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VÍA OXIDATIVA DE PRODUCCIÓN DE NITRATO
BAJO CONDICIONES DE NUTRICIÓN AMONIACAL
EXCLUSIVA EN PLANTAS CRECIDAS EN CULTIVO
AXÉNICO
Ana María Villarroel Dávila
Pamplona, septiembre 2010
PRESENTACIÓN
Título del trabajo:
“Vía oxidativa de producción de nitrato bajo condiciones de nutrición amoniacal
exclusiva en plantas crecidas en cultivo axénico”
Autor: Ana María Villarroel Dávila.
Tutores:
Dr. José Fernando Morán Juez.
Estibaliz Urarte Rodríguez
Grupo de Fisiología Vegetal y Agrobiología
Centro donde se ha realizado el trabajo:
Instituto de Agrobiotecnología
Universidad Pública de Navarra- CSIC-Gobierno de Navarra
Campus de Arrosadía s/n
31192. Mutilva. Navarra.
Palabras clave: Amonio, estrés abiótico, nitrato, nitrificación, nutrición, nutrición
nitrogenada, radicales libres, tolerancia al amonio.
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AGRADECIMIENTOS
Agradezco profundamente a mis padres por todo el apoyo brindado durante toda mi vida, a
mis hermanas cuñados y sobrinos que han estado siempre pendientes de mí.
Agradezco al Gobierno de la República del Ecuador y a la Secretaría Nacional de Ciencia y
Tecnología SENACYT por la beca recibida para obtener el título de Máster en
Agrobiología Ambitenal.
Agradezco a mi tutor por su guía y apoyo en la realización de este trabajo y a todos mis
amigos del laboratorio que con ellos fue mucho más fácil y enriquecedor éste proceso.
3
RESUMEN
La actividad agrícola intensiva ha generado un alto porcentaje de suelos y acuíferos
afectados por lixiviaciones de nitratos y otros compuestos provenientes de la fertilización
nitrogenada. Dada esta problemática, es importante el estudio de aspectos fisiológicos de la
planta que aporten datos relacionados con la nutrición mineral, para plantear nuevas
estrategias de fertilización por medio de las cuales se optimice la absorción de nitrógeno
por la planta, siendo así menor su impacto sobre el agroecosistema. Dentro de este
contexto, en la presente investigación se buscó estudiar las rutas de nitrificación y los
compuestos intermediarios que participan en este proceso en plantas de Arabidopsis
thaliana y Pisum sativum, bajo nutrición amoniacal exclusiva. Se estableció un medio de
cultivo axénico para el desarrollo de las plantas en condiciones de esterilidad y se realizó
un análisis morfológico de su crecimiento. Asimismo, se realizaron ensayos para identificar
compuestos intermediarios de la oxidación del amonio in vitro. Las concentraciones de
amonio (NH4+) aplicadas (1 y 5mM) provocaron una disminución en el crecimiento y
desarrollo de A. thaliana. En los tejidos de la parte aérea se identificó la presencia de nitrato
(NO3-), nitrito (NO2-) e hidroxilamina (NH2OH), considerándose así posibles intermediarios
en el metabolismo del amonio en A. thaliana. En el cultivo de P. sativum no se observaron
diferencias en el crecimiento en los diferentes tratamientos de amonio aplicados. Los
compuestos intermediarios identificados en esta especie únicamente fueron NO3- y NO2-.
Además, las reacciones de nitrificación in vitro realizadas indicaron que ciertos niveles de
NO2- y NH2OH pueden ser producidos de modo no enzimático; sin embargo, parece que la
presencia de compuestos como la xantina, la xantina oxidasa, la Fe-superóxido dismutasa y
algunas hemoglobinas, induce la formación de estas especies de nitrógeno oxidadas.
En conclusión, los resultados obtenidos sugieren la existencia de una vía de
oxidación del amonio dentro de las células vegetales, hecho que hasta ahora se atribuía
exclusivamente a algunos organismos procariotas. No obstante, son necesarios estudios
complementarios para llegar a comprobar de manera fehaciente esta hipótesis.
4
ABSTRACT
Intensive agricultural activity has generated the affection of a high percentage of land and
aquifers by lixiviation of nitrates and other compounds from derived from nitrogen fertilization. It is
important to study the physiological features related to mineral nutrition that would contribute to
establish new fertilization strategies to optimize nitrogen intake by plants. These findings would
help reduce the nitrogen fertilization impact on the agroecosystem. The purpose of this research
project was to find a possible nitrification pathway and the intermediate products of such
hypothetical process in plants of Arabidopsis thaliana and Pisum sativum grown under ammonium
nutrition. Axenic culture was used in order to grow the plants in sterile conditions. Furthermore, a
series of in vitro assays were developed in order to identify possible by-products of oxidation of
ammonium.
The ammonium (NH4+) concentration applied (1 and 5mM) proved to have an effect by
-
-
diminishing of the growth of A. thaliana. The presence of nitrate (NO3 ), nitrite (NO2 ) and
hydroxylamine (NH2OH) were detected in the shoots; therefore, these were considered products of
the ammonium metabolism in A. thaliana. For P. sativum there was no growth difference under the
different treatments of ammonium applied. The products that were identified in this specie were
NO3- and NO2-. Furthermore, the in vitro reactions showed that some levels of NO2- and NH2OH
could be produced by a non-enzymatic pathway. However, the presence of some compounds such
as xanthine, xanthine oxidase, Fe-superoxide dismutase and plant haemoglobins might induce the
formation of the oxidized nitrogen species.
In conclusion, the results obtained from these assays suggest the existence of an ammonium
oxidation pathway within plant cells. This route has been exclusively attributed to some prokaryote
organisms until now. Despite this, it is necessary to make complementary studies to support this
hypothesis.
5
ÍNDICE
PRESENTACIÓN .............................................................................................................................. 2
RESUMEN ...................................................................................................................................... 3
ABSTRACT ...................................................................................................................................... 5
ÍNDICE ........................................................................................................................................... 6
1.
INTRODUCCIÓN...................................................................................................................... 9
1.1 Impacto ambiental de fertilizantes nitrogenados .............................................................. 10
1.2 Nutrición amoniacal: Importancia y mecanismos de tolerancia......................................... 13
1.3 Vía de nitrificación en plantas ........................................................................................... 16
2.
OBJETIVOS ........................................................................................................................... 19
3.
MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 20
3.1 Reactivos y material biológico utilizado ............................................................................ 20
3.2 Condiciones de crecimiento de las plantas........................................................................ 20
3.2.1 Esterilización de las semillas ..................................................................................... 20
3.2.2 Siembra y mantenimiento del material vegetal ......................................................... 21
3.2.3 Medio de cultivo control (Murashigue y Skoog, 1962) ............................................... 21
3.3 Tratamientos .................................................................................................................... 23
3.3.1 Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N. ....................... 23
3.3.2 MS suplementado con K+ (40mM) ............................................................................. 24
3.3.3 MS suplementado con K+ (40mM) y con Mg2+ (5mM) ................................................ 24
3.3.4 MS con L-glutamina como fuente de N ..................................................................... 25
3.3.5 Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro ............................................. 25
3.3.6 Medio Rigaud y Puppo con sacarosa ......................................................................... 26
3.4 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática .................................................... 26
6
3.4.1 Oxidación de NH4+..................................................................................................... 26
3.4.2 Oxidación de NH3 a pH alcalino ................................................................................. 27
3.4.3 Oxidación de NH3 neutralizado ................................................................................. 28
3.4.4 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 1 ............................................................ 29
3.4.5 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 2 ............................................................ 30
3.5 Análisis de iones por cromatografía iónica ........................................................................ 31
3.5.1 Cosecha del material y extracción ............................................................................. 31
3.5.2 Cálculos y cuantificación ........................................................................................... 32
3.6 Estudio morfológico ......................................................................................................... 32
3.7
4.
Análisis estadístico ........................................................................................................... 33
RESULTADOS ........................................................................................................................ 34
4.1 Producción de nitrato y otros compuestos intermediarios de N en el metabolismo oxidativo
del amonio en plantas. ............................................................................................................. 34
4.1.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana ................................................................................. 34
4.1.2 Cultivo de Pisum sativum .......................................................................................... 36
4.2 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática .................................................... 38
a)
Nitrificación a partir de NH4+ ..................................................................................... 39
b)
Nitrificación a partir de NH3 a pH alcalino ................................................................. 39
c)
Nitrificación a partir de NH3 neutralizado .................................................................. 40
d)
Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 1............................................. 42
e)
Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 2............................................. 43
4.3 Estudio morfológico ......................................................................................................... 44
4.3.1 Tratamiento control: Medio MS normal (A.thaliana)................................................. 44
4.3.2 Tratamiento 1: Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N
(A.thaliana). ......................................................................................................................... 44
4.3.3 Tratamiento 2: Medio MS suplementado con K+ (40 mM) (A.thaliana). ..................... 46
7
4.3.4 Tratamiento 3: MS suplementado con K+ (40 mM) y Mg2+ (5 mM) (A.thaliana). ........ 47
4.3.5 Tratamiento 4: MS con L-glutamina como fuente de N (A.thaliana). ......................... 49
4.3.6 Tratamiento 5: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro sin sacarosa
(A.thaliana). ......................................................................................................................... 50
4.3.7 Tratamiento 6: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro con sacarosa
(A.thaliana). ......................................................................................................................... 51
4.3.8 Análisis morfológico (P. sativum). ............................................................................. 53
4.4 Análisis estadístico de biomasa total ................................................................................ 54
4.4.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana ................................................................................. 54
4.4.2 Cultivo de Pisum sativum .......................................................................................... 55
5.
DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 57
5.1 Producción de nitrato y otras especies intermediarias del metabolismo oxidativo del
amonio en plantas ................................................................................................................... 57
5.2 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática .................................................... 61
5.3 Estudio morfológico ......................................................................................................... 64
6.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS .......................................................................................... 73
7.
BIBLIOGRAFÍA....................................................................................................................... 75
8
1. INTRODUCCIÓN
La investigación en el área agrícola y ambiental se ha intensificado en los últimos
años por las graves condiciones medioambientales actuales y las necesidades que han
surgido en el área de seguridad alimentaria. Así, el estudio de la nutrición de las especies
vegetales tiene gran importancia y dentro de este contexto ha sido el nitrógeno por
excelencia el elemento clave para regular el desarrollo de la mayoría de las especies
agrícolas cultivadas. El nitrógeno (N) es el nutriente más limitante de la producción
primaria neta en ecosistemas terrestres (Boring et al., 1988), de ahí que el rol que juega sea
esencial dentro del ciclo de nutrientes de la Tierra.
