Download Diapositiva 1 - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Clostridios
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Clostridium botulinum
•
•
•
•
•
Gram +
Anaeróbica
forma bacilar
Esporogena
Reservorio: ubicua
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Clostridium botulinum stained with gentian violet
Clostridium Difficile
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Clostridium botulinum
4 tipos de botulismo:
1. El originado por el consumo de alimentos contaminados
con la toxina botulínica preformada
2. Botulismo infantil
3. El botulismo de las heridas.
4. La cuarta clase es la no clasificada, los casos de origen
desconocido.
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• Existen 7 tipos de C. botulinum de A al G
basados en los serotipos de sus toxinas.
C. botulinum se divide en 4 grupos basados en caracteres fisiológicos y 16S:
grupo
I
II
III
(A + proteol. B y F)
(E + no proteol. B y F)
no proteol.
A, B, F
E, B, F
C, D
G
10
3.3
15
ND
35-40
18-25
40
37
pH mínimo de crecimiento
4.6
5.0
ND
ND
Conc. Inhibitoria de NaCl %
10
5
ND
ND
aw mínima de crecimiento
0.94
0.97
ND
ND
D100 oC min. (esporas)
25
< 0.1
0.1-0.9
0.8-1.12
D121 oC min. (esporas)
0.1-0.2
<0.001
ND
ND
Característica
Neurotoxina
Temp. de crec. mínima
máxima
IV
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Tolerancia a los métodos de conservación
•
•
•
•
•
•
Temperatura
pH
aw
Eh (potencial redox) -350mV (Crece +30 y +250mV)
Conservantes
NO2
Sorbatos
Otros microorganismos
Parabenos
Nisina
Ascorbatos
EDTA
Matabisulfito
Maleatos
Fumaratos n-monoalquilicos
Humo natural o liquido.
Brotes producidos por alimentos
• Cárnicos ► pescado salado no eviscerado
• Las conservas caseras de hortalizas
• Botulismo infantil ► La miel con recuentos
(104) (normales 1-10 esporas kg-1)
110
100
90
Reported Cases
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1982
1987
1992
Year
MMWR
1997
2002
Las conservas caseras son las que más habitualmente se asocian a
casos de botulismo.
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Características de la enfermedad:
•
El botulismo varía desde una enfermedad que puede pasar desapercibida a
la mortalidad en 24h.
•
Generalmente los síntomas aparecen rápido 12-36h después de la
ingestión de la toxina,
Como la toxina da una parálisis muscular flácida encontramos sus efectos:
• Al comienzo nauseas y vómitos.
• Luego signos y síntomas nerviosos:
–
–
–
–
–
–
–
Trastornos visuales, diplopía o visión doble o borrosa, pupilas fijas dilatadas
Problemas para tragar deglutir
Boca lengua y garganta secas
Cansancio general
Descoordinación muscular
Conflicto respiratorio
Dolor abdominal, diarrea o estreñimiento
botulismo infantil
•
•
•
•
•
•
Estreñimiento
Debilidad
llanto débil
escasa succión
falta de expresión facial
flojedad progresiva.
Tratamiento
• neutralización de la toxina mediante
sueros específicos
• eliminación por enemas del remanente
intestinal
• lavado estomacal
• tratamiento con eméticos
• respiración artificial
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Dosis infecciosa
• En raton DL50 es de approx 0.1 ng kg-1
•
los alimentos deben tener ausencia de la toxina
• condiciones que no permitan el crecimiento de C.
botulinum
It is the most acutely toxic substance known, with a median lethal
dose of about 1 ng/kg when introduced intravenously and 3 ng/kg
when inhaled. This means that, depending on the method of
introduction into the body, a mere 90–270 nanograms of botulinum
toxin could be enough to kill an average 90 kg (200 lb) person.
Factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad
7 neurotoxinas diferentes son producidas por C. botulinum: A, B, C1, D, E,
F y G.
C2 y C3 enzimas ribosilantes ► ej. Ribosilan actina inhibiendo la
polimerizacion y asi la celula pierde estabilidad.
Las neurotoxinas bloquean la neurotransmisión en las terminales de
las neuronas motoras periféricas. Porque hidrolizan la proteínas
implicadas en la fusión de vesículas sinápticas con la membrana
plasmática, impidiendo la liberación de acetilcolina.
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Botulinum Toxin is the world's deadliest poison and the most poisonous
naturally occurring substances.
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•
Fig. 1. Schematic structure of botulinum toxin. In the form of single-chain, toxins have
relatively little potency as neurotoxins. Neurotoxic activation requires a two-step
modification in the tertiary structure of the protein. In the first step, the parent chain is
cleaved between amino acids 448 and 449. The result is one light chain (L-chain,
amino acids 1-448, approx. 50 kDa) and one heavy chain (H-chain, amino acids 4491295, approx. 100 kDa) mutually connected by a disulfide bond (-S-S-). The light
chain is associated with one atom of zinc (Zn2+). In this form toxin enters the axon
terminal. The second activating step, disulfide reduction, occurs only after
internalization by the target cell.
Modo de acción:
• Cadenas H → fijación selectiva e
interiorización de la toxina completa.
• Cadena L → bloquean la exocitosis de las
vesículas sinápticas.
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Toxina botulínica mecanismo
• preguntas
Clostridium perfringens Food Poisoning
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Produce 2 enfermedades muy diferentes:
• Intoxicación alimentaria C. perfringens tipo A
– Enterotoxina CPE
– Toxina ß
• Enteritis necrótica que es sumamente rara.
características que potencian su patogenicidad
• tiempo de duplicación de 10 min!!?
