Download Presencia de Escherichia coli 0157:H7, Listeria

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
FACULTAD DE MICROBIOLOG~A
"Presencia de Escherichia coli 0157:H7, Listeria monocytogenes
y Salmonella spp. en alimentos de origen animal de Costa Rica"
Proyecto de graduación presentado a la Facultad de Microbiología como
requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura en Microbiología y
Química Clínica
Alejandra Reuben Matamoros
Hellen Treminio Galbán
CIUDAD UNIVERSITARIA RODRIGO FACIO
Junio, 2002.
Informe Final de Rdctica Dirigida d e Graduación presentado a la
Facultad de Microbiología d e la Universidad de Costa Rica,como requisito
parcial para optar por el
tu lo de Licenciadas en Microbiología y
Química Clínica y grado p r o f d o n a l de Docto-
en Microbiología
y Química Clínica.
El Tn'buna2 Examinador estuvo integmdo por los siguientes miembros:
&a. Carolina Chaves Ulate
G
, @Dr. D a
'
Lona M&
INDICE GENERAL
Dedicatoria .............................................................................................. i
..
Agradecimientos ......................................................................................
11
Índice de Cuadros y Figuras ...............................................................................................
111
...
Resumen ............................................................................................................................. iv
1 . Objetivos ....................................................................................................................... 1
1.1. Objetivo General ............................................................................................... 1
,.
1.2. Objetivos Especificas .......................................................................................
1
2. Antecedentes y Situación Actual .................................................................................. 2
2.1 Escherichia coli 0157:H7 ............................................................................... 2
2.2 Listeria monocytogenes .................................................................................. 4
2.3 Salmonella spp................................................................................................. 8
3 . Justificación ................................................................................................................ 10
4 . Marco Teórico ............................................................................................................ 13
4.1 Escherichia coli 0157:H7 ..............................................................................13
4.2 Listeria monocytogenes ................................................................................. 21
4.3 Salmonella spp............................................................................................... 30
5 . Metodología ............................................................................................................... 37
5.1 Toma de muestra ......................................................................................... 37
5.2 Transporte ...................................................................................................... 40
5.3 Análisis Microbiológico ................................................................................ 40
6. Resultados ...................................................................................................................
43
7 . Discusión .....................................................................................................................
46
7.1 Escherichia coli 0157:H7 .............................................................................. 46
7.2 Listeria monocytogenes ..................................................................................
52
7.3 Salmonella spp................................................................................................
60
8 . Conclusiones y Recomendaciones ..............................................................................
66
9. Referencias Bibliográficas ..........................................................................................
69
DEDICATORIA
A mi papá, mi mamá, Vío, Dan,
y a Sergio.
Por su inagotable paciencia.
Alejandra.
A Dios: mi fuente de vida y alegría, mi fuerza cada mañana.
A papi, mami, Javier y Glen, por su amor de años.
Hellen.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Mm'a Laura Arias E., por ser más que una directora, una amiga.
Al personal del Laboratorio de Alimentos y Aguas, por toda su colaboración; especialmente
a la Sra. Laura Villalobos.
A los doctores Fernando García, Norman Rojas, Jorge Alvarado, Ileana Holst y Mario
Barrantes, por su apoyo y orientación.
Al personal del Laboratorio de Bacteriología, especialmente a la Sra. Dagmar Utzinger.
Al personal de Servicios de Laboratorio, especialmente al Sr. Wilson Astorga.
A nuestros lectores: Lic. Rafael Monge, Dra. Carolina Chaves, Dra. Eugenia Corrales y Dr.
David Loría.
Al Lic. Marco Aguilar, por su cooperación con el proyecto.
A Gaby Solano, por su amistad y apoyo durante todos estos años.
A la familia Rojas Ramírez, por toda la ayuda brindada.
A nuestros amigos, por estar siempre ahí.
INDICE DE CUADROS Y FIGURAS
CUADROS
Cuadro 1. Distribución de muestras de leche cruda analizadas ...................................... 37
según provincia y procedencia.
Cuadro 2. Distribución de muestras de menudos de pollo analizadas ............................ 39
según provincia y procedencia.
Cuadro 3. Distribución de muestras de leche cruda positivas ........................................ 43
por Listeria monocytogenes según lugar de adquisición.
Cuadro 4. Distribución de muestras de menudos de pollo positivas .............................. 44
por Salmonella spp. según lugar de adquisición.
Cuadro 5. Distribución de muestras de leche cruda positivas ........................................ 45
por Escherichia coli 0157:H7 según provincia y procedencia.
Cuadro 6. Distribución de muestras de menudos de pollo positivas .............................. 45
por Escherichia coli 0157:H7 según provincia y procedencia.
FIGURAS
Figura 1. Distribución de muestras de leche cruda ........................................................ 38
adquiridas según provincia.
Figura 2. Distribución de muestras de menudos de pollo .............................................. 39
adquiridas según provincia.
Figura 3. Distribución de muestras de leche cruda ........................................................ 43
positivas por Listeria monocytogenes según provincia.
Figura 4. Distribución de muestras de menudos de pollo ........................................ 44
positivas por Salmonella spp. según provincia.
RESUMEN
Reuben Matamoros, Alejandra y Treminio Galbán, Hellen
Presencia de Escherichia coli 0157:H7, Listeria monocytogenes y Salmonella spp. en
alimentos de origen animal de Costa Rica.
Proyecto de Graduación Microbiología y Química Clínica.-San José, C.R.:
A. Reuben M. y H. Trerninio G., 2002.
74 h.: 4 i1.-73 refs.
Se pretende determinar la presencia de Escherichia coli 0157:H7, Listeria
monocytogenes y Salmonella spp. en dos tipos de alimentos de origen animal. Se evaluó
Listeria monocytogelzes en leche no pasteurizada y Salmonella spp. en menudos de pollo,
en tanto que E. coli 0157:H7 se examinó en ambos alimentos.
Se colectaron cien muestras de leche no pasteurizada provenientes de las principales
zonas productoras del país, de las cuales noventa fueron proporcionadas por una industria
lechera y las restantes fueron adquiridas en diferentes lecherías. Así como cien muestras de
menudos de pollo, obtenidas al azar en los principales mercados del área metropolitana,
incluyendo carnicerías detallistas, supermercados y ferias del agricultor. Para el análisis de
las muestras se siguió el método descrito por la Food and Drug Administration (FDA) en
1995.
Se aislaron cinco cepas de E. coli 0157:H7, de las cuales tres provenían de
menudos de pollo y dos de leche cruda. Además se encontró un 15% de positividad por
Salmonella spp. en las muestras de pollo y un 3% de positividad por L. monocytogenes en
las muestras de leche. El aislamiento de E. coli 0157:H7 constituye el primer reporte de
esta bacteria a partir de muestras de alimentos en Costa Rica y en la región Mesoamericana,
lo que representa un avance en el estudio del comportamiento epidemiológico de esta
especie. Los aislamientos de Salmonella spp. y L. monocytogenes reiteran la importancia de
un procesamiento adecuado de estos productos para disminuir la probabilidad de
transmisión y así prevenir el desarrollo de las patologías ocasionadas por estos agentes. En
este contexto, la implementación de Hazard Analysis and Critica1 Control Points (HACCP)
y de Buenas Prácticas de Manufactura en la industria alimentaria siguen siendo las
principales medidas de control y garantía de inocuidad.
Palabras clave: E. coli 0157:H7, L. monocytogenes, Salmonella spp., leche no
pasteurizada, vísceras de pollo.
Directora: Dra. María Laura Arias Echandi
Facultad de Microbiología
Universidad de Costa Rica
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar la presencia de Escherichia coli 0157:H7, Listeria monocytogenes y
Salmonella spp. en muestras nacionales de leche no pasteurizada (leche cruda) y vísceras de
pollo (menudos).
1 . Evaluar la presencia de Escherichia coli 0157:H7 y de Listeria monocytogenes en
muestras nacionales de leche cruda.
2. Evaluar la presencia de Escherichia coli 0157:H7 y de Salmonella spp. en muestras
de vísceras de pollo adquiridas en el Área Metropolitana.
2.1 Escherichia coli 0157:H7
Durante los últimos 20 años la bacteria Escherichia coli 0157:H7 ha emergido
como un agente de alta importancia en el campo de la salud (Paton et al, 1998). De acuerdo
con estudios realizados en Canadá y Estados Unidos, ocupa el segundo lugar entre los
enteropatógenos bacterianos asociados a diarrea no específica y es el agente más frecuente
en casos de diarrea sanguinolenta (Karmali, 1996).
En 1982 fue reconocida por primera vez como patógeno de origen alimentario,
cuando fue aislada a partir de carne molida de res, de uno de los lotes implicados en dos
brotes de colitis hemorrágica (Doyle, 1991). Actualmente se le asocia a tres patologías
diferentes: colitis hemorrágica (diarrea sanguinolenta), síndrome urémico hemolítico (fallo
renal) y púrpura trombocitopénica trombótica (Mead et al, 1998).
La infección debida a este serotipo se ha informado en muchos países, siendo
causante de casos esporádicos e incluso de brotes. Entre ellos se encuentran: Argentina,
Canadá, Chile, China, Eslovenia, Francia, Alemania, India, Irlanda, Italia, Japón, Sudáfrica,
Swazilandia (África Austral), Suiza, Tailandia, Reino Unido y los Estados Unidos de
América. Estudios realizados en diferentes regiones de Canadá en 1989, revelaron una tasa
de infección (confirmada por cultivos) que va de 4 a 29 casos por cada 100 000 personas,
mientras que en Estados Unidos la incidencia fue de 8 casos por cada 100 000 (Karmali,
1996). Los países en vías de desarrollo, especialmente aquellos de clima tropical, poseen
condiciones climáticas que favorecen la proliferación del microorganismo, lo cual se ve
reflejado en la alta prevalencia de cuadros diarreicos. En estos países es de esperar una
incidencia mayor del patógeno, en comparación con países de clima templado (Arias et al,
2001).
La implicación de esta bacteria en brotes de origen alimentario le ha conferido
importancia en los estudios epidemiológicos realizados a nivel mundial. Tres de los brotes
más recientes ocunieron en África, Europa y Asia. El primero de ellos se dio en Egipto, en
1994. La causa determinada fue la ingesta de hamburguesas contaminadas con este
serotipo, ello condujo al estudio de la incidencia de esta bacteria en algunos productos de
consumo diario. El resultado fue un aislamiento positivo en el 6% de las muestras de leche
no pasteurizada y un 4% en pollo deshuesado. En Escocia, en 1996, ocasionó un brote
asociado a carne de res mal cocinada; logró afectar a 396 personas y causó la muerte a 11
de ellas. Durante el mismo año en Japón, fue al agente causal de infección en 9758 casos y
de la muerte de 11 de estas personas. En este brote no se lograron identificar los alimentos
involucrados (WHO, 1997). Sin embargo, la mayoría de los brotes reportados provienen de
Norte América y Europa. El mayor brote en Norte América afectó a más de 500 personas
en cuatro estados del oeste de Estados Unidos, se asoció con el consumo de hamburguesas
no completamente cocinadas procedentes de una cadena de restaurantes de comida rápida
(Karmali, 1996).
Por otra parte, la incidencia reportada de casos esporádicos se encuentra en relación
directa con el tipo de patología causada. De esta forma, la frecuencia de casos de Síndrome
Urémico Hemolítico en Norte América es de aproximadamente 2 a 3 casos por 100 000
niños menores de 5 años, en contraste con una incidencia aproximada 10 veces más alta en
el mismo grupo etario en Argentina (Karmali, 1996).
En nuestro país, durante 1998, fue el agente causal de siete casos presentados en
niños, resultando letal en dos de ellos. No obstante, no se logró establecer un vínculo
epidemiológico o asociación con la ingesta de algún tipo de alimento (Arias et al, 1998).
2.2 Liste& monocytogenes
En 1929 se detectó el primer caso de listeriosis en humanos, sin embargo hasta 1985
se empezó a considerar una enfermedad de reporte obligatorio en Estados Unidos. La
presencia de listeriosis en ambientes urbanos permitió entender que el contacto con los
animales no era la única vía de transmisión para esta enfermedad (USDA, 1992).
En los últimos años se han reportado cuatro brotes importantes de listeriosis en
Estados Unidos, todos ellos asociados al consumo de alimentos contaminados (USDA,
1992).
l . En 1981, en Nueva Escocia, se detectaron 41 casos de listeriosis incluyendo 18
fallecimientos. El 83 % de los casos fueron perinatales. Se logró determinar que el
brote fue debido a la presencia de L. monocytogenes en ensalada de repollo
realizada con repollos cultivados en terrenos fertilizados con escrementos de ovejas
infectadas con la bacteria.
2. En 1983, en Boston, aparecieron 49 casos, de los cuales 14 fallecierón. El 14 % de
los casos fueron perinatales mientras que los restantes fueron adultos
inmunocomprometidos. Se quiso vincular el brote con el consumo de leche
pasteurizada proveniente de vacas infectadas con la bacteria, sin embargo no se
logró detectar la bacteria en la leche sospechosa.
3. En 1985, en Los Angeles, se presentaron 142 casos de listeriosis falleciendo 46 de
ellos. El 85% de los casos fueron perinatales. El brote se debió a la presencia de L.
monocytogenes en queso suave estilo mexicano, fabricado con leche contaminada,
incorrectamente pasteurizada. mido confirmarse que el origen del brote se debió a
escapes en los intercarnbiadores de calor del equipo de pasteurización utilizado,
permitiendo que la leche cruda contaminara la leche pasteurizada (Prescott et al,
1999).
4. En 1987, en Filadelfia, se detectaron al menos 32 casos incluyendo 11 muertes. No
se logró identificar la causa.
Además se han presentado muchos otros brotes alrededor del mundo, asociados a
diferentes alimentos, como el de 1998-99 en un hospital de Finlandia, vinculado con
mantequilla contaminada (Maijala et al, 2001), o el acontecido en Canadá en el año 2000,
asociado a imitación de carne de cangrejo (Farber et al, 2000), así como otros debidos a
carne de pescado contaminada.
El CDC (Centers for Disease Control and Prevention) determinó, a partir de
estudios realizados entre 1986 y 1990, que muchos de los casos esporádicos (no brotes) de
listeriosis se relacionan con queso suave, carne de ave mal cocida, "perros calientes" mal
recalentados y alimentos adquiridos en negocios de "delicatessen" (USDA, 1992; Fischetti
et al, 2000).
En países europeos, la especie se ha encontrado en diversos productos lácteos como
el queso rojo para untar. En un estudio realizado por Rudo1 et al (2001) en ese producto, se
encontró el 6,4% de las muestras contaminadas con L. monocytogenes; el 10,6% con L.
innocua, y un 1,2% con L. seeligeri. Un pequeño porcentaje contenía dos o más especies de
Listeria spp., incluyendo al menos un aislamiento de L. monocytogenes. Además se
determinaron las incidencias de L. monocytogenes en quesos de diferentes países,
obteniendo los siguientes porcentajes: 17,4% en Italia; 9,2% en Alemania; 10% en Austria
y 3,3% en Francia. La mayor frecuencia de aislamientos se obtuvo en quesos suaves y
semi-suaves. Pocas muestras presentaron más de 100 U F C I C ~
de~superficie del queso, y
una minoría presentó conteos superiores a lo4 UFC/cm2. Es importante destacar que se
observó una mayor incidencia en quesos elaborados a partir de leche pasteurizada (8%) que
en quesos elaborados con leche cruda (4,8%). Además afirman que la contaminación con el
patógeno dentro de las plantas de industria alimenticia persiste por períodos de semanas a
meses y que la contaminación cruzada dentro de las mismas es un factor muy importante,
recomendando un cuidadoso monitoreo en la producción de lácteos.
