasas y por ultimo se midió su concentración en
nanodrop y se almacenó a -20°C hasta su uso.
VI.9.3.1.2. Síntesis y marcaje de la ribosonda. Se utilizó el sistema de Transcripción
in vitro RibroprobeR Cat. Num. P1460 (Promega) y el protocolo consistió en lo siguiente:
Se mezclaron los siguientes componentes en el orden descrito, a temperatura ambiente
para evitar precipitación del DNA:
4 µL de Buffer de transcripción optimizado 5X, 2 µL de DTT (100 mM), 1 µL de
inhibidor de robonucleasas RNasin, 4 µL de mezcla de rATP, rGTP, rCTP (2.5 mM c/u), 0.6
µL de rUTP 10 mM, 1 µg de DNA linearizado, 0.4 µL de Digoxigenina-11-UTP (10mM) Cat.
Num. 11209256910 (Roche), 1 µL de Polimerasa T7 o Polimerasa SP6 (dependiendo de la
orientación del inserto de DNA) y H2O libre de nucleasas hasta un volumen final de 20 µL. Se
incubaron 1 hora a 37°C; para verificar la integridad y el tamaño de la ribosonda se corrió en
un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio, 2 µL de la reacción previamente
desnaturalizados a 65°C por 5 min.
VI.9.3.1.3. Remoción del templado de DNA. Al producto de la transcripción se
añadió 1 µL de DNAsa RQ1 libre de RNAsa (1 U/µg de DNA) y se incubó a 37°C por 15
min. La ribosonda se limpió con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 pH 4.5) y se
precipitó con 2.5 volúmenes de etanol al 100%, 0.5 volúmenes de NH4OAc 7.5M y se incubó
a -80°C por 30 min, después se centrifugó 20 min a 13 000 rpm a 4°C, se lavó con 1 mL de
etanol al 70% y se resuspendió en 20 µL de H2O libre de nucleasas. Por ultimo, se midió su
concentración en nanodrop y se almacenó a -80°C hasta su uso.
34
VI.9.3.2. Hibridación
VI.9.3.2.1. Pretratamiento del tejido
i) Se removió la parafina con dos tratamientos de Citrisolv por 10 min c/u (sin agitación en
canastilla de vidrio).
ii) Se hidrataron las secciones poniendo las laminillas en la canastilla de vidrio con etanol
100% por 2 min, 2 veces. Después se pusieron en las siguientes soluciones por 30 segundos en
cada una:
Etanol 95%
Etanol 85%/NaCl 0.85%
Etanol 70%/NaCl 0.85%
Etanol 50%/NaCl 0.85%
Etanol 30%/NaCl 0.85%
Después se lavaron en NaCl 0.85% por 2 min, y en PBS 1X por 2 min.
iii) Las laminillas se incubaron en una solución de 2 µg/mL de Proteinasa K en PBS 1X a
37°C por 45 min. Se lavaron a temperatura ambiente en 0.2% de glicina en PBS 1X por 2 min,
en PBS 1X por 2 min y en NaCl al 0.85% por 2 min.
iv) Se deshidrataron los tejidos en forma gradual pasándolas por las siguientes series de etanol
30 segundos en cada una:
Etanol 30%/NaCl 0.85%
Etanol 50%/NaCl 0.85%
Etanol 70%/NaCl 0.85%
Etanol 85%/NaCl 0.85%
Etanol 95%
Se lavaron 2 veces en etanol 100% por 1 min.
VI.9.3.2.2. Prehibridación
Se añadieron 600 µL a cada laminilla de la siguiente solución de hibridación (sin
ribosonda) y se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora.
35
Solución de hibridación (8 mL):
4 mL de formamida absoluta, 2 mL de sulfato de dextrán al 50%, 1 mL de mezcla de
sales 10X, 200 µL de solución de Denhardt, 100 µL de tRNA de levadura (100
mg/mL) y 700 µL de H2O DEPC.
Mezcla de sales 10X (10 mL):
6 mL de NaCl 5 M, 1 mL de Tris-HCl 1 M pH 6.5, 0.78 g de NaH2PO4.H2O, 0.71 g de
Na2HPO4.7H2O, 1 mL de EDTA 0.5 M y H2O DEPC hasta 10 mL.
VI.9.3.2.3. Hibridación de ribosondas
Se usaron 200 ng de ribosonda para cada laminilla, dependiendo del número de
laminillas a hibridar fue la cantidad de ribosonda.
El volumen se llevó hasta 50 µL con formamida absoluta y se desnaturalizó a 80°C
por 2 min y se puso en hielo. Se mezcló la ribosonda desnaturalizada con el volumen total de
la solución de hibridación a usar para todas las laminillas y se puso en hielo. Después se
pusieron 600 µL de la solución de hibridación con ribosonda a cada laminilla, se cubrieron
con parafilm y se incubaron a 55°C sobre puentes de plástico dentro de cajas petri con papel
filtro húmedo durante 12 horas.
VI.9.3.3. Lavados
Las laminillas se lavaron 2 veces con una solución de SSC 2X con 50% formamida,
incubando a 42°C por 30 min con agitación ligera, en canastilla de vidrio. Después se lavaron
2 veces con PBS 1X por 10 min a temperatura ambiente con agitación ligera.
VI.9.3.4. Bloqueo y adición del anticuerpo
Las laminillas en la canastilla de vidrio se incubaron en una solución de 4% de leche
descremada (Difco) en PBS 1X por 45 min a temperatura ambiente sin agitación. Se diluyó el
anticuerpo Anti-Digoxigenin-AP Cat. No. 11093274910 (Roche) a 1:2000 en 400 µL de la
solución de bloqueo para cada laminilla y se incubaron en ésta, cubiertas con parafilm, durante
16 horas a 4°C.
36
VI.9.3.5. Lavados y adición de sustrato
Las laminillas se lavaron 2 veces en PBS 1X con agitación ligera por 20 min a
temperatura ambiente. Después se le añadió a cada una 400 µL de una solución en la que se
disolvió 1 tableta de NBT/BCIP (Nitro blue tetrazolium chloride/ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate Cat. No. 11697471001 (Roche) en 10 mL de H2O DEPC y 8 µL de levamisol 1 M,
se cubrieron con parafilm y se incubaron a temperatura ambiente cubiertas de la luz, por 2
días.
VI.9.3.6. Lavados
La reacción de detección de la fosfatasa alcalina se detuvo en un lavado de las
laminillas con PBS 1X por 10 min a temperatura ambiente con agitación ligera. Después se
deshidrataron las laminillas en forma gradual en las siguientes soluciones de etanol por 30 seg
cada una: Etanol 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, 100% y 100%.
VI.9.3.7 Montaje de las laminillas
Se dejaron secar un poco después del etanol 100% y se les puso citoseal 60, se
cubrieron con un cubreobjetos y se dejaron secar a temperatura ambiente por 16 horas.
VI.9.3.8. Observación al microscopio
Las laminillas se observaron en un microscopio OLYMPUS BX60 y las fotografías
fueron tomadas con la cámara OLYMPUS DP71 acoplada al microscopio, utilizando el
programa Image Pro®.
VI.10. Búsqueda de genes ortólogos a los genes candidatos de Agave tequilana
Los genes seleccionados por mostrar patrones de expresión específicos o abundantes
durante la formación de bulbilos en Agave tequilana, se compararon con sus genes ortólogos
de otras plantas. Se llevaron a cabo alineamientos, búsqueda de dominios funcionales y de
porcentajes de identidad en el programa Bio Edit y en el NCBI. También se construyeron
árboles genéticos en el programa MEGA 4.0 (http://www.megasoftware.net/) para la
identificación de familias de genes en Agave tequilana.
37
VI.11. Análisis funcional por expresión heteróloga en Arabidopsis thaliana
En Agave tequilana el método de transformación genética aún no está establecido, por
lo que para llevar a cabo el análisis funcional fue necesaria la expresión heteróloga. Para esto
se seleccionaron los genes que tenían ortólogos en A. thaliana que ya están caracterizados, por
lo que existen mutantes con fenotipos bien definidos y al final los genes que no están
reportados en otras plantas, con el objetivo de identificar alteraciones en el desarrollo de A.
thaliana por su expresión bajo el control del promotor Ca MV 35S.
Primero se procedió a secuenciar los ORF (Open Reading Frames) completos de los
genes candidatos para poder realizar su expresión; tomando en cuenta que las bibliotecas solo
se secuenciaron por el extremo 5´ y que el cDNA se sintetizó usando un oligo dT, a la mayoría
de las secuencias que no están completas les falta el extremo 3´. Por lo que se verificó por
digestión con la enzima BsrGI que corta en los sitios att para liberar los insertos de las clonas,
el tamaño del inserto y si era mayor a la secuencia obtenida por la primera secuenciación, se
mandaban a secuenciar por los dos extremos para completar el ORF. Después de la segunda
secuenciación cinco de los genes candidatos tenían completo su ORF en una clona en el vector
Gateway de entrada pDONR222 (Fig. 6A). Para la expresión en A. thaliana se seleccionó el
vector Gateway de salida pB7WG2D (Fig. 6B) (Karimi et al., 2002) que tiene el promotor
constitutivo Ca MV35S.
El protocolo seguido para la expresión heteróloga fue el siguiente:
VI.11.1. Recombinación en el vector de expresión
En un tubo para PCR se mezclaron los componentes: 150 ng de vector pB7WG2D, 150
ng de DNA plasmídico del gen de interés en el vector pDONR222, 1.0 µL de Mix de la
enzima Clonasa LR II (Cat. No. SKU # 11791-020, Invitrogen) y H2O desionizada estéril
hasta completar 10 µL de volumen final. Se incubó a 25°C por 16 horas, después se le agregó
1 µL de Proteinasa K (20mg/mL) y se incubó a 25°C por 10 min. Se transformó por
electroporación E. coli TOP 10 con los 10 µL de reacción de recombinación, se sembró en
medio LB sólido con 100 µg/mL de espectinomicina y se incubó a 37°C durante 16 horas, se
seleccionaron 10 colonias, se pusieron a crecer en medio líquido
y se extrajo el DNA
38
plasmídico con el protocolo de Birnboim. Se verificó que el plásmido tuviera el gen de A.
tequilana por PCR con oligonucleótidos específicos para cada gen.
A
B
Fig. 6. Vectores Gateway utilizados para clonación y expresión heteróloga. A, vector usado
para la clonación de las bibliotecas, B, vector usado para la expresión en A. thaliana.
39
VI.11.2. Transformación de Agrobacterium tumefaciens
Se usó la cepa de A. tumefaciens GV2260 (McBride y Summerfelt, 1990) para ser
transformada por electroporación con el DNA plasmídico purificado de E. coli; después de la
transformación se sembró en medio YEB sólido con los antibióticos espectinomicina,
carbenicilina y rifampicina 100 µg/mL de cada uno y se incubó a 28°C durante 48 horas, se
seleccionaron 10 colonias, se pusieron a crecer en medio líquido y se extrajo el DNA
plasmídico con el protocolo de Birnboim. Se verificó que el plásmido de agrobacterium
tuviera el gen de agave por PCR con oligonucleótidos específicos. Una alícuota de la cepa de
A. tumefaciens transformada con cada uno de los cinco genes de agave en el vector de
expresión pB7WG2D se mezcló en glicerol a una concentración final de 50% y se guardó a
-80°C como respaldo, para ser usados en las transformaciones de A. thaliana.
VI.11.3. Siembra de Arabidopsis thaliana wt Col 0 y mutantes del Stock Center
Para la expresión de los genes de A. tequilana en A. thaliana se utilizaron plantas wt
Col 0 y para la complementación se utilizó la línea CS30 del Arabidopsis Stock Center que
tiene una deleción completa del locus KNAT1 (Douglas et al., 2002; Venglat et al., 2002). Las
semillas se esterilizaron superficialmente con el siguiente protocolo: un lavado con solución
de hipoclorito comercial al 20%, un lavado con etanol al 70% y tres lavados con agua
desionizada estéril, después se incubaron 48 horas a 4°C para sincronizar su germinación. Se
sembraron en medio de cultivo MS al 0.5X y se colocaron en una cámara de crecimiento a
22°C con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. A los 10 días después de la
germinación (dpg) se transplantaron a una mezcla de sustrato para arabidopsis, compuesta por
tres partes de Sunshine®, una de perlita y una de vermiculita. Aproximadamente a los 40 dpg
las plantas tuvieron suficientes botones florales para iniciar la infiltración con agrobacterium.
VI.11.4. Infiltración con A. tumefaciens
El protocolo que se usó para la transformación de A. thaliana por infiltración con A.
tumefaciens fue una modificación del “Floral dip” reportada por Martínez-Trujillo et al.
40
(2004), adaptado por el grupo del Dr. Luis Herrera Estrella. La infiltración se realizó tres
veces a intervalos de 4 días para aumentar la cantidad de transformantes. El cultivo de A.
tumefaciens se centrifugó, el paquete celular se lavó tres veces con medio de infiltración [MS
al 0.5X, 5% de sacarosa] y después se resuspendió en 300 µL de medio de infiltración con
0.02% de Silwet L-77, éste se inoculó en los botones florales usando una micropipeta de 20
µL.
VI.11.5. Selección de líneas transformadas
Veinticinco días después de la última infiltración, las semillas de las plantas estaban
secas, se recolectaron, se desinfectaron superficialmente y se sembraron en medio de selección
MS al 0.1X con 20 mg/L de fosfinotricina. Se pusieron a germinar en una cámara de
crecimiento a 22°C con 16 h de luz y 8 h de oscuridad, a los 12 dpg fueron visibles las plantas
resistentes; estas plantas T0 se transplantaron a la mezcla de sustrato para arabidopsis y se
llevaron a invernadero, nuevamente se cosecharon sus semillas, se sembraron 12 líneas (aprox.