La aplicación de fertilizantes nitrogenados para una producción agrícola óptima se
ha convertido en necesaria; sin embargo, uno de los riesgos de la agricultura intensiva es
que parte del nitrógeno aplicado se puede perder, yendo a localizarse en los acuíferos y en
la atmósfera. Del nitrógeno aplicado a los cultivos solamente un 10-50% suele ser
absorbido por las plantas, mientras que el 50-90% restante se lixivia a las aguas
subterráneas y superficiales o puede también perderse en forma gaseosa (González-Murúa
et al., 2004). En cuanto a las pérdidas por lixiviación, existe una evidente relación entre la
cantidad de nitrógeno fertilizante utilizado en la agricultura intensiva y la contaminación de
los acuíferos por nitratos. Esto ha hecho que la legislación haya obligado a la declaración
de “zonas vulnerables”, en las cuales se controla la cantidad de fertilizante aplicado a los
cultivos, con sanciones en caso de sobrepasar las dosis permitidas.
En cuanto a las pérdidas gaseosas, se calcula que la agricultura es la responsable de
aproximadamente 2/3 de la emisión total de amoniaco (NH3) a la atmósfera, de más de 1/3
de las emisiones de N2O, y de alrededor de 1/4 de las emisiones de óxido nítrico (NO).
Estos gases tienen numerosos efectos negativos sobre el medio ambiente, como la
eutrofización de ecosistemas una vez depositados en forma seca o húmeda (NH3 y NO) y el
calentamiento global de la atmósfera (N2O) (Estavillo et al., 1996).
9
Dados estos problemas medioambientales derivados de la aplicación de fertilizantes
nitrogenados, se han desarrollado nuevos estudios en búsqueda de un sistema de agricultura
sostenible en donde se utilicen nuevas alternativas para la alta productividad en cultivares
agrícolas con un mínimo impacto ambiental. Para esto es de interés el desarrollo de nuevos
fertilizantes que puedan ser aplicados en dosis razonables y que su aporte de nitrógeno sea
altamente eficiente, para lo cual es necesario conocer los procesos relacionados con la toma
de este elemento por las especies vegetales de uso agrícola.
1.1
Impacto ambiental de fertilizantes nitrogenados
El alarmante incremento de la contaminación de suelos, aguas subterráneas y
acuíferos por nitratos en los últimos años ha provocado que la legislación ambiental
establezca controles sobre la actividad agrícola, por ser ésta la mayor actividad
antropogénica que contribuye a este tipo de daño ambiental.
Es bien sabido que las sales de nitrato son muy solubles, y la posibilidad de que se
produzca la lixiviación del anión es elevada, más teniendo en cuenta el bajo poder de
adsorción que presentan la mayoría de los suelos para las partículas cargadas
negativamente. El problema ambiental más importante relativo al ciclo del nitrógeno es la
acumulación de nitratos en el subsuelo que, por lixiviación, pueden incorporarse a las aguas
subterráneas o bien ser arrastrados hacia los cauces y reservorios superficiales. En estos
medios los nitratos también actúan como fertilizantes de la vegetación acuática, por lo que
si se concentran puede originarse la eutrofización del medio. En estas condiciones, se
produce la proliferación de especies como algas y otras plantas verdes en áreas
superficiales. Esto trae como consecuencia un elevado consumo de oxígeno y su reducción
en el medio acuático, así mismo dificulta la incidencia de la radiación solar por debajo de la
superficie (Rodríguez y Gallardo, 2004).
La lixiviación de nitratos hacia el subsuelo puede contaminar los acuíferos
subterráneos, creando graves problemas de salud si se consume agua rica en nitratos,
10
debido a que al ingresar en el organismo puede transformarse en nitritos por bacterias
presentes en el tracto digestivo. A su vez, los nitritos pueden transformarse en compuestos
cancerígenos como las nitrosaminas que pueden causar daños al estómago e hígado.
Por estos antecedentes, la gestión del nitrógeno en la explotación agraria debe
referirse a decisiones sobre fertilización mineral y orgánica y al empleo de fiemos y purines
procedentes de explotaciones ganaderas basados en análisis y estudios que sustenten la
sostenibilidad de dicha actividad, considerando que la fertilización nitrogenada es un
problema complejo en el que intervienen aspectos técnicos, económicos y ambientales. El
ciclo del nitrógeno en las parcelas es un aspecto del ciclo del nitrógeno en la naturaleza
(Fig. 1). Depende de la técnica de fertilización y de otros aspectos agronómicos y
ambientales. Si se relacionan las variables de flujo y fondo que intervienen en el ciclo del
nitrógeno en las parcelas cultivadas, se puede observar la cantidad de variables que
intervienen y la complejidad del proceso (Wiederholt y Johnson, 2005).
Figura 1. Ciclo de nitrógeno en la atmósfera (Wiederholt y Johnson, 2005)
Dados los problemas ocasionados por la fertilización nitrogenada, se han planteado
posibles estrategias para mitigar la contaminación de las aguas por nitratos, siendo el
principal objetivo ajustar el aporte de fertilizante a la demanda del cultivo. Así, las
11
estrategias que favorezcan una mayor eficiencia en la asimilación del nitrógeno por el
cultivo reducirían la cantidad que podría ser potencialmente lixiviada a los acuíferos o
emitida a la atmósfera. En este sentido, el reto para la comunidad científica es afrontar el
problema mediante el desarrollo de prácticas agrícolas mejoradas que puedan ser adoptadas
por los agricultores.
Esto se podría conseguir, siempre que fuera factible, mediante la adopción de
prácticas de mínimo laboreo que reduzcan la tasa de mineralización de la materia orgánica
del suelo, así también la rotación de cultivos y el uso de cultivos intercalares que reciclaran
el nitrógeno más eficientemente. Otra estrategia sería la de fertilización flexible basada en
la producción estimada mediante modelos que incorporen la predicción de la precipitación
para la época de crecimiento del cultivo, el desarrollo de fertilizantes o productos accesibles
económicamente que reduzcan la nitrificación o aumenten la retención del nitrógeno en la
zona de la raíz, el desarrollo de nuevos cultivares de plantas que aumenten la captura de
agua y nutrientes, el desarrollo de sistemas de apoyo a la decisión de la fertilización
basados en información sobre el cultivo y el suelo y que pueda ser adquirida rápidamente y
de forma barata, y también la agricultura de precisión con tecnología que facilite la
aplicación de dosis variables de semillas y fertilizantes según las necesidades (GonzálezMurúa et al., 2004).
De esta manera, para alcanzar dichas estrategias sería necesario conocer los
procesos del ciclo del nitrógeno lo suficiente como para postular con cierta confianza que
cada una de estas prácticas probablemente reduciría la contaminación de las aguas y las
emisiones gaseosas de este elemento, por lo que se está estudiando la eficiencia en la
utilización del N desde distintos aspectos: determinando el efecto del laboreo de las
praderas en las emisiones de N2O, estudiando el efecto de la rotación de cultivos forrajeros
y de la incorporación de residuos vegetales como abono verde en la reducción de las
pérdidas de N por lixiviación y gaseosas, determinando la dosis óptima de aplicación de
fertilizante, y sobre todo profundizando en el metabolismo del nitrógeno de las plantas con
la finalidad de obtener nuevas variedades que utilicen el N de forma más eficiente. La
aplicación de todas estas estrategias no sólo influiría en la reducción de la contaminación de
12
las aguas y de la atmósfera, sino que conllevaría también un efecto sobre la producción y la
calidad de los productos vegetales obtenidos (Hart et al., 1994).
1.2
Nutrición amoniacal: Importancia y mecanismos de
tolerancia
Dada la problemática actual del exceso de nitrógeno en el ecosistema y la búsqueda
de mejora en las herramientas agrícolas de fertilización nitrogenada, el tema de las especies
de nitrógeno que pueden ser tomadas por la planta tiene gran importancia. En este contexto
la nutrición amoniacal podría jugar un papel clave para mejorar la eficiencia de toma de
nitrógeno por las plantas.
El nitrógeno se encuentra en el suelo predominantemente como amonio (NH4+) o
nitrato (NO3-). Las condiciones químicas y físicas del suelo así como los factores bióticos
determinan cual de las dos formas predomina (Haynes y Goh, 1978; Blacquiére et al.,
1983). Las tasas de absorción relativas de NO3- y NH4+ por las plantas superiores son
influenciadas por diversos factores tales como la proporción de NO3- y NH4+ en la solución
de crecimiento, el pH, la temperatura, la intensidad de luz, y la concentración de
carbohidratos (Marschner, 1995). La respuesta de las especies plantas o cultivos a nitrato o
amonio tiene gran variación, algunas crecen mejor con amonio y otras especies con nitrato.
Se ha visto que algunas herbáceas y juncos miembros de la familia Ericaceae (Ellenberg,
1977) y algunos árboles de coníferas crecen más rápido bajo nutrición amoniacal (Bigg y
Daniel, 1978). En algunas especies vegetales se ha demostrado que la nutrición amoniacal
tiene gran importancia. Se ha podido determinar que la eficiencia de absorción de nitrógeno
por plantas que recibieron únicamente NH4+ fue 70% superior a la eficiencia mostrada por
plantas que recibieron exclusivamente NO3- (Cruz et al., 2006). Otras especies, en los
mismos estudios, incluyendo algunas coníferas, crecieron mejor con nitrato. La respuesta
en los experimentos de laboratorio a menudo es concordante con lo que sucede en algunas
especies en el campo, donde pueden haberse llegado a adaptar a cualquiera de las formas de
nitrógeno.
13
Al comparar el efecto de esas dos fuentes de nitrógeno, ha sido observado que el
crecimiento es mayor cuando la solución del suelo contiene una mezcla de los dos iones. Se
ha establecido también que el NH4+, cuando es administrado en grandes proporciones,
puede generar problemas de toxicidad y reducir el crecimiento, y por ende la productividad
de los cultivos (Britto y Kronzucker, 2002). Para algunos cultivos, el efecto negativo del
NH4+ sobre el crecimiento ha sido atribuido a la necesidad de utilizar los carbohidratos
producidos prioritariamente para la rápida asimilación del amonio absorbido para evitar su
acumulación y consecuentemente problemas de toxicidad, alteración del pH celular y
desequilibrio iónico (Lewis et al., 1989). Otro aspecto relacionado a la reducción del
crecimiento ha sido la asociación de ese ion con una tasa fotosintética menor en plantas, lo
cual provoca un descenso en el rendimiento del cultivo.
La forma de nitrógeno utilizado por una planta puede afectar a su morfología y su
composición química. El amonio puede provocar bajas concentraciones de K, Ca, Mg y
altas de P, S y N orgánico (Ganmore-Neumann y Kafkafi, 1980; Gashaw y Mugwira,
1981). Sin embargo, la nutrición amoniacal bien suministrada puede convertirse en una
herramienta eficaz para mejorar la toma de nitrógeno en plantas, partiendo del hecho de que
la asimilación de N por la absorción de la forma amoniacal es más rápida (Cramer y Lewis,
1993). Algunos trabajos con ciertas especies vegetales han demostrado las ventajas de la
nutrición amoniacal. Se ha observado que plantas de soja cultivadas exclusivamente con
NH4+ pueden presentar mayor actividad fotosintética como resultado del mantenimiento de
la conductancia estomática y del aumento de la concentración de enzimas relacionadas a la
bioquímica de la fotosíntesis (Raab y Terry, 1994).