En Suiza, en el período comprendido entre los años 1990 y 1999, se encontró un
4,9% de productos lácteos positivos por la presencia de L. monocytogenes. La proporción
más alta de muestras positivas se encontró en los establecimientos donde se madura el
queso (7,6%), seguida de lecherías locales a pequeña escala (4,4%). En cuanto al tipo de
muestra, el mayor porcentaje se obtuvo en muestras del agua utilizada para lavar el queso
(93%) seguido por un 5,0% en hisopados de la superficie del queso. Extrañamente no se
encontró ninguna muestra positiva en productos como helados, crema, leche en polvo,
yogurt, o queso fresco, durante esos diez años; sin embargo el estudio se basó en análisis de
bases de datos, por lo que es posible que lo anterior se deba a un sub-registro de los casos
de contaminación (Pak et al, 2002).
En Francia y otros países industrializados se realizó un estudio para estimar la
proporción de enfermedades debidas a la leche y productos lácteos desde 1980 (De Buyser,
2001). La revisión de los reportes anuales de enfermedades alimenticias indicó que la leche
y los lácteos estaban implicados en un 1% a un 5% de los brotes alimenticios debidos a
bacterias. L. monocytogenes fue responsable de 10 brotes y cuatro casos esporádicos. De
los brotes y casos esporádicos descritos en la literatura asociados a leche y lácteos, los
vehículos más comunes fueron la leche (39,1%), el queso (53,1%) y otros productos lácteos
(7,8%). Además, el 32,8% de los lácteos estaban hechos a base de leche pasteurizada, el
373% de leche cruda y el 18,8% de leche de tipo no especificado.
En Chile, Cordano et al (2001) analizaron diferentes alimentos encontrando un
3,5% de muestras de helado contaminadas, 0,8% de queso suave y ninguna muestra de
queso duro; además en otros tipos de alimentos como productos cárnicos procesados
encontraron un 3,6% de muestras contaminadas y un 11,6% en crustáceos.
En Costa Rica se describió un brote bastante particular de listeriosis neonatal por
contaminación cruzada a partir de aceite mineral que se usaba para limpiar los neonatos
después del nacimiento (Schuchat et al, 1991 ;Jiménez et al, 1995).
También en nuestro país, un estudio realizado en 1991 logró aislar L.
monocytogenes de un 10% de muestras de queso blanco y de un 40% de muestras de helado
(Ellner et al, 1991). En otra investigación en 1992, la bacteria se encontró en un 2% de
muestras de helado pasteurizado y en un 45% de queso suave pasteurizado (Monge et al,
1994).
El estudio más reciente en helado reveló un 24,6 % de muestras positivas por
Listeria sp. de las cuales el 50% correspondía a L. monocytogenes (12,3 %) y el otro 50% a
L. innocua. La primera se aisló exclusivamente de helados caseros. Los resultados
demostraron un aumento en la calidad de los helados pero también la necesidad de
continuar los esfuerzos para garantizar productos seguros para la población (Windrantz y
Arias, 2000). Entre 1993 y 1994 se realizó otro estudio, en leche cruda, encontrándose un
6,4% de positividad por Listeria spp., aunque no se aisló L. monocytogenes (Arias et al,
1994).
2.3 Salmonella spp.
Dentro de las bacterias patógenas más importantes que se han aislado en la carne de
pollo, se encuentra Salmonella spp., causante de patología tanto en animales como en el ser
humano. El primer brote en humanos fue descrito y confirmado en Alemania en el año de
1888, cuando 57 personas presentaron gastroenteritis aguda debido a la ingesta de carne de
vaca contaminada con esta bacteria. No obstante, no fue hasta 1955 que Erwin estableció la
asociación de salmonelosis con la carne de pollo, logrando recuperarla viable a partir de
muestras comerciales (Cox y Bailey, 1987). Desde entonces se han realizado una serie de
estudios determinando la presencia de Salmonella spp. en diferentes productos derivados de
la industria avícola y en los sitios de procesamiento, los cuales representan una importante
fuente de contaminación.
En 1979, sólo en Estados Unidos se aisló Salmonella spp. de 31 000 personas, dato
que superó los aislamientos realizados en los 18 años anterio-s. De igual forma en Canadá,
de 1977 a 1979, los aislamientos aumentaron de 5000 a 8000 personas, lo que representó un
incremento de 60 % en sólo 3 años (Bryan, 1981).
En 1982, Johnston presentó los datos de dos estudios realizados en plantas
procesadoras de pollo en Estados Unidos, uno en 1967 y otro en 1979, en los cuales se
empleó la misma metodología. El número de muestras fue de 600 para cada estudio y las
incidencias fueron de 28,6% en el primer caso y 36,9% para el segundo (Cox y Bailey,
1987). En 1990, De Boehr y Hahne realizaron una investigación similar, logrando aislar
dicha bacteria en un 54 % de un total de 81 pollos crudos.
Otro motivo de investigación ha sido el aumento en la incidencia de serotipos
específicos. Durante la década de 1982 a 1992, en Italia, se observó que del total de cepas
aisladas, S. enteiitidis representó en un 0,5 % al inicio del estudio aumentado hasta un
22,8% al finalizar el mismo, siendo un 60,2% de los aislamientos a partir de huevos y un
15,3% correspondiente a carne de pollo (Fantasia y Fileciti, 1994). Los huevos representan
un importante vehículo de transmisión; a pesar de ser un producto fresco y de presentar un
medio interno estéril, se contaminan por el contacto con materia fecal, nidos contaminados,
bandas transportadoras y material de empaque (Romero, 2000).
En Dinamarca, durante 1995, de un 40 % a un 50 % de los casos de salmonelosis
registrados se asociaron con huevos, mientras que la carne de pollo estuvo implicada en un
15-20 % de los casos (Forsythe y Hayes, 1998). En Francia, por su parte, Salmonella spp.
fue responsable del 83 al 87% de los brotes alimentarios presentados entre 1990 y 1992
(WHO, 1997).
Es importante tomar en cuenta como factor sumatorio, el incremento que ha tenido
en los últimos años el consumo de este tipo de carne. Sólo en 1990, en Estados Unidos, el
consumo per capita de este producto excedió el de la carne de res. Ello se refleja en el
aumento de pollos sometidos a inspección federal, de 1,7 billones en 1961 a 6,6 billones en
1993 (Brewer et al, 1995).
En Costa Rica, la industria comercial de pollos de engorde ha tenido también un
gran desarrollo durante los últimos años, destacando empresas como SUAVE
Corporación pipasaR, As de orosR, ~ r o ~ o k o d u ys aGranja
~
Avícola Santa
MR
,
arta^. En un
estudio realizado por el Sistema de Información sobre Mercadeo (SIME) alimentario
publicado en 1998, acerca de la incidencia del consumo de carnes, se encontró una
tendencia mayor al consumo de carne pollo durante los años de 1993 a 1996 (Romero,
2000).
De acuerdo con las últimas estadísticas presentadas por la Organización Mundial de
la Salud (OMS), las enfermedades de transmisión alimentaria son de 300 a 350 veces más
frecuentes a lo indicado en sus reportes anteriores. Entre los principales patógenos
involucrados en estas enfermedades se encuentran Escherichia coli 0157:H7, Listeria
monocytogenes y Salmonella spp., que junto con Campylobacter jejuni, Clostridium
perji-ingens, Staphylococcus aureus y Toxoplasma gondii, son causantes de 3,3 a 12,3
millones de casos en Estados Unidos y de alrededor de 3900 muertes. A esto se suman los
altos costos para el sector salud, que ascienden a treinta mil millones de dólares al año
(WHO, 1997).
La infección causada por E. coli 0 1 5 7 : ~ 7puede ser letal y está frecuentemente
asociada a los más importantes y mejor documentados casos de enfermedades de
transmisión alimentaria alrededor de todo el mundo (Murray, 2000). Sin embargo, debido a
que los métodos de detección no son ampliamente usados, este serotipo ha sido poco
estudiado y existe un sub-registro importante en cuanto a su asociación con la patología en
humanos (Karmali, 1996); además debido al reciente descubrimiento de este organismo
como agente patógeno, no se cuenta con reportes de su aislamiento en países tropicales
(Arias et al, 2001).
dn nuestro país no se ha determinado su presencia en alimentos de riesgo, debido a
su baja incidencia y a su difícil aislamiento. Considerando la importancia actual de esta
bacteria en salud pública y el limitado número de investigaciones realizadas en tomo a ella,
en este trabajo se pretende evaluar su presencia en alimentos descritos como posibles
vehículos de transmisión.
Por su parte, Listeria monocytogenes es de gran importancia entre los patógenos
asociados a alimentos, particularmente porque se encuentra ampliamente distribuida en la
naturaleza y ha sido aislada de muchas especies de animales y diferentes alimentos. Se han
descrito brotes asociados a ensalada de repollo, quesos no pasteurizados, leche
pasteurizada, y diversos productos cárnicos (Fischetti et al, 2000).
En Costa Rica, los estudios realizados en productos lácteos revelan la importancia
de realizar futuras investigaciones para intentar su aislamiento a partir de leche cruda y
durante la producción de queso (Ellner et al, 1991; Arias et al, 1994; Monge et al, 1994;
Windrantz y Arias, 2000).
Uno de los productos animales más asociados a brotes alimentarios es la carne de
pollo, la cual presenta características que contribuyen al desarrollo de bacterias patógenas,
como Salmonella spp., causante de cuadros de enteritis, septicemia y aborto en animales y
de gastroenteritis y fiebre tifoidea en el ser humano (Mora, 1996).
Los serotipos S. pollumm y S. gallinamm son flora normal de estas aves,
encontrándose en tracto digestivo, superficie de piel y plumas. A pesar de que éstas no
provocan patología en las aves ni en el humano, se ha asociado su eliminación con un
incremento en la posibilidad de contaminación con S. enteritidis, que es agente causal de
gastroenteritis (Baumler y Hargis, 2000). Además otros serotipos como S. typhi y S.
paratyphi, agentes de fiebre entérica, se han relacionado con la ingesta de comida y10 agua
contaminada (Groisman, 2001). En general, su aislamiento se logra utilizando diferentes
medios de enriquecimiento, selectivos y pruebas confirmatorias bioquímicas y serológicas.
La ausencia de esta bacteria forma parte de muchas de las normas alimentarias de
productos de venta comercial, destacando entre ellos la carne de pollo. En Costa Rica,
según un estudio realizado en el año 2000, la incidencia de Salmonella spp. en las plantas
de procesamiento de carne de pollo no es significativa, sin embargo la calidad sanitaria del
producto puede verse alterada después de su procesamiento. El consumo de vísceras de
pollo (hígado y mollejas, entre otros) forma parte de la cultura de muchos países
latinoamericanos, incluyendo el nuestro, debido a su bajo costo y alto contenido proteínico
(Romero, 2000). Por tanto es necesario evaluar la presencia de esta bacteria en este tipo de
producto listo para la venta al consumidor.
4.1 Escherichiu coli 0157:H7
Escherichia coli es uno de los microorganismos más estudiados, ha sido utilizada
como modelo en el estudio de diversos aspectos del metabolismo bacteriano, proceso de
división celular, biosíntesis de pared celular, quimiotaxis, genética bacteriana y en la
detenninación de la importancia fisiológica de bacterias entéricas como parte de la flora
normal (Neidhradt, 1996).
La especie pertenece a la familia Enterobacteriaceae, la cual incluye bacilos Gram
negativos, anaerobios facultativos, oxidasa negativos y reductores de nitratos. La mayoría
de las cepas son móviles, gracias a la presencia de flagelos peritricos. El género incluye
cinco especies, de las cuales la especie tipo es E. coli. Ésta es, a su vez, el bacilo Gram
negativo más comúnmente aislado como patógeno en el ser humano. Las otras especies aún
no han sido encontradas produciendo patología, aunque se han aislado de heridas, heces e
intestino del ser humano y otros animales (Torres, 1992).
E. coli es habitante del suelo, plantas, e incluso se encuentra como flora indígena
del intestino de animales, incluyendo al ser humano. El 99% de los aislamientos de
intestino en humanos y animales de sangre caliente lo constituye dicha especie (Torres,
1992).
La especie se asocia con infecciones intestinales, así como con infecciones del
tracto urinario, meningitis purulenta en neonatos, neumonía, septicemia y como
contaminante de heridas expuestas. Las cepas causantes de infecciones han ido
desarrollando diversas características de patogenicidad, debido en parte a la adquisición de
genes transportados en plásrnidos o en el cromosoma bacteriano. Las diarreas que son
producidas por E. coli tienen una distribución mundial, e incluyen desde cuadros leves
hasta disenterías. Afectan a todos los grupos etarios, pero principalmente niños en edad
preescolar (Torres, 1992).
Entre los factores de virulencia presentes en la bacteria pueden citarse el factor de
colonización 1 (CFAII); el complejo de colonización 11 (CFAIII) compuesto por los
antígenos CS1, CS2 y CS3; y el PCF8775 formado por los antígenos CS4, CS5 y CS6. Con
excepción de los antígenos CS3 y CS6, todos los anteriores son fimbrias, codificadas por
plásmidos. Además, las cepas responsables de cuadros diarreicos producen al menos dos
toxinas, una termolábil (LT) muy similar a la toxina de Vibrio cholerae, y otra termoestable
(ST) (Torres, 1992).
Las variantes patógenas son determinadas serológicarnente, de acuerdo a diferencias
específicas en los antígenos de superficie. Cada una presenta distintos factores de
virulencia, que determinan a su vez el cuadro clínico en el que se ven involucradas
(Groisman, 2001). Los tres grupos antigénicos más utilizados en la clasificación serológica
son el O (somático), el K (capsular) y el H (flagelar). El antígeno O está constituido por
lipopolisacáridos complejos de la membrana externa, estables a temperaturas entre 100" C
y 121" C. El antígeno H es de naturaleza proteica y sufre inactivación a 100" C. El antígeno
K se compone de polisacáridos ácidos (Torres, 1992).
Las cepas de Escherichia coli que causan diarrea en el ser humano varían en
severidad y han sido clasificadas en 6 categorías: Escherichia coli enterotoxigénica
(ETEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), Escherichia coli enteropatogénica
(EPEC), Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), Escherichia coli de adherencia difusa
enterohemorrágica (DAEC) y Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) (Groisman,
2001).
El término de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) se ha aplicado a
serotipos productores de verotoxinas que tienen las mismas características clínicas,
epidemiológicas y patogénicas asociadas con Escherichia coli 0157:H7. Entre estos
serotipos asociados con brotes de enfermedad en humanos destacan el 026:H11,0103:H2,
0104:H21, 0 l l l : n o móvil y 0145:no móvil. Sin embargo, de acuerdo con estudios
realizados, las cepas 0157:H7 constituyen un grupo clonal genéticamente diferente y que
sólo está lejanamente relacionado con los otros serotipos (Karmali, 1996).