300 semillas de cada una) en medio con PPT, se seleccionaron las líneas que tuvieran
segregación 3:1, correspondientes a la generación T1. Se sembraron 12 plantas descendientes
de estas líneas en sustrato y se llevaron a invernadero. Se sembraron al menos 6 líneas T1, 12
plantas de cada una, de la generación T1. Se colectaron las semillas de las plantas que
mostraron el fenotipo mas parecido a lo esperado y se sembraron semillas de 12 plantas en
medio con PPT para buscar líneas homocigotas. Las plantas homocigotas se utilizaron para los
análisis de expresión por RT-PCR.
VI.12. Análisis de expresión de genes de interés en las líneas transformadas.
Se llevaron a cabo análisis de RT-PCR y en algunos casos RT-PCR en tiempo real con
oligonucleótidos específicos para los genes de A. tequilana para verificar que las plantas
expresaran los genes, después se analizó la expresión de varios genes endógenos de A.
thaliana para determinar si fueron afectados por la expresión de los genes de A. tequilana.
41
VII.
RESULTADOS
VII.1. Inducción de la formación de bulbilos en Agave tequilana
La inducción se realizó en tres plantas por año durante cuatro años consecutivos. Se
observó que la formación de bulbilos ocurre de 14 a 45 días después de la inducción
dependiendo del grado de estrés en que se encuentre la planta, éste puede ser causado por
exceso de agua, cambios climáticos desfavorables, o en el caso de algunas de las plantas que
usaron en este estudio, por removerlas de su sitio original de crecimiento a otro (instalaciones
del Cinvestav Unidad Irapuato), para facilitar la colecta de muestras, ya que las plantas
provenían de campos de cultivo ubicados en diferentes lugares. También se utilizaron plantas
que estaban creciendo en óptimas condiciones, en jardines del Cinvestav Unidad Irapuato y
que no fueron removidas de su sitio de crecimiento.
En las plantas que presentaron mayor grado de estrés los bulbilos aparecieron a los 14
días y en las que crecieron en condiciones óptimas y nunca fueron removidas de su sitio
original aparecieron a los 45 días.
La inducción se hizo cortando los botones florales
previamente a la antesis (Fig. 7A, B), los que fueron cortados cuando ya había ocurrido la
antesis y la fecundación, no produjeron bulbilos.
Los bulbilos se formaron solamente en secciones localizadas de la inflorescencia (muy
cerca de los bractéolos) donde fueron cortados los botones, mientras que los que no fueron
cortados produjeron cápsulas y semillas (Fig. 7C). Esto sugiere que las señales regulatorias
para el desarrollo floral y vegetativo son localizadas e incapaces de redirigir el desarrollo en
otras regiones de la inflorescencia.
42
Fig. 7. Inducción de la formación de bulbilos. A, botones florales, las estrellas indican
botones en estado de desarrollo adecuado para el corte, las puntas de flecha indican los sitios
de corte en la parte superior de los pedicelos. B, pedicelo después del corte del botón floral, la
punta de flecha indica el sitio de corte y las flechas indican los bracteólos. El rectángulo
amarillo corresponde a la parte de tejido que se colectó en forma longitudinal para los análisis
histológicos. C, inflorescencia de Agave tequilana mostrando bulbilos (punta de flecha) y
cápsulas con semillas (flecha) formados. D, formación de botones florales entre los bulbilos,
se observan anteras dentro de un bulbilo. Las barras representan 1cm en A, 0.3 cm en B, 50
cm en C y 5 cm en D.
VII.2. Análisis morfológico e histológico
Se colectaron muestras de pedicelos florales en diferentes estados de desarrollo de
bulbilos, en total se colectaron muestras de seis etapas (S0 a S5), desde el momento del corte
de los botones florales (etapa S0; Fig. 8A) hasta que los brotes vegetativos fueron visibles
(etapa S5; Fig. 8E); el tiempo de las etapas de colecta corresponde a los 0, 14, 28, 35, 42 y 49
días después del corte. Mediante el análisis de cortes longitudinales se observó que el primer
indicio de formación de bulbilos era la lignificación de la pared celular; la tinción que se
43
utilizó de safranina-azul de anilina, permitió diferenciar las células que iniciaron el proceso de
lignificación en la etapa S1, observables con pared celular color rojo, teñidas con safranina
(Fig. 8G). En esta etapa no se observaron diferencias a nivel morfológico, pero se pudo
observar un patrón de crecimiento celular más desordenado que en S0. Las etapas S2 y S3
mostraron claramente una región de células lignificadas en los cortes histológicos y a nivel
morfológico se aprecó hinchamiento del pedicelo justo arriba de los bractéolos (Fig. 8 H, I).
En la etapa S4 la organogénesis ha iniciado y se pudieron observar varios meristemos
potenciales enmarcados en el rectángulo (Fig. 8D y 8J). En S5 el desarrollo de bulbilos fue
claramente visible (Fig. 8E); se observaron primordios de hojas y el análisis histológico
mostró nuevas zonas meristemáticas teñidas de azul (Fig. 8K). Cabe resaltar que esta etapa
fue una mezcla de todas las etapas, ya que en un solo pedicelo se estaban formando
continuamente nuevos meristemos que darían origen a un grupo de aproximadamente 20
bulbilos, hasta que las reservas de energía en la planta se agotaran. La figura 7D muestra
etapas posteriores del desarrollo de bulbilos donde se pueden observar botones florales entre y
dentro de los bulbilos, lo cual sugiere que las señales de desarrollo floral permanecen y están
en competencia con las de desarrollo vegetativo.
Fig. 8. Etapas de desarrollo analizadas durante la formación de bulbilos. A, pedicelo en
la etapa S0 y S1, no existen diferencias morfológicas. B, etapa S2 mostrando hinchamiento y
necrosis arriba del bractéolo. C, S3 mostrando incremento del hinchamiento. D, inicio de la
organogénesis en S4. E, S5 con un grupo de bulbilos formados. F - K, cortes histológicos
longitudinales en la región arriba del bractéolo, el círculo en G muestra el inicio de la
lignificación de las paredes celulares. Las puntas de flecha indican las regiones lignificadas y
la flecha en K indica el meristemo apical de uno de los bulbilos. Las barras en A-E son de
0.5 cm y la escala en F-K es de 100 µm.
44
VII.3. Elaboración de bibliotecas de cDNA y búsqueda de genes de interés
Para identificar genes potencialmente involucrados en la formación de bulbilos, como
parte de una estrategia general para el análisis del transcriptoma de Agave tequilana
(Martínez-Hernández et al., datos no publicados), se elaboraron tres bibliotecas de cDNA,
como se describió en Materiales y Métodos, a partir de mRNA de tejido de pedicelos
colectados durante las seis etapas que se utilizaron para el análisis histológico (S0 y S1, S2 y
S3, S4 y S5). La Figura 9 muestra la calidad del RNA total, mRNA y el cDNA usados para las
bibliotecas.
Fig. 9. Etapas de la elaboración de bibliotecas de cDNA. A, RNA total, la nitidez de las
bandas de RNA ribosomal 28S y 18S muestra que esta íntegro. B, RNA mensajero con
tamaño de más de 500 pb. C, 1ª cadena de cDNA, D, 2ª cadena de cDNA de tamaño superior a
500 pb (flecha). E, Fracciones de cDNA obtenidas de la cromatografía de exclusión, la línea
horizontal señala las fracciones que fueron tomadas para la recombinación. F, Digestión con la
enzima BsrGI del DNA plasmídico de 13 clonas para liberar los insertos de cDNA que fueron
clonados en el vector pDONR222, la flecha indica el vector de 2.5 Kb y en la parte abajo se
observan los insertos. El marcador de peso molecular en todos los geles mostrados es de 1Kb
(Invitrogen).
45
Para cada biblioteca se calculó el título, el porcentaje de clonas recombinantes (por
digestión con la enzima BsrGI para liberar los insertos) y el tamaño promedio de los insertos a
partir de la digestión. Las bibliotecas fueron parcialmente secuenciadas por el extremo 5´ y se
obtuvieron alrededor de 6000 ESTs provenientes de las bibliotecas de bulbilos, los cuales se
depositaron en la base de datos MAZORKA del LANGEBIO (Laboratorio Nacional de
Genómica para la Biodiversidad). Después de la filtración de los datos para eliminar
secuencias de baja calidad como vector y poli A, se determinó el tamaño promedio de los
ESTs; estos datos se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Estadísticas básicas de las bibliotecas de cDNA.
En la interfase de la base de datos de MAZORKA se determinó el número de gi, es
decir, el número de secuencias de A. tequilana que encontraron identidad a algún gen otras
plantas, reportado previamente en las bases de datos públicas y se compararon con las 35 000
secuencias de otras 12 bibliotecas de cDNA de Agave tequilana, de tejidos de meristemo
apical vegetativo y reproductivo, piña, hoja, raíz, anteras y ovarios. Los datos que se
encontraron fueron los siguientes:
•
Existen 35,796 secuencias de alta calidad en la base de datos de A. tequilana.
•
6057 son secuencias de bulbilos.
•
Hay 8665 diferentes gi en la base de datos de A. tequilana.
•
513 gi del total de la base de datos sólo se encontraron en bulbilos.
46
•
2196 diferentes gi se encontraron en bulbilos, pero también en otros tejidos de la
planta.
•
701 de los 2196 gi, fueron abundantes en bulbilos (esto es, que estuvieron presentes en
bulbilos más del 50% de las veces que se encontraron en toda la base de datos).
La redundancia de la base de datos de A. tequilana fue de 59.9% y la redundancia por
biblioteca de bulbilos:
• ajswble01 (Etapas S0 y S1) = 22.9%
• ajswble02 (Etapas S2 y S3) = 21.4%
• ajswble03 (Etapas S4 y S5) = 45.2%
Para la categorización funcional de las secuencias de las bibliotecas se llevó a cabo la
anotación por Gene Ontology para A. thaliana (http://www.geneontology.org) como parte del
procesamiento de las secuencias en la base de datos de MAZORKA. Con estos datos se
elaboraron las gráficas de frecuencia para cada uno de los aspectos que maneja Gene Ontology
(Componente celular, Proceso biológico y Función molecular), para la base de datos de Agave
y para las bibliotecas de bulbilos. Estos resultados se muestran en la Tabla 4 y la Figura 10.
Las gráficas de categorización muestran que el porcentaje de secuencias con identidad
a algunos aspectos de los que se evaluaron varía en las bibliotecas de bulbilos con respecto al
total de las secuencias de la base de datos de A. tequilana. Por ejemplo, en componente celular
el porcentaje de secuencias relacionadas con cloroplasto aumentó en las bibliotecas de
bulbilos; el mismo caso ocurrió en función molecular para la categoría de factor de
transcripción. En los tres aspectos que evalúa Gene Ontology, el porcentaje de secuencias con
función desconocida aumentó en bulbilos con respecto al total de la base de datos.
47
Tabla 4. Resultados de la anotación de las secuencias de las bibliotecas
por Gene
Ontology Arabidopsis.
Porcentaje
Componente celular
Pared celular
Componente celular desconocido
Cloroplasto
Citosol
Retículo endoplásmico
Extracelular
Aparato de Golgi
Mitocondria
Núcleo
Membrana plasmática
Plástidos
Ribosoma
Total
Función molecular
Unión a DNA o RNA
Actividad de hidrolasa
Actividad de cinasa
Función molecular desconocida
Unión a ácidos nucléicos
Unión a nucleótidos
Unión a proteínas
Unión a receptores
Actividad de molécula estructural
Actividad de factor de transcripción
Actividad de transferasa
Actividad de transportador
Total
Proceso biológico
Proceso biológico desconocido
Organización celular y biogénesis
Procesos de desarrollo
Metabolismo de DNA o RNA
Transporte de electrones
Metabolismo de proteínas
Respuesta a estímulos abióticos o bióticos
Respuesta a estrés
Transducción de señales
Transcripción
Transporte
Total
Total A.
tequilana
Total
bulbilos
Bulbilos 1
(S0-S1)
Bulbilos 2
(S2-S3)
Bulbilos 3
(S4-S5)
1.07
27.98
14.16
6.40
2.55
2.02
0.50
13.69
16.75
1.83
1.32
11.74
100
1.47
29.4
17.5
6
2.48
1.89
0.36
13.74
13.27
1.92
2.25
9.72
100
1.56
31.01
14.91
6.97
2.97
2.37
0.30
14.69
12.17
2.52
1.56
8.98
100
1.54
29.39
17.93
5.29
2.72
2.06
0.59
14.25
14.77
1.62
1.76
8.08
100
1.25
27.36
20.33
5.68
1.54
1.06
0.10
11.85
12.72
1.54
3.76
12.81
100
10.90
12.62
3.71
19.57
5.07
7.03
7.73
0.69
10.92
3.97
9.58
8.22
100
9.26
13.7
3.61
21.48
5.18
6.78
8.05
0.93
8.9
4.27
9.6
8.24
100
9.11
15.04
3.41
22.68
4.64
6.11
5.99
0.65
8.11
5.29
9.69
9.28
100
10.16
13.96
3.74
17.42
5.71
8.13
10.00
1.26
7.36
3.85
9.89
8.52
100
8.11
11.41
3.72
25.89
5.13
5.71
8.02
0.83
12.32
3.47
9.02
6.37
100
18.33
9.16
3.80
4.34
7.29
25.28
7.61
6.75
2.74
6.04
8.65
100
20.7
6.15
4.38
1.89
10.14
23.55
8.61
7.49
2.99
5.62
8.48
100
21.97
5.48
4.75
1.57
8.50
21.24
9.17
8.44
3.47
6.04
9.39
100
18.61
5.76
4.43
2.11
10.86
24.82
8.86
7.04
2.94
5.71
8.86
100
21.85
7.59
3.79
2.05
11.38
24.96
7.51
6.83
2.43
4.93
6.68
100
48
Total A. tequilana
Total bulbilos
Fig. 10. Gráficas de categorización correspondientes a los datos de la Tabla 3 de la anotación
de secuencias del total de A. tequilana y del total de bulbilos.
