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Caracterización molecular, serotipificación y casos estudio de
Listeria monocytogenes en la industria de alimentos chilena.
Equipo R&D, TAAG Genetics.
Contacto: Mauricio Niklitschek, PhD.
Mail: [email protected]
Introducción:
La listeriosis es una enfermedad infecciosa grave causada por la bacteria Listeria monocytogenes, siendo la principal fuente de contagio para
el hombre el consumo de alimentos contaminados por esta bacteria.
Esta enfermedad puede presentarse como casos esporádicos o epidemias, siendo una infección de carácter oportunista que afecta sobre
todo a mujeres embarazadas, recién nacidos, ancianos y adultos
inmunodeprimidos. Durante el año 2013, el Instituto de Salud Pública
ha confirmado 74 casos de listeriosis provocados por alimentos,
costando la vida de tres embarazadas y dos adultos mayores (1).
Estudios en distintas cepas de L. monocytogenes han demostrado una
Resultados:
Principales fuentes de Listeria.
En este estudio se analizaron muestras de materias primas, superficies
y productos elaborados en búsqueda de L. monocytogenes, en igual
proporción. De estos análisis, 36 muestras resultaron positivas para
esta bacteria. Así, las muestras se distribuyeron de la siguiente manera
de acuerdo a su origen:
Figura 1: Origen de las muestras que presentaron
crecimiento de L. monocytogenes.
alta variabilidad en su virulencia relativa, identificándose y separándose
19%
en 13 diferentes serogrupos (también denominados serotipos). Sin
embargo, adicionalmente los avances en genómica bacteriana aplica-
36%
da, han permitido ampliar estos grupos a más de 600 clones distintos
45%
de esta bacteria. Estos clones, pueden presentar características distintas de hábitat, potencial patogénico, resistencia a sanitizantes y
antibióticos, etc. La utilización de esta metodología ha sido muy útil
para identificar y caracterizar los brotes epidémicos, establecer potenciales fuentes de origen de la contaminación (trazabilidad microbiológica) e implementar planes de control dirigido a las contaminaciones
originadas durante la producción y distribución de alimentos.
Objetivo:
Este trabajo tiene como objetivo aislar e identificar los clones de L.
monocytogenes presentes en superficies y alimentos de diferentes
industrias chilenas de alimentos. Los resultados obtenidos permitirán
determinar el real riesgo asociado con un resultado positivo para L.
monocytogenes, de modo de tomar acciones correctivas más eficientes.
Su p e r f ic ie s
Pro d u c t o s e la b o r a d o s
M ater ias p r im as
Estos resultados nos indican que la principal fuente potencial de contaminación de alimentos por listeria corresponde a las superficies de
trabajo y manipulación de los alimentos, siendo esto concordante con
otros estudios internacionales aplicados a diferentes industrias (2).
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de Listeria monocytogenes en la industria de alimentos chilena
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Identificación de distintos
serotipos de Listeria.
de listeriosis (Figura 2). La prevalencia de cada uno de los serotipos
La serotipificación de L. monocytogenes permite agrupar y diferenciar
Tabla 2: Porcentaje de prevalencia de serotipos de
L. monocytogenes v/s matriz
dependiendo de la matriz analizada se detalla en la Tabla 2.
los distintos aislados de esta bacteria y correlacionarlos de acuerdo a
su grado de patogenicidad y virulencia. Así, se han descrito 5 grupos
Serotipo
Producto terminado
Materia prima
Superficies
moleculares, IIA, IIB, IIC, IVA y IVB, siendo este último el principal
causante de los casos de listeriosis por consumo de alimentos contami-
IVB
47%
12%
18%
nados.
IIB
29%
12%
41%
IIA
18%
29%
18%
IIC
6%
0%
0%
IVA
0%
0%
6%
Tabla 1: Potencial patogénico de los distintos serotipos
de L. monocytogenes (3).
Serotipo
Incidencia
IlA
Serotipo comúnmente aislado desde alimentos y
plantas procesadoras. Baja prevalencia clínica.
