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Soluciones automáticas para el control microbiológico de alimentos XI WORKSHOP MRAMA Barcelona – Noviembre 2012 1 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 ¿Quiénes somos? Empresa de biotecnología que desarrolla, produce y comercializa reactivos y equipos automáticos para el control de la calidad microbiológica en productos de consumo. SECTOR ALIMENTACIÓN SECTOR FARMACÉUTICO SECTOR COSMÉTICO SANIDAD ANIMAL bioMérieux + AES = completo rango de soluciones para todas las etapas del proceso: desde la preparación de la muestra hasta la obtención del resultado. 2 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Distribución mundial • 150 PAISES • 14 + 2 CENTROS I+D • 18 + 1 CENTROS PRODUCCIÓN 3 • 39 FILIALES • > 100 DISTRIBUIDORES • > 6.000 EMPLEADOS XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Investigación y Desarrollo Boxtel (Netherlands) Lyon: Marcy, Craponne, La Balme (France) Saint Louis (USA) Grenoble (France) Shanghai (China) Durham (USA) Rio de Janeiro (Brazil) MÁS DE 900 EMPLEADOS 4 14 CENTROS I+D Florence (Italy) INVERTIMOS EL 13% DE LAS VENTAS > 400 FAMILIAS DE PATENTES XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Objetivos • Nuestra misión: a través del diagnóstico in vitro, contribuimos a mejorar la Salud Pública en el mundo. • Gama completa: soluciones en cada etapa del análisis desde preparación de muestra hasta genotipado microbiano. • Nuestra apuesta: FMLA (Full Microbiology Lab Automatization) Ofrecer técnicas rápidas y sencillas para la automatización integral del laboratorio. • Prioridades: CALIDAD y SERVICIO. • No sólo proveedores, también ASESORES. • Formación al cliente: cursos generales y a medida. • Congresos, simposios, jornadas técnicas. 5 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Soluciones … diseñadas para dar respuesta a las necesidades del sector: • • • • • • Rapidez en la obtención de resultados. Fiabilidad: técnicas eficaces (sensibilidad / especificidad). Automatización. Sencillez: técnicas fáciles de usar. Mínima manipulación. Validaciones internacionales (AFNOR, AOAC, etc.): métodos validados (ISO 16140) y estandarizados Técnicas mundialmente reconocidas. • Trazabilidad. • Calidad (Certificación ISO 9001, sistemas de gestión, ISO 11133, parte 1 y 2). 6 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Soluciones • Preparación de la muestra: DILUIDORES / TRITURADORES • Material de referencia para control microbiológico cuantitativo de medios de cultivo y validaciones: BioBalls®. • Sistema automático de control de temperaturas y otros parámetros: LabGUARD®. • Gama completa de medios listos al empleo (ISO 11133) en placa, frasco y tubo para aislamiento, detección y/o recuento de patógenos alimentarios, IC y Legionella. 7 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Soluciones • Medios preparados cromogénicos: ChromID Salmonella Detección Salmonella ChromID Coli Detección y recuento Campylobacter ALOA® ChromID Lmono ESIA® Detección Cronobacter 8 Recuento E. coli ASAP® IBISA® Detección y recuento L. monocytogenes REBECCA® ChromID Sakazakii CASA® CampyFood Agar Detección E. coli O157H7 ChromID O157H7 Detección Vibrio ChromID Vibrio Recuento B. cereus BACARA® XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Soluciones • Detección automática de patógenos: VIDAS®. • Recuento automático de indicadores de calidad: TEMPO®. • Extracción automática de ácidos nucleicos: miniMAG® / easyMAG®. • Detección de patógenos alimentarios mediante PCR Real Time: ADIAFOOD®. Gene UP®. Próximamente • Diagnóstico veterinario mediante PCR Real Time: ADIAVET®. • Identificación bioquímica de microorganismos y antibiograma: API®, VITEK® 2 Compact. 