En los últimos años ha aumentado el interés por el análisis de los alimentos como
posibles vehículos de transmisión de agentes patógenos. En este contexto la bacteria
Escherichia coli 0157:H7 es de especial importancia ya que este serotipo es el más
asociado a brotes alimentarios. Al parecer, el antígeno 0157 fue adquirido a través de
transferencia horizontal y recombinación. Además ha sido categorizada en el tercer nivel de
bioseguridad, junto a agentes como: ántrax, rabia, HIV, tuberculosis y fiebre tifoidea
(FSNET, 1998; Mead et al, 1998).
Su reservorio principal es el tracto gastrointestinal de ganado y otros animales, por
tanto alimentos de origen animal contaminados con materia fecal durante su procesamiento
son vehículos potenciales. El ganado joven productor de leche ha sido identificado como
reservorio de ella, mientras que experimentos han demostrado que la carne de pollo es una
posible fuente de este microorganismo. En general, los productos cárnicos probablemente
se contaminen durante la matanza, mientras que la molienda suele contribuir a introducir el
patógeno en el alimento. Además del ganado vacuno, se ha logrado aislar de venados,
ovejas, cabras, caballos, perros, aves y moscas (Doyle, 1991; Arias et al, 2001). Otras vías
alimentarias relacionadas como fuentes de brotes incluyen: jugo de manzanas, yogurt,
mayonesa comercial, vegetales fertilizados con estiércol, emparedados no refrigerados,
entre otros (Morgan et al , 1993; Karmali, 1996).
La infección puede también ser adquirida por el agua o mediante la transmisión de
persona a persona. Esta última se ha documentado en centros como asilos y albergues para
enfermos crónicos. En estos establecimientos se combinan las altas densidades de la
población con un riesgo aumentado por el padecimiento de otras enfermedades. Los brotes
han ocurrido con mayor frecuencia en ambientes familiares o comunitarios, escuelas,
restaurantes, asilos geriátricos y guarderías; siendo sustancialmente más común en niños
blancos que en negros. No obstante, las razones de tales diferencias regionales y10
socioculturales de prevalencia deben ser establecidas (Karmali, 1996). El contacto con
animales infectados también es fuente de infección, así como la exposición ocupacional
entre enfermeras y microbiólogos (Mead et al, 1998).
El microorganismo se disemina vía fecal-oral, y se cree que tan solo 500 bacterias
son la dosis infectante (Prescott et al, 1999). La infección es más común en los meses
cálidos en ambos hemisferios, Norte y Sur; además, las personas que viven en zonas rurales
parecen estar en mayor riesgo de infección, posiblemente debido a una mayor exposición a
los diferentes tipos de ganado (Mead et al, 1998).
El período de incubación es aproximadamente de 3 a 5 días, similar al de
campylobacteriosis, pero significativamente más largo que el correspondiente a otras
enfermedades originadas por la ingesta de alimentos (Karmali, 1996). Los síntomas de la
infección con este serotipo suelen ser diarrea, dolor abdominal, vómito y fiebre. En la
mayoría de los casos, incluso si presentan episodios de diarrea sanguinolenta, los síntomas
resuelven.
No obstante, en el 10-20 % de los casos, especialmente en poblaciones pediátricas y
geriátricas, la infección puede llevar al desarrollo de serias complicaciones tales como el
Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), Púrpura trombocitopénica y Fallo Renal. La tasa de
mortalidad es de un 5 %, y un 25 % de los pacientes pueden desarrollar daños renales
permanentes (Groisman, 200 1).
La frecuencia de SUH ha sido alrededor del 8 % en varios de los brotes de infección
con este tipo de bacteria, aunque en un brote que afectó a residentes mayores en un asilo
geriátrico, llegó al 22% (Karmali, 1996). El establecimiento de este serotipo como agente
causal de este cuadro clínico permitió aclarar aspectos etiológicos, fisiopatológicos y
terapéuticos relacionados con éste. Desde 1965, Barnard y Kibbel sugirieron la asociación
de Escherichia coli con el SUH, pero no fue hasta 1983 que Karmali demostró el rol de la
verotoxina producida por el serotipo 0157:H7 con dicho cuadro clínico, ello en un brote
causado por la ingesta de carne mal cocida (Exeni, 1996).
Este trastorno se caracteriza por la instauración súbita de trombocitopenia y de
hemólisis con eritrocitos fragmentados e insuficiencia renal anúrica aguda. Aparece
principalmente en niños y en mujeres durante la gestación o el postparto. El desarrollo del
síndrome se explica con el hecho de que la infección con Escherichia coli 0157:H7
provoca una endotoxemia, que a su vez puede desencadenar un episodio de coagulación
intravascular diseminada (CID) que provoca el depósito de fibrina en el interior del lecho
capilar glomerular y la instauración de la insuficiencia renal aguda. No obstante, este tipo
de síndrome se ha asociado también a otros microorganismos como Rotavirus, Cocksakie,
HIV, Shigella, Salmonella e inclusive con agentes citotóxicos no infecciosos como la
ciclosporina, por lo que su patogenia sigue siendo controversia1 (Berkow, 1994;
Exeni, 1996).
Gran parte de la patogenicidad de esta bacteria se atribuye a los factores de
virulencia. Entre ellos se encuentran su capacidad de generar toxinas, hemolisinas y serina
proteasas, sumado a la regulación mediada por plásmidos y a la presencia de una intirnina,
importante en la producción de las lesiones por adhesión-remoción (Mead et al, 1998;
Groisman, 200 1).
En este contexto, Escherichia coli 0157:H7, con sus antígenos somático (0) y
flagelar (H) específicos, ha adquirido los genes enterohemorrágicos de Shigella, incluidos
los que codifican por las Verocitotoxinas de tipo Shiga (Prescott et al, 1999). Este tipo de
toxinas es llamado así por su efecto tóxico sobre cultivos de células Vero y por la
homología de su actividad con la citotoxicidad producida por la de Shigella dysenteriae
tipo 1, lo anterior en el caso de VT1 (Exeni, 1996).
Las cepas productoras de verotoxinas son capaces de elaborar una o más de por lo
menos tres diferentes exotoxinas proteicas. Estas son VT1, VT2 y VT2c (Karmali, 1996).
La VT1, es idéntica a la producida por Shigella dysenteriae tipo 1, mientras que la VT2
presenta únicamente un 56% de identidad en arninoácidos. La mayoría de las cepas
producen la toxina VT2. Ambas toxinas están compuestas por cinco subunidades B y una
subunidad A, y son codificadas por un bacteriófago insertado en el cromosoma bacteriano.
La subunidad B se une a un glicolípido de membrana en las células eucariotas y ocurre la
endocitosis. Posteriormente la subunidad A inactiva enzimáticamente la porción 60s
ribosomal, bloqueando la síntesis proteica. Las toxinas tienen efectos tanto a nivel local
como sistémico en el intestino, y son esenciales para la evolución hacia una diarrea
hemorrágica (Mead et al, 1998).
Por su parte, la hemolisina es codificada por el plásmido p0157 y es altamente
conservada en los diferentes serotipos aislados de brotes. Su papel en la patogénesis no ha
sido claramente establecido, se sugiere que puede estimular el crecimiento bacteriano,
permitiendo la extracción de hemoglobina de los eritrocitos y asegurando así la fuente de
hierro requerida para ello(Law y Kelly, 1995; Brunder et al, 1999).
Con respecto a la serina proteasa (EspP), es una proteína extracelular de 104 kDa,
capaz de degradar el factor V de la coagulación y es citotóxica para cultivos de células
Vero. Se supone que posee un efecto sinérgico durante el desarrollo de la enfermedad
hemorrágica, ello apoyado en la detección de anticuerpos contra dicha proteína en el suero
de pacientes infectados con esta bacteria (Brunder et al, 1997).
La disponibilidad de métodos efectivos para caracterizar las cepas productoras de
verotoxinas a nivel de serotipo son vitales como ayuda para la investigación de brotes y
para detectar las fuentes, reservorios y vías de transmisión de la infección. El estudio de la
presencia de esta bacteria en alimentos de consumo diario, es una de la estrategias
orientadas en dicho sentido. Sin embargo, la frecuencia de recuperación a partir de
alimentos es muy baja: 2-4% en carne de res, 1,5% en carne de cerdo y 1,5% en carne de
pollo; también se ha aislado a partir de leche no pasteurizada. Los niveles detectados en
muestras asociadas a brotes han sido bajos, encontrándose entre 10 y 6200 UFCIg (Doyle,
1991). Las normas comerciales actualmente son bastante estrictas, incluyendo un criteno de
"cero tolerancia" para la importación de alimentos en Estados Unidos (Arias et al, 2001).
Los métodos para su aislamiento e identificación se encuentran aún en desarrollo,
sin que se haya aprobado una normativa oficial. Las tres técnicas más utilizadas son: (a)
Aislamiento en medio selectivo Agar MacConkey-Sorbitol, (b) Inmunoblot para
Verotoxina y (c) ELISA con Anticuerpos monoclonales contra epitopos específicos de la
bacteria (Vanderzant et al, 1992). Sin embargo, también se han empleado técnicas de
identificación rápida con sondas de ADN, sondas específicas de serotipo y técnicas de PCR
(Prescott et al, 1999). Un procedimiento alternativo para su identificación, desarrollado por
el USDA (United States Department of Agriculture) y el FSIS (Food Safety and Inspection
Service), emplea un aislamiento consecutivo en diferentes medios selectivos y una fase
confirmatoria que incluye un ensayo de aglutinación en látex, pruebas bioquímicas, y
pruebas serológicas con sueros policlonales (anti-0157) y monoclonales (anti-H7) (Doyle,
1991).
Las pruebas diagnósticas deben realizarse a cualquier persona que presente diarrea
hemorrágica aguda o síndrome urémico hemolítico luego de episodios de diarrea. También
es posible que se presenten casos de diarrea sin hemorragia, especialmente durante un
brote. La muestra debe recogerse lo antes posible y cultivarse en medios específicos como
el agar MacConkey-Sorbitol, donde las colonias aparecen incoloras debido a que el
patógeno no fermenta el carbohidrato. En las zonas donde se han identificado cepas
fermentadoras del sorbitol, es posible emplear pruebas que identifiquen las toxinas Shiga, o
los genes que las codifican, para detectar las infecciones por E. coli 0157:H7. El
diagnóstico serológico, aún no se encuentra estandarizado (Mead et al, 1998).
El tratamiento es básicamente de sostén, incluyendo un monitoreo del estado de
hidratación del paciente, el peso, la oliguria, hemograma y hematocrito. La administración
de antibióticos parece ser contraproducente, al aumentar la liberación de la toxina Shiga,
aunque este fenómeno aún no se encuentra comprobado. En el futuro posiblemente se logre
tratar la infección mediante la administración vía oral de resinas que unan la toxina, o de
anticuerpos neutralizantes de la misma. La infección no confiere inmunidad natural, ni se
cuenta actualmente con una vacuna para humanos (Mead et al, 1998).
4.2 Listeria monocytogenes
Esta bacteria es habitante temporal del tracto gastrointestinal de muchos animales,
incluyendo el ser humano, siendo éste el principal sitio sospechoso para el inicio de una
listeriosis invasiva. Su presencia generalmente es inofensiva y el individuo puede
permanecer como portador asintomático por tiempo indefinido, incluso se calcula que el
5% de la población sana excreta L. monocytogenes y estaría en riesgo de contraer la
enfermedad. Actualmente se reconoce que la infección en humanos tiene un origen
alimentario (Fischetti et al, 2000).
La bacteria es un cocobacilo Gram positivo pleomórfico, con un tamaño
aproximado de 0,4 a 0,5 Fm de diámetro y de 0,5 a 2,O Fm de largo; cuando se encuentra
en cultivo líquido tiende a adquirir morfología cocoide, mientras que en cultivos jóvenes
puede formar pares, cadenas cortas, o cadenas en forma de "V. En cuanto a los
requerimientos de oxígeno, es una bacteria anaerobia facultativa. No es esporulada ni posee
cápsula, y es móvil por la presencia de flagelos peritricos; sin embargo los flagelos no se
presentan a temperaturas de 30" C a 37" C. A temperatura ambiente puede apreciarse la
característica "movilidad en sombrilla" cuando se inocula por picadura en tubos con agar
semisólido y se incuba por 24 a 48 horas. El fenómeno consiste en un crecimiento a lo
largo de la línea de inoculación, siendo más disperso en la zona superior, a pocos
milímetros de la superficie. La especie es además $-hemolítica, presenta la prueba de
CAMP positiva con Staphylococcus aureus, y es fermentadora de Ramnosa pero no de
Xilosa (Lovett et al, 1987).
El microorganismo es altamente resistente a altas temperaturas, pH bajo y altas
concentraciones de sal (hasta 10% de NaCl) y nitritos. Su ámbito de temperatura de
crecimiento va desde 4" C hasta 44" C, mostrando una ventaja adaptativa sobre otros
microorganismos en ambientes fríos como refrigeradoras. El crecimiento óptimo se da entre
30" C y 37" C. Su aislamiento a partir de suelo, agua, vegetación, e inclusive alimentos,
puede realizarse utilizando medios de cultivo selectivos y posteriormente pruebas
bioquímicas para su identificación. Todos los aislamientos tienen constitutivamente la
capacidad de producir los factores de virulencia característicos de la especie. Se conocen al
menos 16 serotipos, sin embargo tres de ellos son los responsables del 90% de las
infecciones en humanos, sobretodo el serotipo 4b (Fischetti et al, 2000).
Dado que L. monocytogenes está ampliamente distribuida en el medio ambiente, es
prácticamente imposible evitar que los animales entren en contacto con ella. Sin embargo,
los ganaderos, lecheros, y todos aquellos que tengan contacto con los alimentos sí pueden
tomar medidas para reducir la contaminación y mantener a los alimentos libres de esta
bacteria (USDA, 1992).
Las investigaciones realizadas, principalmente por la FDA (Food and Drug
Administration), han confirmado.la eficacia de la pasteurización comercial para eliminar el
microorganismo de productos lácteos, sin embargo la contaminación post-procesamiento
sigue siendo un problema. Es más probable que esa sea la causa de la presencia de la
bacteria en productos procesados, más que fallas en el proceso de pasteurización o en las
temperaturas utilizadas (USDA, 1992).
Los productos lácteos son muy susceptibles a la contaminación con la bacteria ya
que ésta puede ser excretada en la leche de vacas infectadas. Por su parte, la leche protege
al microorganismo de la acción de los jugos gástricos, una vez ingresado al estómago del
ser humano. Además, como se indicó anteriormente, las temperaturas de refrigeración no
impiden que el patógeno se reproduzca. El valor D para leche cruda, a una temperatura de
71,7" C, es de 0,9 segundos por lo que la FDA recomienda aplicar dicha temperatura por al
menos 15 segundos. Sin embargo, varios investigadores han señalado que la leche
pasteurizada puede ser vehículo de listeriosis y muchos de ellos sugieren que la bacteria se
protege de la inactivación térmica por su condición intracelular. Incluso se ha visto que es
capaz de sobrevivir a temperaturas de 72,2" C por 16 segundos si se encuentra dentro de
neutrófilos bovinos en niveles de lo3a lo4 por m1 (Lovett et al, 1987; Doyle, 1988).