49
Para el análisis de anotación se hizo un BLAST a las bases de datos públicas NT, NR,
EST-others, Péptidos de Arroz, Péptidos de Arabidopsis y TIGR de Maíz. Posteriormente se
evaluó la abundancia de los diferentes transcritos de las bibliotecas de bulbilos en
comparación con todas las demás, así se seleccionó un grupo de genes candidatos
potencialmente involucrados en este proceso, por estar presentes solo en estas bibliotecas, ser
relativamente abundantes o estar reportados en otras plantas con función de origen y
desarrollo de meristemos (Tabla 5).
Tabla 5. Genes seleccionados potencialmente involucrados en la formación de bulbilos.
Nombre
Criterio de
selección
Descripción del gi
UNK1
gi|23197966|gb|AAN15510.1| expressed protein [Arabidopsis thaliana]
UNK2
gi|50919935|ref|XP_470328.1| expressed protein [Oryza sativa]
Secuencias
encontradas
solo en
bibliotecas de
bulbilos
UNK3
UNK4
UNK5
gi|50920103|ref|XP_470412.1| unknown protein [Oryza sativa]
gi|54287600|gb|AAV31344.1| unknown protein [Oryza sativa]
gi|6714413|gb|AAF26101.1| unknown protein [Arabidopsis thaliana]
GlsA
gi|31442292| gonidia forming protein GlsA [Lilium longiflorum]
WIP
gi|34908460|ref|NP_915577.1| WIP zinc finger - like protein [Oryza sativa]
KNAT1
gi|1256575|gb|AAC49251.1| KNAT1 homeobox-like protein[Solanum lycopersicum]
KNAT2
AS1
YABBY2
MADSbox
Secuencias
gi|7581979|emb|CAB88029.1| knotted1-like homeobox protein [Dendrobium grex]
asociadas con
el desarrollo
gi|145360723|ref|NM_129319.3| AS1 (Asymmetric leaves1) [Arabidopsis thaliana]
de
meristemos
gi|4928751|gb|AAD33716.1| YABBY2 [Arabidopsis thaliana]
gi|33309882|gb|AAQ03227.1| MADS box protein [Elaeis guineensis]
En base a los criterios de selección se identificaron 7 secuencias presentes solamente
en las bibliotecas de bulbilos, 5 de estas tuvieron hit significativo a proteínas de Arabidopsis
thaliana o de Oryza sativa que no están caracterizadas. Además, se encontraron 5 secuencias
abundantes en las bibliotecas de bulbilos que también se encontraron en bibliotecas de otros
tejidos que tuvieron hit significativo a proteínas asociadas con inicio y desarrollo de
meristemos. En el primer grupo se encontraron dos secuencias interesantes, una con hit a la
proteína GlsA de Lilium longiflorum involucrada en divisiones celulares asimétricas (Mori et
50
al., 2003) y otra con hit al factor de transcripción tipo dedos de zinc WIP2 de Arabidopsis
thaliana expresado en regiones meristemáticas (Marsch-Martinez et al., datos no publicados).
VII.4. Análisis de expresión por RT-PCR
Para confirmar los patrones de expresión de los genes candidatos seleccionados, se
realizaron análisis de RT-PCR para la mayoría de los genes en tejidos de pedicelos de las 6
etapas (S) del desarrollo de bulbilos y en tejidos de flor, hoja y raíz de acuerdo al protocolo
descrito en Materiales y Métodos. Como control de la reacción de amplificación se usó el gen
ACT2 de Agave tequilana. Los oligonucleótidos usados para la amplificación se muestran en
la Tabla 1.
Estos resultados mostraron que aunque en las bibliotecas de cDNA 7 secuencias se
identificaron solamente en bulbilos, también se expresaron en otros órganos de la planta. Es
probable que hayan estado en niveles bajos por lo que se clonaron en baja abundancia y que el
número de clonas secuenciadas no fue suficiente para identificar más. Solamente dos
secuencias (UNK2 y GlsA) mostraron expresión exclusiva en pedicelos y desarrollo de
bulbilos, lo cual es de interés para análisis posteriores.
Los análisis de RT-PCR también sugieren que otros cuatro candidatos UNK1, KNAT1,
KNAT2 y WIP presentaron aumento de expresión a través del desarrollo de bulbilos. Estos 6
genes candidatos fueron elegidos para realizar la confirmación del análisis de expresión por
RT-PCR en tiempo real y para determinar si su expresión heteróloga en Arabidopsis thaliana
causaba alguna anateración en el fenotipo que sugiriera alguna función. Los RT-PCR también
exhibieron que algunos de los genes evaluados muestran expresión diferencial en tejidos de
flor, hoja y raíz. Como se observa en la Figura 11, UNK1 no se expresó en raíz y MADS box
no se expresó en hoja y raíz. UNK5, KNAT1 y KNAT2 se expresaron en nivel muy bajo en
hoja.
51
S0
S1
S2
S3
S4
S5
Flor Hoja Raíz
Fig. 11. Análisis de expresión por RT-PCR de los 11 genes potencialmente
involucrados en la formación de bulbilos. Los genes candidatos que
mostraron patrones de expresión diferenciales y que fueron seleccionados para
análisis posteriores son indicados con flechas. S0-S5 son las etapas analizadas
durante el desarrollo de bulbilos.
VII.5. Análisis de secuencias para determinar identidad a genes reportados
Después de la búsqueda de las secuencias que conforman los “clusters” para los
diferentes genes candidatos, se realizaron alineamientos intraclusters, se buscaron las
secuencias consenso y se alinearon con sus ortólogos, se determinó el porcentaje de identidad
a los genes conocidos y construcción de árboles genéticos utilizando los programas Bio Edit y
MEGA 4 (http://www.megasoftware.net/).
52
Se identificó la secuencia codificante (CDS) para cada uno de ellos por secuenciación
por los extremos 3´y 5´. De los 6 genes elegidos, en 5 se identificó el CDS completo;
solamente GlsA no se logró completar, en este caso una estrategia es llevar a cabo
amplificación RACE 5´ para obtener la secuencia completa.
A continuación se muestran los alineamientos de
las secuencias en aminoácidos
correspondientes a las CDS de los genes potencialmente involucrados en la formación de
bulbilos, con sus ortólogos de otras plantas y el porcentaje de identidad a los ortólogos
reportados
en
el
NCBI
(National
Center
for
Biotechnology
Information,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las CDS se identificaron con el programa DNA Star y después
se realizó la traducción a aminoácidos, las secuencias resultantes se utilizaron para los
alineamientos para compararlas con los ortólogos reportados:
UNK1 con el cDNA de Lycoris longituba obtenido de una biblioteca de botones florales:
89% ID
Fig. 12. Alineamiento de UNK1. Es probable que la primera M sombreada sea el sitio de
inicio de la traducción y que el ORF de UNK1 esté completo.
UNK2 con una proteína hipotética de Sorgum bicolor y una proteína hipotética de Zea mays:
47.5 % ID Sorgo-Agave
45.0% ID Maíz-Agave
Fig. 13. Alineamiento de UNK2. Las tres proteínas hipotéticas inician y terminan con los
mismos aminoácidos, lo cual da una alta probabilidad de que el ORF de UNK2 esté completo.
53
Las proteínas a las que se encontró identidad de UNK1 y UNK2 no han sido
caracterizadas, por lo que sería muy informativo describir su función en Agave tequilana
durante la formación de bulbilos.
En cuanto a las secuencias que tuvieron identidad a genes caracterizados previamente
en otras plantas, se llevaron a cabo los alineamientos y la construcción de árboles genéticos
que incluyen los miembros de la familia más cercanos de otras especies.
WIP de Agave con las 6 proteínas de la familia WIP de Arabidopsis thaliana:
El ovalo rojo señala el dominio WIP que caracteriza a la familia, la cual forma parte de los
factores de transcripción tipo dedos de zinc. La secuencia de Agave tequilana también posee
los tres aminoácidos WIP (triptófano, isoleucina y prolina).
45% ID WIP Agave- WIP3 Arabidopsis
Fig. 14. Alineamiento de WIP. Se muestra el locus de cada secuencia de arabidopsis y al
final la de agave. El ovalo rojo indica el dominio característico WIP.
54
Fig. 15. Árbol de relaciones genéticas de la familia WIP de factores de transcripción de
dedos de zinc del grupo A1. ajswble02014a02 es la secuencia de agave y muestra una relación
más cercana con WIP3.
En el alineamiento se puede observar que la proteína WIP de A. tequilana inicia con la
metionina (M) y hacia el extremo 5´ también parece estar completa, ya que el ORF que se
encontró usando el programa DNA Star queda entre dos extremos de secuencia no codificante
que corresponde a los extremos no traducidos (UTR).
Otra de las secuencias elegidas para analizar fue la que mostró identidad a GlsA de
Lilium longiflorum, en la base de datos de A. tequilana se identificaron dos secuencias con
identidad a este gen, las dos son de la biblioteca de bulbilos que corresponde a las etapas de
colecta S2 y S3. A continuación se muestra el alineamiento de estas dos secuencias con la de
L. longiflorum y el porcentaje de identidad en aminoácidos.
83.2% ID
ajswble02014_h03
ajswble02013_f10
70.0% ID
GlsA Lilium longiflorum
ajswble02013_f10
61.3% ID
GlsA Lilium longiflorum
ajswble02014_h03
55
Fig. 16. Alineamiento de las dos secuencias GlsA de A. tequilana y la proteína GlsA de L.
longiflorum.
Como se observa en el alineamiento, las secuencias de A. tequilana no tienen 100% de
identidad, probablemente representan dos alelos del mismo gen, pero una de ellas
(ajswble02013_f10) mostró un alto porcentaje de identidad a la proteína de L. longiflorum y le
faltó una parte pequeña para completarla, de aproximadamente 234 aa, en comparación con la
segunda secuencia (ajswble02014_h03) a la cual le faltaron 334 aa si se comparan con la de L.
longiflorum. En el genoma de A. thaliana se identificaron dos genes parecidos a GlsA; sin
embargo no han sido caracterizados en esta planta y no se sabe si las mutantes en estos genes
tienen algún fenotipo característico.
A continuación se presenta un árbol de relaciones
genéticas ubicando las dos secuencias de A. tequilana más relacionadas con la de lilium que
con las de arabidopsis, aunque el porcentaje de identidad en aminoácidos entre las de agave y
arabidopsis fue significativamente alto (60% ID). Aunque para llevar a cabo el análisis
funcional de estos genes de agave, es necesario obtener la secuencia completa. Se
secuenciaron estas dos clonas de las bibliotecas por los dos extremos, pero no se logró
completar el ORF hacia el extremo 5´, por lo que será necesario hacer uso de otras técnicas
para completarlos.
56
ajswble02014 h03
100
ajswble02013 f10
Lilium-longiflorum GlsA
Arabidopsis-thaliana60203.m00062
100
0.30
0.25
0.20
Arabidopsis-thaliana67593.m00005
0.15
0.10
0.05
0.00
Fig. 17. Árbol de relaciones genéticas de las secuencias GlsA de A. tequilana, L. longiflorum y
A. thaliana.
Las últimas dos secuencias elegidas para llevar a cabo su análisis durante la formación
de bulbilos, tienen identidad significativa a factores de transcripción de la familia KNOX I.
Se consideró de particular interés este grupo de secuencias por ser abundantes en las
bibliotecas de bulbilos y de SAM, además de ser buenos candidatos para llevar a cabo el inicio
de la formación de meristemos vegetativos, como está reportado en varias especies como
Arabidopsis thaliana y Kalanchoe daigremontiana, donde genes de esta familia inducen
cambios en la diferenciación celular en órganos determinados para conferir un estado
meristemático, dando origen a nuevas plántulas en tallos y hojas (Chuck et al., 1996; Garces et
al. 2007).
Se identificaron 15 secuencias de genes KNOXI de bulbilos y SAM. Se llevó a cabo el
análisis de estas secuencias a nivel de DNA y de proteína con alineamientos usando el
programa Clustal W; después se construyó un árbol de relaciones genéticas con el programa
MEGA 4, usando el método Neighbour-Joining (Saitou y Nei, 1987). La robustez de los nodos
fue establecida por análisis Bootstrap (Felsenstein, 1985) con 1000 réplicas. Se lograron
identificar solamente dos secuencias diferentes KNOXI, una conformada por secuencias de
SAM y otra por secuencias de bulbilos. La de SAM fue nombrada AtqKNOX1 por su alta
similitud con el gen KNAT1 de Arabidopsis thaliana (61.2 % ID en aminoácidos) y estar en el
subgrupo de genes KNAT1 en el árbol genético, y la de bulbilos fue nombrada AtqKNOX2 por
57
estar dentro del subgrupo KNAT2; esta secuencia tuvo un alto porcentaje de identidad con el
gen DOH1 de Dendrobium grex (66.0 % ID en aminoácidos).
Para estos genes de Agave tequilana se logró identificar la secuencia codificante
completa en las bibliotecas de cDNA y los alineamientos mostraron que tienen los cuatro
dominios característicos de la familia KNOXI (Fig. 18).
Fig. 18. Alineamiento de las proteínas KNOXI de A. thaliana y de A. tequilana, mostrando
los cuatro dominios conservados.
Para localizar los probables genes ortólogos a los dos genes KNOXI de agave, se
construyó un árbol de relaciones genéticas con varias secuencias en aminoácidos de diferentes
plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas que fueron caracterizadas como parte de la familia
KNOX (Fig.19). Además se determinó el porcentaje de identidad en aminoácidos entre los
miembros KNOXI de A. thaliana y los de A. tequilana, los resultados se muestran en la Tabla
6.