9 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Soluciones • Citometría de barrido: ChemScanRDI®. • Citometría de flujo: D-Count, BactiFLOW®. • Preparadores de medios: APS One®, Masterclave®, XY 500. • Contadores de placas: Easy Count 2®, Protocol 3®, WASP. • Control ambiental: Sampl’air®, gama Count-TactTM y Count-SlideTM • Genotipado microbiano automatizado mediante rep-PCR: DiversiLab®. • Otros: estufas, autoclaves, filtración, etc. 10 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Control microbiológico en el sector alimentario Sector alimentario ALIMENTO SEGURO ALIMENTO DE CALIDAD Seguridad alimentaria Calidad alimentaria Flora patógena Indicadores de Calidad en alimentos o procesos Detección - Presencia/ausencia Riesgo para la salud del consumidor Recuento Calidad higiénica Toma de muestra 11 Calidad comercial Trazabilidad de la calidad Flora deteriorante Impacto en la calidad del producto Impacto en la rentabilidad Riesgo financiero Dilución 1/10 Homogeneización Detección patógenos Recuento IC XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 12 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Preparación de la dilución madre DILUMAT S® - DILUMAT 4® 13 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Preparación manual vs. … Preparación del medio 1. Pesada 2. Mezcla medio 3. Autoclavado + agua a 100°C de frascos Preparación de la dilución madre 4. Preparación del lugar de trabajo 5. Ajuste del peso de la muestra 6. Adición del diluyente - Poca precisión. - Ebullición a 100ºC. - Manipulación de frascos: ~4 min / frasco - Tiempo consumido para ajustar la pesada: ~3min / muestra. - Apertura de un frasco por muestra. - No trazabilidad. - Control de calidad del diluyente. - Lavado y eliminación de frascos. - Manipulación tediosa: muchos frascos, etc, … 14 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 … preparación con Diluidor Un trozo de muestra Un click Informe: trazabilidad Descrito en norma ISO 7218: “Gravimetric diluters are electronic instruments based on a balance and a programmable liquid dispenser” Basado en un factor de dilución: Cualquiera que sea el peso de la muestra dispensación automática del volumen adecuado de diluyente para alcanzar el correcto factor de dilución. 15 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Ventajas 16 AHORRO DE TIEMPO Rapidez / automatización. PRODUCTIVIDAD No necesario preparar medio. SEGURIDAD Y PRECISIÓN Menor manipulación no contaminación cruzada. Factor de dilución eliminación de errores. ESTANDARIZACIÓN No necesario ajustar pesada a 10 / 25 g. COMODIDAD Automatización / eliminación errores manuales. TRAZABILIDAD Eliminación riesgo de transcripción manual errónea. XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 DILUMAT S • Multi-tarea. • Posibilidad de segunda bomba. • TRAZABILIDAD. • Impresora. • Teclado. • Aplicaciones específicas. • Polvo. • Listo al empleo. 17 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 DILUMAT 4 • Rapidez Opción turbo. • Multi-tarea Opción 4 x 4. • Grandes volúmenes Opción para muestras de 4kg (375 g). • Trazabilidad Posibilidad de conexión a LIMS. • Aplicaciones específicas. • Polvo. • Cosmética. 18 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Homogeneización de la dilución madre EasyMIX® - SMASHER® 19 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Homogeneización de la dilución madre Necesaria para: • • • • Homogeneizar / triturar. Extracción de microorganismos. Mantener la parte interna aséptica. Estandarizar las condiciones del análisis. LÍMITES: • • • • • 20 Dependiente de la matriz. Fase ruidosa. No segura. Manipulación. Diseño XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 SMASHER ALTA EFICIENCIA: Efecto SMASH (patentado) Fuerza máxima inicial instantánea. No necesario precortar la muestra. Eficiancia en el mezclado Paso 1: aplastado de las muestras Paso 2: efecto peristáltico Evaluación AFSSA (Agencia Francesa Seguridad Alimentaria) Homogeneización en 15-30 segundos vs. 1-2 minutos con los trituradores convencionales. 21 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 SMASHER FACILIDAD DE LIMPIEZA: Posición de 45ºC. Palas removibles fácilmente extraibles. Cámara con ABS inyectado: resistente a desinfectantes. Cajón para los desechos integrado. 