En leche entera la bacteria se reproduce con tiempos de generación de
aproximadamente cuarenta minutos a 35" C; seis horas a 13" C y 1,5 días a 4" C. A esta
última temperatura la población alcanza lo6 bacteriaslml en un período de 15 días, y 10'
bacteriaslml en 3 a 4 semanas. Si se adiciona chocolate en polvo, azúcar o carragenina, el
crecimiento puede verse aumentado. Por otra parte, se ha logrado determinar que la bacteria
es capaz de sobrevivir al proceso de secado por aspersión de la leche en polvo, si su
concentración inicial es de al menos lo5 a 106/ml. La población tiende a reducirse en 1 a
1,s logaritmos por gramo durante este proceso (Oreamuno, 1994).
El queso fresco es altamente susceptible a la contaminación con el microorganismo,
tanto por el proceso mismo de fabricación como por otras propiedades que facilitan el
crecimiento del patógeno; por ejemplo su alto contenido de humedad (mayor a 50 %), alta
disponibilidad de nutrientes y concentraciones de sal del 1% al 3%. En Costa Rica la cuarta
parte de la producción de leche se dedica a la fabricación de queso, de la cual el 70%
corresponde a queso blanco o fresco. El consumo per capita de este producto es de 4 a 5
Kg al año. Además, el 90% de este queso es fabricado por pequeños y medianos
productores en forma artesanal y con escasa tecnología. La mayoría utiliza leche sin
pasteurizar y no adiciona cultivos lácteos que podrían inhibir el crecimiento del patógeno.
A su vez hay un alto riesgo de recontaminación por manipulación, ligado al uso de
condiciones de empaque y temperaturas de almacenamiento inadecuadas (Oreamuno,
1994).
Existen dos grupos etarios particularmente afectados por la listeriosis: niños
menores de un mes y personas mayores de 60 años. En los primeros la infección ocurre
durante la vida fetal, por transmisión transplacentaria (temprana), o durante el paso por el
canal cervico-vagina1 (tardía). En general, un tercio de las infecciones ocurren durante el
embarazo y pueden provocar abortos espontáneos, óbitos fetales, meningitis, o sepsis
neonatal (USDA, 1992).
La transmisión temprana se caracteriza por el nacimiento de bebés prematuros y
muy enfermos, con una resolución espontánea de la sepsis por parte de la madre. El
neonato también puede presentar sepsis, fiebre, erupción cutánea máculo-papular difusa o
evidencias del compromiso hepático como ictericia. La mortalidad, aún con tratamiento, es
muy alta, así como los casos de mortinatos. Las autopsias han revelado corioamnionitis en
los remanentes placentarios y granulomas en varios órganos como hígado y bazo. Algunos
reportes de casos aislados sugieren que el tratamiento de la madre que padece sepsis puede
prevenir la infección transplacentaria, o funcionar como tratamiento in útero para el feto,
resultando en un neonato sano. Por otra parte, en la transmisión tardía la enfermedad se
desarrolla de 7 a 14 días post-parto. Se cree que la infección se da por aspiración o
ingestión del microorganismo. Los síntomas incluyen fiebre, irritabilidad, tumefacción de
las fontanelas, entre otros. El embarazo, parto y post-parto suelen cursar sin complicaciones
ni signos de sepsis en la madre (Fischetti et al, 2000).
Otros pacientes con alto riesgo de infección son aquellos que tienen algún tipo de
inmunosupresión como SIDA, cáncer, o tratamientos con esteroides o ciclosporina A, así
como pacientes con cirrosis, diabetes mellitus y colitis ulcerativa crónica (CUCI). En
cuanto a la infección con HIV, se ha reportado que la tasa de ataque para listeriosis invasiva
en estos pacientes (HIV positivos) es de 500 a 1000 veces más que para la población en
general. Se ha visto una importante reducción de los casos de listeriosis en pacientes con
HIV por la implementación de controles en la dieta para prevenir la enfermedad
alimentaria, y debido al uso del tratamiento profiláctico para Pneumocystis carinii, que
consiste en Trimetoprim-Sulfametoxazol, el cual también es efectivo contra L.
monocytogenes (Fischetti et al, 2000).
La dosis infecciosa de L. monocytogenes aún se desconoce, sin embargo se cree que
varía según la cepa y, por supuesto, la susceptibilidad de la persona. Con base en los casos
de infecciones a través de leche cruda o supuestamente pasteurizada se sospecha que, en
personas susceptibles, menos de 1000 microorganismos pueden ser causa de enfermedad.
Además es importante mencionar que cuatro de las personas afectadas en un brote ocurrido
en Los Angeles, declararon haber ingerido el producto contaminado (queso suave) una sola
vez (USDA, 1992).
La especie es capaz de invadir el epitelio gastrointestinal. La ingestión de grandes
cantidades del microorganismo puede sobrepasar los sistemas de defensa locales del
hospedero, en el tracto gastrointestinal y sistema retículo-endotelial del hígado y bazo,
desarrollándose una listeriosis invasiva (Fischetti et al, 2000). Las cepas patógenas
penetran la mucosa ya sea directamente o por endocitosis por parte de los enterocitos, o
indirectamente, por penetración de las placas de Peyer. En algunos casos la enteritis aguda
resulta ser el único síntoma de la infección. Una vez que la bacteria entra en los monocitos,
macrófagos o neutrófilos del hospedero, la infección pasa al torrente sanguíneo
(septicemia) y el microorganismo se multiplica. Su presencia intracelular en células
fagocíticas también le posibilita el acceso al cerebro, y probablemente la migración
transplacentaria al feto, en mujeres embarazadas. La patogénesis de L. monocytogenes
radica en su habilidad para sobrevivir y multiplicarse dentro de las células fagocíticas del
hospedero (USDA, 1992 ;Hof, 2001).
Algunos componentes de la membrana o de la pared celular, como los ácidos
lipoteicoicos, pueden unirse a receptores en el macrófago y modular la respuesta
inflamatoria en el hospedero. Además la bacteria puede escapar rápidamente del fagosoma
mediante la secreción de listeriolisina 0 , una proteína lítica que pertenece a la familia de las
hemolisinas formadoras de poros, al igual que la estreptolisina O y la perfringolisina O. La
movilidad del patógeno dentro de las células, así como la propagación de célula a célula, se
encuentran íntimamente relacionadas con la presencia de la proteína ActA; aunque para la
dispersión entre células también son importantes las fosfolipasas y metaloproteasas
bacterianas (Fischetti et al, 2000).
Los síntomas de la enfermedad son variables y también dependen de la
susceptibilidad del individuo. mieden limitarse a fiebre, fatiga, náuseas, vómito y diarrea.
Sin embargo estos síntomas pueden anteceder una forma más seria de la enfermedad
(USDA, 1992).
Las formas más severas de listeriosis pueden resultar en meningitis y septicemia.
Las mujeres embarazadas pueden experimentar síntomas similares a un resfriado común o a
una pielonefritis, presentándose posteriormente las complicaciones ya mencionadas en el
recién nacido. En niños de más edad, así como en adultos, las complicaciones generalmente
comprometen al sistema nervioso central y también pueden incluir bacteremia, neumonía,
endoftalmitis, osteomielitis, otitis media, hepatitis y endocarditis. Al contacto con la piel, L.
rnonocytogenes puede causar abscesos localizados u otro tipo de lesiones. En casos de
meningitis, la mortalidad puede alcanzar cifras del 70%; a partir de septicemia se acerca al
50%, y en infecciones perinatales/neonatales es generalmente mayor del 80%; además
puede producir retraso mental en los niños. En infecciones durante el embarazo, la madre
generalmente sobrevive (USDA, 1992).
Se necesitan de una a seis semanas para que se desarrolle una manifestación severa
de listeriosis, aunque los síntomas tipo resfriado pueden aparecer aproximadamente 12
horas después de la ingestión de alimentos contaminados. El tiempo de aparición de los
síntomas dependerá del estado de salud del paciente, la cepa de L. monocytogenes y la
cantidad de bacterias ingeridas (Meier y López, 2001).
El CDC estima que ocurren unos 1850 casos de listeriosis humana en Estados
Unidos, cada año; y que de ellos se derivan 415 muertes anuales. Aproximadamente el 5%
de las 9000 muertes por intoxicación alimenticia se deben a L. rnonocytogenes. A medida
que la población envejece y que se alarga la sobrevivencia de personas con enfermedades
malignas y otros trastornos inmunosupresores, ha aumentado el número de individuos en
riesgo de sufrir una listeriosis (USDA, 1992).
La listeriosis esporádica es más común en primavera y en verano, probablemente
debido a las variaciones estacionales en cuanto al tipo de alimentación, pues durante los
meses más cálidos, los alimentos que se acostumbra consumir son de mayor riesgo.
Además se ha visto que la infección con virus predispone al desarrollo de una listeriosis
invasiva, ya que ocurre un daño en la mucosa gastrointestinal que facilita la penetración por
parte de L. monocytogenes, y que estos virus tienen patrones estacionales que se traslapan
con los de la listeriosis (Fischetti et al, 2000).
Tanto el FSIS como la FDA rechazan cualquier presencia detectable de L.
monocytogenes en alimentos para consumo humano; es decir, aplican un criterio de "cero
tolerancia". Los programas de la FDA para monitorear la presencia de este microorganismo
se aplicaron inicialmente en queso y productos lácteos. Posteriormente se amplió la
cobertura para incluir otros alimentos listos para consumo, como emparedados, ensaladas
preparadas y pescado ahumado. Ambas entidades coinciden en que la estrategia más
efectiva para controlar la presencia de éste y otros patógenos en los alimentos es la
implementación de un sistema HACCP (Hazard Analysis and Critica1 Control Point),
sobretodo en estos tiempos en que se ha incrementado la demanda de productos frescos y
sin procesar, inclusive sin pasteurizar; aumentando el riesgo de infecciones alimentarias. La
mayoría de las industrias lecheras practican actualmente medidas de control basadas en los
principios HACCP (USDA, 1992 ;Fischetti et al, 2000).
La FDA y el FSIS han desarrollado procedimientos de cultivo que dependen de la
presencia de antibióticos en el medio, lo cual permite la multiplicación de L.
monocytogenes pero inhibe el crecimiento de otros microorganismos competidores. El
método que emplea la FDA actualmente, revisado en Setiembre de 1990, utiliza
enriquecimientos de 24 y 48 horas, seguidos de una variedad de pruebas; el tiempo total de
identificación es de 5 a 7 días. Sin embargo, el surgimiento de sondas de ADN específicas
(no radioactivas) podría permitir próximamente una confirmación más rápida y más simple
de los aislamientos sospechosos. La tecnología de ADN recombinante permitiría un análisis
completo en 2 a 3 días. Actualmente la FDA está tratando de adaptar esta metodología para
cuantificar números muy bajos de rnicroorganismos, directamente de los alimentos.
También se han utilizado ensayos inmunoenzimáticos con anticuerpos monoclonales, e
inclusive la citometría de flujo. Para serotipear un aislamiento se cuenta con diversos
antisueros comerciales como el polivalente contra antígeno 0, y los específicos contra los
tipos 1 y 4 (USDA, 1992).
Las colonias en agar nutritivo aparentan gotas de rocío ya que son translúcidas y
circulares, con un diámetro de 0,5 a 1,5 mm. Además pueden diferenciarse de las de otros
géneros porque, en un medio de cultivo incoloro como el agar nutritivo, presentan una
coloración de celeste a verde cuando se iluminan con luz oblicua (Luz de Henry). En agar
Oxford son de color café oscuro a negro, debido a la hidrólisis de la esculina, y presentan
una depresión central.
La listeriosis puede diagnosticarse mediante el cultivo de la bacteria a partir de
sangre o líquido cefalonaquídeo. En mujeres infectadas también es posible cultivarla a
partir de frotis vaginales o del cérvix uterino. En gastroenteritis febriles, el coprocultivo en
medios selectivos para L. monocytogenes también puede resultar positivo, sobretodo si los
agentes tradicionales no han podido ser aislados. Las pruebas serológicas no son útiles
como diagnóstico en la fase aguda, pero sí para análisis retrospectivos de brotes de
gastroenteritis, donde se ha demostrado la presencia de altos títulos de anticuerpos antilisteriolisina A (USDA, 1992).
El tratamiento consiste en antibióticos B-lactárnicos como penicilina parenteral o
ampicilina. Actualmente lo que se utiliza es una combinación de ampicilina y gentamicina.
En la mayoría de los casos, una duración de 2 a 3 semanas es suficiente. En pacientes
alérgicos a la penicilina se ha utilizado exitosamente el trimetoprim-sulfarnetoxazol, o la
vancomicina. La bacteria es resistente a cefalosporinas, lo cual representa un retraso en la
recuperación de algunos pacientes, ya que estos antimicrobianos se usan comúnmente
como tratamiento empírico de meningitis bacteriana o de sepsis no específicas; cuando el
agente etiológico es la especie L. monocytogenes, este tratamiento no tendrá ningún efecto
(USDA, 1992 y Fischetti et al, 2000).
4.3 Salmonella spp.
El género Salmonella fue descrito por primera vez en 1900 por el bacteriólogo
Daniel E. Salmon, de quien deriva su nombre (Mora, 1996). Pertenece a la familia
Enterobacteriaceae, la cual incluye organismos anaerobios facultativos, oxidasa negativos,
capaces de crecer en medios de crecimiento ordinario y fermentar glucosa con o sin
producción de gas, además de poder reducir los nitratos a nitritos (Forbes et al, 1998).
Particularmente Salmonella spp. se caracteriza por ser un bacilo Gram negativo, no
fermentador de lactosa, no esporulado, con un tamaño aproximado de 2-3 pm por 0,4-0,6
pm, la mayoría móvil por flagelos peritricos (Farmer y Kelly, 1991). Es una bacteria indol
y ureasa negativa, que no produce lipasa ni deoxirribonucleasa y no posee capacidad de
desaminación oxidativa sobre los aminoácidos fenilalanina y triptofano (Groisman, 2001).
Su taxonomía y nomenclatura han tenido varios cambios en los últimos años (Le
Minor, 1992). No obstante, basándose en la similitud genética y el rango de huésped, se ha
clasificado en seis subespecies, categorizadas a su vez en grupos. Estos son: choleraesuis (o
enterica, Grupo 1), salamae (Grupo 2), arizonae (grupo 3a), diarizonae (Grupo 3b),
houtenae (Grupo 4) e indica (Grupo 6). S. bongori se considera como una especie aparte
debido a la drvergencia que esta presenta con respecto a las otras especies del mismo
género. Además, de acuerdo a tres de sus principales determinantes antigénicos: el antígeno
H flagelar, el antígeno O somático y el antígeno Vi (que constituye un homopolímero de
ácido N-acetilgalactosaminourónico predominante en S. typhi), se ha agrupado en 2200
serotipos (Groisman, 200 1).
El hábitat principal de Salmonella es el tracto gastrointestinal del ser humano y
otros animales mamíferos, reptiles, aves , peces e incluso insectos. La relación de
especificidad de este bacilo con respecto al huésped, varía de acuerdo al tipo de especie
involucrada. Ello provoca la presencia de diferentes grados de infección, desde inaparentes
(portadores asintomáticos) hasta el desarrollo de cuadros de enteritis, septicemia, aborto y
combinaciones de dichas patologías. Desde esta perspectiva, cabe destacar que la
transmisión de dicha bacteria puede ocurrir de animal a animal, de animal a humanos y de
humano a humano, ya sea de forma directa o indirecta (Clarke y Gyles , 1993).