Se han efectuado varios estudios de este tipo, como por ejemplo la comparación
entre espinaca (Spinacea oleracea), especie sensible, con guisante (Pisum sativum), especie
tolerante, donde los resultados demuestran que en guisante existe una mejor regulación de
la absorción del amonio en las raíces y un control de los niveles de amonio, sobre todo en
los tejidos de las hojas (Ariz, 2009). Además, se observan modificaciones de importancia
en la relación de carbono y nitrógeno (C/N) de los aminoácidos mayoritarios como la
asparragina (Asn) en el guisante y la glutamina (Gln) en la espinaca, lo que indica una
14
regulación diferente en la relación C/N (Ariz et al., 2010). Con respecto a las actividades de
las enzimas glutamina sintetasa (GS) y glutamato deshidrogenasa (GDH), principales
responsables de la asimilación del amonio, no se modifican en concentraciones moderadas
de esta sustancia en el guisante, pero sí en la espinaca. En cuanto a las principales
modificaciones metabólicas, éstas tienen lugar en la raíz en el caso del guisante, y en las
hojas en el de la espinaca. Además, en las raíces del guisante se han observado
modificaciones morfológicas, que podrían ser indicio de adaptaciones para asimilar el
amonio sin modificar sus procesos internos (Domínguez-Valdivia et al., 2008).
Varios mecanismos de tolerancia a la nutrición por amonio pueden estar
relacionados con la habilidad para regular los contenidos internos de amonio en la raíz de
las plantas. La actividad de la GS en las raíces se incrementa durante la nutrición con
nitrato o amonio, pero con particular incremento en el último. Existen dos formas distintas
de GS1 citosólicas compuestas por polipéptidos con similar tamaño, pero diferente carga.
El análisis de la secuencia de genes de GS ha establecido que son dos isoformas que
expresan productos que regulan los altos niveles de nitrógeno inorgánico por aplicación en
la raíz, y sobre todo son productos expresados en las raíces laterales (El Omari et al., 2009).
Los últimos trabajos que se han realizado mencionan la tolerancia al amonio como
un mecanismo que genera una reducción de la producción de biomasa, ya que el ciclo transmembrana de la toma de NH4+ y su eflujo en las células de la raíz puede acarrear un alto
coste energético, por lo que se dan los efectos de menor desarrollo de la planta (Britto et al.,
2001; Britto y Kronzucker, 2002). Sin embargo no se ha llegado a un consenso en cuanto a
los rasgos que confieren la tolerancia de NH4+ en una planta, dependiendo esto de la
especie vegetal. Así, por ejemplo, se ha establecido que el guisante muestra tolerancia a
NH4+ como fuente única de nitrógeno, sin embargo entre variedades de la misma especie
existen diversas respuesta a esta tolerancia (Domínguez-Valdivia et al., 2008).
También existen estudios recientes donde la tolerancia de NH4+ está dada en gran
medida por la disponibilidad energética la cual puede venir dada en forma de esqueletos
carbonados provenientes de la fotosíntesis (Ariz et al., 2010). También, la interacción entre
15
C y N muestran diferentes niveles de complejidad en el control y la señal a través de los
compartimientos celulares donde el balance C/N juega un papel primordial, e influye a la
fisiología de los órganos de la planta determinando ratios entre hojas y raíz (Viktor y
Cramer, 2005).
De esta manera, se han establecido algunas ideas sobre los mecanismos de
tolerancia a la forma amoniacal del nitrógeno en algunas especies vegetales, así como la
identificación de otras especies sensibles y los posibles beneficios que tiene la aplicación o
asociación de técnicas de nutrición amoniacal en plantas.
1.3
Vía de nitrificación en plantas
Con los datos mencionados sobre el estudio y la importancia de la nutrición
amoniacal y los mecanismos de tolerancia por parte de las plantas, se ha profundizado más
en el estudio del metabolismo del N en plantas, específicamente en l vía de nitrificación.
Este proceso biológico tiene una gran importancia en el área ambiental y agrícola como ya
ha sido mencionado. Consiste en la oxidación de amonio a nitrito (NO2-), y de nitrito a
nitrato (NO3-). La nitrificación puede tener lugar en condiciones aerobias aunque, algunos
microorganismos anaerobios pueden contribuir a la nitrificación en condiciones de anoxia,
mediante la llamada vía Annamox. La vía de la nitrificación aerobia puede implicar la
formación de especies intermedias como son la hidroxilamina (NH2OH ó HA), el NO2- y
también, el NO, el NO3- o el N2O4 (Subbarao et al., 2007).
La presencia de una vía de nitrificación ha podido identificarse en pocas especies
vegetales de la familia de las leguminosas, todas ellas sin importancia agronómica (Hipkin
et al., 2004). No se ha descrito nitrificación en ninguna otra especie de leguminosa de
interés agronómico o en plantas no leguminosas. En varios trabajos de investigación, sin
embargo, se muestra que las células vegetales son capaces de oxidar HA añadida
exógenamente a NO o NO2- en presencia de oxígeno (Rümer et al., 2009). Asimismo, se ha
visto también que ciertas hemoglobinas vegetales están involucradas en el proceso
participando en la eliminación de NO, produciendo NO3- (Dordas et al., 2003). Sin
16
embargo, aún es necesario elucidar el sentido fisiológico de dicha vía oxidativa y si la
ciertamente la oxidación completa desde amonio a nitrato tiene lugar en las células
vegetales o si hay participación bacteriana en el proceso.
En animales y bacterias existen hasta 3 formas de NO sintasa (NOS), enzima que
produce NO a partir del aminoácido L-arginina. Existe numerosa bibliografía sobre la NOS
en plantas, y varios artículos llegan a presentar su descubrimiento. Sin embargo, todavía no
existe constancia concluyente de una NO sintasa en plantas. En la actualidad, se conocen
varios sistemas de síntesis de NO en plantas (Planchet et al., 2005). Según algunos estudios
basados en la identificación como subproducto de la NOS a partir de L-arginina, no se ha
podido rechazar la evidencia de la presencia de este compuesto en plantas. La identificación
de la NOS en peroxisomas aislados de hojas de guisante brinda también un gran adelanto
para entender cuáles pueden ser los orgánulos celulares implicados en procesos de
señalización. Sin embargo, aún es necesario ampliar los estudios en cuanto la identificación
y caracterización molecular de la enzima responsable de esta actividad para demostrar
finalmente su presencia y funcionamiento en plantas (Corpas et al., 2009).
Por otro lado, se ha considerado que las concentraciones de NO en plantas siempre
son más bajas que las producidas por las bacterias circundantes en condiciones de campo
(Meyer et al., 2005). También sería muy interesante conocer el sentido fisiológico de la
ausencia o las muy bajas concentraciones de enzimas del tipo NOS en vegetales, así como
conocer en qué momento evolutivo las plantas perdieron los genes codificantes y la
significación biológica de ese hecho.
Actualmente, en nuestro grupo de investigación se han realizado estudios con varias
especies vegetales como alfalfa (Medicago sativa) o guisante (Pisum sativum), donde se ha
probado la producción NO2- y NO3- a partir de amonio, y se han determinado compuestos
intermediarios (comunicación personal). Sin embargo, sería muy interesante obtener
información sobre otros sistemas de cultivo donde se compruebe la única intervención de la
plantas en estos procesos eliminando la contaminación por bacterias, como es el caso del
cultivo in vitro de tejidos, mediante el cual se realiza el crecimiento del vegetal en
17
condiciones de asepsia. Es fundamental el uso de actuales herramientas de la biología
molecular de las que se dispone, así como las bases de datos genómicas, por lo que la
selección del tipo de organismo de estudio debe ser seleccionado en función de un criterio
de fácil estudio a nivel molecular.
De esta manera el estudio sobre las vías de nitrificación en plantas entendido desde
el punto de vista fisiológico y sus mecanismos en las plantas es una herramienta importante
para diseñar nuevos planes para mejorar la utilización de N como elemento nutritivo en
suelos. Así, se podrán diseñar nuevas estrategias de nutrición amoniacal que compensen los
requerimientos de este importante elemento en los tejidos vegetales contribuyendo a la
disminución de fertilizantes nitrogenados que han causado grave daño ambiental en
agrosistemas como ya se ha mencionado a detalle en la exposición del impacto ambiental.
Dentro de este contexto, el estudio sobre vías de nitrificación en plantas de
Arabidopsis thaliana en cultivo axénico con aplicación de amonio como única fuente de
nitrógeno, como se propone en el siguiente trabajo de investigación, aportaría gran
información para el estudio del ciclo del nitrógeno en plantas, y podría servir para encontrar
nuevas técnicas de nutrición vegetal sostenibles, el cual es el objetivo primordial de la
problemática de contaminación por nitrógeno planteada.
18
2. OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo de investigación es el estudio de la vía oxidativa de
producción de nitrato en plantas de Arabidopsis thaliana L. y Pisum sativum L. cultivadas
in vitro bajo nutrición amoniacal exclusiva.
Este objetivo general será abordado a través de los siguientes objetivos específicos:
-
Estudio de la producción de nitrato y otros compuestos intermediarios del
metabolismo oxidativo del amonio en plantas.
-
Estudio bioquímico de la vía no-enzimática de oxidación de amonio mediante
reacciones in vitro.
-
Establecimiento del cultivo in vitro bajo nutrición amoniacal para Arabidopsis
thaliana y Pisum sativum.
-
Análisis morfológico de Arabidopsis thaliana y Pisum sativum crecidos con amonio
como única fuente de nitrógeno.
19
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1
Reactivos y material biológico utilizado
Los reactivos utilizados en los ensayos fueron suministrados por Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO, USA). El agua empleada fue en todos los casos destilada ultrapura, y
se obtuvo a través de un sistema Milli-Q (Wasserlab). Las columnas de cromatografía de
5ml (His Trap Chelating) fueron suministradas por GE Healthcare (Uppsala, Sweden). Las
especies vegetales utilizadas fueron Arabidopsis thaliana L. (cv. Columbia, silvestre–col) y
Pisum sativum L. (cv Sugar Snap).
3.2
Condiciones de crecimiento de las plantas
3.2.1 Esterilización de las semillas
Las semillas de A. thaliana se esterilizaron mediante el protocolo de desinfección de
material para cultivo in vitro en condiciones estériles en cabina de flujo laminar. Se
colocaron las semillas durante 2 min en una solución de etanol al 70%, posteriormente se
retiró el etanol y se añadió hipoclorito sódico al 1% con tres gotas de tween durante 8 min.