22 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 SMASHER MUY SILENCIOSO: Insonorizado. Mediciones acústicas. El nivel de ruido se multiplica por dos cada 3dBA 23 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 DETECCIÓN DE PATÓGENOS miniVIDAS® - VIDAS® 24 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 VIDAS es una plataforma que evoluciona para dar soluciones a las necesidades del laboratorio de microbiología de alimentos (PLATAFORMA PARA LA INNOVACIÓN) • • • • 25 Métodos rápidos. Métodos fáciles de usar. Mínima manipulación. Métodos fiables y precisos (alta sensibilidad y especificidad). XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Plataforma evolutiva Inmuno Concentración ELFA 1992 1993 Listeria 26 ECO 1996 ICS + SLM Fragmento Fab 2002 LMO2 Tecnología Proteína Recombinante de Fagos 2003 2004 2006 SET2 LSX Next Day LDUO 2008 ECPT 2009 SLMX LMX 2011 SPT XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Plataforma evolutiva ELFA / Inmuno-detección 1992 1993 Listeria ECO 27 1996 ICS + SLM 2002 LMO2 2003 2004 2006 SET2 LSX Next Day LDUO 2008 ECPT 2009 SLMX LMX 2011 SPT XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Plataforma evolutiva Inmuno-concentración 1992 1993 Listeria 28 1996 ECO ICS + SLM 2002 LMO2 2003 2004 2006 SET2 LSX Next Day LDUO 2008 ECPT 2009 SLMX LMX 2011 SPT XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Plataforma evolutiva Fragmento Fab 1992 1993 Listeria 29 ECO 1996 ICS + SLM 2002 2003 2004 2006 LMO2 SET2 LSX Next Day LDUO 2008 ECPT 2009 SLMX LMX 2011 SPT XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Plataforma evolutiva Fragmentos: Fab’ Anticuerpo completo XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Plataforma evolutiva 1992 1993 Listeria 31 ECO 1996 ICS + SLM 2002 LMO2 2003 2004 2006 2008 SET2 LSX Next Day LDUO ECPT 2009 SLMX LMX 2011 SPT XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Plataforma evolutiva LDUO 1992 1993 Listeria 32 ECO 1996 ICS + SLM 2002 LMO2 2003 2004 2006 SET2 LSX Next Day LDUO 2008 ECPT 2009 SLMX LMX 2011 SPT XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Plataforma evolutiva FAGOS 1992 1993 Listeria 33 ECO 1996 ICS + SLM 2002 LMO2 2003 2004 2006 SET2 LSX Next Day LDUO 2008 2009 2011 ECPT SLMX LMX SPT XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Equipo empleado para la detección (ausencia/presencia) de patógenos bacterianos de forma automática. Es un ROBOT Reactivos: CARTUCHOS Y CONOS - Cartuchos con pocillos conteniendo reactivos RTU. - Cono: pipeta + soporte (fase sólida) Si Ac específicos recubriendo la pared del cono Inmunodetección automática mediante un ELISA SANDWICH ligado a fluorescencia. Si Proteína FAGOS recubriendo la pared del cono Detección automática mediante tecnología de CAPTURA ESPECÍFICA CON FAGOS ligada a fluorescencia. 34 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 PRINCIPIO Técnica ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay), unida a técnicas de inmuno-detección, inmunoconcentración y a captura específica mediante fagos 35 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Inmuno-detección CONO (SPR = Solid Phase Receptable) CARTUCHO Buffer de lavado Muestra Sampl Diluyente e (Prelavado) 36 Conjugado Sustrato Photo diode XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Inmuno-detección sustrato sandwich 37 conjugado XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Inmuno-detección Ciclo in and out Reacción inmunológica Reacción enzimática Vídeo VIDAS Strip 3D 38 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Inmuno-concentración Captura Las bacterias diana de la muestra son capturadas por los Ac que tapizan la pared del cono. 39 Lavado Las fases de lavado arrastran las bacterias no deseadas, mientras los antígenos buscandos siguen unidos al Ac del cono Liberación Una enzima específica rompe la unión del Ag-Ac y deposita las bacterias vivas en un pocillo XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Inmuno-concentración 40 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Captura específica mediante fagos Un bacteriófago o fago es un virus que solo infecta bacterias. Muy común: la forma de vida más abundante sobre la Tierra. Optimizado por la naturaleza: - Necesita un hospedador específico para su reproducción. - Extremadamente estable: se ha desarrollado en condiciones difíciles de pH y temperatura. 