Con base en lo anterior, y tomando en cuenta parárnetros epidemiológicos, esta
bacteria puede clasificarse en tres grupos principales. El primero incluye especies altamente
adaptadas al ser humano, siendo capaces de producir fiebre entérica. h e d e n transmitirse
por medio de la ingesta de comida y10 agua contaminada o de persona a persona. Entre
ellas destacan: S. typhi, S. paratyphi, S. schottmuelleri (ocasionalmente aislada de
animales), S. hirschfeldii y S. sendai. El segundo grupo está constituido por serotipos
adaptados a especies particulares de vertebrados, no humanos. Sin embargo, algunos de
estos serotipos pueden causar también patología en el hombre (S. dublin, S. choleraesuis).
El tercer grupo comprende más de 2000 serotipos que son ubicuos en la naturaleza y por
tanto son inadaptados a huéspedes específicos. La mayoría de las especies del género se
clasifican en este grupo, siendo S. typhimurium y S. enteritidis las más frecuentemente
implicadas en casos de gastroenteritis (WHO, 1988; Clarke y Gyles, 1993;Berkow,, 1994).
Por tanto, la importancia de Salmonella spp. radica en su implicación económica
tanto en animales como en el ser humano. Varios de los serotipos de esta bacteria son
capaces de producir infección en animales, desencadenando en algunas ocasiones
enfermedades severas y constituyéndose en un reservorio y fuente de transmisión para el
ser humano (Clarke y Gyles , 1993).
Algunos de los factores que contribuyen a aumentar la patogenicidad de Salmonella
spp. en el ser humano son: el serotipo, la edad de la persona, la dosis infectante, tipo de
alimento contaminado y predisposición a enfermedades. Así, la mayor cantidad de
aislamientos de esta bacteria se han reportado en bebés de 1 a 4 meses, luego decrece en
forma abrupta al alcanzar la niñez temprana y la edad adulta, para aumentar al llegar a
edades de más de 80 años. La salmonelosis extraintestinal se da más frecuentemente en
niños que en adultos y las personas con deficiencias en el sistema inmune son mayormente
susceptibles a estas infecciones (Poppe, 1990).
La infección está usualmente confinada al tracto intestinal pero el microorganismo
puede invadir la comente sanguínea causando septicemia, principalmente en el caso de
adultos mayores. En casos muy extremos el paciente puede entrar en coma y morir
(Forsythe y Hayes, 1998). Existen otros sitios menos comunes de infección que se
relacionan principalmente con defectos inmunológicos; entre ellos destacan la vasculatura
(endocarditis), hueso (osteornielitis) y articulaciones (artritis) (Groisman, 2001).
El período de incubación en una persona infectada varía considerablemente, pero en
general oscila entre 8 y 48 horas. Los principales síntomas son diarrea, dolor abdominal,
fiebre, náuseas y vómito, los cuales pueden persistir por 2 a 5 días, o inclusive extenderse a
semanas en casos particulares (Prescott et al, 1999).
Los dos cuadros clínicos principales de la salmonelosis en humanos son la fiebre
tifoidea y la gastroenteritis. Los serotipos S. typhi y S. paratyphi, causantes del primer
cuadro mencionado, tienen una tasa de mortalidad de casi un 10 % comparado con la otra
patología que es menor a 1 % (Poppe, 1990; AOAC, 1998; Groisman, 2001).
La fiebre tifoidea inicia gradualmente y se caracteriza por fiebre, postración, dolor
abdominal y presencia de una erupción rosada. El período de incubación en general es de 8
a 14 días y es inversamente proporcional al número de microorganismos ingeridos. El
serotipo de Salmonella spp. infectante penetra en el organismo por vía digestiva y asciende
al torrente circulatorio por los conductos linfáticos. Hay inflamación monocítica en el ileon
y el colon, en la lámina propia y las placas de Peyer, siendo frecuente la necrosis tisular
localizada en estos puntos. En los casos más graves puede haber ulceración, hemorragia y
perforación intestinal; estas complicaciones se producen sobre todo en pacientes no
tratados. El diagnóstico se basa en el aislamiento de S. typhi mediante cultivos, aunque el
cuadro clínico y las anomalías hematológicas puedan sugerir fiebre tifoidea. El tratamiento
se basa en el uso de antibióticos, principalmente de cloranfenicol; sin embargo, debido al
aumento de la resistencia ante este antibiótico y ante la ampicilina, la ceftraxiona y
cefoperazona son la primera elección para una terapia apropiada.
En comparación, la gastroenteritis suele aparecer entre 12 y 48 horas tras la
ingestión de esta bacteria. Empieza con náuseas y dolor cólico abdominal, seguidos de
diarrea, fiebre y a veces vómitos. Habitualmente la enfermedad es leve y persiste entre 1 y
4 días. Se trata sintomáticamente con dieta blanda y fluidoterapia. El uso de antibióticos no
está justificado para casos no complicados, debido a que prolongan la excreción del
microorganismo (Berkow, 1994).
Gran parte de la capacidad patogénica de Salmonella se debe a la presencia de
varios factores de virulencia, cuya existencia se explica por la complejidad de
requerimientos necesarios para que esta bacteria logre una interacción efectiva con el
huésped determinado. Entre los principales se encuentran: la presencia de enterotoxinas,
citotoxinas, lipopolisacárido (LPS), flagelos, sideróforos, proteínas de choque térmico
("Heat-Shock Proteins") y plásmidos. Para su estudio se han realizado una serie de ensayos
tanto in vitro como in vivo (Mora, 1996; Groisman, 2001).
Se han descrito tres enterotoxinas relacionadas con el género Salmonella spp.,
siendo la de mayor relevancia en humanos la toxina "CT-like", cuyo nombre se deriva de la
similitud estructural, funcional y antigénica con la toxina del cólera y las enterotoxinas LT
de Escherichia coli. Se ha aislado a partir de S. typhimurium, es lábil al calor y se une al
gangliósido GMI induciendo un aumento en la secreción de fluidos por incremento de
AMP cíclico y prostaglandina E2 (Prasad et al, 1992).
La presencia de LPS, característica de bacterias Gram negativas, es un determinante
importante de la virulencia de Salmonella spp. Se ha relacionado con la capacidad de
penetración en células de la mucosa intestinal, la producción de septicemia por algunos
serotipos y el descontrol homeostático en los sistemas de coagulación, cardiovascular e
inmunológico (Robbins et al, 1992; Clarke y Gyles, 1993).
Los flagelos son necesarios para la invasión de células epiteliales, sin embargo,
parecen no ser necesarios en el caso de S. typhimurium y se han reportado gran cantidad de
cepas mutantes inmóviles (Jones et al, 1992). Por su parte, la presencia de plásmidos se ha
relacionado primordialmente con la resistencia a antibióticos por algunos serotipos, tales
como: S. dublin, S. choleraesuis, S. gallinarum, S. pollomm y S. abortosovis , mientras que
no se han detectado en patógenos humanos como S. typhi.(Guiney et al, 1995).
En cuanto a la supervivencia, Salmonella es relativamente resistente a variaciones
en los factores ambientales en comparación con otros bacilos Gram negativos. Puede crecer
a temperaturas que oscilan entre los 8" C y 45" C, en un rango de pH entre 4 - 8, en
presencia o ausencia de oxígeno y es capaz de sobrevivir a concentraciones de NaCl entre
0,5 - 16,O % (WHO, 1988; USDA,2002). En este aspecto, cabe destacar la capacidad que
presenta Salmonella de sobrevivir en el medio ambiente durante largos períodos de tiempo,
de esta forma puede permanecer varios días en el agua e incluso varios años en el suelo
bajo condiciones favorables de temperatura, humedad y pH. Sin embargo parece ser
incapaz de multiplicarse significativamente fuera de su ambiente natural, es decir, fuera del
tracto digestivo (Le Minor, 1992).
Este microorganismo puede diseminarse en el medio ambiente a través de las
excreciones humanas o de animales, llegando a contaminar agua, suelos y algunas plantas
comestibles. Los fertilizantes y contenedores de alimento para animales representan
también una de las principales fuentes de infección (Forbes et al, 1998).
Con respecto a la dosis infectante, se pensaba que era alta, alrededor de 5 x 10' a
lo6 microorganismos. Sin embargo, existe evidencia de que de 10 a 1000 bacterias pueden
causar enfermedad en niños y personas inmunosupresas, especialmente si el alimento
presenta un alto contenido de grasa (Poppe, 1990). La AOAC (Association of Official
Analytical Chemists, 1998) considera como dosis infectante una menor cantidad de
bacterias, de 15 a 20 células, dependiendo del serotipo y factores propios del huésped,
como su edad y estado general de salud.
En los seres humanos la salmonelosis ocurre, generalmente, luego del consumo de
alimentos como huevos, carne de res y de aves, crudas o con poca cocción, leche sin
pasteurizar, pescado, camarones, ancas de rana, gelatina, mantequilla de maní, coco,
chocolate y otros alimentos contaminados (AOAC, 1998). No obstante, a pesar de la gran
variedad de fuentes y vehículos de transmisión, la adquisición de salmonelosis en humanos
se relaciona principalmente con el consumo de animales o de productos derivados a partir
de estos. En este sentido las carnes, primordialmente la de pollo, juegan un papel
protagónico (Thorne, 1991).
Existen diferentes factores que contribuyen al aumento de la contaminación de la
carne de pollo, entre ellos destacan el inadecuado manejo de las aves en su procesamiento
para el consumo humano, la composición química de este tipo de carne (proteínas, grasa,
agua), características como un pH cercano a 6 y un aw alto que favorecen el desarrollo de
microorganismos patógenos como Salmonella spp. (Romero, 2000).
De esta forma los pollos suelen
infectarse con Salmonella, desarrollando
enfermedad en los casos de las especies S. pollorum o S. gallinarum. La primera especie es
capaz de producir una enfermedad predominantemente entérica en el animal, mientras que
la segunda especie nombrada puede provocar un cuadro de tifoidea caracterizado por
septicemia (Thome,l991). No obstante, para el desarrollo de patología por estas especies en
las aves, se deben tomar en cuenta varios factores, como la edad y ruta de infección. Según
estudios realizados, los pollos de pocos días de vida son más propensos a desarrollar
salmonelosis y a morir por una pequeña dosis si son infectados por la madre, que en el caso
de una dosis mayor suministrada en el alimento (Romero, 2000).
A ello se suma el hecho de que en la mayoría de países se ha logrado una
disminución en la incidencia de estas especies de Salmonella spp. de la carne de pollo,
consideradas por algunos autores como flora normal, encontrándose en tracto digestivo,
superficie de piel y plumas @e Boehr y Hahne, 1990). Dicha eliminación se ha asociado
con un incremento en la posibilidad de contaminación con S. enteritidis, que es el agente
causal de gastroenteritis en el ser humano (Baurnler y Hargis, 2000).
5.1 Recolección de muestra
Se analizaron 100 muestras de leche no pasteurizada provenientes de las principales
zonas productoras del país. Noventa de ellas fueron proporcionadas por una industria
lechera nacional, cada una de aproximadamente 40 mL y empacadas en bolsas estériles.
Las dos primeras semanas se trabajó con una muestra proveniente de una lecheria de
Sabanilla, dos de una lecheria de Cartago, una de Alajuelita, dos de San Ramón y cuatro de
una lechería en Coronado. La procedencia según provincia se muestra en el Cuadro l.
Cuadro 1. Distribución de muestras de leche cruda analizadas
según provincia y procedencia.
PROVINCIA
I
San José
Alaiuela
PROCEDENCIA
Alaiuelita
.,
Coronado
1 Sabanilla
1 Alfaro Ruiz-Zarcero
Altarnira
Bijagua
Jabillos
1 Sn. Carlos-La Marina
orotina
San Miguel
San Ramón
otros*
Cot-Irazú
Paraíso
Otros*
Río Frío
1 Otros *
Arenal-Tilarán
Y
Cartago
Heredia
1
Guanacaste
1
Liberia
Nandavure
TOTAL
* La industria no especificó procedencia.
TOTAL DE MUESTRAS
1
1
1
13
1
6
1
2
1
9
2
1
2
5
4
2
8
8
8
2
100
G ~ y A l a y ~ ( : E a ~ l a s i p r o v m E i a s d e ~ ~ p ~ m
El resto de las provimias
con un mismo prtrce9tajrt, que a9icila entre m 14% y 16%
parwntaje & las rmrestras (29% y 26%* -e).
contribuyen p
-
Fisura 1).
TOTAL DE MUESTaAS
15
PROCEDENCIA
San José
1
San Jod Centmi
MdCenhral
Otros*
~
n
d
u
y
c
13
2
,
9
l
TOTAL
*
1
i
otras*
-GiiGzi~
Chbgo
5
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~
a
r
i
a
~
d
a
~
~
,
~
a
l
t
,
~
~
txmledm
Figure 2. DisMbucibn d4 rnussims de m u d o s de pdlo adquiridas,
sregún provincia.
~
~
~
~
~
~
~
p
5.2 Transporte
Las muestras fueron debidamente identificadas; incluyendo procedencia, tipo de
producto, fecha de adquisición y condiciones de almacenamiento. Posteriormente fueron
transportadas al laboratorio en el menor tiempo posible (nunca mayor a 4 horas), para ello
se mantuvieron en hielo hasta su procesamiento.
5.3 Análisis Microbiológico
Para el análisis de las muestras se siguió el método descrito en el Manual de
Bacteriología, Food and Drug Adrnistration (1995).
Aislamiento de Escherichia coli 0157:H7 a partir de ambos alimentos:
a) Enriquecimiento: 25,O mL de leche ó 25,O g de menudos de pollo homogenizados
en Stomacher, en 225,O mL de caldo EC+Novobiocina. Se incubó durante 24 horas
a 37°C.
b) Aislamiento selectivo en Agar MacConkey-Sorbitol (Oxoid,USA): se rayaron los
caldos en este medio y se utilizó el mismo tiempo y temperatura de incubación.
c) Aislamiento en Agar MacConkey suplementado con 4-metil urnbeliferil
fl
D
glucurónido (MUG) 0,2 g/L (Oxoid,USA): las colonias sospechosas (sorbitol
negativas) se rayaron en este agar, incubando bajo las mismas condiciones. Se
repitió este procedimiento con las colonias MUG negativas, al día siguiente.
d) Pruebas bioquímicas: se realizaron las pruebas de TSI, ureasa, oxidasa, catalasa,
IMVIc, lisina descarboxilasa y API 20E (Biomerieux Vitek, Inc., Hazelzood, Mo.),
a partir de las colonias sospechosas (MUG negativas).
e) Confirmación serológica: por aglutinación en látex con antisueros monoclonales
específicos para el antígeno O 157 (Unipath, Oxoid, US) y el antígeno H 7
(Difco,USA). Para la confirmación de la presencia de verotoxina se contó con la
colaboración de los laboratorios del INCIENSA.