58
Tabla 6. Porcentajes de identidad entre las secuencias en aminoácidos de los genes
KNOXI de A. thaliana y A. tequilana.
AtqKNOX2 AtqKNOX1 KNAT1
AtqKNOX2 100
46.4
50.0
AtqKNOX1
100
61.2
KNAT1
100
KNAT2
KNAT6
STM
KNAT2
52.6
44.6
42.4
100
KNAT6
53.8
46.8
43.7
72.0
100
STM
48.2
51.0
45.8
40.5
40.8
100
Clase I
Clase II
Fig. 19. Árbol de relaciones genéticas de varios miembros de la familia KNOX de
diferentes plantas. Incluye los ortólogos más cercanos de la familia KNOXI, el árbol fue
construido con el método de Neighbour Joining. Los valores bootstrap con 1000 repeticiones
son mostrados en los nodos, las secuencias de A. tequilana se indican en cajas.
Las dos secuencias de Agave se localizaron en la Clase I de la familia, AtqKNOX1 se
encuentra en el grupo KNAT1 muy relacionada con Kn1 de maíz y Kn1 de trigo. AtqKNOX2
59
se localiza en el grupo KNAT2 muy cercana a KNOX1 de orquídea y después a KNAT2 y
KNAT6 de arabidopsis.
VII.6. Análisis de expresión de los genes seleccionados
VII.6.1. RT-PCR en tiempo real
Para confirmar el patrón de expresión de los genes seleccionados, se llevaron a cabo
análisis de RT-PCR en tiempo real para las seis etapas que se evaluaron durante el desarrollo
de bulbilos, excepto para el gen WIP. Los oligonucleótidos usados para la amplificación se
muestran en la Tabla 2, como fluoróforo se usó el SYBR Green (AB). Se llevaron a cabo los
cálculos para determinar el nivel de expresión relativa usando como calibrador el Ct (ciclo
threshold, ciclo del PCR en que el producto excede el nivel basal) de la etapa S0 y como
normalizador el valor del gen de ACT2 o UBQ11. En la Tabla 7 se muestra un ejemplo de los
cálculos para el gen UNK1.
Tabla 7. Cálculos para determinar la expresión relativa del gen UNK1de Agave. ΔCt es
la diferencia entre los Ct de UNK1 y el de ACT2 para cada etapa. ΔΔCt es la diferencia
entre ΔCt de UNK1 de todas las etapas del desarrollo de bulbilos que se evaluaron y ΔCt en
S0. E(-ΔΔCt) es la eficiencia de la reacción de PCR de UNK1 elevado al valor ΔΔCt.
Ct
S0
S1
S2
S3
S4
S5
ACT 2
21.26
21.02
21.31
21.63
22.28
21.66
UNK 1
21.67
21.75
19.94
19.81
20.89
21.73
0.41
0.73
-1.37
-1.82
-1.39
0.07
0
0.32
-1.78
-2.23
-1.8
-0.34
1
0.8018
3.4345
4.6918
3.4822
1.265
ΔCt
UNK 1
ΔΔCt
UNK 1
E e ( -ΔΔCt)
UNK 1
El valor final correspondiente a la expresión relativa del gen de interés con respecto a
la etapa S0, se obtuvo por triplicado; con los tres valores se calculó la desviación estándar para
60
la elaboración de las gráficas. En la Figura 20 se presentan las gráficas de expresión relativa
de los cinco genes que se evaluaron.
Fig. 20. Análisis por RT-PCR en tiempo real de los genes de A. tequilana seleccionados
durante las etapas de la formación de bulbilos. El eje de las y representa el nivel de
expresión relativo y el eje de las x representa las condiciones evaluadas. Para todos se
realizaron tres réplicas de PCR usando diferentes muestras de cDNA, con excepción de
UNK2 para el que se realizó una sola determinación.
Con estos resultados se comprobaron los análisis de RT-PCR llevados a cabo
anteriormente y se corroboró que los genes UNK1 y GlsA tuvieron aumento de expresión en la
etapa S3 y en las S4 y S5 disminuyó nuevamente. También para UNK2 se confirmó que
presenta aumento en el nivel de transcritos a través del desarrollo de bulbilos, aunque no es
definitivo, ya que falta hacer réplicas del experimento para poder representar la gráfica con
valores de desviación estándar. Los genes AtqKNOX1 y AtqKNOX2 presentaron patrones de
expresión similares, existiendo aumento del nivel de transcritos para los dos genes durante la
formación de bulbilos, siendo acentuada en las ultimas tres etapas. El aumento de expresión de
AtqKNOX2 ocurrió antes que el de AtqKNOX1 como se observa en la Fig. 20, sugiriendo una
actividad más temprana. Estos resultados sugirieren que el aumento en el nivel de expresión
de estos genes durante el desarrollo de bulbilos está relacionado con este proceso. Sin
61
embargo, en otras plantas se ha observado que la regulación de genes de desarrollo ocurre a un
nivel celular localizado, por lo que es necesario utilizar otras técnicas para evaluar la
localización de la expresión. La técnica de elección fue la hibridación in situ.
VII.6.2. Hibridación in situ
Para localizar a nivel espacial en qué parte de los pedicelos florales se estaban
expresando estos genes de Agave tequilana durante la formación de bulbilos y poder
relacionar su dominio de expresión con este proceso, se utilizó la técnica de hibridación
in situ. Para lo cual se usaron muestras de pedicelos florales de las seis etapas del desarrollo de
bulbilos evaluadas durante el análisis histológico y los análisis de expresión por RT-PCR; para
cada gen se sintetizó una ribosonda en antisentido que se uniría por complementariedad de
bases al mRNA correspondiente. También se sintetizó una sonda en sentido para cada gen,
como control negativo. La Figura 21 representa la estructura de un pedicelo con bulbilos en
diferentes etapas de desarrollo; los rectángulos punteados señalan la localización de los tejidos
que fueron disectados para realizar la hibridación in situ. En la Figura 22 se muestran los
patrones de expresión de UNK1, UNK2, AtqKNOX1 y AtqKNOX2. Para los genes KNOX
también se evaluó la expresión en meristemo apical de la inflorescencia (IM), ya que se sabe
que estos genes tienen la función de iniciar y mantener el meristemo.
Fig. 21. Esquema de los tejidos disectados para la hibridación in situ.
62
A
S
A
S
A
S
A
S
Fig. 22. Localización del mRNA de los genes UNK1, UNK2, AtqKNOX1 y AtqKNOX2 por
hibridación in situ. A, indica que se usó la sonda antisentido y S, la sonda sentido; IM es el
meristemo de la inflorescencia. La escala en todas las imágenes es de 100 µm. Las imágenes
fueron tomadas en un microscopio con el objetivo 10X.
63
En la Figura 22, que muestra las hibridaciones in situ, se observa la parte del pedicelo
que en la Figura 7 se indica con un rectángulo amarillo; la región mostrada en las imágenes
corresponde a la zona debajo del bractéolo. En la mayoría de las fotografías esta parte se
puede observar como una hendidura en las etapas S0 a S3. En las ultimas etapas S4 y S5, se
observan brotes meristemáticos que salen de la zona inmediata al fondo de la hendidura. Los
transcritos de UNK1 se detectaron en los haces vasculares y en la zona que rodea al bractéolo
justo en la hendidura, observándose un anillo de células teñidas en S3 donde el corte era
transversal al pedicelo. La expresión se observó en las etapas S2, S3 y S4 en la misma zona,
pero en S5 ya no se observó y no hubo expresión en los brotes vegetativos formados. La
expresión de UNK2 se observó desde la etapa S2 hasta la S4 en la hendidura, pero no
rodeando todo el pedicelo como UNK1, solo debajo del bractéolo. En S5 se detectó expresión
en los brotes vegetativos formados cuando estaban en etapa globular. En cuanto a los genes
KNOXI, se observó que para AtqKNOX1 los transcritos fueron detectados en SAM de la
inflorescencia, confirmando el resultado obtenido en el RT-PCR y durante la formación de
bulbilos se detectó en los domos meristemáticos presentes en las etapas S4 y S5. Para el gen
AtqKNOX2 se detectaron transcritos en etapas más tempranas (confirmando los resultados de
los RT-PCR en tiempo real), desde la etapa T2 cuando todavía no se habían formado los
domos meristemáticos, en la región del vértice que formó el bractéolo con la epidermis del
pedicelo. También se detectó expresión en las células que estaban formando el abultamiento
inicial que dará origen a los domos meristemáticos, en los meristemos de bulbilos
ya
formados, en SAM de la inflorescencia y en primordios de hojas. En la hibridación con la
sonda sentido no se detectó ninguna señal. Este resultado sugiere que AtqKNOX1 presenta
actividad a nivel de transcrito en meristemos ya formados, ya sea SAM de la inflorescencia o
vegetativos de bulbilos. En cambio AtqKNOX2, UNK2 y UNK1 presentan actividad en etapas
más tempranas probablemente determinando la identidad de las células que darán origen a los
bulbilos. Por otro lado, mientras que la expresión de UNK1 desapareció en la etapa S5, la de
AtqKNOX2 y UNK2 permaneció hasta que los meristemos vegetativos estaban formados.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en los RT-PCR en tiempo real.
64
VII.7. Expresión heteróloga de los genes de Agave tequilana en Arabidopsis
thaliana
VII.7.1.- Expresión constitutiva en plantas wt
Puesto que en Agave tequilana el ciclo de vida es muy largo y aún no está
estandarizado el método de transformación genética, para una aproximación del análisis
funcional de los genes de Agave tequilana UNK1, UNK2, WIP, AtqKNOX1 y AtqKNOX2, se
llevo a cabo la expresión bajo el promotor constitutivo CaMV35S en Arabidopsis thaliana.
Con la secuenciación de las clonas por los extremos 5´y 3´ se logró completar la secuencia
codificante para los 5 genes seleccionados.
A continuación se presentan las secuencias completas de cDNA de los cinco genes
candidatos que se usaron para la expresión heteróloga en Arabidopsis thaliana.