41 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Captura específica mediante fagos Anticuerpos vs. fagos: Los anticuerpos son proteínas específicas de la respuesta inmune humoral y representan uno de los muchos mecanismos involucrados en dicha respuesta inmune. Si este mecanismo falla, el organismo puede emplear otros mecanismos de protección. Los elementos de reconocimiento que emplean los fagos para identificar su hospedador representan su única posibilidad de propagarse. El funcionamiento correcto de estas proteínas lleva consigo una elevada presión selectiva, pues son indispensables para la supervivencia de los fagos. Los elementos de reconocimiento de los fagos pueden considerarse como una herramienta con propiedades únicas para ser empleada en ensayos de detección bacteriana en relación a especificidad y sensibilidad. 42 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Captura específica mediante fagos Vídeo Phage 43 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Captura específica mediante fagos Se emplea solo la proteína recombinante de la fibra de la cola del fago y no el fago completo. es la parte más específica del fago. se elimina el riesgo de mutación: se elimina riesgo de destrucción de resto de flora. garantiza la especificidad del test. 44 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Captura específica mediante fagos Resultado FAGOS + VIDAS: + Aumento de sensibilidad: - Fagos son 100 veces más sensibles que los anticuerpos. - Fagos concentran la bacteria diana desde el medio enriquecimiento. de Aumento de especificidad: - Fagos son específicos de determinadas especies / cepas bacterianas. - Fagos seleccionan la bacteria diana entre toda la flora competitiva. Acortamiento en el tiempo de obtención de resultados. Disminución de la manipulación. Automatización de una herramienta sin precedentes para la detección rápida de patógenos bacterianos. 45 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Parámetros / Protocolos PARÁMETRO Solución 48 horas Solución Next Day VIDAS SLM Doble Vía Salmonella spp. VIDAS SPT VIDAS Easy SLM Listeria spp. VIDAS LIS VIDAS LPT* Listeria monocytogenes VIDAS LMO2 VIDAS LMX Listeria spp . & L. monocytogenes VIDAS LDUO - VIDAS ECPT E. coli O157 (incluyendo H7) VIDAS ICE Campylobacter Enterotoxina Staph VIDAS CAM - - VIDAS SET2 * Lanzamiento noviembre 2012 46 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Detección Salmonella spp.: VIDAS SPT Método certificado AFNOR VALIDATION BIO-12/32-10/11 Todos los alimentos Muestras ambientales X g ó X ml de muestra + 9 X ml de APT (Dilución 1/10) + Suplemento selectivo 18 - 24 h 41,5°C +/- 1°C VIDAS SPT Calentamiento H&G 5 min Vídeo Vidas SPT 47 48 min Tecnología ELFA empleando Proteina Recombinante de Fagos + Ac XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Detección Salmonella spp.: VIDAS SPT Método certificado AFNOR VALIDATION BIO-12/32-10/11 Heces animales Muestras ambientales de producción primaria X g ó X ml de muestra + 9 X ml de APT (Dilución 1/10) + Suplemento selectivo 18 - 24 h 41,5°C +/- 1°C 1 ml en caldo SX2 (precalentado) 6 - 24 h 41,5°C +/- 1°C VIDAS SPT Calentamiento H&G 5 min 48 min 48 Tecnología ELFA empleando Proteina Recombinante de Fagos + Ac XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Detección L. monocytogenes: VIDAS LMX Método certificado AFNOR VALIDATION BIO-12/27-02/10 Todos los alimentos Muestras ambientales X g ó X ml de muestra + 9 X ml de Caldo LMX (Dilución 1/10) + Suplemento LMX 26 - 28 h 37°C +/- 1°C VIDAS LMX Calentamiento H&G 5 min 80 min 49 Tecnología ELFA empleando Ac XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Detección E.coli O157: VIDAS ECPT Método certificado AFNOR VALIDATION BIO-12/25-05/09 Carne cruda 25 g en 225 ml de APT + vancomicina 7-24 h. 15-24 h. 41,5 +/- 1°C VIDAS ECPT 45 min 50 Alimentos (excepto carne cruda) y muestras ambientales 41,5 +/- 1°C Calentamiento Heat & Go 5 min Tecnología ELFA empleando Proteina Recombinante de Fagos VIDAS ECPT 45 min XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Detección Listeria spp.: VIDAS LPT Método certificado AFNOR VALIDATION BIO-12/33-05/12 X g ó X ml de muestra + 9 X ml de caldo LPT (Dilución 1/10) 26 - 30 h 30°C +/- 1°C VIDAS LPT Calentamiento H&G 5 min 80 min 51 Tecnología ELFA empleando Proteina Recombinante de Fagos XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Resumen características • Multiparamétrico. • Plataforma para la innovación. • Sensibilidad y especificidad. • Rapidez: protocolos “al día siguiente” y de 48 horas. • Validaciones internacionales. • Capacidad analítica de 1 a 30 muestras / varios parámetros simultáneamente: mejora flujo de trabajo. • Sencillez y mínima manipulación (un paso de pipeteo). • No necesarias condiciones especiales en el laboratorio mínimo riesgo de contaminación. • Software sencillo y estandarizado. • Automatización: elimina el error humano. • Trazabilidad: posibilidad de conectar VIDAS a LIMS 52 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 DETECCIÓN DE PATÓGENOS PRÓXIMAMENTE GENE UP® 53 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 GENE UP PRÓXIMAMENTE • • • • • • • • PCR Real Time. Formato de 96 pocillos Sondas FRET. Extracción: lisis mecánica. Tiempo en termociclador: 1 hora. 1 a x parámetros cada ciclo. Almacenamiento de reactivos a Tª ambiente. Parámetros (lanzamiento): Salmonella, Listeria spp., E. coli O157:H7 & Listeria monocytogenes kits. Resultados al día siguiente. Validado para muestras de 375g para Salmonella & E. coli O157:H7. Resultados en el mismo día combinando con EasyMAG. Otros parámetros (posteriormente): STEC, … 54 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 RECUENTO DE INDICADORES DE CALIDAD TEMPO® 55 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Equipo automático para el recuento de indicadores de calidad basado en la técnica del Número Más Probable (NMP) Lectura: por fluorescencia 56 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Características • Multiparamétrico: aerobios mesófilos ( ), coliformes totales ( ), E. coli ( ), enterobacterias ( ), bacterias ácido-lácticas ( ), Staph ( ) y mohos y levaduras ( ). • Mismo protocolo para todos los parámetros y todos los alimentos. • Validaciones internacionales (acorde ISO 16140). • Aumento de capacidad de trabajo: 1 analista = 500 determinaciones / día. • Basada en microbiología automatizado. 57 tradicional: método NMP XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Principio de la técnica 16 tubos miniaturizados 2,25 µl 22,5 µl 225 µl Tarjeta de recuento patentada: PVC moldeado con pocillos de distinto volumen: NMP de 16 x 3 tubos 58 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Fluorescencia ---++-----+-+---+++++++++++++++ NMP ++++++++++++++++ 59 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Combinación NMP ---++-----+-+---++++++++++++++ ++++++++++++++++ 16 / 15 / 4 Tabla MPN + Factor dilución 5.000 ufc/g 60 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Reactivos Cajas de 48 test (2x24 tarjetas + 2x24 viales). Reactivos identificados con código de barras y de color. Medio deshidratado estéril: selectivo (EC, TC, EB, STA, LAB, YM) o general (TVC). FRASCO DE MEDIO DE CULTIVO TARJETA 61 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Protocolo de trabajo 1 2 Preparación de la muestra madre: Dilución 1/10 ESTACIÓN DE LECTURA 4 Lectura e interpretación automáticas en Tempo Reader 62 WIFI Llenado y sellado en Tempo Filler ESTACIÓN DE PREPARACIÓN 3 Incubación en estufa tradicional XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Computer ESTACIÓN DE PREPARACIÓN Media shelf Filler / Sealer Barcode Reader – – – – – 1 TEMPO Filler 1 PC con léctor de código de barras & mini teclado 4 gradillas de llenado 1 estantería para los medios Dispensers 4 dispensadores + frascos (1litro) Tray 63 63 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Diluciones Rangos de recuento / Sensibilidad Dilución 1/40: 10 