Aislamiento de Listeria monocytogenes en leche no pasteurizada:
a) Pre-enriquecimiento: 25,O mL de leche en 225,O mL de caldo UVM, incubando por
24 horas a 37°C.
b) Enriquecimiento en caldo selectivo: 0,l mL de los caldos anteriores en 9,9 mL de
caldo Frazer, incubando bajo las mismas condiciones.
c) Aislamiento en medio selectivo: se rayaron los caldos anteriores en Agar Oxford,
incubando 24 horas a 37°C. Posteriormente se dejaron a temperatura ambiente hasta
que apareciera crecimiento de colonias sospechosas y por un máximo de siete días.
d) Pruebas confirmatorias: luz de Henry, movilidad en sombrilla, oxidasa, catalasa,
fermentación de Ramnosa y Xilosa, prueba de CAMP.
e
Aislamiento de Salmonelúr spp. en menudos de pollo:
a) Pre-enriquecimiento: 25,O g homogenizados en Stomacher, en 225,O rnL de agua
peptonada estéril (APE ) O,l% ,incubando 24 horas a 37°C.
b) Enriquecimiento en caldos selectivos: 0,l mL de cada caldo en 9,9 mL de Caldo
Selenito y Caldo Tetrationato, incubándose 24 horas a 37°C y a 43°C
respectivamente.
c) Enriquecimiento en medios selectivos: se rayaron cada uno de los caldos
sospechosos en medio XLD y medio Hecktoen y se incubaron durante 24 horas a
37°C.
d) Confirmación bioquírnica: a las colonias sospechosas se les realizaron las pruebas
TSI, ureasa, catalasa, oxidasa e IMVIc.
e) Confirmación serológica: ensayo de aglutinación con suero monoclonal contra el
antígeno 09.
6. RESULTADOS
E l ~ p r p ~ ~ k r , ~ ~ ~ a d q u i r i d a s , i m d %
pol&iww
ea San Jod (lJl5) y m 14% para el caso de -O
(314).
L a dean89ppo-
ptemnunOS/o&pM(Ew3).
<
San Jord
AlmjWi
Cirargo
HHisdki
Oum&cmb
Fira 3.DisibibuciPlnde mucrstms da M e cruda posiaras
por L. montxq&g@ne)g, ssgirn pmvhcie.
ael total de nwdras &e d
s de
S
-
pioh
m
n
Mmmlla spp. Su íibüib&n s q g h provincia se:detalla en el Giiihidro 4,
E I ~ d e p o ~ v a t i a c o n ~ a l a E o ~ d e ~ a d q t l i r P d a s
Cartago presenB6 un 44% de mikestc9s
en cada provincia (Figura 4). De a t a
posíths (4B), H e m h un 22 % (Ug), S, José un 12 % (8/67) y Ahjuela un 7% (1/15).
.~.rdqui*
M
. *-
O
T
O
2
0
3
0
4
0
8
0
W
M
r
n
Figura 4. Dbbibución de muestras da menudos ds polk positnras par
SalmmIa spp., según pmlncta.
Con respecto a la positividad por Escherichia coli 0157:H7, ésta se logro aislar en
un 2% de las muestras de leche cruda y en un 3% de las muestras de menudos de pollo,
cuya procedencia se detalla en los Cuadros 5 y 6, respectivamente.
Cuadro 5. Distribución de muestras de leche cruda positivas por
E. coli 0157:H7 según provincia y procedencia.
PROVINCIA
Alajuela
Cartago
TOTAL
PROCEDENCIA
San Ramón
Paraíso
MUESTRAS
ADQUIRIDAS
2
2
MUESTRAS
POSITIVAS
1
1
2
Cuadro 6.Distribución de muestras de menudos de pollo positivas por
E. coli 0157:H7 según provincia y procedencia.
PROVINCIA
San José
Heredia
TOTAL
PROCEDENCIA
Mercado Borbón
Mercado Coca Cola
Mercado Central
MUESTRAS
ADQUIRIDAS
20
6
9
MUESTRAS
POSITIVAS
1
1
1
3
7.1 Escherichiu coli 0157:H7
Los productos de consumo de origen animal han sido descritos como fuente
primaria de contaminación con Escherichia coli 0157:H7 (Arias e? al, 2001). Por tanto, la
determinación de esta bacteria en ellos, es esencial para la evaluación epidemiológica de las
patologías provocadas por una posible infección de este tipo. A pesar de que su aislamiento
se ha notificado en diferentes partes del mundo, en los países tropicales existen muy pocos
reportes al respecto.
La ausencia de resultados positivos en Costa Rica, anteriores a este trabajo, podría
deberse a su baja incidencia y a la dificultad que supone su aislamiento, a ello se suma el
hecho de que su prevalencia e incidencia son altamente variables (Reuben e? al, en prensa).
Nuestros resultados constituyen un logro importante en el estudio epidemiológico de esta
bacteria en nuestro país, no solamente por ser el primer aislamiento realizado sino por
revelar posibles fuentes alimentarias de contagio. Lo anterior se demuestra con el 2% de
positividad encontrado en las muestras de leche cruda, y el 3% hallado en las muestras de
menudos de pollo analizadas, tal como lo ilustran los Cuadros 5 y 6, respectivamente.
Los productos cárnicos han sido descritos como el principal vehículo de transmisión
de esta bacteria en los seres humanos (Arias e? al, 2001). Como plantean Mead y
colaboradores (1998), la mayoría de los brotes asociados a alimentos han sido debidos a la
ingestión de productos derivados del ganado vacuno, especialmente carne molida y leche
cruda; no es sorprendente entonces, encontrar muestras positivas en el presente estudio. En
este contexto, la carne vacuna representa el principal alimento donde se le ha aislado, lo
que se refleja en las estadísticas de prevalencia en carne de vaca molida/deshuesada, siendo
de 5 % a 18 % en Canadá. La explicación de este hecho se atribuye a las operaciones de
molido con equipo.contaminado y a un procesamiento inadecuado en la remoción del cuero
y del tracto gastrointestinal, principal reservorio de dicha bacteria (Karmali, 1996).
Los estudios realizados por Arias y colaboradores (2001) en leche pasteurizada
inoculada con el patógeno demuestran que éste posee una importante resistencia a bajas
temperaturas y que es capaz de multiplicarse tanto a 12" C como a 22" C, así como a pH
ácido. Además concluyen que la bacteria es capaz de crecer en alimentos bajo condiciones
frecuentemente encontradas en países tropicales como el nuestro.
La presencia de la bacteria en leche cruda representa un riesgo potencial para la
salud pública ya que podría utilizarse como materia prima para la fabricación de otros
lácteos como queso, o incluso consumirse sin tratamiento, como se discutirá posteriormente
para el caso de L. monocytogenes. Este producto ha sido asociado con brotes de
Escherichia coli 0157:H7, como el ocurrido en Canadá, que afectó a varios niños. Cabe
destacar que este microorganismo puede sobrevivir en derivados de leche con un bajo pH,
por lo que los productos fermentados no pasteurizados representan un posible vehículo de
transmisión (Reuben et al, en prensa). Para disminuir el peligro de transmisión se
recomienda, entre otras medidas, aplicar a la leche un tratamiento de pasteurización, el uso
de "starters" activos y el cumplimiento de normas higiénicas estrictas.
Además, al igual que lo explicado más adelante para L. monocytogenes, su
presencia también es indicadora de un control de calidad deficiente en las fincas
productoras y del mismo modo, puede servir para que la industria receptora identifique las
fincas que están entregando leche de menor calidad y que tome las medidas del caso. A
diferencia de L. monocytogenes, ninguna de las muestras que presentaron E. coli 0157:H7
procedían de las fincas proveedoras a la industria. Ambas muestras se obtuvieron por
ordeño manual, lo cual confirma una vez más el hecho de que este método está más
propenso a contaminación que el ordeño mecánico.
Escherichia coli es una bacteria que se destruye fácilmente con los tratamientos de
pasteurización, sin embargo logra sobrevivir al proceso de desecación por atomización,
utilizado para fabricar la leche en polvo. Por ello es indispensable que la leche destinada a
venderse como leche en polvo sea pasteurizada antes de someterla a desecación. También
debe recordarse que cualquier fallo en el tratamiento térmico constituye un peligro
potencial, ya que puede perpetuar la presencia de E. coli en el alimento (Vanderzant et
al, 1992).
Se ha visto que la fermentación láctica inhibe el crecimiento y favorece la muerte de
E. coli; sin embargo, los quesos semiduros de maduración superficial son particularmente
susceptibles a que ocurran fermentaciones anormales, debido a que la acidez se desarrolla
más lentamente y a que la concentración de sal en su interior es baja, durante las primeras
fases de la maduración. Es por ello que existe una alta probabilidad de transmisión del
patógeno a través de este tipo de derivados (Vanderzant et a1,1992 ).
En cuanto a la carne de pollo, esta representa uno de los tantos alimentos vendidos
por minoristas que no han sido relacionados con brotes de esta bacteria, pero que bien
pueden ser fuentes en algunos casos esporádicos de infección (Karmali, 1996). De acuerdo
a lo anterior, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, aconseja el
establecimiento de estándares de confiabilidad para el consumo de ésta y otras carnes, así
como de los productos derivados de ellas (Exeni, 1996). Como consecuencia de lo anterior,
durante las décadas de los 80 y 90 la investigación dentro de la industria avícola ha puesto
mucho más énfasis en la determinación de Escherichia coli 0157:H7 productora de
verotoxina (Murray, 2000).
La carne de pollo y los huevos han sido considerados como vehículos de
transmisión de este patógeno, debido a que estas aves pueden ser colonizadas por pequeñas
poblaciones de Escherichia coli 0157:H7 y continuar excretando la bacteria por largos
períodos de tiempo. Sin embargo, se han obtenido diversos reportes acerca de su
aislamiento, desde resultados negativos a partir de pollo crudo, hasta un 12% de muestras
positivas en cloacas de pollo (Reuben et al, en prensa).
Las posibilidades de contaminación con agentes patógenos que presenta este
cámico se encuentran relacionadas con el tipo de procesamiento llevado a cabo, como se
detalla posteriormente para el caso de Salmonella, así como con el tipo de manipulación y
manejo por parte del consumidor. Cabe destacar el aumento de manipulación dado en la
obtención de las vísceras o "menudos" de pollo, en donde el proceso de evisceración
representa la principal fuente de contaminación por la probabilidad de ruptura del intestino
del animal, el cual a su vez puede ser reservorio de Escherichia coli 0157:H7.
Por tanto, los "menudos" de pollo, son potenciales vehículos de transmisión de esta
bacteria. Hay una alta probabilidad de contaminación de este tipo de carne fuera de la
planta de procesamiento, por lo que se requiere el mantenimiento de una serie de cuidados
por parte del comerciante y el consumidor mismo. La prevención de este serotipo se centra
no solamente en la calidad del procesamiento industrial sino también en el mantenimiento
de la cadena de frío, en la cocción apropiada de los alimentos y en la prevención de la
contaminación cruzada.
El almacenamiento en condiciones de refrigeración es determinante para el
mantenimiento de la calidad del producto, sin embargo, en caso de que éste se encuentre
contaminado con Escherichia coli 0157:H7, las bajas temperaturas no constituyen una
forma de destrucción para la bacteria. Según estudios recientes, esta bacteria tiene
capacidad de sobrevivir en rangos amplios de temperaturas, logrando no solo sobrevivir
sino también multiplicarse en menudos de pollo almacenados a 0,6"C y 12" C (Arias et al,
2001).
En esta perspectiva, cabe señalar la capacidad de supervivencia presentada por esta
bacteria. Diferentes estudios revelan su resistencia a ambientes ácidos, logrando sobrevivir
en un rango de pH de 3,7-4,l por 14-21 días a 4" C en sidra de manzana y 24 horas a un pH
de 2 en agar tripticasa soya (Arias et al, 2001). No obstante, se ha demostrado que un
tratamiento térmico de 65" C por 7,25 minutos para carne de res y de 2,6 minutos a la
misma temperatura para pollo, logran matar alrededor de un millón de bacterias de este
serotipo (Vijay et al, 1996). Esto recalca la importancia de un buen cocinado de la carne, ya
sea por parte del consumidor como por parte de restaurantes o instituciones que involucren
el procesamiento de alimentos como una de sus actividades.
Otro de los aspectos esenciales en la prevención de este tipo de infección lo
constituye los cuidados en la manipulación de esta carne por parte de los encargados de la
preparación de los alimentos. Esto es determinante en la disminución de la contaminación
cruzada con utensilios, como se detalla posteriormente para el caso de Salmonella spp.
Cabe resaltar la importancia del estado de salud del personal ya que son posible fuente de
transmisión de Escherichia coli 0157:H7, principalmente si se encuentran involucrados en
instituciones como asilos geriátricos y guarderías, donde se encuentran los principales
grupos de riesgo.
La aplicación del sistema HACCP, así como la introducción de las Buenas Prácticas
de Manufactura en la industria alimentaria, tanto avícola como lechera, constituyen una
medida para la reducción del riesgo potencial para la salud pública que representa este
patógeno.
El método utilizado para el aislamiento de la bacteria a partir de alimentos ha
demostrado ser el más efectivo hasta el momento, no en vano es el que se encuentra
actualmente aprobado por la FDA. Por lo anterior es justo suponer que el porcentaje
obtenido de muestras positivas, se acerca al porcentaje real de prevalencia de E. coli
0157:H7 en los alimentos analizados. El aislamiento en medios de enriquecimiento y en
medios selectivos y diferenciales permite una disminución en la probabilidad de falsos
negativos y positivos, ello sumado a la utilización de pruebas bioquímicas y confirmación
serológica.
Con respecto al empleo de métodos serológicos, cabe destacar la posibilidad de que
algunas de las bacterias no estuvieran expresando en ese momento los antígenos empleados
en la identificación, pero que sí presentaran la información genética correspondiente a los
principales factores de virulencia, tal como lo reportan estudios realizados (Feng et al,
1998). Además, otros serotipos causantes de enfermedad como el 055:H7, relacionado con
brotes de diarrea infantil en todo el mundo, quedaron fuera de la cobertura del análisis
realizado (Karmali, 1996). La presencia de otros serotipos productores de toxinas dificulta
el diagnóstico y podría dar origen a confusiones en los aislamientos, cuando se utilicen
únicamente los ensayos de detección de toxinas, o sus genes, sin previa identificación
serológica.
No se realizaron ensayos de patogenicidad a los aislamientos de E. coli 0157:H7.
La evaluación de la producción de verotoxina por parte de las cepas aisladas no pudo
llevarse a cabo, debido a la alteración de su estado inicial durante el almacenamiento, lo
que originó colonias rugosas atípicas. Sin embargo para este agente aplica lo mismo que se
discutirá más adelante para L. monocytogenes, en el sentido de que su presencia en los
alimentos representa, per se, un riesgo para el consumidor. Además en este caso se sabe
que la dosis infecciosa puede ser tan baja como 2 células125 g (Arias et al, 2001) y que el
serotipo tiene la capacidad potencial de producir la toxina, responsable en gran parte de las
manifestaciones clínicas. Esto último requeriría demostrarse mediante técnicas de análisis
molecular, como Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
7.2 Listeriu monocytogenes
Como se observa en el Cuadro 1, se logró aislar Listeria monocytogenes en el 3%
de las 100 muestras de leche cruda analizadas. Este porcentaje de aislamiento concuerda
con otros resultados reportados en la literatura, en donde la prevalencia de la bacteria en
leche cruda es de un 5,4% en Canadá, 3,6% en Reino Unido, 0,9% en Alemania, 0,5% en
Australia, y 0% en Italia y Nueva Zelanda; encontrándose una prevalencia mundial de
alrededor del 2,2%. La prevalencia en España es muy diferente al resto de Europa e
inclusive de América, ya que el porcentaje de aislamiento es de 45,3% (Arias et al, 1994;
Orearnuno,1994).