>UNK1 Agave tequilana
GTTGGAAGTACTGCAAACAGAGGCAA
ATGGCAGCCATGGCAACTTCCACCACCATTGCTGGCTTGGGGGCATCTCCTCTCTGCGTC
M A A M A T S T T I A G L G A S P L C V
TCGCGCACTTCTTCAAAGCCATCTCTCAACTCTAGTTTCCTGAGGTCTCAGGTGTCTGCA
S R T S S K P S L N S S F L R S Q V S A
AGGAGCCCACTGCAGCAGAAGCTAGCCTCAGGTGGAAGGTTCACCTGCTTTGAGAGGGAC
R S P L Q Q K L A S G G R F T C F E R D
TGGCTCCGTAGGGATCTTAACGTGATTGGGTTCGGATTGATCGGGTGGATTGCTCCCTCG
W L R R D L N V I G F G L I G W I A P S
TGCATTCCAGCAATTAACGGCAAAAGCCTAACTGGGCTGTTCTTTGAGAGCATTGGCACC
C I P A I N G K S L T G L F F E S I G T
GAGCTCGCTCACTGGCCAACTGGCCCTGCACTCACTTCTCAGTTCTGGCTTTGGATGATT
E L A H W P T G P A L T S Q F W L W M I
ACATGGCACCTTGGGCTATTTCTTTGCCTCACATTTGGTCAGATTGGATTCAAGGGAAGG
T W H L G L F L C L T F G Q I G F K G R
ACTGAGGAGTACTTCTGA
T E E Y F *
GAACCTTTGTTACTTCTGAGAACCTTTGTTGACACTGTAATCTCTTTCTTAAGACTCTGT
ACTCTTTACTCTTGTGTATAGGCGGAGATTGAACTTGTTCATCTCGGCACCACTGTGCTC
ATCTCAAATGCAATCCACAATGATTATCTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
ORF
438 nucleótidos
PROTEÍNA 145 aminoácidos
65
>UNK2 Agave tequilana
GAGCTCTGTTAACAAAACGGGTCCGAAGCC
ATGAAGCCGCCTCCGCATGCACAGGGTGAGGGGTCGTGGGGGCACGAGGTGAGGCGGGCG
M K P P P H A Q G E G S W G H E V R R A
ATCGGAGACAGGCTGAGGAAGGCGTATGATGCAACCCTGAGCCCTTCGGCCCTCAGGGGG
I G D R L R K A Y D A T L S P S A L R G
GGACTGGATCCAAAGACGATTGATGAGATGCCGAAGTCTAGCGGGTTTGATCGGCGGGTC
G L D P K T I D E M P K S S G F D R R V
GGGTCTGGACCCGAGGACCCGATAAGGAGAGTGATGTTCTTGGGCCCTTGGAGCCACACA
G S G P E D P I R R V M F L G P W S H T
TGA
*
GCATGTTGGATTGGATTGTGCGCATGAATTTGTACTAAAAGAAAGGAGATGGATCATAGA
TTAATGATTTCTTTTCTGTGAATAAATGATGTAAATATTAGAAGTTTGAGGAGAATATCA
CTCCATTTTACTTCTTTTCTTGGATTAAATTGAGATTGTTATTGGATTGTGATTTTGAAC
TTGATTTAGAGTTGAGGTAGCTTGAATAAGTAATTAACTGATTATTTTGGAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
ORF
243 nucleótidos
PROTEÍNA 80 aminoácidos
66
>WIP Agave tequilana
TTGGCTCCACCTCTCTTCCCCCCCATCCCTCCCCACCCAAAACACTTTCCTCTCGGGGCT
TTCTTGCAGAAATTTGACCAGTTTTTTTCGAAAAAG
ATGGGGCTTAGGAATTTCTCCATGGATCTTGATCAGCATGACTTGGGCTTCTGCTTCCAA
M G L R N F S M D L D Q H D L G F C F Q
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CAACAACAACAAGCACAAGATCTGATGGAAGGAGCCCAACAAGCTCAGTGCTTGCCTCTC
Q Q Q Q A Q D L M E G A Q Q A Q C L P L
ATCGATATGCTTGAAGAGCCCAAGAAGCCCATCAAAGAGGAGAAGGGGTTGGATCTGAGA
I D M L E E P K K P I K E E K G L D L R
GAGGACGGCGGCGAGTCGGTGAAGGTCACTGTGGCTCTGCAACTAGGGTTACCTGGGGCT
E D G G E S V K V T V A L Q L G L P G A
AATTCAGCAAATCTTGATGGTGATGGTGAGAACAAGAGTAGTACTACTGTTGCATCATAC
N S A N L D G D G E N K S S T T V A S Y
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F N R Y N N M Q M H M W G H G S E Y R K
GGGCCTGATTCTCTCAAGGGGACACAACCCATGGCCATGCTCAAACTCCCTTGCTACTGT
G P D S L K G T Q P M A M L K L P C Y C
TGCGCCCTCGGGGTGCAGAACAACATCAACTACCCCAGGGCAAAACCCTTGAAGGACTTC
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TGCAGCAAGCCCTTCGCGGTGCGAGGGGACTGGAGGACGCACGAGAAGAACTGCGGCAAG
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AGATCATTCGGCAAGGACCATGTTCCTTATTTCCCTTGA
R S F G K D H V P Y F P *
GAAATCAATCAAGCCATGGTAAGCTCCAATCAATAGTGAAGTATGTAGGYTTATYTATAG
TYTTGTGYTCAGTAACAAAAAACTTTGAGAAGTGTTTGAACMCAAGTATAGGGAGTGGTT
TGTTGTGAGCMCAAGCTYTAATGATGAGCGATAACAAAATTAGGATAGAGTTGTTTGAGC
TCGATCAATAAGAGATATAGTGTGATCAATTACCCTTCAAGAGAAGATTGTGAAGTAGCT
GAATTTTYTCCTGTTTTAACTYTATAGTTCATTCATTTAGTAACCGGTCAAAATYTATGT
ATTAGAGAAAAGTTTCCMCCTTCMCAGACTACTTATTAATTGGGTAATTGCAATCGAAAA
CKTYTTGAATTTTYGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
ORF
879 nucleótidos
PROTEÍNA 292 aminoácidos
67
>AtqKNOX1 Agave tequilana
AAAAAGTTGGTTTCCCTTCCTCTATCTTTTGAAAAATAAAACAAAATAAAATTTAATAAT
ACTACTCTCTCTCTCTCTCTCACTCTCACTCTCACTCTCACTCAAACGTTCTAGTCTCAA
ACAAAACCC
ATGGAGGAATTCCCTCACTTGAGTGGATCCAACTCCAGAGCCACTGACTGCATGTATTTG
M E E F P H L S G S N S R A T D C M Y L
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L T V G S S Q N P Y A A A S S G S R S I
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V S T D D E A I I K A K I I S H P H Y S
GCCCTTCTCGGAGCCTACATGGACTGCCAGAAGGTTGGAGCATCACCAGAAGTGGCGGCG
A L L G A Y M D C Q K V G A S P E V A A
AGGCTGTCGGCGGTTGCGCGGGAGATCGAGGCCCGGCAACAGGCCTCCATGAGCTGCCGA
R L S A V A R E I E A R Q Q A S M S C R
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R D A S S A E D P E L D Q F M E A Y C N
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M L V K Y R E E L T R P L Q E A M N F F
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R G V E S Q L N S L T N G A T A S I F S
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A A D E K C E G V G F S E E D Q D D S G
GGCGAGGCTGAACACCCTGAGATTGACCCGCGTGCTGAAGACAAAGAGCTGAAGCGCCAC
G E A E H P E I D P R A E D K E L K R H
CTTTTGAAGAAGTACAGCAGGTACCTCAGCAGCCTAAGGCACGAACTCTCCAAAAAGAAA
L L K K Y S R Y L S S L R H E L S K K K
AAGAAAGGCAAGCTCCCCAAGGAGGCGCGACAGAAGCTACTGAACTGGTGGGAGCTGCAC
K K G K L P K E A R Q K L L N W W E L H
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D Q K Q I N N W F I N Q R K R H W K P S
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M R G Q F I G D G S Y R F G P S P *
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AAATACTATTAATATTGGCTGTTAGACACTACATTGTATATTTATTTGAATGTTATCCAG
TGTCATAGTTTTCTCTG
ORF
1074 nucleótidos
PROTEÍNA
357 aminoácidos
68
>AtqKNOX2 Agave tequilana
TGGGAACAAAATAAAAAGCTGATATGATCATCTCGACCTGAACTCATCGCCGATCGAGGAG
ATGTACGGCGTGCGGACGGAGCTCAACCCCGCCGACGACCTCCACACCCTCATGGCCACC
M Y G V R T E L N P A D D L H T L M A T
GCCCGCTATCGGAGGACGATGAGGGCAGAGTACTCAGAGGAGGAGCTGAAGGCTCGGATT
A R Y R R T M R A E Y S E E E L K A R I
GCCTCCCACCCTCGCTATCCATTATTACTCCAAGCCTATATTGATTGTCAAAAGGTGGGT
A S H P R Y P L L L Q A Y I D C Q K V G
GCGCCACCGGAGATCGCGTGCCTGCTGGACGAGATCACTAGTAGTAACGGCGCCGTCGTC
A P P E I A C L L D E I T S S N G A V V
AACAAACGGACTGCCGCCGCCGCCTTCTCCGGTCGGTTCGGGTCCGATCCTGAGCTCGAC
N K R T A A A A F S G R F G S D P E L D
GACTTCATGGAGAGATACTGCGATGTGCTGATGAAGTACAGATCAGACCTGGCCCGTTCC
D F M E R Y C D V L M K Y R S D L A R S
ATCGACGAGGCCACCCATTTCCTCAACACCATAGAGACCCAGCTCTCCGATCTCTCCAAC
I D E A T H F L N T I E T Q L S D L S N
AACAAGCCTCCGCCACCTTCTAGAAGATCAAGCCCCTTGATCTCCTCCCTTCTTGATGAG
N K P P P P S R R S S P L I S S L L D E
GCTGCTGCTGGGTCATCGGATGAAGAAGTCAGTGGTGGAGAGACTGAGGTTCAAGAATTT
A A A G S S D E E V S G G E T E V Q E F
CATTTAAAAGGCGAAAGTGGGGATCTTAAGGAAAAGCTACTCCGCAAATATAGTGGTTAC
H L K G E S G D L K E K L L R K Y S G Y
TTGAGTAGCTTGAAGCGAGAGTTCTCAAAGAAGAAGAAAAAAGGAAAGCTCCCGAAGGAG
L S S L K R E F S K K K K K G K L P K E
GCACGGCAGATGCTGCTTGAATGGTGGACTGCTCACTATAAATGGCCCTATCCAACAGAA
A R Q M L L E W W T A H Y K W P Y P T E
GGAGATAAGACTGCATTGGCAGAGTCGACAGGGTTAGATCAGAAGCAGATAAACAATTGG
G D K T A L A E S T G L D Q K Q I N N W
TTTATAAACCAAAGGAAACGCCATTGGAAGCCATCAGAGAGCATGCAGTTTGCCGTTATG
F I N Q R K R H W K P S E S M Q F A V M
GGAAGCCTTTCAGCACCATTCTATGACGACGACTGA
G S L S A P F Y D D D *
GGATAATTGGAGCAACAATTAGAAAGACGTCAGTAAATTCTGATGATACTAAAATGTACCAAA
TAGAAATATTTTGAGACCTAGTTAAAAGAAATTAATGTATATCAGATATTGATGTTCAAGCTG
GGACTTGCATTGATATGCAGCCAGCCAAAACTGCAAGCCTCTGTGCG
ORF
876 nucleótidos
PROTEÍNA 291 aminoácidos
69
De las secuencias que fueron elegidas para llevar a cabo el análisis funcional por
expresión heteróloga, a las que mostraron identidad a genes de la familia KNOXI se les
asignó el nombre de AtqKNOX1 y AtqKNOX2 por las iniciales de Agave tequilana.
Estas
secuencias fueron depositadas en el GenBank .
Tabla 8. Números de accesión de las secuencias de A. tequilana depositadas en el GenBank.
Nombre
No. de Accesión
AtqKNOX1
GU980050
AtqKNOX2
GU980051
En la elaboración de las bibliotecas para el análisis del transcriptoma de Agave
tequilana, los genes se clonaron en el vector Gateway pDONR222 para facilitar la
transferencia a vectores de expresión utilizando la tecnología Gateway®. Así, para la
expresión en Arabidopsis thaliana se llevó a cabo una recombinación en el vector Gateway
pB7WG2D; este vector contiene el promotor CaMV35S, el gen Bar de resistencia a
fosfinotricina y el gen para la proteína verde fluorescente (GFP). Después de la recombinación
se transformó E. coli TOP 10 por electroporación, se verificó por PCR con oligonucleótidos
específicos para el gen de agave que las clonas fueran positivas; de las 10 colonias que se
analizaron, todas fueron positivas. En la Figura 23 se muestra el DNA plasmídico y el
resultado del PCR.
A
1
2
3
4
5
6 PM
B
C
PM
1
2
Fig. 23. DNA plasmídico y PCR de las clonas de E. coli con AtqKNOX2. A, DNA
plasmídico de 6 clonas de E. coli transformada con el vector pB7WG2D llevando el gen
AtqKNOX2, PM, marcador de peso molecular 1 Kb plus (Fermentas). B, PCR con
oligonucleótidos específicos para AtqKNOX2, C, control positivo (DNA plasmídico de la
clona AtqKNOX2), 1 y 2 PCR de clonas diferentes, PM, marcador de peso molecular 100 pb
(Invitrogen).
70
Usando el DNA plasmídico de E. coli de las clonas positivas, se transformó
Agrobacterium tumefaciens GV2260, por electroporación. Se extrajo el DNA plasmídico de
10 colonias y se llevó a cabo PCR para verificar que tuvieran el gen de agave. Todas las
colonias fueron positivas. En la Figura 24 se muestra el DNA y el PCR.
1D
2D
PM
1P
2P
PM
C
Fig. 24. DNA plasmídico y PCR de las clonas de A. tumefaciens con AtqKNOX2. 1D y 2D,
DNA plasmídico de 2 clonas de A. tumefaciens transformada con el DNA de E. coli de clonas
positivas llevando el gen AtqKNOX2, PM, marcador de peso molecular 1 Kb plus (Fermentas).
1P y 2P, PCR con oligonucleótidos específicos para AtqKNOX2 de dos clonas positivas, C,
control positivo (DNA plasmídico de la clona AtqKNOX2).
Se usó el cultivo de A. tumefaciens de las clonas positivas para la infiltración, se
realizaron tres infecciones y después se dejaron madurar las semillas durante
aproximadamente 25 días; cuando estuvieron secas se cosecharon y se procedió a sembrarlas
en el medio de selección.
Para determinar la eficiencia de la transformación en arabidopsis y obtener plantas
transformadas, se sembraron aproximadamente 6000 semillas de cada una en medio de
selección MS 0.1X con fosfinotricina. A los 10 días después de la germinación se pudieron
observar las plantas resistentes, que presentaron color verde y ya presentaban las dos primeras
hojas, en cambio las que no fueron resistentes presentan color amarillo y solamente se
desarrollaron los cotiledones. La eficiencia de transformación fue de alrededor de 2% para las
plantas wt y 1% para las plantas mutantes knat1 en la complementación. También se verificó
que las plantas que fueron resistentes a fosfinotricina presentaran expresión de GFP por
observación al microscopio de fluorescencia, como un marcador de selección; todas las
71
plantas que fueron resistentes expresaron GFP aunque existió un gradiente en esta expresión,
algunas plantas presentaron fuerte expresión, mientras que en otras fue tenue. La Figura 25
muestra una planta expresando GFP.
A
B
Fig. 25. Expresión de GFP en las plantas transformantes. A, Planta de Arabidopsis de 6
dpg 35S::AtqKNOX2 expresando el gen de GFP visualizada con el microscopio de
fluorescencia, B, planta wt en la misma posición y acercamiento que en A sin expresión de
GFP.
Las plantas que fueron positivas para resistencia a fosfinotricina y expresión de GFP se
transplantaron a suelo a los 10 días después de la germinación; en total fueron 40 plantas para
cada construcción y éstas representaron 40 líneas independientes transformadas. Se dejaron
creciendo a 25°C en fotoperiodo de días largos (16 h de luz y 8 h de oscuridad). A los 22 días
después de la germinación las plantas expresando las construcciones 35S::AtqKNOX1,
35S::AtqKNOX2 y 35S::WIPAgave ya presentaban en las hojas un fenotipo diferente a las
plantas wt, con alteración en la forma de las hojas de la roseta y las tres construcciones
mostraron un gradiente en la severidad del fenotipo en las diferentes líneas. En las plantas
expresando las construcciones 35S::UNK1 y 35S::UNK2 no se identificó un fenotipo diferente
a las plantas wt en la generación T0.
Cuando las líneas T0 produjeron semillas (correspondientes a la generación T1), se
sembraron aproximadamente 300 semillas de cada línea (en total 12 líneas para cada
construcción) con el objetivo de buscar las que tuvieran segregación 3:1, lo cual indicaría que
tenían una sola inserción del transgen. La Tabla 9 muestra el número de líneas que presentaron
segregación 3:1 en cada construcción.
72
Tabla 9. Líneas transformantes que presentaron segregación 3:1. Se probaron 12 de las 40
líneas de la generación T0.