• resistencia térmica de sus esporas
• tolerancia de Eh relativamente elevados
• Las células vegetativas son muy sensibles a la refrigeración y
congelamiento
• Produce 13 tipos de toxinas diferentes, pero se clasifica respecto de
4 de ellas.
Tipado de C. perfringens
Tipo de C. perfringens
Toxinas producidas
Alfa
Beta
Epsilon
Iota
Fosfolipasa C
Toxina
necrosante
▲
permeabilidad
vascular
necrótica y ▲
permebilidad
vascular
+
-
-
-
B
+
+
+
-
C enteritis necrótica
+
+
-
-
D
+
-
+
-
E
+
-
-
+
A
intoxicación alimentaria
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Tolerancia a los métodos de conservación
• Carne a ebullición puede sobrevivir más de 1h.
• La cocción incompleta (20 min a 70-80 oC) induce la
germinación de las esporas de C. perfringens A.
• Crece entre 6 y 50 oC (Temp. óptima a 43-45 oC)
Reservorio
• investigaciones recientes demostraron que <5 % de un gran
número de aislamientos tenían el gen cpe responsable de la
intoxicación.
Síntomas de la intoxicación
• aparecen a las 8-24h después de la ingestión del
alimento y se resuelven espontáneamente en 12-24h.
• Típicamente las victimas padecen
– Diarrea
– espasmos o retortijones abdominales intensos
– no suele haber ni vomito ni fiebre.
Esquema
alimento altamente contaminado por Cp las
células vegetativas
mueren en el HCl del estomago pero un
numero sobrevive debido a la alta densidad
en el intestino se multiplican y esporulan al
esporular expresan CPE
Enterotoxina (CPE), altera el transporte de
iones en el íleon y en el yeyuno.
Brotes de intoxicación alimentaria
• Los casos identificados ocasionan brotes
de gran magnitud generalmente
institucionales
Vehículos alimentarios
• Los alimentos cárnicos son los más
involucrados
Identificación del brote:
• encontrar más de 105 ufc/g de alimento contaminado
• demostrar más >106 esporas/g de heces del individuo
enfermo
• identificar el mismo serotipo capsular en todos los
individuos enfermos y en los alimentos
• se tiende a identificar la CPE (proteína del gen cpe) por
elisa
Dosis infecciosa
• Células en el alimento: >106-107 / g
Recuento de C. perfringens
Medio agar sulfito hierro cicloserina SIC-agar (Sulphite iron cycloserine)
Triptona
15g
Extracto de levadura
10g
Citrato ferrico
0.5g
Agar
15g
Agua destilada
1l
Esterilizar 121oC 20 min
Agregar a 50oC
10ml solución de sulfito sodico al 5% recién preparada.
10ml solucion de D-cicloserina al 4% (da selectividad inh. Otros grupos) (ambas esterilizadas por filtración)
Se prepara un macerado del alimento con un diluyente que contiene cisteína y se realizan diluciones seriadas. se
agrega 1 ml de las mismas a tubos con tapa rosca y se agrega 10ml del agar sic y una vez que solidifico se agrega una capa
del mismo agar de unos 3 cm y se incuba a 46oC durante 14-18 horas. Contar el número de colonias negras con halo negro y
calcular las ufc/g de alimento.
Identificación de los aislamientos:
Tubos CP para C. perfringens
Capa inferior con medio SIC
Capa central agar acuoso (20 g agar en un litro de agua)
Capa inferior agar SIM (sin sal ferrosa)
SIM sulfuro indol mobilidad (sulphide indole motility)
Triptona
20g
Peptona de soja
6g
Sulfato amonico ferroso
0.2g
Tiosulfato sodico
0.2g
NaCl
5g
Agar
3.5g
Agua destilada
1 litro
Se toman unas colonias bien aisladas de los tubos SIC y se inocula por punción a lo largo de un tubo CP, se incuban de
16-18 h a 46 oC.
Positivo: la capa inferior es muy negra, mientras que la movilidad y la producción de indol son negativas.
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• Clostridium perfringens
• Confirmación:
•
•
•
•
•
•
•
•
Sulfitos reductores anaerobios positivos:
Tomar 5 colonias:
GRAM: bacilos cortos y delgados GRAM +
Licuefacción de gelatina: +
Nitrato:+
Movilidad: Lactosa: acido y gas (+)
Lecitinasa: +
Germinación de esporas de Clostridios sulfito-reductores. Se observa un
crecimiento confluente que impide el recuento. El agar se ha resquebrajado
y elevado con motivo de la formación de gas.
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CAA
Si bien se considera obligatorio el análisis de clostridios sulfitos reductores en aguas
de consumo y de preparación de alimentos. El CAA en su Artículo 720bis - (Res. 305,
26.03.93) resuelve las siguientes exigencias microbiológicas: las pastas frescas
rellenas se denominarán entre otras denominaciones: cappellettis, ravioles, panzottis,
tortellettis, agnolottis, de acuerdo a sus características.
Responderán a las siguientes exigencias microbiológicas:
S. aureus coagulasa positiva: menor de 103 UFC/g.
Clostridium. sulfito reductores: menor de 103 UFC/g. y
Salmonella: ausencia en 25g".
VIANDAS A DOMICILIO
Además deberán cumplir con las siguientes especificaciones microbiológicas:
Escherichia coli: ausencia en 5 g. de muestra.
Staphylococcus aureus: ausencia en 1 g. de muestra.
Salmonella: ausencia en 50 g. de muestra.
Clostridium perfringens: ausencia en 50 g. de muestra
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Preguntas ?
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