En Estados Unidos los resultados de aislamiento de Listeria sp. varían entre un
12,6% en tres diferentes zonas de la región (Lovett et al, 1987), un 12% en Georgia y un
4% en Nebraska (Ellner et al, 1991); sin embargo estos datos se refieren a la presencia del
género Listeria y no a la especie de nuestro interés, por lo tanto existe la posibilidad de que
el porcentaje de aislamiento de L. monocytogenes sea menor. Cabe destacar que en estudios
anteriores realizados en nuestro país no se logró el aislamiento de L. monocytogenes a partir
de leche cruda (Ellner et al, 1991 y Arias et al, 1994) con excepción de la investigación
realizada por Orearnuno (1994), quien encontró un 20% de muestras de leche cruda
positivas por la presencia de esta especie.
Una vez más se confirma que la leche cruda es una posible fuente del
microorganismo, justificándose la necesidad de un manejo y tratamiento adecuados para
este alimento. La pasteurización sigue siendo una medida apropiada para eliminar la carga
de patógenos (la mayor parte de las formas vegetativas) en la leche, aunque se considera
que esta bacteria en particular es capaz de sobrevivir el proceso de inactivación térmica en
determinadas condiciones (Lovett et al, 1987; Doyle, 1988). Pese a ello, en nuestro país
aún no se ha logrado aislar el microorganismo de leche pasteurizada, exceptuando los
posibles casos de recontaminación post-proceso.
La pasteurización, realizada a la temperatura y tiempo adecuados para el tipo de
patógeno y de alimento, permite conservar la mayoría de las propiedades organolépticas y
nutricionales de la leche, a la vez que aumenta la seguridad del alimento. Cuanto menor sea
el tiempo de tratamiento térmico, mejor será el sabor del mismo. Los estándares
internacionales de tiempo y temperatura para leche cruda se fijaron inicialmente con base
en estudios de muerte térmica de Coxiella bumetti, por ser este el patógeno más resistente
conocido. Posteriormente estos valores fueron disminuidos. Actualmente es necesario
reconsiderar dichos parámetros tomando en cuenta la presencia de Listeria monocytogenes.
Según las especificaciones de la FDA, existen dos tipos principales de
pasteurización: la discontínua o baja (LTH)que se realiza a una temperatura de 65" C
durante 30 minutos, y la contínua o alta (HTST) que se lleva a cabo a 72" C por 15
minutos. Finalmente existe un tratamiento más drástico conocido como UIFT que consiste
en someter la leche a temperaturas de 138" C durante 1 a 2 segundos. Las grandes
compañías productoras prefieren emplear los procesos HTST o UHT, ya que consumen
menos tiempo (Vandemant et al, 1992). Posteriormente a la pasteurización, el producto se
enfría rápidamente a 5" C o menos, con el fin de inhibir el crecimiento microbiano, sin
embargo esta medida no es válida para L. monocytogenes, dado que esta especie es capaz
de reproducirse incluso a 4" C (Fischetti et al, 2000).
Debido a que no se conoce la dosis infecciosa, es imposible aplicar el criterio de la
OMS, el cual indica que la pasteurización debe llevarse a cabo a una temperatura y tiempo
suficientes para que muera la cantidad de bacterias necesaria para producir patología. Por
ello, la norma consiste en aplicar el criterio de cero tolerancia (USDA, 1992).
En Europa se utiliza el género Listeria spp. como indicador de higiene. En nuestro
caso, la especie L. monocytogenes es un importante indicador de que existen fallas en el
control de calidad de los productores que suministran la leche a la compañía. Lo anterior es
de gran utilidad para esta última, ya que le permite identificar las fincas que están
entregando leche de menor calidad y de mayor riesgo para el consumidor, además de que
puede tomar medidas como por ejemplo informar a los productores, educar a los
responsables del ordeño e incluso tomar decisiones acerca de la aceptación o rechazo del
producto. Como advierten las entidades estadounidenses FSIS y F'DA (1992), el sistema
HACCP es la medida más efectiva para controlar la presencia de L. monocytogenes, así
como de otros patógenos, en alimentos.
La leche cruda es muy utilizada como materia prima para la fabricación de queso,
helados y otros productos lácteos. No todos los derivados de la leche se fabrican con leche
pasteurizada y por ello es importante la calidad de la leche cruda, ya que de ella dependerá
la calidad del producto final. Como menciona Oreamuno (1994), en Costa Rica el 25% de
la producción de leche se dedica a la fabricación de queso; la mayoría es producción
artesanal, con escasa tecnología y leche sin pasteurizar. En el caso del presente estudio, la
leche está destinada a una posterior pasteurización; sin embargo es posible que no toda la
leche sea vendida a la industria y, por lo tanto, existe el riesgo de que sea consumida sin
pasteurizar o utilizada para fabricar derivados. El hecho de que se encuentre la bacteria,
nuevamente alerta sobre la frecuencia con que ésta se presenta y sobre la probabilidad de
ingerirla.
Entre los factores que influyen sobre el grado de pureza de la leche cruda se
encuentran los aspectos propios del animal como la limpieza y sanidad de la ubre, la
ausencia de mastitis y otras enfermedades, así como la limpieza de las superficies exteriores
del animal, ya que los microorganismos presentes en el alimento, estiércol, tierra, etc. pasan
con facilidad a la leche. El equipo de ordeño constituye la principal fuente de
microorganismos que se encuentran en la leche cruda, por lo que es de vital importancia la
limpieza del mismo, así como de los utensilios (ej. tarros colectores). Se ha logrado
eliminar la presencia de organismos termodúricos en menos de 5 meses, únicamente
mediante una buena limpieza e higienización de las ordeñadoras. Los puntos críticos en la
higiene de éstas son las pezoneras, los caños y los codos (Vanderzant et ~1,1992).Otros
componentes del equipo que pueden contribuir a la contaminación de la leche son los
tanques de almacenamiento, los agitadores, llaves de salida, válvulas, tuberías, los tanques
para el transporte de la leche, etc. Las llaves de salida pueden estar muy contaminadas
aunque no lo aparenten, ya que la unión entre el metal y los tapones de goma no es muy
eficiente (Cortés, 1992).
Cuando no se realiza una buena limpieza al equipo pueden depositarse restos de
leche que constituyen una fuente importante de nutrientes, además de que las superficies
permanecen mojadas o húmedas durante tiempos prolongados, lo cual favorece la presencia
de microorganismos que luego pasarán a la leche. Muchos de éstos son termodúricos y
pueden constituir un grave problema en los productos pasteurizados.
El aire no contribuye de manera importante al contenido microbiano de la leche, sin
embargo otros componentes del ambiente circundante sí son importantes, como la limpieza
de las instalaciones, los corrales, etc. El personal que realiza el ordeño manual puede ser la
causa de que lleguen a la leche ciertos microorganismos, inclusive patógenos,
principalmente desde la piel o vías respiratorias, por ello es necesario que el ordeñador se
encuentre en buen estado de salud y libre de infecciones (Vanderzant et al, 1992 ).
Es de esperar que la frecuencia de aislamiento, tanto de L. monocytogenes como de
E. coli, sea mayor para leche obtenida por ordeño manual. Ello debido a la mayor
manipulación y contaminación que implica este proceso; por ejemplo con heces de la vaca,
agua, tierra, o de parte del mismo ordeñador. El ordeño mecánico, cuando se realiza
correctamente, incluye una desinfección de las ubres usualmente con una solución al 1% de
yodo, así como del equipo en sí. Además, conlleva menor manipulación por parte de la
persona encargada. En nuestro país, el porcentaje de aislamiento de L. monocytogenes en
muestras obtenidas mediante ordeño manual oscila entre el 20 y el 45%.
La mayoría de las muestras analizadas en este estudio se obtuvieron mediante
ordeño mecánico, con excepción de las provenientes de San Ramón, Alajuelita, Sabanilla y
Paraíso. En la mayoría de los casos provenían de fincas abastecedoras de leche para
industrialización. En estas fincas, posteriormente al ordeño, el productor guarda la leche en
tanques refrigerados y en agitación; de allí se toma la muestra para el análisis
microbiológico: se transfiere a una bolsa estéril con una cuchara desinfectada
químicamente, usualmente mediante hipoclorito. En todos los casos, las muestras se
transportaron hasta el sitio de análisis a temperaturas de refrigeración, en bolsa estéril y
cerrada, y se almacenaron a esta temperatura hasta ser analizadas. Es conveniente destacar
que la temperatura se mantuvo a lo largo de todo el proceso, lo cual es esencial para
garantizar una buena representación de las condiciones reales, evitando que se agregue
carga bacteriana al producto. Lo anterior también aplica para la técnica aséptica utilizada
para la colecta.
En lo referente a las muestras obtenidas por ordeño manual, se siguió el mismo
procedimiento empleado por el ordeñador para la recolección de la leche, con el fin de
reproducir al máximo las condiciones bajo las cuales se vende o se consume el producto.
Igualmente se transportaron en refrigeración.
El mantenimiento de la cadena de frío a través de la distribución y venta del
producto no es tan importante para la multiplicación de L. monocytogenes, pues como se
mencionó, esta especie es capaz de replicarse a temperaturas de refrigeración; no obstante,
si las muestras se transportaran a temperatura ambiente aumentaría la probabilidad del
microorganismo para reproducirse.
En el caso de Paraíso, la muestra provenía de un lechero que vende el producto de
casa en casa, para el consumo familiar. Una vez en las viviendas, el máximo tratamiento
que llevará esa leche, será la aplicación de calor hasta el punto de ebullición, lo cual es
posible que no elimine los bacilos de L. monocytogenes, ya que esta especie es muy
resistente a altas temperaturas (Fischetti et al, 2000). Lo anterior es aún más razonable si
recordamos que en ocasiones ni siquiera la pasteurización parece eliminar el patógeno.
Es muy importante señalar que esta muestra resultó positiva por ambas especies,
tanto L. monocytogenes como E. coli 0157:H7, lo cual podría deberse como ya se discutió,
a la mayor probabilidad de contaminación asociada con el ordeño manual. Además, estuvo
más propensa a adquirir los microorganismos puesto que se recolectó en su envase original
y sufrió más manipulación, exponiéndose a una mayor cantidad de riesgos de transmisión.
Pese a ello, las condiciones enfrentadas no le restan validez ya que en última instancia, la
leche que será consumida por la población también recibirá el mismo trato.
La industria se eligió como proveedora de las muestras por representar la mayor
empresa productora del país. Por su parte, las zonas de donde provenía la mayor cantidad
de muestras fueron las provincias de Alajuela y Guanacaste (Gráfico 1), por tratarse de las
principales zonas lecheras del país.
La zona con más muestras positivas por L. monocytogenes fue la provincia de
Cartago (Gráfico 2). De las dos muestras positivas, una provenía de Paraíso como ya se
discutió, mientras que la otra sí provenía de una finca abastecedora de la industria. La
mayor proporción encontrada en esta provincia se debe sin duda a la muestra de Paraíso, ya
que ésta no compartía las mismas condiciones con las muestras destinadas a
industrialización. La muestra originaria de San José también provenía de una finca
abastecedora, situada en Coronado; por lo tanto podría decirse que ambas provincias
exhiben un 1% de positividad en muestras obtenidas por ordeño mecánico. Este porcentaje,
si bien es bajo, no satisface las normas internacionales aplicadas al microorganismo. Las
provincias de Alajuela y Guanacaste revelan un mejor sistema de recolección y10 un mejor
control de calidad puesto que, a pesar de que de ellas proviene el mayor número de
muestras, en ambos casos se encontró un 0% de positividad.
Como mencionan Fischetti y colaboradores (2000), es posible aislar el
microorganismo de diversos tipos de muestra, incluyendo material crudo para consumo
humano, utilizando medios selectivos sin previo procesamiento. Cuando la carga bacteriana
supera las 100 células/g es posible detectar la presencia de L. monocytogenes por plateo
directo en medios selectivos; por el contrario si la carga es baja, o si las células se
encuentran dañadas, es necesario aplicar un aislamiento con una fase de preenriquecimiento, como el aprobado por la FDA y utilizado en este estudio. No obstante,
debe considerarse que los métodos de cultivo proporcionan resultados más que nada
cualitativos, y que un resultado negativo no indica necesariamente la ausencia de la bacteria
(Vanderzant et al, 1992).
A pesar de que existe gran variedad de métodos rápidos de detección, éstos aún no
se encuentran aprobados por la FDA. Una alternativa para la detección de organismos
dañados por el calor, específicamente en leche pasteurizada, ha sido propuesta por Teo y
colaboradores (2001). En ella se utiliza una combinación de concentraciones óptimas de
Cloruro de Litio, Sulfato de Magnesio y D-serina en una base de caldo mPSU (modified
Pennsylvania State University) para el cultivo del patógeno, a una temperatura óptima de
30" C.
Es poco probable que la diferencia con respecto al porcentaje encontrado por
Oreamuno (1994) se deba al método empleado para el aislamiento, puesto que la única
variante utilizada por este investigador es la prolongación del tiempo de incubación en la
fase de pre-enriquecimiento y la introducción de un procedimiento de purificación postaislamiento. En todo caso, la incubación del pre-enriquecimiento por un lapso de 7 días
podría ser significativa en cuanto a la cantidad de bacterias recuperada, pero a su vez podría
traer como consecuencia un sobrecrecimiento de la flora contaminante. Posiblemente por
esta razón se hizo necesario introducir la etapa de purificación.
En lo concerniente al tipo de ordeño, no se especifica qué modalidad se empleó para
la toma de muestra, sin embargo se sospecha que se obtuvieron por ordeño mecánico, por
tratarse de plantas productoras de gran volumen. El investigador sí reporta que la extracción
de la muestra se realizó a partir de los tanques de pasteurización, con pipetas estériles,
luego de haberse mezclado todo el volumen. En nuestro caso, la muestra se tomó de los
tanques de almacenamiento, antes de ser llevada a la industria para ser pasteurizada, pero
este hecho difícilmente se relaciona con la discrepancia entre los porcentajes de
aislamiento.
Para comprobar la patogenicidad de un aislamiento de L. monocytogenes existen
varios modelos; algunos consisten en demostrar la capacidad de causar patología en
ratones, mientras que otros se basan en la inoculación de la membrana corioalantoidea de
huevos de pollo embrionados. La FDA utiliza la inoculación intraperitoneal de cinco
ratones con una solución conteniendo aproximadamente lo9 UFC; las cepas patógenas
provocan la muerte de los ratones en cinco días. Una prueba que podría sustituir a los
modelos animales es la producción de hemolisina, ya que se ha visto que las cepas
P listeriolisina, y que la síntesis de ésta última se encuentra ligada
a la presencia de hemólisis P. Sin embargo aún no se ha demostrado la validez de este
patógenas producen a y
ensayo (Vanderzant et al, 1992). En el presente estudio no se evaluó la patogenicidad de los
aislamientos sin embargo, la sola presencia del microorganismo en el alimento representa
un riesgo para la salud. Si bien no se puede asegurar que el consumo de la leche llevará al
padecimiento de una listeriosis, es un hecho que las personas que la consuman tendrán una
mayor probabilidad de contraer la enfermedad.