Construcción
expresada
35S::UNK1
35S::UNK2
35S::WIPAgave
35S::AtqKNOX1
35S::AtqKNOX2
No de líneas
probadas
12
12
12
12
12
No de líneas
segregando 3:1
6
5
7
6
5
Se pasaron a suelo 24 plantas de cada una de las líneas con segregación 3:1 con el
objetivo de buscar líneas homocigotos; se seleccionaron las plantas que mostraron el fenotipo
más severo como posibles homocigotos. Cuando tuvieron semillas maduras, se sembraron en
medio de selección con fosfinotricina y las líneas que presentaron 100% de las plantas
germinadas resistentes, se marcaron como homocigotas (generación T2).
Las plantas
homocigotas se transplantaron a suelo y se usaron para llevar a cabo los análisis de expresión
por RT-PCR de los genes endógenos de Arabidopsis thaliana y comprobar la expresión de los
genes de Agave tequilana. La Figura 26 muestra los fenotipos que presentaron las plantas
expresando constitutivamente los genes de Agave UNK1, UNK2 y WIP, así como los RT-PCR
para comprobar que las plantas de arabidopsis expresan los genes de Agave.
La expresión del gen UNK1 de Agave no mostró fenotipo diferente a las plantas wt,
aunque sí se detectó expresión en las tres líneas analizadas. En cambio, los genes UNK2 y WIP
de Agave sí provocaron alteración en el fenotipo; las plantas expresando 35S::UNK2 Agave
mostraron tamaño reducido de la planta en general y 35S::WIP Agave también presentó
reducción en el tamaño y además las hojas enrolladas hacia abajo y con márgenes aserrados.
Algo notable en los RT-PCR es que los genes UNK1 y UNK2 mostraron amplificación de dos
bandas, lo cual no fue observado en la amplificación de WIP. Esto sugiere que puede existir
un procesamiento alternativo de los transcritos.
73
Genotipo
Fenotipo
WT
RT-PCR
Homocigoto
35S::UNK1 Agave
WT
Homocigoto
35S::UNK2 Agave
WT
Homocigoto
35S::WIP Agave
Fig. 26. Fenotipos de las plantas de A. thaliana expresando constitutivamente los genes de
A. tequilana y análisis de expresión por RT-PCR. 1,2 y 3 representan 3 líneas homocigotas
independientes. La amplificación de cDNA de actina fue usada como control.
La expresión en A. thaliana de los dos genes KNOXI identificados en la base de datos
del transcriptoma de Agave tequilana aportó información muy interesante. En vista de que
existe amplia información acerca del efecto de esta familia de genes en la formación y
mantenimiento de meristemos en varias plantas y con base en los resultados de los análisis de
expresión por RT-PCR e hibridación in situ durante la formación de bulbilos, en este trabajo
se consideró de particular interés caracterizar el fenotipo de las plantas silvestres con
expresión constitutiva de los genes de Agave AtqKNOX1 y AtqKNOX2, así como llevar a cabo
la complementación de la mutante knat1.
74
Cuando los genes KNOXI de Agave fueron expresados en plantas silvestres de
arabidopsis ecotipo Col0 bajo el control del promotor constitutivo CaMV35S se produjo un
efecto fenotípico muy claro observándose la formación de hojas lobuladas, como se muestra
en la Figura 27. Este fenotipo asemejó fuertemente el de las plantas sobreexpresantes del gen
KNAT1 de A. thaliana (Fig. 27 E).
Fig. 27. Fenotipos producidos por la expresión constitutiva de los genes KNOX de A.
tequilana en A. thaliana. A, 35S::AtqKNOX1, B, wt Col 0, C, 35S::AtqKNOX2, estas plantas
tenían 18 días de edad. D y F, plantas de 28 días de edad 35S::AtqKNOX1 y 35S::AtqKNOX2
respectivamente, E, planta de 30 días de edad sobreexpresando KNAT1 de Arabidopsis. G, H
y I corresponden a las plantas en A, B y C a los 38 días. Las puntas de flecha indican lóbulos
en las hojas. Las barras en A, B, C, D, E y F son de 0.5 cm; las barras en G, H y I son de 1.0
cm). J-L, Fenotipos de silicuas recién formadas y silicuas maduras, J, 35S::AtqKNOX1, K, wt
Col, L, 35S::AtqKNOX2. Las barras en J-L son de 4.0 mm.
75
La alteración en la forma de las hojas se observó desde la generación T0. En la Figura
27 las líneas transgénicas son homocigotas de la generación T2, note el tamaño más pequeño
de las transformantes comparadas con las plantas silvestres. Para comprobar que el fenotipo
obtenido de las plantas transformantes fue debido a la expresión de los genes de Agave, se
realizaron análisis de RT-PCR en tiempo real en tejido de hoja de tres líneas homocigotas
independientes para cada gen, con diferente grado de severidad en el fenotipo. Los resultados
indican que el nivel de expresión de AtqKNOX1 y AtqKNOX2 está directamente relacionado
con la severidad en el fenotipo (Figura 28), en las plantas silvestres no se detectó expresión y
es notable que AtqKNOX2 se expresó a un mayor nivel que AtqKNOX1. Aunque la
construcción 35S::AtqKNOX2 se expresó en niveles mas altos que la construcción
35S::AtqKNOX1, esta ultima produjo fenotipos mas severos (Figura 27 A, D, G).
Fig. 28. RT-PCR en tiempo real de AtqKNOX1 y AtqKNOX2 en tres líneas
transformantes independientes, homocigotas. A, B y C, transformantes expresando la
construcción 35S::AtqKNOX1. D, E y F, transformantes expresando la construcción
35S::AtqKNOX2, de mayor a menor severidad. G, wt Col 0. H, sobreexpresante de KNAT1. I,
nivel de expresión relativo de las líneas analizadas. La severidad del fenotipo decrece
progresivamente a medida que el nivel de expresión disminuye. Las barras son de 1.0 cm.
76
Las transformantes de 35S::AtqKNOX1 fueron mas similares a las 35S::KNAT1, ya que
las primeras hojas tenían fenotipo como la silvestre, como se ha reportado para
sobreexpresantes KNAT1 de A. thaliana (Chuck et al., 1996), pero conforme aumentó el
numero de hojas los lóbulos se presentaron más profundos; en cambio, para 35S::AtqKNOX2
ocurrió lo contrario, pues desde la primera hoja se presentaron profundas lobulaciones que
iban presentándose menos profundas conforme aumentaba el número de hojas. Así cuando
comienzó a crecer el tallo floral, se observó el fenotipo más drástico para las transformantes de
AtqKNOX1 que de AtqKNOX2 (Figura 27).
Un fenotipo que no ha sido reportado en A. thaliana sobreexpresando los genes KNOXI
y que se identificó en las transformantes 35S::AtqKNOX2 fue la presencia de órganos florales
(sépalos, pétalos y estambres) unidos a las silicuas aún en estado de madurez, esto es, que no
se presentó la dehiscencia (Figura 27 L); lo cual no ocurrió en las transformantes
35S::AtqKNOX1 (Figura 27 J, K y L).
Una característica que compartieron las transformantes de ambas construcciones fue la
floración tardía en comparación con plantas silvestres, en la Figura 29 se observa que la
silvestre está iniciando la formación de silicuas cuando las transformantes con los genes
KNOXI de Agave apenas tienen los primeros botones. Esto se observó en todas las líneas
homocigotas. Estos resultados sugieren que los genes KNOXI de Agave son funcionalmente
equivalentes a los genes KNOXI de A. thaliana, para confirmar esta observación se llevó a
cabo la complementación de una línea mutante knat1.
77
Fig. 29. Fenotipo de floración tardía de las transformantes 35S::AtqKNOX. A, planta
expresando 35S::AtqKNOX2. B, wt Col0, C, planta expresando 35S::AtqKNOX1. Las tres
plantas tenían 20 días de edad, La barra es de 2.0 cm.
VII.7.2.- Complementación de la mutante knat1 de Arabidopsis thaliana con los
genes KNOXI de Agave tequilana
La complementación de la mutante knat1 (Stock CS30) del ecotipo Ler, la cual está
ampliamente caracterizada y tiene deleción completa del locus KNAT1, permitió confirmar la
equivalencia funcional del gen KNAT1 y un gen KNOX de Agave tequilana. El fenotipo que
presenta la mutante es tamaño reducido, internodos acortados y pedicelos apuntando hacia
abajo (Douglas et al., 2002, Venglat et al., 2002). La mutante fue transformada con las dos
construcciones A. tequilana 35S::KNOX que se usaron para la transformación de plantas wt; se
obtuvieron 16 líneas independientes para cada construcción y para los análisis fenotípicos y de
expresión por RT-PCR se utilizaron líneas homocigotas de la generación T2. En la Figura 30
se puede observar el fenotipo obtenido.
78
Fig. 30. Fenotipo de la mutante knat1 complementada con los genes KNOXI de A.
tequilana. A y B, wt Ler, C y D, knat1 complementada con AtqKNOX2, E y F, mutante knat1
(Stock CS30), G y H, knat1 complementada con AtqKNOX1. Las barras son de 0.5 cm.
La línea mutante (Fig. 30 E y F) es mucho mas corta que la silvestre (Fig. 30 A y B) y
tiene los pedicelos y silicuas apuntando hacia abajo. La transformación con 35::AtqKNOX1
rescató solo parcialmente el fenotipo de knat1 produciendo plantas ligeramente más altas y
con silicuas horizontales (Fig. 30 G y H). Sin embargo, la transformación con 35::AtqKNOX2
rescató completamente el fenotipo de knat1 en términos de altura de la planta y orientación de
las silicuas; estos fenotipos se observaron en todas las líneas que presentaron segregación 3:1
para las dos construcciones y en algunas líneas transformantes 35::AtqKNOX1 que tenían más
de una inserción, en base a la segregación, se presentó el rescate casi completo de la mutación
knat1, pero sin llegar a los niveles observados en las líneas de 35::AtqKNOX2. También en
estas transformantes 35::AtqKNOX2 se observó el fenotipo de no dehiscencia en las líneas que
presentaron los más altos niveles de expresión (Fig. 30 D). Estos resultados sugieren que los
genes AtqKNOX1 y AtqKNOX2 juegan papeles funcionalmente diferentes.
79
VII.7.3. Análisis de expresión de los genes KNAT1, KNAT6 y AS1 por
RT-PCR
en las plantas transformantes
En Arabidopsis thaliana se lleva a cabo una compleja interacción entre los diferentes
genes de la familia KNOXI donde KNAT1 reprime a KNAT6 en los tallos de la inflorescencia,
confinando la expresión de KNAT6 a los nodos (Ragni et al., 2008). Para determinar si los dos
genes KNOXI de Agave tequilana estaban afectando los patrones de expresión de los genes
endógenos de A. thaliana KNAT1, KNAT6 y AS1 en forma similar a KNAT1 sobreexpresado y
si esto podría explicar las diferencias en los fenotipos observados en las líneas de arabidopsis
expresando ectópicamente las construcciones 35S::AtqKNOX, se llevaron a cabo análisis de
RT-PCR de KNAT1, KNAT6 y AS1 en hojas de líneas expresando los genes KNOXI de Agave
y de líneas sobreexpresando KNAT1 de A. thaliana y en tallos y nodos florales de la línea
mutante knat1 complementada por las construcciones 35S::AtqKNOX1 o 35S::AtqKNOX2; la
línea knat1 y plantas wt fueron incluidas como controles.
En hojas de plantas silvestres los genes endógenos KNOXI de Arabidopsis thaliana son
reprimidos debido a una interacción negativa con el complejo AS1/AS2 (Hay et al., 2006) y
esto es confirmado en los resultados mostrados en la Figura 31. La expresión ectópica del gen
KNAT1 condujo a una reducción de los niveles de transcritos de AS1. La expresión ectópica de
AtqKNOX1 también condujo a la expresión ectópica de los genes endógenos KNAT1 y KNAT6
en tejido de hoja junto con una ligeramente más alta expresión de AS1 (Fig. 31). La
sobreexpresión de KNAT1 y KNAT6 podría contribuir al fenotipo más severo observado en las
líneas transformantes 35S::AtqKNOX1. En contraste, las líneas 35S::AtqKNOX2 mostraron
solo muy bajos niveles de la expresión de los genes endógenos KNAT1 y KNAT6 y niveles
reducidos de la expresión de AS1 (Fig. 31) similar a lo observado en la sobreexpresión de
KNAT1.
80
Fig. 31. Análisis por RT-PCR del efecto de la expresión de los genes KNOXI de A.
tequilana sobre los genes endógenos de A. thaliana KNAT1, KNAT6 y AS1. Se uso tejido de
hojas de plantas wt Col0, sobreexpresantes KNAT1 y transformantes 35::AtqKNOX1 y
35::AtqKNOX2. El gen de ACT2 de A. thaliana y los genes KNOXI de Agave fueron usados
como control. Los paneles horizontales indican los genotipos del material usado para la
extracción del RNA y las columnas indican los genes que fueron analizados.
Para comprobar los resultados de la Figura 31, se llevó a cabo el análisis por RT-PCR
en tiempo real, usando los mismos tejidos y además se agregó otro control, una línea mutante
as1; con esto se comprobaría el efecto de los genes AtqKNOX1 y AtqKNOX2 sobre los genes
endógenos de arabidopsis que se analizaron (Figura 32).
El qRT-PCR confirmó los patrones de expresión observados en la Figura 31, la
expresión constitutiva de AtqKNOX1 induce la expresión de los genes KNAT1, KNAT6 y AS1
en tejido de hoja, mientras que AtqKNOX2 sólo induce ligeramente la expresión de KNAT1,
pero reprime la expresión de AS1. Además en la mutante as1 se induce fuertemente la
expresión de KNAT1, confirmando que AS1 y KNAT1 son mutuamente excluyentes (Figura
32).