Finalizado el tiempo, se retiró la solución de hipoclorito sódico y se realizaron tres lavados
con agua milli-Q estéril. Posterior al proceso de esterilización se almacenaron las semillas
en agua estéril durante 2 ó 3 días en cámara fría oscura para sincronizar el proceso de
germinación.
La desinfección de las semillas de guisante se realizó siguiendo del protocolo de
Labhilili et al. (1995), en condiciones estériles en cabina de flujo laminar. Se colocaron las
semillas en una solución de 1% de hipoclorito de sodio con 0,01% de SDS durante 40 min.
Transcurrido el tiempo se lavaron las semillas con agua destilada estéril, posteriormente se
colocó una solución de ácido clorhídrico 0,01N durante 10 min. Se realizó un lavado de las
20
semillas con agua destilada estéril y finalmente se mantuvieron en agua destilada durante
45 min para posteriormente proceder a la siembra.
3.2.2 Siembra y mantenimiento del material vegetal
La siembra del material vegetal se realizó en cabina de flujo laminar con
micropipeta automática de 10 µl. Las puntas se cortaron a 5 mm de la base para que las
semillas pudieran ser tomadas y dispensadas con facilidad. Una vez cortadas se pulverizó
con abundante alcohol para esterilizarlas y se dejó evaporar por unos minutos.
Se tomaron las semillas con la micropipeta con un volumen de 10 µl del tubo
eppendorf previamente estériles. Se dispensó cuidadosamente las semillas, una por una,
sobre la placa petri o el frasco, colocándolas a un centímetro de distancia en un total de 10 a
12 semillas por placa. Finalmente se sello las placas con cinta leucopore y se colocó en la
cámara de crecimiento a una intensidad de luz de aproximadamente 80 µmol fotones m-2s-1.
Las plantas se crecieron durante un período de tres semanas, observando con períodos de
cuatro días su desarrollo.
3.2.3 Medio de cultivo control (Murashigue y Skoog, 1962)
Se elaboró el medio Murashige y Skoog o MS (1962) como cultivo base para el
crecimiento de A. thaliana. Se realizaron varias soluciones stock de 10x de macroelementos
y una de 500x de micronutrientes individuales como se muestran en las siguientes tablas:
Tabla 1. Contenido de macronutrientes de la solución stock 10x para la preparación del medio
Murashigue y Skoog.
Sales
NH4NO3
KNO3
MgSO4 7H2O
KH2PO4
Cantidad para 1L
de stock 10x (g)
16,5
19
3,7
1,7
Concentración
final 1x (mM)
20,61
18,79
1,50
1,25
21
Tabla 2. Contenido de micronutrientes de la solución stock 500x para la preparación del medio
Murashigue y Skoog.
Sales
MnSO4H2O
HBO3
ZnSO4 7H2O
KI
Na2MoO42H2O
CoCl26H2O
CuSO45H2O
Cantidad para 1L
de stock 500x (g)
0,845
0,310
0,430
0,0415
0,0125
0,0012
0,0012
Concentración
final 1x (mM)
0,10
0,10
29,91
5,01
1,03
0,11
0,10
-Solución de cloruro de calcio (Cl2Ca2H2O):
Para la solución de Cl2Ca2H2O se preparó una solución stock de 100x (6,55 g L-1)
para alcanzar una concentración final de 2,99 mM.
- Solución de Fe2Na-EDTA:
Para la solución de Fe2Na-EDTA se preparó una solución stock de 100x (3,67g L-1).
En el medio final la concentración final fue de 0,1mM
Finalmente para preparar el medio MS se siguió el siguiente protocolo ajustando el
pH a 5,8 antes de añadir el agar:
Tabla 3. Contenido final de los compuestos para el medio Murashigue y Skoog (1962)
Compuesto
Microelementos (10x)
Oligoelementos (500x)
Fe2Na-EDTA (100x)
Cl2Ca2H2O (100x)
Vitaminas (100x)
Sacarosa 3% (m/v)
Agar 0,8% (m/v)
Cantidad para
1L de medio
0,845
0,310
0,430
0,0415
0,0125
0,0012
0,0012
22
3.3
Tratamientos
Se realizaron seis tratamientos variando la composición del medio de cultivo base,
las cuales se presentan a continuación, conteniendo en cada tratamiento dos
concentraciones de sulfato de amonio (NH4)2SO4 como única fuente de nitrógeno. Los
medios de cultivo se autoclavaron durante 20 min a 120°C a 1 atm de presión y se
dispensaron en frascos y cajas estériles para asegurar las condiciones de asepsia de la
experimentación.
Tabla 4. Concentraciones de NH4+ como única fuente de N en cada tratamiento, aplicado como
sulfato de de amonio (NH4)2SO4.
Tratamiento
1 mM
5 mM
Cantidad para
1L de medio
0,066
0,33
3.3.1 Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de
N.
Se efectuó un cambio en la solución stock de macronutrientes sustituyendo las sales
que contenían nitrógeno en forma de nitrato para garantizar que la única fuente de
nitrógeno sea la añadida en forma de amonio. Se añadió 30 g de sacarosa, posteriormente se
ajustó el pH del medio final a 5,8 y finalmente se añadió 8 g de planta agar para gelificar.
Tabla 5. Contenido de la solución stock 10x de macronutrientes sustituidas las sales de nitrato,
siendo reemplazado el KNO3 por KCl.
Sales
KCl
MgSO4 7H2O
KH2PO4
Cantidad para 1L
de stock 10x (g)
2,8
3,7
1,7
Concentración
final 1x (mM)
3,7
1,50
1,25
23
3.3.2 MS suplementado con K+ (40mM)
Se incrementó la cantidad de potasio en la solución de macronutrientes del medio
base MS, añadiendo K2SO4 a la solución stock hasta alcanzar una concentración de 40 mM
en el medio final. Se añadió 30 g de sacarosa, posteriormente se ajustó el pH del medio
final a 5,8 y finalmente se añadió 8 g de planta agar.
Tabla 6. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes con suplemento de K+. Se
aumentó la concentración de KCl y se añadió K2SO4 hasta alcanzar 50 mM.
Sales
KCl
MgSO4 7H2O
KH2PO4
K2SO4
Cantidad para 1L
de stock 10x (g)
1,86
2,46
3,4
15,25
Concentración
final 1x (mM)
2,5
1
2,5
17,5
3.3.3 MS suplementado con K+ (40mM) y con Mg2+ (5mM)
La solución stock de macronutrientes fue preparada como la del tratamiento 2
(apartado 3.3.2) pero con incremento en la cantidad de MgSO4 7H2O hasta alcanzar una
concentración de 5 mM. Se añadieron 30 g de sacarosa, se ajustó el pH del medio final a
5,8 y finalmente se añadieron 8 g de agar.
Tabla 7. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes con suplemento de iones K+ e
iones Mg2+, aumentando la concentración de MgSO4 7H2O.
Sales
KCl
MgSO4 7H2O
KH2PO4
K2SO4
Cantidad para 1L
de stock 10x (g)
1,86
12,32
3,4
15,25
Concentración
final 1x (mM)
2,5
5
2,5
17,5
24
3.3.4 MS con L-glutamina como fuente de N
Se realizó una solución stock de micronutrientes sustituyendo las sales a igual que el
tratamiento 1 (apartado 3.3.1) y se colocó L-glutamina como fuente de nitrógeno
sustituyendo al (NH4)2SO4. Se añadieron 30 g de sacarosa, a continuación se ajustó el pH
del medio a 5, 8 y finalmente se añadió 8 g de agar.
Tabla 8. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes del medio base para la
aplicación de L-glutamina
Sales
KCl
MgSO4 7H2O
KH2PO4
Cantidad para 1L
de stock 10x (g)
2,8
3,7
1,7
Concentración
final 1x (mM)
3,7
1,50
1,25
En la solución final de 1x se añadieron 0,36 g de L-glutamina para alcanzar una
concentración final de 10 mM.
3.3.5 Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro
Se utilizó como tratamiento el medio Rigaud y Puppo (1975), utilizado para riego
en cultivo hidropónico, pero con modificaciones para ser utilizado en cultivo in vitro. Se
prepararon las sales como en el protocolo original y a la solución final se añadió 8 g de agar
para gelificar el medio. En este tratamiento no se añadió sacarosa y finalmente se ajustó el
pH final a 7.
Tabla 9. Contenido y concentración final de macronutrientes 1x para la preparación del medio
Rigaud y Puppo (1975).
Sales
K2HPO4
MgSO4 7H2O
KCl
CaSO4 2H2O
Na2Fe EDTA
Cantidad para 1L
final 1x (g)
0,2
0,2
0,2
0,12
0,025
Concentración
final 1x (mM)
1,15
0,812
2,68
0,69
0,053
25
Tabla 10. Contenido y concentración final de micronutrientes para la preparación del medio Rigaud
y Puppo (1975).
Sales
Na2MoO42H2O
FeCl3 6H2O
ZnSO47H2O
H3 BO3
MnSO4 H2O
CuSO4 5H2O
AlCl3 6H2O
NiCl2 6H2O
KI
Cantidad para 1L
final 1x (g)
4
1
1
1
0,08
0,03
0,05
0,03
0,01
Concentración
final 1x (mM)
0,016
0,0036
0,0034
0,016
0,00047
0,00012
0,00021
0,00012
0,00006
3.3.6 Medio Rigaud y Puppo con sacarosa
Se efectuaron medios con la misma composición que los del tratamiento 5 (apartado
3.3.5), gelificando la solución nutritiva Rigaud y Puppo. En este tratamiento se añadieron
30 g de sacarosa al medio y se ajustó el pH a 7.
3.4
Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática
Se realizaron varios ensayos in vitro para determinar la producción de nitrato, nitrito
e hidroxilamina en el laboratorio, mediante reacciones químicas, en los cuales se probaron
los siguientes procedimientos:
3.4.1 Oxidación de NH4+
Los ensayos realizados fueron a partir de NH4+ añadido en forma de NH4Cl, con
diferentes reactivos como se muestra en la Tabla 1. Fue utilizado el buffer que contiene
KH2PO4 y K2HPO4 ajustado a un pH de 5,8 por lo que las reacciones se llevaron a cabo en
medio ligeramente ácido. Cada tubo fue incubado por el período de 2 h a 37°C y
posteriormente fueron medidos en el cromatógrafo iónico para determinar el contenido de
NH2OH, NO2- y NO3-.
26
Se realizó también los mismos ensayos mencionados pero sustituyéndose la fuente
de NH4+ añadido esta vez como (NH4)2SO4. El tiempo y temperatura de incubación fue la
misma y la medición final para determinar si existen compuestos intermediarios del proceso
de nitrificación también fue realizada por cromatografía iónica.