IlB
Serotipo epidémico oportunista de baja
prevalencia clínica.
llC
Serotipo comúnmente aislado desde alimentos y
plantas procesadoras. Causante de casos
esporádicos de Listeriosis.
lVA
Serotipo comúnmente aislado en animales.
lVB
Serotipo epidémico que posee la mayor
probabilidad de causar Listeriosis.
Estudio de clonalidad de los distintos
aislados de Listeria.
El estudio de clonalidad de los aislados de listeria se realizó mediante
la secuenciación de varias regiones hipervariables de su ADN y posterior comparación con una base de datos internacional. Este procedimiento, permitió diferenciar cada clon de manera independiente,
asignándole su código de acuerdo a las más de 640 variantes distintas
de esta bacteria. La relación clonal entre las distintas muestras fue la
siguiente:
Figura 3: Relación clonal de los aislados de L. monocytogenes.
Las muestras analizadas se distribuyeron de acuerdo a su grupo
molecular de la siguiente manera:
Figura 2: Serogrupos moleculares de los aislados
de L. monocytogenes.
22%
S e rogru p o I I A
S e rogru p o I I B
33%
39%
C lo n e s ú n ic o s
44%
C lo n e s re p e tid o s
S e rogru p o I I C
S e rogru p o I VA
3%
3%
56%
S e rogru p o I VB
En las muestras analizadas se observa una mayor prevalencia del grupo
molecular IIB, que presenta una baja incidencia clínica. Sin embargo, el
33% de los aislados de listeria pertenecen al grupo de alto riesgo IVB,
serotipo altamente epidémico y responsable de los principales brotes
De las 36 muestras analizadas, 20 de ellas presentaron clones únicos
que fueron aislados en una única oportunidad. De las 16 muestras
restantes, 1 clon se aisló desde 4 muestras distintas, otro clon se aisló
desde otras 6 muestras y otro clon desde otras 6 muestras.
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Casos Estudio:
1
CLON TG06 ENCONTRADO EN 4
MUESTRAS DISTINTAS.
MISMO PROVEEDOR, MATRICES DISTINTAS.
3
CLON TG09 ENCONTRADO EN 6
MUESTRAS DISTINTAS.
DISTINTAS EMPRESAS, ALIMENTOS SIMILARES
Este clon se encontró en las instalaciones de un mismo expendedor de
Se observó que el clon TG09 fue aislado desde empresas distintas, un
alimentos y en la misma fecha. Las muestras donde se encontró este
productor y expendedor de alimentos, sin embargo ambas empresas
clon fueron las siguientes:
venden productos similares. Este clon se encontró en:
Un producto elaborado
Dos superficies
Un equipo de procesamiento.
En este caso, es posible asumir que la contaminación del producto
elaborado se debe a una contaminación cruzada desde la superficie de
trabajo, además de comprobar que el clon de L. monocytogenes ya se
encuentra en múltiples lugar dentro de las instalaciones.
2
CLON TG17 ENCONTRADO EN 6
MUESTRAS DISTINTAS.
MISMO PROVEEDOR, TIEMPOS DISTINTOS
Este clon se encontró en las instalaciones de un mismo expendedor de
alimentos pero en tiempos distintos. Las muestras y las fechas donde
se encontró este clon fueron las siguientes:
Empresa X
Materia prima A
1º semana Agosto
Empresa X
Materia prima B
1º semana Agosto
Empresa Y
Producto J
con materia prima A
3º semana Agosto
Empresa Y
Producto K
con materia prima A
3º semana Agosto
Empresa Y Producto
K con materia prima A
4º semana Agosto
Empresa Y
Superficie de contacto
con prima A
4º semana Agosto
Equipo procesos A
1º semana Agosto
Equipo procesos A
2º semana Agosto
que uno de ellos sea proveedor del otro y esté propagando la contami-
Equipo procesos A
3º semana Agosto
nación de L. monocytogenes.
Equipo procesos A
4º semana Agosto
Equipo procesos A
1º semana Septiembre
Equipo procesos A
2º semana Septiembre
En este caso existe una contaminación persistente en el equipo de
procesos. Está descrito en diversas publicaciones que L. monocytogenes puede persistir por varios años en caso de no tomar las acciones
correctivas apropiadas (4).