81
Fig. 32. Análisis de la expresión por RT-PCR en tiempo real, de los genes de A.
thaliana KNAT1, KNAT6 y AS1 por efecto de la expresión constitutiva de AtqKNOX1 y
AtqKNOX2.
El análisis de la expresión de KNAT6 por RT-PCR en tallos y nodos florales proporcionó
información importante sobre la complementación de la mutante knat1 por AtqKNOX2. Ragni
et al. (2008) reportaron una interacción negativa entre KNAT1 y KNAT6 en tallos florales.
Donde KNAT1 reprime a KNAT6 en tallos de plantas wt, confinándolo solamente a los nodos;
por lo que en la mutante knat1, KNAT6 es desreprimido, presentando aumento de expresión en
tallos. Esta información fue utilizada para determinar si AtqKNOX1 y AtqKNOX2 tenían algún
efecto sobre la expresión de KNAT6 que pudiera explicar el efecto de la complementación
(Fig. 33). La expresión de 35S::AtqKNOX1 en el fondo mutante knat1 no tuvo efecto sobre la
expresión de KNAT6 mientras que la expresión de 35S::AtqKNOX2 sí lo tuvo, observándose
represión de KNAT6 en tallos de plantas complementadas con AtqKNOX2, tal como es
observado en las plantas silvestres. Estos resultados correlacionan con la habilidad de
82
AtqKNOX2 para complementar totalmente la mutante knat1, mientras que la complementación
con AtqKNOX1 fue parcial. Puede ser que la represión de KNAT6 en tallos florales sea
necesaria para recuperar el fenotipo silvestre.
A
B
Fig. 33. A. RT-PCR de KNAT1 y KNAT6 en tejido de tallos (T) y nodos (N) de la
inflorescencia de plantas wt,
knat1 y knat1 complementadas con AtqKNOX1 y
AtqKNOX2. B. RT-PCR en tiempo real.
Los resultados de la Figura 33 fueron comprobados por RT-PCR en tiempo real
(Figura 33B), los datos de todas las muestras de tallos fueron calibrados con respecto a T wt y
todos los de nodos, con respecto a N wt, por lo que estos adquirieron valor de 1, pero se puede
observar claramente que el nivel de expresión de KNAT6 es similar en la mutante knat1 y la
complementación con AtqKNOX1 (más alto en tallos que en nodos), en cambio en la
complementación con AtqKNOX2, se observa disminución de la expresión de KNAT6, tanto en
tallos como en nodos. Estos niveles de expresión no pudieron ser observados en el RT-PCR no
cuantitativo, pero se mantiene el hecho de que AtqKNOX2 tiene efecto en la disminución de la
expresión de KNAT6 y AtqKNOX1 no. Al parecer AtqKNOX2 tiene el mismo efecto de
represión que tiene KNAT1 sobre KNAT6.
83
VIII.
DISCUSIÓN
La formación de bulbilos representa una forma exitosa de propagación vegetativa que
presentan algunas plantas, probablemente adquirida a través del tiempo por la dificultad de
reproducirse por otros medios como las semillas. Esta forma de reproducción asexual es
relativamente poco frecuente en la naturaleza, probablemente siendo la razón por la cual
existen muy pocos reportes sobre estudios acerca del tema. Entre éstos se encuentran los
trabajos realizados por Arizaga y Ezcurra (1995) en Agave macroacantha y Szarek et al.
(1996) en Agave angustifolia, Agave fourcroydes, Agave murpheyi y Agave vilmoriniana
sobre la formación de bulbilos, ellos describieron este fenómeno a nivel fisiológico, desde
cuáles son los factores que influyen para el éxito de este tipo de reproducción hasta las
características de las plántulas formadas. Los trabajos fueron llevados a cabo en campos
silvestres a lo largo de varios años, pues las especies analizadas no son de uso comercial como
lo es Agave tequilana; esto probablemente dificultó aun más el trabajo, por lo que los datos
que aportaron son muy valiosos para estudios posteriores. El estudio de la formación de
bulbilos en Agave tequilana tiene la ventaja de que se pueden buscar plantas en estado de
floración en campos de cultivo comerciales, aunque encontrarlas no es común y solo ocurre en
plantaciones que no son destinadas a la producción de tequila, ya que como parte del proceso
de “maduración” de la piña de A. tequilana para la producción de tequila el tallo floral es
removido cuando inicia la floración, evitando así que los carbohidratos acumulados sean
consumidos en el proceso de floración. Adicionalmente, es difícil trabajar con estas plantas
por sus características como floración monocárpica (que sólo florecen una vez en su vida y
después mueren), la altura de la inflorescencia (que va de 2.5 hasta 5 metros); por esta razón
algunas plantas fueron removidas de su lugar original de crecimiento a las instalaciones del
Cinvestav Unidad Irapuato cuando comenzaba la emergencia del escapo floral, para ser
establecidas nuevamente. Esto provocó que las plantas perdieran en su mayoría los botones
florales y formaran bulbilos. Aunque también se trabajó con plantas en optimas condiciones de
desarrollo ubicadas en jardines ornamentales, las cuales solo formaron bulbilos cuando se
cortaron intencionalmente los botones florales.
84
Este trabajo es el primer reporte sobre la formación de bulbilos en el género Agave a
nivel histológico y molecular. A pesar de ser un mecanismo de reproducción muy importante
en este género en el cual predomina la reproducción asexual, este proceso es muy poco
entendido hasta ahora. La formación de bulbilos se ha reportado en 17 de las especies de
Agave reconocidas por Gentry en 1982 (Szarek et al., 1996), entre éstas existen especies que
forman bulbilos de manera inducida, es decir solo cuando se propician las condiciones
adecuadas, que en general incluyen métodos para evitar la formación de semillas; pero
también existen especies que los forman de manera constitutiva; éstas generalmente se
reproducen únicamente en forma asexual y no necesitan de inducción. Para llevar a cabo este
estudio, se eligió la especie Agave tequilana, que pertenece al primer grupo, ya que para este
análisis la etapa de referencia es cuando el botón maduro se encuentra en un estado previo a la
antesis, sin ser separado del pedicelo, por lo tanto en el lugar de la formación de bulbilos
(pedicelo) no se presenta todavía la señal inductiva, asegurando así que las plantas utilizadas
recibieron esa señal con el corte de los botones florales.
VIII.1. La formación de bulbilos tiene características de organogénesis
De acuerdo a los resultados del análisis histológico, se observó que la forma en que
ocurre el desarrollo de bulbilos es a través de un programa con características de
organogénesis, a partir de formación de meristemos de novo, ya que en la etapa S0, los cortes
histológicos mostraron que no existen primordios de brotes vegetativos. Después de la señal
de inducción, se lleva a cabo un rearreglo celular que inicia la proliferación para dar origen a
los meristemos. Los brotes no tienen dos polos de crecimiento que corresponden al meristemo
apical y de la raíz, ni tienen sistema vascular independiente del tejido de origen como ocurre
en la embriogénesis (Reinert, 1977), sino que al inicio solo cuentan con meristemo apical y
hasta que tienen un estado de desarrollo avanzado adquieren su propio sistema vascular, para
después desarrollar primordios de raíces y caer al suelo para establecerse como un organismo
independiente. En base a estas observaciones, se propone que probablemente existe un
reclutamiento de programas de desarrollo de tipo organogénico que confiere a un grupo de
células determinadas la capacidad de adquirir una nueva identidad meristemática, tal como fue
propuesto por Tooke et al. (2005) y Kerstetter y Hake (1997) en otras plantas.
85
El fenómeno de formación de bulbilos en Agave tequilana, es claramente diferente a lo
que ocurre en otras plantas, ya que se produce una profusión de meristemos en una región muy
pequeña originalmente diferenciada como pedicelo, que aparentemente no se ha definido
como meristemo, mientras que en Kalanchoë se forma un solo meristemo en una región muy
bien definida en el margen de las hojas (Garces et al., 2007) y en Titanotrichum el meristemo
floral revierte, ya sea para producir una estructura vegetativa llamada bráctea o un grupo de
nuevos meristemos vegetativos (Wang y Cronk, 2003).
La inducción de bulbilos en Agave también parece estar basada en señales localizadas,
ya que los botones florales que no han sido afectados producen cápsulas y semillas en una
inflorescencia que produjo bulbilos asexuales en otros pedicelos en los que se cortó el botón,
probablemente debido a cambios localizados en la concentración de hormonas. Esta idea es
soportada por reportes en Arabidopsis thaliana, donde fue mostrado que las auxinas pueden
reprimir la expresión de los genes KNOX y que las citocininas modulan las auxinas inducidas
en la organogénesis (Hay et al., 2004; Jasinski et al., 2006; Hay y Tsiantis, 2009). La
presencia ocasional de señales de desarrollo vegetativo y floral en conflicto en los sitios donde
se induce la formación de bulbilos se muestra cuando se desarrollan bulbilos y flores en el
mismo tejido, es decir, en el mismo pedicelo se forman meristemos que dan lugar a bulbilos y
meristemos que dan lugar a flores, o incluso meristemos que forman bulbilos que llevan en el
centro órganos florales, como se muestra en la Figura 7D.
VIII.2. Identificación de genes potencialmente involucrados en la formación de
bulbilos
La elaboración de bibliotecas completas de cDNA aunado a la disponibilidad de
bibliotecas de otros órganos de la planta, permitió la comparación entre éstas y las de bulbilos
la cual fue una estrategia adecuada para la búsqueda de genes candidatos para estar
involucrados en este proceso de desarrollo. A partir de este análisis comparativo se pudieron
identificar secuencias que solamente están expresadas durante el desarrollo de bulbilos, tal es
el caso de los genes llamados GlsA y UNK2. Sin embargo, las gráficas de categorización que
86
presentan el porcentaje de gi mostraron que las secuencias con homología a factores de
transcripción y genes relacionados con procesos de desarrollo en las bibliotecas de bulbilos
están representadas en bajos porcentajes, de 4 a 5%. Por ello, las secuencias correspondientes
a los genes de interés para el estudio de este proceso son pocos en relación al total de gi de
toda la base de datos.
El análisis de las secuencias también mostró la existencia de genes expresados con
mayor abundancia en tejidos de pedicelos durante la formación de bulbilos, característica que
se usó como un criterio de selección. También fue importante el segundo criterio de selección,
el cual se basó en genes reportados en otras plantas cuya función estuviera relacionada con
formación de meristemos vegetativos, en este caso las secuencias de Agave identificadas como
homólogos de genes reportados generalmente tienen baja expresión y muy localizada; sin
embargo, se pudieron detectar con las técnicas de RT-PCR y la hibridación in situ. La elección
de genes previamente reportados, específicamente en Arabidopsis thaliana, también tiene la
ventaja de poder expresarlos en forma heteróloga y así determinar si su función es la misma,
lo cual proporciona una aproximación a la función que pudieran tener en Agave tequilana,
como fue el caso de los genes de la familia KNOXI y el gen de la familia WIP identificados en
Agave.
La identificación de genes con patrones de expresión relacionados con la formación de
bulbilos, que no han sido identificados o caracterizados en otros sistemas, proporciona
información valiosa sobre el proceso, pues probablemente sean específicos de plantas
bulbiliferosas, por ejemplo los genes de A. tequilana en los que no se encontró identidad a
genes conocidos, llamados UNK. Por lo que es un reto su caracterización, puesto que en el
sistema biológico utilizado para este trabajo aun no es posible llevar a cabo la transformación
genética para sobreexpresión o silenciamiento, que pueda conducir al establecimiento de la
función del gen de un manera directa. Pero existen herramientas que se pueden utilizar como
el análisis a nivel de secuencia de aminoácidos con la posibilidad de encontrar alguna
secuencia de interacción que pueda proporcionar alguna clave para la búsqueda de su función,
este análisis está en proceso. O la expresión transitoria en Agave tequilana en un lugar y
tiempo específicos en los que puedan provocar algún efecto perceptible.
87
VIII.3. Los genes KNOXI son candidatos para conferir identidad meristemática
Durante la búsqueda de genes candidatos para estar involucrados en la formación de
bulbilos, se eligió el grupo de genes con identidad significativa a la familia KNOX, por su
abundancia en las bibliotecas de bulbilos y su función reportada en otras plantas de iniciar la
actividad meristemática para la formación de brotes ectópicos. Estos genes se han usado como
marcadores de linajes celulares que demarcan las células iniciadoras de embriones en varias
plantas, para trazar el meristemo apical del tallo durante la embriogénesis y también en el
desarrollo post embriogénico; así, la expresión de los genes KNOX puede definir la región en
la que se formará el meristemo en un estado globular temprano antes de su formación, como
fue reportado en arroz (Ito et al., 2002; Itoh et al., 2006). En Arabidopsis thaliana la
sobreexpresión de KNAT1 cambia las hojas simples a hojas lobuladas y en algunas plantas se
ha observado la formación de meristemos ectópicos en la parte adaxial de la hoja; estos
hallazgos sugieren que el producto del gen ectópico KNAT1 es capaz de interactuar con
factores endógenos presentes en la hoja para inducir meristemos con identidades específicas
(Chuck et al., 1996). En orquídea la sobreexpresión del gen DOH1 (KNOXI) produce hojas
con zonas indiferenciadas, aparición de tricomas y puntas bifurcadas (Yu et al., 2000).
Recientemente se reportó que la supresión del gen STM de Kalanchoe daigremontiana impide
la formación de plántulas en los márgenes de las hojas y se detectaron altos niveles de
transcritos de KdSTM en el meristemo apical del tallo y en meristemos axilares, por lo que se
sugirió que KdSTM provoca una señal inductiva para generar células meristemáticas (Garces
et al., 2007).