7.3 Salmonella spp.
De acuerdo con estudios realizados por la Organización Mundial de la Salud, la
salmonelosis representa una de las enfermedades de transmisión alimentarias más
frecuentes tanto en países industrializados como en aquellos en vías de desarrollo (WHO,
1997). Por tanto, la determinación de Salmonella spp. forma parte de normas
internacionales para la aceptación microbiológica de muchos productos alimentarios.
Los productos cárnicos presentan una serie de características adecuadas para el
desarrollo de microorganismos, incluyendo agentes bacterianos patógenos. Entre éstas
destacan: su alto contenido proteico, aw elevado, pH relativamente neutro, potencial oxidoreducción favorable para aerobios y10 anaerobios y una composición inorgánica y
vitamínica balanceada. Estos factores intrínsecos, sumados a la alta manipulación que
existe en el procesamiento industrial, propician la contaminación con Salmonella spp. en
gran parte de dichos alimentos, principalmente en la carne de pollo.
El procesamiento en la industria avícola representa una de las principales formas de
contaminación, ello desde la matanza hasta el transporte del producto listo para el consumo
humano. Un sacrificio inapropiado provoca un desangrado incompleto en el ave, lo que
conlleva a una prolongación en el tiempo de respiración y una probable inhalación de agua
durante el proceso de escaldado (Obando y Murillo, 1998). Esta agua se encuentra
altamente contaminada por distintas bacterias, debido a que durante el desangramiento hay
una pérdida del control de los esfínteres, provocando un aumento logarítmico en la
contaminación de las plumas, de donde se ha logrado aislar Salmonella spp. (Cox y Bailey,
1987).
Además un escaldado muy prolongado ocasiona que la carne se cocine
parcialmente, lo que impide una limpieza apropiada de los tejidos musculares del ave. Ello
dificulta la eliminación de la contaminación que posteriormente ocasiona la
descomposición de la carne (Obando y Murillo, 1998).
Otro de los inconvenientes dentro de este proceso, corresponde a la forma en que se
aplique el desplumado y evisceración de las aves. El desplumado manual genera mayor
cantidad de lesiones en la piel, lo que permite la introducción de bacterias. Por otra parte, la
evisceración manual representa una mejor práctica, debido a que existe un mayor cuidado
en el corte, evitando así un rompimiento de los intestinos y una posterior contaminación de
la carne con bacterias propias de este tracto, entre las que destacan S. pollorum y S.
gallinarum.
La aplicación de normas HACCP dentro de industrias avícolas ha permitido una
disminución en la tasa de prevalencia de Salmonella spp. en este tipo de carne, llegando a
constituirse incluso una norma obligatoria en muchos países. Lo anterior se ve reflejado en
Estados Unidos, durante 1998, donde gracias a la aplicación de las regulaciones HACCP el
porcentaje de pollos crudos positivos por esta bacteria disminuyó de un 16 % a un 9 %
(USDA, 1998).
Además el empleo de estas prácticas de operación permite evitar la contaminación
dentro de las granjas de producción, ello por medio de la calidad del alimento brindado a
las aves, el control de insectos y roedores (reservorio natural de S. enten'tidis) y el
monitoreo de aves libres de infección con serotipos patógenos de Salmonella (Poppe,1990).
El empleo de estas prácticas, en países industrializados como Inglaterra y Estados
Unidos, permitieron, a partir de la década de los setenta, la erradicación de las especies S.
pollorum y S. gallinarum dentro de la mayor parte de industrias avícolas. Esto por cuanto
ocasionaban patologías en las aves, como diarrea y fiebre tifoidea, respectivamente.
(Baumler y Hargis, 2000). Cabe destacar, que la patogenicidad de Salmonella en las aves se
encuentra determinada por factores como la edad, ruta de infección y la alteración en la
flora competitiva normal, lo que contribuye a prevenir o a reducir la colonización de
serotipos también patógenos para el hombre (Romero, 2000).
En contraste con la disminución de S. pollorurn y S. gallinarum, a partir de 1970, la
incidencia de S. enteritidis, patógeno sólo en humanos, se ha visto incrementada. Lo
anterior, sugiere que la eliminación de los serotipos de Salmonella propios de las aves ha
favorecido la colonización de estas por parte de especies patógenas para el ser humano.
Ello se explica en el hecho de que estructuralmente S. pollorurn , S. gallinarum y S.
enteritidis comparten los antígenos 012 (unidades repetitivas de polisacárido 0 ) y 0 9
(cadenas de tivelosa), por lo que aves infectadas con las primeras especies presentan títulos
altos
de
anticuerpos
contra
estos
antígenos,
principalmente contra
el
09
(inmunodorninante), pudiendo presentar una inmunidad cruzada que las proteja de la
infección con la especie patógena para el ser humano y de presencia asintomática en ellas,
no así con S. íyphimurium, donde este tipo de inmunidad no parece presentar efecto
protector en el ave (Baumler y Hargis, 2000).
No obstante, posterior al procesamiento industrial el producto puede contaminarse
en los pasos siguientes hasta su llegada al consumidor. Dentro de este contexto, cabe
destacar la importancia del mantenimiento de la cadena de frío, debido a que se ha
demostrado que la población de esta bacteria decrece en refrigeración, es decir, a 4" C
(FSIS,1998).
En nuestro país, estudios recientes no demostraron una incidencia significativa de
Salmonella spp. en los canales de procesamiento de las principales industrias avícolas
(Romero, 2000). Sin embargo, la determinación de la presencia de dicha bacteria en
menudos de pollo adquiridos en el área metropolitana mostró una prevalencia de un 15%
como se observa en el Cuadro 4, lo que refleja una dudosa calidad en el manejo de estos
productos posterior a su procesamiento. Ello representa un aumento en la probabilidad de
contaminación con serotipos patógenos, llevando inclusive a probables infecciones
alimentarias.
Las muestras analizadas fueron vísceras (hígado y mollejas) de pollo, que
constituyen uno de los productos de mayor venta para la industria avícola nacional. Estos
representan un factor de riesgo potencial de salmonelosis, no solo por ser un cárnico con
características propicias para el desarrollo de bacterias, sino también porque muchos de
estos órganos son reservorio de agentes patógenos. A esto se añade la mayor manipulación
que requieren durante su obtención.
La elección de mercados como los principales sitios de adquisición de las muestras
analizadas, se justifica en el hecho de que gran parte de la venta de productos cámicos del
área metropolitana se da en ellos. Además, debido a sus características, representan lugares
con alta probabilidad de contaminación.
San José, por ser la capital del país, presenta tres mercados y mayor cantidad de
expendios comerciales; esto explica que la procedencia del 67 % de las muestras analizadas
correspondan a dicha provincia, como se observa en la Figura 2. No obstante, la positividad
en los aislamientos fue mayor en Cartago, en proporción al total de muestras adquiridas en
esta zona. Lo anterior se ilustra en la Figura 4.
Para el aislamiento e identificación de Salmonella spp. se utilizó el método de
cultivo tradicional, el cual a pesar de ser un método tedioso por la duración de los análisis,
sigue representando el estándar de oro y el método confirmatorio de técnicas de
identificación rápidas. Su principal ventaja deriva en el empleo de fases de enriquecimiento
y cultivo selectivas para este tipo de bacteria, lo cual sumado al uso de diferentes pruebas
bioquímicas y serológicas, permite una disminución en la incidencia de falsos positivos y
negativos.
El antígeno identificado en la fase de confirmación serológica fue el 0 9 , presente en
diferentes especies de la familia Enterobacteriaceae, lo cual puede originar la presencia de
falsos positivos. Sin embargo, la utilización previa de medios selectivos y diferentes
pruebas bioquímicas disminuyen significativamenteesta probabilidad.
Las bacterias aisladas fueron identificadas como Salmonella spp. y no en especies
particulares, debido a que los objetivos en la determinación de la presencia de este agente
potencialmente patógeno se centran en su incidencia en productos, lo que representa un
riesgo mayor para la adquisición de salmonelosis. Además, de acuerdo con la NAS
(National Academy of Sciences) y NRC (National Research Council), todos los serotipos
de esta bacteria presentan igual nivel de importancia en la identificación en muestras
alimentarias y los análisis realizados por normas ICMSF establecen que la determinación
de especies aplica solo en casos de investigaciones específicas (Vanderzant et al, 1992).
A pesar de las normas apropiadas durante el procesamiento de la carne de pollo y al
mantenimiento de una cadena de frío adecuada, que disminuyan la probabilidad de
contaminación con Salmonella; la causa más común de infección alimentaria relacionada
con la ingesta de este tipo de carne es una inadecuada separación de la misma con
productos que no requieren ser cocinados, como son comidas frías y ensaladas (Murray,
2000). Esto por cuanto, Salmonella spp. es sensible al calor y no sobrevive a temperaturas
mayores a los 70°C (WHO, 1988); por lo que un correcto proceso de cocción de la carne
contaminada puede eliminar la bacteria.
La utilización de tablas de picar juega un papel muy importante en este tipo de
contaminación cruzada, convirtiéndose en reservorio de muchas bacterias, especialmente si
contienen residuos de grasas u otros detritos por una limpieza inapropiada de las mismas.
El tipo de material de ésta es también determinante. De acuerdo a estudios realizados en
tablas de picar, utilizando trozos de pollo crudo como fuente de bacterias, las tablas de
plástico presentan un mayor nivel de recuperación de microorganismos con respecto a las
tablas de madera. Además, las tablas nuevas presentan mayor porcentaje de recuperación,
dependiendo del estado de las viejas. Ello demuestra la importancia de una limpieza
exhaustiva de estos utensilios, siendo necesario el uso de limpiadores más fuertes para las
tablas plásticas.(FEDEMCO, 2002).
Por tanto, las medidas preventivas primarias de cocción y limpieza apropiada de
recipientes, son determinantes para la profilaxis de este tipo de infección. El
establecimiento de estas y otras prácticas relacionadas debe ser obligatorio en instituciones
que alberguen grupos de riesgo como son ancianos, niños e inmunosupresos.
Otro aspecto importante a considerar en el hallazgo significativo de esta bacteria, es
la presencia de cepas de Salmonella spp. resistentes a antibióticos. De esta forma, para
1998 en el Reino Unido, la presencia de Salmonella spp. resistente a estreptomicinas,
sulfonamidas y especialmente tetraciclinas, puso en alerta a las industrias avícolas y
autoridades de salud (Murray, 2000). De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud,
son este tipo de cepas, las de mayor importancia e implicación en brotes alimentarios
(WHO, 1997). Dicha resistencia, puede explicar en parte la alta incidencia de esta bacteria,
demostrada en el estudio realizado.
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El estudio de Escherichia coli 0157:H7, como agente causal de brotes alimentarios
debe incluir una investigación dirigida en todos los niveles de la cadena de transmisión.
Ello involucra las granjas o establos, las industrias de procesamiento, el tipo de transporte
empleado, el almacenamiento y finalmente el trato dado por el mismo consumidor.
También resulta indispensable para futuros estudios epidemiológicos reportar cualquier
caso de infección con este serotipo, así como interrogar al paciente para tratar de
determinar si existe algún vínculo entre la enfermedad y la ingestión de algún alimento en
particular, o el contacto con otras personas enfermas.
Se debe implementar una serie de programas que contemplen medidas de control
sanitario estricto en las instituciones que brindan apoyo nutricional a personas de alto
riesgo de contaminación como son ancianos, niños y enfermos. Este debe incluir normas
básicas de higiene, el correcto proceso de cocción en el caso de carnes y consumo de leche
pasteurizada.
Es preciso realizar más investigaciones relacionando el riesgo de infección con el
aislamiento de esta bacteria en alimentos. Además es recomendable determinar la
frecuencia de otras variantes de cepas productoras de verotoxinas, que son causantes de
enfermedad en humanos. Es conveniente seguir realizando estudios para lograr que las
vacunas que se han desarrollado a partir de toxoides contra este patógeno, y que han
probado su efectividad en animales, puedan ser aplicadas en humanos.
Las fincas lecheras deben ser más cuidadosas en cuanto a la limpieza y sanidad de
los animales, equipo, e incluso del personal. La materia prima, así como los productos
pasteurizados deben analizarse regularmente para evaluar la calidad microbiológica, las
posibles fuentes de contaminación y alertar al fabricante de que puede existir algún fallo en
el proceso.
En nuestro país es necesario ampliar las investigaciones en el campo de la
listeriosis, e inclusive realizar estudios epidemiológicos sobre dicha enfermedad. El sistema
de salud pública de nuestro país no realiza de rutina el cultivo de L. monocytogenes, a partir
de frotis vagina1 o de cérvix uterino en mujeres embarazadas. Sería valioso realizar dicho
procedimiento, ya sea para el registro epidemiológico de los casos, o para tomar medidas
preventivas como la cirugía cesárea, con el fin de evitar la transmisión tardía al neonato.
Finalmente sería importante continuar los intentos de aislamiento a partir de leche
pasteurizada para poder determinar si este tratamiento es realmente una medida efectiva
contra el patógeno. Al respecto, podría considerarse la posibilidad de utilizar el método
propuesto por Teo y colaboradores (2001).
La determinación de la presencia de Salmonella spp. en carne de pollo,
específicamente en "menudos", es de vital importancia en el establecimiento de la garantía
de la calidad de este producto; la cual se encuentra establecida a su vez por el tipo de
procesamiento empleado y el seguimiento de normas de seguridad apropiadas que eviten su
contaminación posterior.
Se precisan otras investigaciones para averiguar los serotipos más frecuentes de
Salmonella spp. en este tipo de carne y poder así determinar el porcentaje de cepas
patógenas para el humano que puedan utilizar este alimento como vehículo de transmisión.
Además es recomendable realizar un análisis estadístico en nuestro país, del número de
casos de las distintas patologías producidas por esta bacteria, y determinar su relación con
el consumo de algún alimento.
De igual forma, se necesitan investigaciones sobre el nivel de resistencia a
diferentes antibióticos que presentan este tipo de cepas. Esto debido a la implicación que
representa para el manejo clínico de potenciales infecciones.
La implementación de normas HACCP dentro de las industrias alimentarias es una
de las principales formas de control y garantía de la calidad microbiológica e inocuidad de
los productos. Además, esto evitaría consecuencias más graves que impliquen mayores
gastos económicos.
Los consumidores deben participar activamente en la prevención de enfermedades
de origen alimentario, reconociendo y evitando cualquier riesgo asociado. Para ello es
necesario el establecimiento de campañas educativas que incluyan información acerca de
los peligros de consumir leche cruda, la poca utilidad de hervir la leche como medida
preventiva, la importancia de una preparación adecuada y cocción completa de la carne de
pollo, la adecuada separación de los alimentos de consumo crudo, como vegetales, de este
tipo de carne, y el almacenamiento de los alimentos a temperaturas de refrigeración, entre
otras.
AOAC. 1998. HACCP obligatorio en las plantas de carne y pollo en los Estados
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