Tabla 11. Ensayos in vitro con NH4+ como sustrato, conteniendo XOD: xantina oxidasa, FeSOD:
Fe-superoxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz
(+3).
Ensayo
Reactivo
Buffer
NH4+
H2O2
Fe 3+
Fe 2+
FeSOD
ASC
PQ
H 2O
Concentración
final
1
(µl)
2
(µl)
3
(µl)
4
(µl)
5
(µl)
6
(µl)
7
(µl)
200 mM
50 mM
10 mM
1 mM
10 µM
50 µM
10 µM
10 µM
500
500
500
500
500
500
500
200
200
200
200
200
200
200
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
50
50
50
100
100
100
100
1100
1000
1000
1000
950
950
1050
-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------
3.4.2 Oxidación de NH3 a pH alcalino
Se efectuaron reacciones mezclando varios compuestos que pueden intervenir en el
proceso de nitrificación, y se partió del amoniaco sin neutralizar como sustrato para
identificar su transformación hasta obtener NO3-. Posteriormente, para cada ensayo se
midió por cromatografía iónica el contenido de NH2OH, NO2- y NO3-.
Cada reacción se llevó a un volumen final de 2 mL de solución complementado con
agua destilada para cromatografía. Las reacciones realizadas fueron incubadas durante 2 h a
37°C y posteriormente se realizaron las medidas en el cromatógrafo. Cada uno de los
27
ensayos realizados se especifica a continuación, y se indican los reactivos utilizados con su
concentración final en la solución y los volúmenes adicionados por cada uno de estos:
Tabla 12. Ensayos in vitro con NH3 como sustrato sin neutralización conteniendo XOD: Xantina
oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI:
hemoglobina I de arroz (+3).
Ensayo
Reactivo
Buffer
NH3
XOD
Xantina
Concentración
final
0
(µl)
1
(µl)
2
(µl)
3
(µl)
4
(µl)
5
(µl)
6
(µl)
100 µM
50 mM
0,5 U
1 mM
10 µM
50 µM
10 µM
10 µM
10 mM
500
500
500
500
500
500
500
15
15
15
15
15
15
15
50
50
40
40
Riboflavina
20
20
20
20
FeSOD
714
714
714
Lb II
65
65
Hb I
159
159
NADH
400
400
400
400
H2O
1485
1395
681
1000
906
192
286
-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------
3.4.3 Oxidación de NH3 neutralizado
Se efectuaron reacciones similares a las del apartado 3.4.2 pero partiendo como
sustrato de amoniaco previamente neutralizado con H3PO4 hasta alcanzar un pH de 5,8.
Cada tubo se llevó a un volumen final de 2 mL y fueron incubados por 2 h a 37°C. Los
ensayos realizados se muestran en la tabla 3, en donde se indican los reactivos utilizados, su
concentración en la solución final y los volúmenes colocados en cada tubo de reacción:
28
Tabla 13. Ensayos in vitro con NH3 previamente neutralizado conteniendo XOD: Xantina oxidasa,
FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de
arroz (+3).
Ensayo
Reactivo
Buffer
NH3
XOD
Xantina
Riboflavina
FeSOD
Lb II
Hb I
NADH
H2O
Concentración
final
50 mM
50 mM
0,5 U
1 mM
10 µM
1 µM
10 µM
10 µM
10 mM
0
(µl)
1
(µl)
2
(µl)
3
(µl)
4
(µl)
5
(µl)
6
(µl)
500
200
1300
500
200
50
40
1210
500
200
50
40
14
1196
500
200
20
25
400
85
500
200
20
15
400
865
500
200
20
14
15
400
851
500
200
20
14
25
400
841
-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------
3.4.4 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 1
Se realizaron siete reacciones a partir de NH2OH combinando diferentes
compuestos como se describe en la tabla 4. En donde se indica los reactivos usados para
cada ensayo y su concentración final en el medio, la cual fue mayor en algunos reactivos
con respecto a otra experimentación similar que se describirá en el apartado siguiente 3.4.5.
Cada ensayo se llevó a un volumen de 2 mL completado con agua destilada e incubados por
2 h a 37°C:
29
Tabla 14. Ensayos in vitro con NH2OH como sustrato conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD:
Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz
(+3).
Ensayo
Reactivo
Buffer
NH2OH
XOD
Xantina
Riboflavina
FeSOD
Lb II
Hb I
NADH
H2OH
Concentración
final
100 µM
50 mM
0,5 U
1 mM
10 µM
50 µM
10 µM
10 µM
10 mM
0
(µl)
1
(µl)
2
(µl)
3
(µl)
4
(µl)
5
(µl)
6
(µl)
500
200
1300
500
200
50
40
1210
500
200
50
40
714
496
500
200
20
252
400
628
500
200
20
158
400
722
500
200
20
714
158
400
8
500
200
20
714
252
400
-
-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------
3.4.5 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 2
Se realizaron reacciones similares a las llevadas a cabo en el apartado anterior con
NH2OH como sustrato, pero con concentraciones menores de Fe-proteínas como se
describe en la Tabla 5. Los tubos de reacción también se llevaron a un volumen final de 2
mL completados con agua destilada y e incubados durante 2 h a 37°C. Posteriormente las
muestras fueron medidas en el cromatógrafo:
Todos los ensayos in vitro descritos fueron finalmente sometidos a cromatografía
iónica como se explica en el apartado 3.5.2, para identificar la producción de compuestos
intermediarios y finales del proceso de nitrificación a partir de amoniaco e hidroxilamina.
30
Tabla 15. Ensayos in vitro con NH2OH como sustrato con menor concentración de reactivos
conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de
cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3).
Ensayo
Reactivo
Concent
final
0
(µl)
1
(µl)
2
(µl)
3
(µl)
4
(µl)
5
(µl)
6
(µl)
7
(µl)
8
(µl)
9
(µl)
Buffer
50 mM 500
NH3
50 mM 200
XOD
0,5 U
Xantina
1 mM
Riboflavina 10 µM
FeSOD
1 µM
Lb II
1 µM
Hb I
1 µM
NADH
1 mM
H2O
1300
500
200
50
40
1210
500
200
50
40
14
1196
500
200
20
25
400
855
500
200
20
15
400
865
500
200
20
14
15
400
851
500
200
20
14
25
400
841
500
200
20
400
880
500
200
50
40
25
400
785
500
200
50
40
15
400
795
-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------
3.5
Análisis de iones por cromatografía iónica
3.5.1 Cosecha del material y extracción
Transcurridas tres semanas las plantas fueron cosechadas. Se recolectaron todas las
plantas para cada tratamiento, fueron cortadas con pinzas y bisturí estériles, y la raíz fue
separada de la parte aérea. El material se colocó en tubos para cromatografía en los que se
rotuló correctamente el peso y el número de muestra correspondiente. Finalmente, las
muestras fueron sumergidas en nitrógeno líquido inmediatamente después de su recolección
y se mantuvieron en refrigeración a -80°C hasta su extracción.
En cuanto a la extracción del material vegetal para cromatografía iónica, se
separaron las muestras correspondientes para la medición de aniones y cationes. La
extracción de las muestras a medirse hidroxilamina se realizó con ácido sulfúrico 150mM,
mientras que las de nitrato y nitrito se extrajeron con agua milli-Q estéril. Se cortó la tapa
31
de varios tubos eppendorf, los cuales fueron debidamente etiquetados y se anotó el peso de
cada tubo vacío. A continuación, se añadió 1 mL de agua o ácido según la medida que se
fuera a realizar y se incubaron durante 5 min al baño maría (80°C). Transcurrido el tiempo
de incubación se procedió a realizar un agujero con un punzón caliente en la base del tubo
que contenía el material y el sobrenadante extraído. Se colocó el tubo eppendorf cortado
bajo el tubo con el agujero encajándolo cuidadosamente con parafilm. Una vez encajado los
dos tubos se centrifugó a máxima velocidad durante 30 min. Transcurrido el tiempo se
retiró el tubo con el material vegetal, se conservó el tubo inferior con el líquido de
extracción y se anotó el peso del eppendorf cortado lleno. Finalmente se almacenó la
solución extraída en nuevos tubos rotulados adecuadamente a -20°C hasta su medición en
el cromatógrafo iónico.
3.5.2 Cálculos y cuantificación
Las mediciones de hidroxilamina, nitrito y nitrato y se realizaron en cromatógrafo
iónico, con una columna para aniones y otra para cationes. Se hicieron diluciones 1:10
(v/w) de los extractos para su medición. Una vez establecida la línea base y con los
estándares adecuados, se procedió a pinchar las muestras para ser medidas. Finalmente con
los datos emitidos por el equipo de los contenidos de nitrato, nitrito e hidroxilamina, se
realizaron los cálculos a partir de la siguiente fórmula:
µmol/gPF= [ppm x (peso t.lleno – peso t.vacío)/PM ion]/gPF
3.6
Estudio morfológico
El estudio morfológico se realizó tomando un registro del crecimiento de las plantas
para cada tratamiento realizado. Se tomaron fotografías a las tres semanas de crecimiento
para identificar el crecimiento radical y de altura de las plantas. Con la información
32
obtenida se realizaron comparaciones del crecimiento foliar (biomasa), la dimensión y el
número de hojas, y se observaron las diferencias en el crecimiento de la raíz.
3.7
Análisis estadístico
Los resultados obtenidos en este trabajo fueron examinados mediante el programa
“SPSS versión 17.0” para Windows. Se calculó la media como estadístico de tendencia
central y el error estándar como estadístico de dispersión. Los cálculos estadísticos
referidos a la comparación entre tratamientos de cultivo fueron realizados bajo la asunción
de que los datos tratados seguían una distribución normal. Para este tipo de comparación
estadística se realizaron Análisis de Varianza (ANOVA). Los estadísticos seleccionados
según el cumplimiento o no del principio de homoscedasticidad u homogeneidad de
varianzas (test de Levene) fueron: mínima diferencia significativa (MDS) para las variables
con homogeneidad de varianzas y T3 de Dunnett para los casos de no homoscedasticidad.
Los cálculos estadísticos referidos a la comparación entre tratamientos para cada
concentración de NH4+ fueron realizados bajo la asunción de que los datos tratados seguían
una distribución normal. Este análisis se realizó mediante el test de comparación de medias
t de Student, teniendo en cuenta si cumplía o no el principio de homoscedasticidad
mediante el test de Levene. Todos los análisis estadísticos se realizaron a un nivel de
significación del 5% (P ≤ 0,05).
33
4. RESULTADOS
4.1
Producción de nitrato y otros compuestos intermediarios de N
en el metabolismo oxidativo del amonio en plantas.