En este caso, es posible que ambos compartan un proveedor común o
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Conclusiones:
La trazabilidad microbiana de L. monocytogenes realizada mediante los
estudios de clonalidad, permite identificar potenciales fuentes de
contaminación, además de evaluar los procedimientos de prevención y
corrección. En este sentido, la alta incidencia de L. monocytogenes en
muestras de superficie remarca la necesidad de establecer procedimientos y controles en las líneas de producción y procesos. Adicionalmente, estos resultados reafirman la importancia de complementar
estos controles con verificaciones microbiológicas periódicas, que
permitan medir la efectividad de las acciones correctivas inmediatas
tomadas y también establecer acciones correctivas resolutivas en caso
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Los casos estudio ponen en evidencia algunas de las aplicaciones que
tiene el análisis de clonalidad, como por ejemplo:
a.- Al identificar en los alimentos y las superficies un mismo clon, se
puede inferir que quizás la contaminación en el alimento es a través de
la transferencia desde la superficie;
b.- En el caso de contaminaciones recurrentes con el mismo clon, esto
da indicios que las acciones correctivas no han sido efectivas;
c.- Al realizar análisis de clonalidad en muestras de proveedores y
además en muestras internas de superficies o productos terminados,
se puede determinar si la causa de alguna contaminación es producto
de un clon proveniente de un proveedor.
de contaminaciones.
Materiales y métodos:
Los serotipos encontrados en mayor proporción fueron los serotipos
Desde clientes interesados en participar en el TAAG Knowledge Center,
IIA, IIB y IVB, que entre ellos tuvieron una prevalencia de un 94%. Este
se tomaron muestras de superficies, materia prima y producto termina-
resultado es concordante con otros estudios similares realizados en
do; en total 300 muestras. A todas la muestras se les realizó PCR
otros países (5). En el caso particular de los productos terminados
tiempo real para determinar la presencia de L. monocytogenes. Desde
listos para el consumo, el clon IVB fue predominante con cerca del 50%
las muestras con resultados positivos (36) se aisló L. monocytogenes
de los aislados, lo cual es significativo ya que es el serotipo más
utilizando agar aloa cromogénico, confirmando que la colonia seleccio-
frecuentemente asociado con listeriosis humana (5).
nada es L. monocytogenes mediante un segundo PCR tiempo real.
Con respecto al estudio de clonalidad, como era de esperar, la mayoría
de los clones fueron distintos entre sí. En el caso de los clones que se
encontraron en muestras distintas, en el 100% de los casos fueron
muestras relacionadas, lo cual permite determinar el origen o la causa
de la contaminación, además de poder determinar la eficacia de acciones correctivas.
Cada colonia aislada fue genotipificada mediante la secuenciación de
ADN bi-direccional de 7 genes hipervariables. Cada clon fue asignado
de acuerdo al código generado por cada uno de los alelos de los 7
genes. Para determinar el serotipo de L. monocytogenes, se utilizó un
PCR multiplex que amplifica 6 genes de virulencia en Listeria.
REFERENCIAS:
1. http://epi.minsal.cl/epi/html/bolets/reportes/Listeriosis/Listeria_SE442013.pdf
2. Sauders BD, et al. Prevalence and molecular diversity of Listeria monocytogenes in retail establishments. 2009. J Food Prot 72:2337-49.
3. Liu y cols, 2004. Liu, D. (2004). Listeria monocytogenes: comparative interpretation of mouse virulence assay. FEMS Microbiol Lett 233,
159–164.
4. Aarnisalo K, et al. Typing of Listeria monocytogenes isolates originating from the food processing industry with automated ribotyping and
pulsed field gel electrophoresis. 2003. J. Food Prot. 66:249-255.
5. Zhang, Y., Yeh, E., Hall, G., Cripe, J., Bhagwat, A. Characterization of Listeria monocytogenes isolated from retail foods. 2007.
International Journal of Food Microbiology. 113:47-53.