Los dos genes KNOXI identificados en Agave tequilana, son expresados
diferencialmente durante la formación de bulbilos y en grupos específicos de células; este
resultado está de acuerdo con los reportes sobre la función de esta familia de genes. El patrón
de expresión observado sugiere que AtqKNOX2 es necesario en las etapas iniciales de la
formación de los meristemos vegetativos, mientras que AtqKNOX1
probablemente está
involucrado en el mantenimiento y desarrollo de los meristemos formados. En las secuencias
KNOXI identificadas en la base de datos de Agave, no se encontró ninguna con identidad a
88
STM; esto puede ser debido a que la expresión de STM sea específica de ciertos estados de
desarrollo como la embriogénesis, o a que en el transcriptoma de Agave no se encuentren
homólogos a este gen y que los otros KNOXI lleven a cabo la función de STM.
La expresión heteróloga de los genes KNOX de Agave confirmó que ellos pueden
mimetizar funcionalmente los genes endógenos para producir el fenotipo de sobreexpresión y
en A. thaliana los genes KNOX de Agave muestran diferentes efectos regulatorios. Es
interesante que aunque AtqKNOX2 es más parecido a KNAT2 y KNAT6 a nivel de secuencia, a
nivel funcional es más similar a KNAT1. Al contrario, AtqKNOX1, el cual se parece mas a
nivel de secuencia a KNAT1 pero no en función, no logró complementar totalmente la mutante
knat1 a nivel morfológico y molecular. La expresión heteróloga de los genes de Agave está
bajo la regulación del mismo promotor, por lo que las diferencias en el fenotipo deben ser
causadas por la proteína expresada.
Aunque ambos genes AtqKNOX1 and AtqKNOX2 contienen los cuatro dominios
característicos de esta familia, el homeodominio, MEINOX, GSE y ELK, el dominio GSE que
es una señal para la regulación de la degradación de proteínas y está formado por 6
aminoácidos, en AtqKNOX1 solo tiene tres de ellos conservados; en cambio, en AtqKNOX2
este dominio es idéntico al de KNAT1. Uno de los aminoácidos sustituidos es aromático en
lugar del aminoácido hidrofílico. La deleción del dominio GSE en un gen homólogo KNOX de
arroz condujo a un fenotipo más severo en la sobreexpresión probablemente debido a una baja
autorregulación de la proteína (Nagasaki et al., 2001). Las diferencias observadas en la
expresión ectópica de AtqKNOX1 en A. thaliana podrían deberse a la falta de regulación de
AtqKNOX1 por un mecanismo similar.
VIII.4. Los dos genes KNOXI de Agave tequilana actúan de forma diferente sobre
genes KNAT1, KNAT6 y AS1 de Arabidopsis thaliana
La expresión heteróloga también condujo a observaciones interesantes en los efectos
sobre la regulación de los genes endógenos KNAT1, KNAT6 y AS1 de A. thaliana. Los
resultados de la expresión constitutiva, la complementación y los RT-PCR revelaron
89
interacciones reportadas anteriormente entre los genes KNOX de A. thaliana donde KNAT6 es
reprimido por KNAT1. El fenotipo observado en la expresión constitutiva de AtqKNOX2
donde las estructuras florales permanecen unidas en las silicuas maduras no ha sido
previamente reportado para sobreexpresantes de genes KNOX y esto puede indicar una
interacción entre genes miembros de la familia KNOX y genes de otras familias que producen
este fenotipo. Este fenotipo se reportó en plantas sobreexpresantes del gen AGL15, el cual
provoca inhibición de la senescencia y abscisión de los órganos florales, retraso en el tiempo
de floración y la maduración del fruto; se propuso que este gen actúa ya sea directa o
indirectamente para mantener un estado juvenil o no senescente, haciendo más lenta la
progresión de características relacionadas con la edad. AGL15 en plantas wt es expresado en
embriones en desarrollo, en la base de los pecíolos y órganos florales en desarrollo (Fernández
et al., 2000; Fang y Fernandez, 2002); este patrón de expresión está relacionado al que
presentan los genes KNOXI y en el caso de la formación de bulbilos, probablemente además
de la organogénesis, también existan características de embriogénesis que puedan relacionar
los genes KNOXI con los MADS-box. Por otro lado, los genes KNOXI también tienen efecto
de alargar el periodo vegetativo en A. thaliana, provocando retraso en floración y senescencia
(Chuck et al., 1996); esta característica también se observó en las transformantes
35S::AtqKNOX, como se muestra en la Figura 29.
VIII.5. Asociación de los genes KNOXI de Agave tequilana con el inicio de la
formación de bulbilos
La evidencia de que los dos genes KNOXI de Agave tienen funciones o patrones de
expresión diferentes en A. thaliana, sugiere que probablemente están actuando a niveles
diferentes en la ruta de reclutamiento de programas de desarrollo de tipo organogénico que se
lleva a cabo para la formación de bulbilos. Hasta ahora se tiene evidencia de la participación
de los genes KNOXI en el inicio de este proceso por el resultado de los análisis de hibridación
in situ, que muestran la presencia del mRNA de AtqKNOX2 en el grupo de células que inician
la división celular para la formación de los brotes vegetativos y la expresión de ambos genes
KNOXI en los meristemos apicales formados. Apoyando la hipótesis de que estos genes
podrían ser los que provocan la desdiferenciación celular en la zona debajo de los bractéolos
90
de los pedicelos florales, está la comprobación de que su función biológica corresponde a la de
los genes KNOXI. Sin embargo, para realmente poder afirmar que estos genes son requeridos
para el inicio de la formación de bulbilos, es necesario llevar a cabo experimentos de
sobreexpresión o silenciamiento en Agave tequilana.
La información generada hasta ahora es de gran importancia como un inicio del estudio
de la formación de bulbilos a nivel molecular y permite proponer el siguiente modelo:
Agave tequilana cuenta con una plasticidad que le permite reproducirse de forma
sexual y asexual. Durante la fase vegetativa se reproduce de manera asexual mediante hijuelos
de rizoma y simultáneamente acumula carbohidratos que almacena en el tallo para ser
utilizados en el desarrollo de la inflorescencia en su fase reproductiva.
Después de la
formación de botones florales, si la fecundación no es favorecida, se dispara una señal
inductiva para la formación de bulbilos. Si la interrupción de la fecundación se da antes de la
antesis, la planta tiene la posibilidad de cambiar de estrategia reproductiva. Este cambio
implica el reclutamiento de genes de actividad temprana, entre los que se proponen
AtqKNOX2, GlsA y UNK2 que posiblemente actúan provocando un cambio en la identidad de
un grupo de células que ya estaban diferenciadas en el pedicelo, confiriéndoles la capacidad de
desdiferenciarse para convertirse en células meristemáticas. Los genes con actividad temprana
pueden estar interactuando con otros para completar el proceso. Es probable que AtqKNOX1
lleve a cabo el mantenimiento de los meristemos formados y otros genes como GlsA que
participa en divisiones celulares asimétricas (Mori et al., 2003), AS1 en formación de
primordios de hojas (Hay et al., 2006), YABBY2 en el crecimiento abaxial en primordios de
hojas (Bowman, 2000), genes MADS-box que especifican la identidad de los órganos
(Yanofsky et al., 1990; Krizek y Meyerowitz, 1996) estén llevando a cabo la organogénesis.
Este modelo es esquematizado en la Figura 34. La Figura 35 muestra el pedicelo después del
corte del botón floral con los dominios de expresión observados en los análisis de expresión
por RT-PCR e hibridación in situ de los genes que fueron evaluados en este trabajo
proponiendo un orden en su participación.
91
Fig. 34. Modelo de estrategias de reproducción en Agave tequilana. El esquema incluye los
factores que se proponen es este trabajo involucrados en la producción de bulbilos y los genes
identificados.
Corte de
botón floral
?
?
AtqUNK1
? AtqGlsA
AtqAS1
AtqYABBY2
AtqKNOX1
AtqKNOX2
AtqKNOX2
AtqUNK2
Formación
de
Bulbilos
Orden propuesto de intervención de genes
Fig. 35. Modelo de dominios de expresión de genes en la formación de bulbilos. La flecha
indica el orden propuesto. Los signos de interrogación indican que no se ha comprobado el
patrón, pero se basa en la expresión obtenida por RT-PCR para AtqGlsA y en la expresión de
ortólogos para AtqAS1 y AtqYABBY2.
92
Para completar el modelo de expresión de genes y su interacción durante la formación
de bulbilos es necesario realizar ensayos de interacción de proteínas de los genes que se
identificaron, así como llevar a cabo el análisis de expresión masiva que proporcionen más
información. También es de gran importancia determinar el papel de las hormonas en este
proceso, pues por las características del desarrollo de bulbilos es muy probable que exista un
cambio en el balance hormonal que esté favoreciendo la expresión de genes específicos.
Los genes que se identificaron durante la formación de bulbilos para los que no se
encontró identidad a genes caracterizados en otras plantas presentan una línea de investigación
interesante, pues es probable que se puedan identificar en otras plantas que forman bulbilos.
Por lo que su caracterización en Agave proporcionará información valiosa.
Para determinar la función biológica de los genes que se han identificado en Agave
tequilana durante la formación de bulbilos es primordial lograr estandarizar un método de
transformación en esta planta, que permita sobreexpresar o silenciar genes y así poder
asignarles una función. Esto permitirá determinar en detalle cómo es controlada a nivel
molecular la inducción de bulbilos en Agave tequilana y en particular, el papel de genes no
caracterizados previamente o que son específicos de este proceso.
93
IX.
CONCLUSIONES
En base a los resultados del análisis histológico, se determinó que la formación
de bulbilos tiene características de organogénesis y que ocurre a partir de meristemos
formados de novo.
Con el análisis de las bibliotecas de cDNA se identificaron 11 genes
potencialmente involucrados en la formación de bulbilos por su abundancia en las bibliotecas
de estos tejidos y se confirmó que los 5 genes seleccionados, presentan expresión diferencial a
través de la formación de bulbilos.
Cuatro de los cinco genes expresados constitutivamente en Arabidopsis
thaliana causaron modificación en el fenotipo de hojas; esto puede ser debido a la alteración
en el desarrollo del meristemo apical. Uno de los genes que causó modificación en el fenotipo
de Arabidopsis thaliana no ha sido caracterizado en otras plantas y mostró expresión
específica durante la formación de bulbilos, por lo que es un buen candidato para la
caracterización en Agave tequilana.
Los tres genes de Agave tequilana expresados constitutivamente en
Arabidopsis thaliana, que son ortólogos de genes caracterizados en esta planta, WIP Agave,
AtqKNOX1 y AtqKNOX2, mostraron el fenotipo reportado en la sobreexpresión de los genes
endógenos, por lo que se determinó que los genes KNOXI de Agave tequilana tienen función
biológica equivalente a los genes KNOXI de Arabidopsis thaliana.
La función del gen KNOXI de Agave tequilana AtqKNOX2 equivalente a
KNAT1 se confirmó por la complementación total de la mutante knat1 de Arabidopsis
thaliana.
Se identificaron efectos diferentes sobre la expresión de algunos genes KNOXI
endógenos de Arabidopsis thaliana por los genes expresados de Agave tequilana. Con estos
resultados se comprobó que la expresión heteróloga en Arabidopsis thaliana es un método
94
aplicable a la caracterización funcional de genes de Agave tequilana que intervienen en el
desarrollo o que tienen funciones conservadas filogenéticamente.
X.
PERSPECTIVAS
Los datos aportados en este trabajo son el punto de partida para el análisis
funcional de genes de Agave tequilana en un proceso determinado, en este caso, la formación
de bulbilos. Ahora el reto es determinar en detalle cómo se controla este proceso a nivel
molecular; esto se puede abordar por el estudio de la interacción entre genes involucrados y
con esto establecer la red de señales que existe. Por lo que como perspectivas se tiene, realizar
ensayos de interacción entre proteínas por métodos como el sistema de dos híbridos en
levadura.
Otro aspecto de interés que se plantea como perspectiva, es evaluar la
participación de hormonas como las auxinas y citocininas en el proceso de formación de
bulbilos, ya que existen reportes en los que se menciona que hay un balance entre éstas, que
interviene en la expresión de genes con la función de inicio y mantenimiento de meristemos
vegetativos, como los genes KNOXI, en procesos de organogénesis.
En lo que respecta a la determinación de la función biológica de los genes que
se identificaron, una perspectiva es realizar la transformación de Agave tequilana. Esto se
puede llevar a cabo con el establecimiento del método de transformación en forma estable, ya
sea por infiltración con Agrobacterium tumefaciens o por biobalística y también se puede
realizar en forma transitoria por bombardeo de partículas, para la expresión de los genes de
interés.
95
También será importante realizar RT-PCR de genes de Arabidopsis thaliana
que inducen la floración, para establecer si existe regulación negativa por los genes de Agave
tequilana que se asociaron con la formación de bulbilos, como se reportó en Titanotrichum
oldhamii, donde la formación de bulbilos provoca disminución de los niveles de expresión de
genes de floración.
96
XI.
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105
XII. APÉNDICE
XII.1. Apéndice 1
Curvas de fusión para comprobar la especificidad de los oligonucleotidos usados para
los análisis de RT-PCR en tiempo real de los genes de A. tequilana
En el eje “y” se muestra la disociación del producto y en el eje “x” la temperatura a la
que ocurre. Si la curva presenta un solo pico significa que se amplificó un solo producto. Se
aprecia una curva con un pico único en todos, lo cuál indica que existe solo un producto de
amplificación. Con excepción de los oligonucleótidos utilizados para UNK2 que muestra un
pico principal y otros dos menores, sugiriendo que además del producto principal existen otros
dos en menor cantidad.
UNK1
UNK2
GlsA
106
AtqKNOX1
ACT2 Agave
AtqKNOX2
UBQ 11 Agave
107
XII.2. Apéndice 2
Artículo publicado en la revista Journal of Experimental Botany
“Class I KNOX genes are associated with organogenesis during bulbil formation in Agave
tequilana”
108
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