4.1.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana
Se crecieron plantas de A. thaliana en cultivo axénico con medio Rigaud y Puppo
con varias concentraciones y formas de N en el medio. Las plantas de A. thaliana crecidas
con 1 y 5 mM de NH4+, así como un control crecido con NO3- (40 mM NO3- + 20 mM de
NH4+), presentaron NO2-, NO3- y NH2OH. En los siguientes gráficos (Figs. 6 y 7) se
muestran las diferencias existentes en los contenidos de estos iones en la parte aérea y en la
raíz de las plantas según los tratamientos aplicados.
La concentración de NO3- es muchísimo mayor en las plantas control, ya que son las
que fueron crecidas bajo nutrición nítrica. Sin embargo muestran la menor concentración de
NH2OH en la parte aérea, que es casi nula. El tratamiento de 1 mM de NH4+ presenta
mayor concentración con respecto al de 5 mM de NH4+.
Las hojas de A. thaliana crecidas en cultivo axénico con NH4+ contienen NO2-, NO3e NH2OH. Es importante también señalar que todos los iones analizados (NO2-, NO3- e
NH2OH) mostraron contenidos superiores en el tratamiento de 1 mM de NH4+ con respecto
al tratamiento de 5 mM de NH4+. Los valores de NO2- obtenidos en la pare aérea de las
plantas pertenecientes al tratamiento de 1 mM de NH4+ son muy similares a los valores de
las plantas control crecidas con NO3-. No obstante, es muy significativa la disminución a
casi la mitad del contenido en NO2- en plantas crecidas con 5 mM de NH4+.
34
Control
100,0
1 mM NH4+
80,0
5 mM NH4+
-1
µmol ion g PF
60,0
40,0
20,0
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
NH2OH
NO2
-
-
NO3
Figura 2. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3-) e hidroxilamina (NH2OH) en parte aérea de
Arabidopsis thaliana crecida con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica),
1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N.
También las raíces de plantas de A. thaliana crecidas en cultivo axénico con NH4+
contienen NO2-, NO3- e NH2OH. Con respecto a los valores obtenidos en la raíz, se observa
que las plantas crecidas con 1 mM y 5 mM de NH4+ presentan concentraciones similares de
NH2OH y de NO2-. El control crecido con NO3- tiene también similares contenidos en NO2-,
sin embargo, al igual que en hojas, no se detecta NH2OH.
35
100,0
Control
1 mM NH4+
95,0
5 mM NH4+
-1
µmol ion g PF
90,0
85,0
80,0
1,5
1,0
0,5
0,0
NH2OH
NO2-
NO3-
Figura 3. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3-) e hidroxilamina (NH2OH) en raíz de
Arabidopsis thaliana crecida con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica),
1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N.
4.1.2 Cultivo de Pisum sativum
También se han realizado pruebas de crecimiento en plantas de guisante con amonio
en medio axénico para ver la producción de la vía oxidativa del amonio. Los resultados
obtenidos mostraron que en la parte aérea no se dan concentraciones de NH2OH en ninguno
de los tratamientos. Sin embargo, se detecta NO2- en el tratamiento de 1 mM de NH4+ el
cual muestra una mayor concentración que el tratamiento control (crecido con NO3-) y que
el de 5 mM de amonio. En el caso de las determinaciones de NO3-, las plantas control y las
crecidas con 1 mM de amonio tienen similar concentración, no así en el tratamiento de 5
mM donde no se halló ningún contenido de nitrato como se muestra en la siguiente figura:
36
4
Control
1 mM NH4+
+
5 mM NH4
-1
µmol ion g PF
3
2
1
0
NH2OH
NO2-
NO3-
Figura 4. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3-) e hidroxilamina (NH2OH) en parte aérea de
plantas de Pisum sativum crecidas con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición
nítrica), 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N.
La parte radical tampoco mostró concentración de NH2OH, sin embargo, se observó
que el control es el tratamiento con mayor cantidad de NO2- con respecto a los otros dos
tratamientos, y en el caso del NO3-, como era de esperar, las plantas control crecidas con
NO3- superaban en NO3- en gran medida al tratamiento de 1mM de NH4+, existiendo
ausencia de NO3- en el tratamiento de 5 mM de NH4+ como se mostraba también en la parte
aérea (Fig. 9).
Se observó diferencia con los datos obtenidos de las hojas donde el tratamiento
correspondiente a la aplicación de 1 mM de NH4+ presentó mayor concentración de nitrato
y nitrito. En este caso la presencia de estos iones es mayor en las raíces de las plantas
control.
37
300,0
250,0
Control
1 mM NH4+
200,0
5 mM NH4
+
-1
µmol ion g PF
150,0
100,0
50,0
1,5
1,0
0,5
0,0
NH2OH
NO2-
NO3-
Figura 5. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3-) e hidroxilamina (NH2OH) en raíz de plantas
de Pisum sativum crecidas con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM
de NH4+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N.
4.2
Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática
Para conocer la ruta de nitrificación en plantas, en la experimentación se estableció
una primera parte en la cual de modo preliminar se buscó simular las reacciones químicas
que podrían tener lugar en la transformación de especies intermediarias del metabolismo
del nitrógeno hasta la producción de nitrato y nitrito. Estos ensayos se realizaron partiendo
de dos diferentes sustratos; el primero fue amoniaco (NH3) y el segundo hidroxilamina
(NH2OH) con diferentes tratamientos para analizar finalmente la transformación de estos
compuestos en nitrato y nitrito. El mecanismo de reacción podía estar mediado por radical
superóxido como sería en el sistema xantina oxidasa (XOD)+ xantina; por un sistema
reductor no mediado por superóxido que sería riboflavina+NADH (Becana y Klucas.,
1990) o por radical hidroxilo bien usando Fe2+ (FeSO4) o Fe3+ más ascorbato.
Además, se incluyeron proteínas como la superóxido dismutasa de hierro (FeSOD),
que se conoce puede tener efectos diferentes en la conversión reversible del anión nitroxilo
38
(NO-) a NO (Murphy y Sies, 1991) o en la síntesis de hidroxilamina (Rümer et al., 2009).
Además, no debemos olvidar que la FeSOD tiene como producto final de su reacción de
dismutación el H2O2. También se incluyeron en algunos tubos alícuotas de hemoglobinas
(Hbs) vegetales como la Hb I de arroz, que es una hemoglobina hexacoordinada que une
NO con alta afinidad, y la Lb II de cowpea que es una hemoglobina pentacoordinada con
menor afinidad por los ligandos como NO y O2 (Moran et al., 1997).
Además, se ha propuesto que en plantas las Hbs (sobre todo las hexacoordinadas, en
este caso la Hb I) participarían en la eliminación de NO produciendo nitrito o nitrato
(Dordas et al., 2003). Finalmente, dado que el proceso de eliminación de NO por las Hbs
precisaría de un reductor, se añadió NADH, que se conoce que es capaz de funcionar como
molécula reductora en presencia de Hbs a pH neutro y ligeramente ácido (Becana y Klucas,
1990).
a) Nitrificación a partir de NH4+
Se realizaron ensayos con amonio como sustrato a pH 5.8. En estos ensayos se
incluyeron Fe, ascorbato, Fe3+ y peróxido de hidrógeno (H2O2). Esencialmente, se
consideraba que el mediador de las reacciones sería el radical hidroxilo (OH-). Los tubos de
reacción después de 2 horas de incubación no presentaron contenidos en NH2OH, NO2- ni
NO3-. Se estudiaron dos fuentes de amonio y con ninguna de las dos, ya fuese NH4Cl o con
(NH4)2SO4 evidenció presencia de los intermediaros de la nitrificación.
b) Nitrificación a partir de NH3 a pH alcalino
Las reacciones in vitro realizadas utilizando NH3 como sustrato sin neutralizar a pH
9,0 fueron medidas de acuerdo al ensayo aplicado, lo cual se explica en la siguiente gráfica
donde se detallan los compuestos adicionados. No hubo ninguna evidencia de NO3- ni
NH2OH como productos de la oxidación del amoniaco. Sin embargo, se encontró NO2- en
algunos tratamientos. El ensayo control, que únicamente contenía NH3 y la solución buffer,
39
presentó producción de NO2-, con un valor de 5 µmol en los 2 mL del tubo de ensayo. Los
tubos de reacción 1 y 2 que contenían el radical superóxido producido por el sistema
XOD/xantina, mostraron valores semejantes al control. El ensayo 5 con FeSOD,
riboflavina, HbI y NADH fue el que demostró tener mayor concentración de NO2- respecto
al control y al 1 y 2 con un valor de 15 µmol.
18
Contenido de nitrito (µ
µmol)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
XOD
Xantina
Riboflavina
FeSOD
Lb II
Hb I
NADH
1
+
+
2
+
+
3
4
5
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
6
+
+
+
+
Figura 6. Contenido de nitrito (NO2-) a partir de amoniaco a pH 9,0 en mezclas in vitro conteniendo
XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD (Fe-superóxido dismutasa), Lb II
(leghemoglobina II de cowpea), Hb I (hemoglobina I de arroz) y/o NADH según se indica en la
tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37°C y se midieron los contenidos por cromatografía
iónica.
c) Nitrificación a partir de NH3 neutralizado
Los resultados de los ensayos efectuados a partir de NH3 neutralizado previamente
con ácido fosfórico (pH 5,8) muestran gran variación con respecto a los obtenidos en la
40
primera serie de tubos con NH3 a pH alcalino. En la gráfica se puede observar que existe
NH2OH en la mayoría de ensayos, lo cual no se obtuvo en la serie de reacciones anteriores.
Se obtuvo NH2OH en el tubo control. No se detectó presencia de NO3- en ninguno de los
tubos, y sólo uno de los tubos correspondiente al ensayo 2, el que contenía XOD, xantina y
FeSOD, presentaba contenidos de NO2-. En concreto, de los tubos que muestran NH2OH
sólo los tubos 2, 3 y 4 tienen concentraciones superiores al control. El tubo 2 de nuevo es el
que contiene la mayor concentración de NH2OH con respecto a los demás tubos. Los tubos
5 y 6 correspondiente a ensayos con presencia de riboflavina, FeSOD, NADH, y LbII o HbI
no presentaron NH2OH, NO2- ni NO3-.
NO2-1
NH2OH
Contenido iónico (µ
µmol)
20,0
15,0
10,0
5,0
2,5
0,0
0
XOD
Xantina
Riboflavina
FeSOD
Lb II
Hb I
NADH
1
+
+
2
3
4
5
+
+
+
+
+
+
+
6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Figura 7. Producción de nitrito (NO2-) e hidroxilamina (NH2OH) a partir de amoniaco a pH 5,8, en
mezclas in vitro conteniendo XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD (Fe-superoxido
dismutasa), Lb II (leghemoglobina II de cowpea), Hb I (hemoglobina I de arroz) y/o NADH según
se indica en la tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los contenidos
iónicos por cromatografía.