a 4,9 E4 ufc/g Dilución 1/400: 100 a 4,9 E5 ufc/g Dilución 1/4.000: 1.000 a 4,9 E6 ufc/g Dilución 1/4,0 E4: 1,0 E4 a 4,9 E7 ufc/g ... Dilución 1/4,0 E8: 1,0 E8 a 4,9 E11 ufc/g Posibilidad de disminuir rango (asociación de tarjetas): - 2 tarjetas: 5 a 6,2 E4 ufc/g - 3 tarjetas: 4 a 6,9 E4 ufc/g 65 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Tempo Filler: llenado y sellado de tarjetas + Medio de cultivo rehidratado con agua estéril Muestra alimento homogeneizada (dilución 1/10) ¡¡Único protocolo para todos los alimentos y todos los parámetros!! Tempo Filler: llenado tarjeta por aspiración (vacío) y sellado automático. • Llenado de 6 tarjetas en 3 min (400 tarjetas en una jornada de 8 horas) • Preparar 6 tarjetas = Llenar 6 tarjetas 66 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Incubación Gradilla de llenado Sellado Vídeo Test_inoculationTEMPO Incubación en estufa convencional: Temperatura según parámetro. 67 Gradilla de incubación/ lectura XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Incubación Parámetro 68 Temperatura incubación Tiempo incubación 30°C 40 – 48 h 35°C 22 – 27 h 30°C 24 – 27 h 37°C 24 – 27 h 37°C 24 – 27 h 30°C 40 – 48 h 25°C 72 – 76 h XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Incubación TVC Express • Mismo kit TEMPO TVC, pero se lee a 24+/-1h • Válido para carne cruda: – Ternera / vaca / cerdo / pollo / cordero / pavo / etc… – Con o sin mezcla (con hierbas, etc.) – Fresca o congelada • Alto nivel de contaminación: > 1000 ufc/g Las muestras pueden ser leídas a las 24h y a las 40h 24h ± 1h Resultado Express 69 40h 48h Resultado Final validado XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Incubación fines de semana MIÉRC. JUEV. VIER. SÁB. DOM. nevera incubación incubación lectura lectura nevera lectura nevera incubación incubación LUNES lectura lectura lectura nevera lectura incubación lectura nevera 70 incubación lectura XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 ESTACIÓN DE LECTURA – – – – – – 71 1 TEMPO Reader 1 PC Lector código de barras 1 impresora & ratón 1 dispositivo WIFI 12 gradillas de incubación/lectura XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Tempo Reader 20 tarjetas / 2,5 min Lectura por fluorescencia Informe resultados: NMP UFC por g, ml, S, cm2 Vídeo Reading 3D_TEMPO 72 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Principios de detección CRECIMIENTO Medio especialmente formulado (con o sin agentes selectivos) REACCIÓN FLUORESCENTE – Coliformes, Enterobacterias y S. aureus: – Indicador de pH fluorescente : 4-Metilumbeliferona (4MU) – Aerobios y E. coli : – Sustrato enzimático fluorescente – Lactobacilos y Mohos y Levaduras: – Oxidorreducción 73 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 TC, EB y STA: Acidificación Acidificación del medio debido al metabolismo de los carbohidratos 4MU fluorescente a pH > 7 4MU No fluorescente a pH < 6 Pocillo positivo: no fluorescente Pocillo negativo: fluorescente 74 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 TVC y EC: Actividad enzimática fluorescente no fluorescente 4MU-X Actividad bacteriana enzimática específica X 4MU Pocillo positivos: fluorescente Pocillo negativo: no fluorescente 75 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 E. coli Sustrato enzimático específico para la detección de E. coli: 4-metilumbeliferil- β -D-glucuronide (MUG) + MUG 76 β glucuronidasa (E. coli) Glucuronato 4-methilumbeliferona XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 YM y LAB: Oxidorreducción NO2 O no fluorescente O COOH oxidorreducción NH 2 O nitro-reductasa 7-nitrocoumarin-3-carboxylic acid fluorescente O COOH 7-aminocoumarin (7AMC) Pocillo positivos: fluorescente Pocillo negativo: no fluorescente 77 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 Trazabilidad Worklist efgh abcd 1234 1 OR LIMS 3 2 WIFI data transfer 78 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012 MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN 79 XI Workshop Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria Barcelona - Noviembre 2012