41
d) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 1
Las reacciones efectuadas a partir de NH2OH como sustrato fueron realizadas a pH
5.8. Los resultados no detectaron la presencia de NO3-. Sin embargo, en algunos
tratamientos se encuentró producción de NO2-. Adicionalmente, se midió la concentración
de NH2OH observándose la desaparición de este compuesto de N desde el tubo control, por
lo que se identificó la mayor concentración en el ensayo 0. En este caso, se observó que los
tubos en los que existe reacción con FeSOD, NADH y las hemoglobinas son los que
presentaron producción de nitrito, así como sucede en el tubo control. Por ello, no
descartamos que se estén produciendo otros intermediarios como el óxido nítrico (NO).
NO2-
Contenido iónico (µ
µmol)
NH2OH
400
120
80
40
0
0
XOD
Xantina
Riboflavina
FeSOD
Lb II
Hb I
NADH
1
+
+
2
3
4
5
6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Figura 8. Producción de nitrito (NO2-) e hidroxilamina (NH2OH) a partir de hidroxilamina en
medio neutro en mezclas in vitro conteniendo XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD
(Fe-superoxido dismutasa), Lb II (Leghemoglobina II de cowpea), Hb I (Hemoglobina I de arroz)
y/o NADH según se indica en la tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los
contenidos iónicos por cromatografía.
42
e) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 2
Se repitió el experimento descrito en d) usando concentraciones menores de Feproteínas (apartado 3.4.5). De este modo, FeSOD, Hb I y Lb II se utilizaron en este
segundo ensayo de oxidación de NH2OH a una concentración 1µM cada uno de estos
compuestos, mientras que el pH (5,8) y el resto de los reactivos se mantuvieron en idéntica
concentración. Tampoco existió la producción de NO3- como en las pruebas efectuadas
anteriormente, sin embargo, sí encontramos NO2- a excepción de en los ensayos 2 y 6. Es
importante identificar que en los ensayos donde existió producción de NO2- no se identificó
presencia de NH2OH salvo en el correspondiente al número 7.
NO2NH2OH
Contenido iónico (µ
µmol)
400
300
10
5
0
0
XOD
Xantina
Riboflavina
FeSOD
Lb II
Hb I
NADH
1
+
+
2
3
4
5
6
7
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
8
9
+
+
+
+
+
+
+
+
Figura 9. Producción de nitrito (NO2-) a partir de hidroxilamina (NH2OH) a pH 5.8 en mezclas in
vitro con menores concentraciones de FeSOD (Fe-superóxido dismutasa), Lb II (Leghemoglobina II
de cowpea), Hb I (Hemoglobina I de arroz) según se indica en la tabla adjunta. Los viales con la
mezclas de reacción se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los contenidos iónicos por
cromatografía.
43
4.3
Estudio morfológico
Se establecieron varios tratamientos para el crecimiento de Arabidopsis thaliana y
Pisum sativum buscando establecer un medio de cultivo axénico en nutrición estrictamente
amoniacal para las plantas. Una vez crecidas, se estableció el análisis morfológico que se
presenta a continuación, donde se observa el crecimiento de la parte aérea y la raíz de las
plantas, así como su biomasa.
4.3.1 Tratamiento control: Medio MS normal (A.thaliana).
El tratamiento control de plantas crecidas con NO3- correspondía al crecimiento de
plantas en condiciones óptimas establecidas para el desarrollo de A. thaliana en medio MS
(Murashigue y Skoog, 1962). Estas plantas crecidas bajo nutrición nítrica mostraron hojas
largas y estrechas, y se identificó una roseta con un número aproximado de 6 o 7 hojas para
cada planta. Se pudo observar también la emisión de la inflorescencia con pequeñas flores
en su parte terminal. El peso medio de planta fue de 0.22 g por planta. El crecimiento de la
raíz fue proporcional a la parte aérea (Fig. 10), presentando también raicillas secundarias.
El desarrollo y crecimiento se dio con normalidad, las hojas no presentaron clorosis o
manchas de marchitez, el desarrollo de sus raíces fue radial y el crecimiento final de las
plantas fue el óptimo correspondiente a las tres semanas de cultivo durante las cuales
fueron mantenidas las plantas.
4.3.2 Tratamiento 1: Medio MS modificado con sales de amonio como
única fuente de N (A.thaliana).
El primer tratamiento aplicado se preparó sustituyendo las sales del medio MS
normal. Las plantas germinaron en su mayoría, sin embargo, como se puede observar en la
figura 10, no tuvieron un desarrollo normal y la coloración de sus hojas cambió tomando un
tono rojizo. En el tratamiento con una concentración de 1 mM de NH4+ se observó mayor
desarrollo de la parte aérea y de la raíz en comparación con el de 5 mM de NH4+, así
también con respecto al porcentaje de biomasa calculado. Se identificó un mayor
44
incremento de biomasa en la parte radical en el tratamiento de 1 mM de NH4+ a diferencia
con la parte aérea. Sin embargo, en el tratamiento con 5 mM de NH4+, el incremento de la
biomasa de la parte aérea fue mínimo, no mostrando mayor desarrollo de la raíz. En el
tratamiento control que cuenta con todas las sales de un MS normal con nitrato como fuente
de nitrógeno, se pudo observar la diferencia en la biomasa con respecto a los tratamientos
con nutrición amoniacal, y también se observó que el crecimiento de la parte aérea y la raíz
fueron casi iguales siguiendo la misma proporción.
A1
B1
C1
A2
B2
C2
D
Parte aérea
Raíz
0,1400
Biomasa (g PS)
0,1200
0,1000
0,0030
0,0015
0,0000
Control
1mM NH 4+
5mM NH 4+
Figura 10. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS con las
modificadas. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4+
(medio MS modificado con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio MS modificado
con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los
tratamientos: Control, 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ crecidas en medio MS modificadas las sales.
45
4.3.3 Tratamiento 2: Medio MS suplementado con K+ (40 mM)
(A.thaliana).
La adición de potasio ha sido descrito recientemente como un medio para reducir el
estrés por nutrición amoniacal (Sczerba et al., 2008). En el tratamiento con aumento de K
hasta una concentración de 40 mM se observó un mejor desarrollo en las plantas con
respecto al tratamiento 1 tal y como indican los datos de biomasa (Fig. 11D). El aumento en
la disponibilidad de K en el medio permitió que las hojas de las plantas mostrasen mayor
apertura y dimensión, sin embargo el desarrollo aún fue muy limitado y la coloración de las
hojas era rojiza. El tratamiento de 1 mM de amonio presentó mayor desarrollo de biomasa
en la raíz que en la parte aérea. Este comportamiento se repitió también en el tratamiento 1
pero con aumento de K la biomasa total de la planta aumenta. El tratamiento de 5 mM
presentó un menor desarrollo de las plantas, con un porcentaje de biomasa muy similar
entre la parte aérea y la parte radical. La diferencia entre el valor de biomasa con el
tratamiento control seguía siendo muchísimo mayor tanto para la parte aérea como para la
raíz.
C1
A1
A1
B1
B1
C1
A2
A2
B2B2
C2 C2
46
0,14
D
Parte aérea
Raíz
Biomasa (g PS)
0,12
0,10
0,01
0,00
Control
1mM NH4+
5mM NH4+
Figura 11. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS suplementado
con K+. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4+ (medio
MS + suplemento K+ con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio MS + suplemento
K+ con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los
tratamientos Control, 1 mM de NH4+ y 5 mM de NH4+ crecidas en medio MS con suplemento de
K+.
4.3.4 Tratamiento 3: MS suplementado con K+ (40 mM) y Mg2+ (5 mM)
(A.thaliana).
El suplemento de potasio y magnesio conjunto generó una variación en los
resultados respecto a los tratamientos 1 (MS sustituidas las sales) y 2 (MS + aporte de K+)
los cuales fueron similares entre sí en lo que concierne a la distribución de biomasa entre
parte aérea y raíz. En este caso, la biomasa de la parte aérea superó a la de la raíz en las dos
concentraciones de NH4+ aplicadas, pero se diferenciaban entre ellas en que en las plantas
crecidas con 5 mM de amonio el desarrollo de las plantas fue mayor.
Las hojas de Arabidopsis crecidas bajo este tratamiento fueron de mayor tamaño y
número, y las dimensiones de la raíz también aumentaron, mientras que las plantas del
tratamiento 1 mM de NH4+ fueron muy pequeñas y su desarrollo era difícilmente visible.
47
A1
B1
C1
A2
B2
C2
D
Parte aérea
Raíz
Biomasa (g PS)
0,120
0,100
0,003
0,000
Control
+
1mM NH4
+
5mM NH4
Figura 12. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS suplementado
con K+ y Mg2+. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4+
(medio MS + suplemento K+ y Mg2+ con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5 mM de NH4+ (medio MS
+ suplemento K+ y Mg2+ con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de
A. thaliana de los tratamientos Control, 1 mM de NH4+ y 5 mM de NH4+ crecidas en medio MS con
suplemento de K+ y Mg2+.
48
4.3.5 Tratamiento 4: MS con L-glutamina como fuente de N
(A.thaliana).
En el tratamiento suplementado con L-glutamina como fuente de nitrógeno se
obtuvieron mejores resultados de crecimiento, siendo el desarrollo de la raíz y de la parte
aérea visiblemente mayor. Las hojas presentaron una coloración más verdosa, aunque
existían algunas plantas que aún presentaban coloración rojiza. A diferencia de los
tratamientos anteriores, la disposición de las hojas y su apertura se dan de mejor manera, y
su tamaño aumenta.
Se aplicó únicamente un tratamiento, ya que se realizó una experimentación anterior
aplicando varias concentraciones de L-glutamina, donde la única que daba buen
crecimiento fue la de 10 mM, que es la que se añadió en este tratamiento. En este caso la
biomasa radical fue mayor que la de la parte aérea, siendo la distribución y extensión de las
raíces visiblemente mayor que en el resto de tratamientos, y se observaron gran cantidad de
raicillas.
A1
B1
C1
A2
B2
C2
49
D
0,14
Parte aérea
Raíz
0,12
Biomasa (g PS)
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
Control
10 mM
Figura 13. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS con L-glutamina
como fuente de N. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B y C10mM de Lglutamina (medio MS + L-Gln); D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los
tratamientos Control y 10mM de L-glutamina.
4.3.6 Tratamiento 5: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in
vitro sin sacarosa (A.thaliana).
La utilización del medio Rigaud y Puppo mostró mejores resultados en el desarrollo
de las plantas de Arabidopsis, obteniendo plantas verdes con diferente número de hojas y
también la emisión del pequeño tallo de florescencia con la producción de pequeñas flores,
llegando así a realizar todo su ciclo vital.
Se pudo observar el mayor desarrollo de la parte aérea a diferencia de la raíz en los
dos tratamientos, sin embargo el de 1 mM de NH4+ presentó mayor biomasa total de la
planta que el de 5 mM de NH4+.
50
D
A1
B1
C1
A2
B2
C2
0,14
Parte aérea
Raíz
Biomasa (g PS)
0,12
0,10
0,01
0,00
Control
1mM NH4+
5mM NH4+
Figura 14. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y medio Rigaud y
Puppo (R y P) sin sacarosa. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2:
1mM de NH4+ (medio R y P sin sacarosa); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio R y P sin sacarosa). D:
Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1mM de NH4+ y
5mM de NH4+ crecidas en medio R y P sin aplicación de sacarosa.
4.3.7 Tratamiento 6: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in
vitro con sacarosa (A.thaliana).
El último tratamiento tuvo similares resultados que el anterior, aunque existió
diferencia en la cantidad de biomasa producida, que en este caso fue menor. Se puede
observar que existe mayor desarrollo en la parte aérea que en la raíz en los dos tratamientos
51
de 1 y 5 mM de NH4+ y que el primero tuvo mayor cantidad de biomasa total que el
segundo. Se obtuvieron plantas con numerosas hojas y raíces con la producción de
pequeñas flores como se obtuvo en el tratamiento 5. Sin embargo, en este caso las hojas no
mantuvieron por tanto tiempo su color verde y su vitalidad. Asimismo, se identificó un
desarrollo completo de la planta, es decir, se vio que alcanzó la floración. Sin embargo, el
tamaño de las flores fue muy pequeño en comparación con las plantas desarrolladas en el
tratamiento control.
A1
B1
C1
A2
B2
C2
D
Parte aérea
Raíz
Biomsa (g PS)
0,120
0,100
0,006
0,000
Control
1 mM NH4
5 mM NH4
Figura 15. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y medio Rigaud y
Puppo (R y P) con sacarosa. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2:
1mM de NH4+ (medio R y P con sacarosa); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio RyP con sacarosa). D:
Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1mM de NH4+ y
5mM de NH4+ crecidas en medio Rigaud y Puppo con aplicación de sacarosa.
52
4.3.8 Análisis morfológico (P. sativum).
Las plantas de guisante sometidas a los mismos tratamientos que Arabidopsis no
mostraron diferencias en su crecimiento (el desarrollo de su parte aérea y raíz fueron
similares),
razón por la cual se ha obviado la descripción detallada de todos los
tratamientos. Las hojas de guisante se desarrollaron con normalidad presentando pares de
foliolos que terminan en zarcillos característicos de esta especie. El desarrollo de la raíz fue
también normal presentando raíz pivotante, siendo bastante robustas tanto la raíz principal
como las secundarias. El desarrollo de esta especie durante el período de experimentación
no completó su ciclo por lo que no existió la presencia de flores ni fruto. Las características
morfológicas de esta especie se identificaron claramente en todos los tratamientos aplicados
(Figura 16).
Control
A
MS K+ + Mg2+
D
MS sust
L-Gln
B
E
MS K+
RyP
C
F
53
G
1 m M N H 4+
5 m M N H 4+
0 ,3 0
Biomasa (g PS)
0 ,2 5
0 ,2 0
0 ,1 5
0 ,1 0
0 ,0 5
0 ,0 0
c o n tro l
M S sust
MS K
MS K + Mg
L -G ln
R yP s in
R yP c o n
Figura 16. Crecimiento de P.sativum en cultivo axénico bajo los tratamientos aplicados. A: Control
(medio MS normal con nutrición nítrica); B: medio MS sustituidas las sales (nutrición amoniacal);
C: medio MS con aporte de K+; D: medio MS con aporte de K+ y Mg2+; E: medio con L-Gln como
fuente de N; F: Medio Rigaud y Puppo; G: Gráfico de biomasa total de P.sativum correspondiente
a los tratamientos de medio de cultivo aplicados a 1 y 5 mM de NH4+.
4.4
Análisis estadístico de biomasa total
4.4.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana
Los distintos tratamiento aplicados (medio de cultivo, presencia de cationes y
sacarosa) tuvieron un efecto sobre la producción de biomasa total de A. thaliana en ambas
concentraciones de NH4+ (1 y 5 mM, Figura 17). Los tratamientos con el medio de cultivo
Rigaud y Puppo (RyP) mostraron mayor biomasa que los de medio MS. Además dentro del
medio Rigaud y Puppo el tratamiento que mayor rendimiento en biomasa presentó fue el
Ry P sin sacarosa (Figura 17).
El factor concentración de NH4+ mostró también un efecto sobre la variable biomasa
total de A. thaliana en los tratamientos de cultivo. En los casos de MS sustituidas las sales,
54
MS con suplemento de K+ y Rigaud y Puppo sin sacarosa, al aumentar la concentración de
NH4+ se observó una disminución de la biomasa total (Figura 16).
Producción de Biomasa (g PS)
0,025
1mM NH 4 +
*
*
*
5mM NH 4 +
0,020
b
0,015
ab
ab
0,010
0,005
a
a
b
b
0,000
b
b
a
MS sust
MS K
MS K + Mg
RyP sin
RyP con
Figura 17. Efecto de los tratamientos aplicados sobre la biomasa de las plantas de A. thaliana
crecidas bajo 1mM de NH4+ (●) y 5mM de NH4+ (○). Los valores representan el promedio ± el
error estándar (n=10). Las letras (a, b) representan diferencias significativas, según el factor
tratamiento de cultivo para cada concentración aplicada. El asterisco (*) indica diferencias
estadísticamente significativas entre 1 y 5 mM de NH4+ para cada tratamiento de cultivo. Todos los
análisis estadísticos se han realizado con un nivel de confianza del 95% (P ≤ 0,05).
4.4.2 Cultivo de Pisum sativum
El análisis estadístico efectuado para los datos obtenidos de Pisum sativum mostró
diferencias significativas entre el tratamiento de cultivo Rigaud y Puppo con respecto a los
demás medios de cultivo, sobre la producción de biomasa total. La concentración de 1 y 5
mM de NH4+ no tuvo efecto alguno sobre el crecimiento de guisante (Figura 18).
55
1mM NH 4 +
0,30
5mM NH 4 +
Producción de Biomasa (gPS)
0,25
a
a
a
0,20
a
a
a
0,15
a
b
a
0,10
b
0,05
0,00
MS sust
MS K
MS K + Mg
RyP sin
RyP con
Figura 18. Efecto de los tratamientos aplicados sobre la biomasa total de las plantas de Pisum
sativum crecidas bajo 1 mM de NH4+ (●) y 5 mM de NH4+ (○). Los valores representan el promedio
± el error estándar (n=10). Las letras (a, b) representan diferencias significativas, según el factor
tratamiento de cultivo para cada concentración aplicada. El asterisco (*) indica diferencias
estadísticamente significativas entre 1 y 5 mM de NH4+ para cada tratamiento de cultivo. Todos los
análisis estadísticos se han realizado con un nivel de confianza del 95% (P ≤ 0,05).
56
5. DISCUSIÓN
5.1
Producción de nitrato y otras especies intermediarias del
metabolismo oxidativo del amonio en plantas
Hasta ahora apenas se ha prestado atención a los contenidos de nitrato en las plantas
crecidas con amonio, y se consideraba que el NO2- podría producirse en la solución
nutritiva debido a contaminación de bacterias nitrificantes como pueden ser las
pertenecientes a los géneros Nitrosomonas y Nitrobacter. Para descartar este hecho se han
utilizado medios axénicos para crecer todas las plantas usadas en el estudio. Se midió el
contenido de iones intermediarios del metabolismo del amonio en la parte aérea de las
plantas de A. thaliana, y se pudo comprobar la presencia de NH2OH, NO2- y NO3- en todos
los tratamientos con aplicación de 1 y 5 mM de (NH4)2SO4, lo cual confirma la existencia
de una vía de oxidación de amonio en plantas. Rümer y colaboradores (2009) ya sugirieron
la existencia de esta vía pero no demostraron la existencia in vivo del primer paso de
oxidación de amonio a NH2OH (Ec. 1).
Nuestros resultados proceden de varias plantas originarias de diferentes frascos de
cultivo. El crecimiento de las plantas se llevó a cabo en dos series independientes con un
desfase temporal de una semana, por lo que es necesario considerar que tanto la
variabilidad biológica como el factor temporal pueden influir en la variabilidad de los datos
obtenidos. Todo ello explicaría la considerable dimensión de los errores mostrados en los
resultados de A. thaliana (Fig. 2 y 3) y quizás fuese necesario aumentar el número de
réplicas para mejorar la estadística. Con respecto al contenido de NH2OH en la parte aérea
para las dos concentraciones de amonio aplicadas, se demuestra que es un compuesto que
interviene en el proceso oxidativo que se da en la planta para metabolizar el amonio
absorbido. Algunos estudios en células de Nicotiana tabacum se basan en la identificación
del contenido de óxido nítrico, mostrando que la producción de este compuesto puede
ocurrir a partir de la oxidación de hidroxilamina (HA), tal y como indican los resultados in
vitro (Rümer et al., 2009; Sthör et al., 2001). Sin embargo, su relevancia fisiológica no ha
57
sido esclarecida en su totalidad. Originalmente, la HA fue considerada un intermediario en
la reducción del nitrito a amonio, pero esta posibilidad fue descartada posteriormente
(Cresswell et al., 1964), aunque en recientemente se ha mostrado que la HA si puede ser un
intermediario en la reacción de la NiR fotosintética (Hirasawa et al., 2010). Así, también se
ha mencionado que la HA puede ser un supuesto intermediario en la reacción de la óxido
nítrico sintasa (NOS, DeMaster et al., 1989), y también se consideró que podía ser un
producto de la reacción catalizada por la nitroso-glutatión reductasa (GSNOR, Jensen et al.,
1998). Existen también algunos trabajos en los que se propone otras fuentes potenciales
para la producción de HA, como por ejemplo el proceso de oxidación del amoniaco,
catalizada por una de amonio mono-oxigenasa (AMO) como sucede en el caso de algunas
bacterias (Hooper et al., 1997). Dentro de este contexto, es evidente que son necesarias más
experimentaciones para dilucidar si la producción de HA sucede bajo condiciones
específicas para servir como sustrato de formación de otras especies del metabolismo del N
en plantas.
A pesar de este hecho, los resultados obtenidos en la experimentación son
interesantes desde el punto de vista del entendimiento de los procesos ocurridos en la
nutrición amoniacal exclusiva en plantas de A. thaliana, donde se comprueba que la
molécula está presente en parte aérea así como también en la parte radical, en menor
medida, y se determina que la molécula es producida por la planta (Fig.2). Esta molécula
podría ser parte de la transformación del amonio hasta la formación de nitrito basándose en
procesos identificados en algunas especies de bacterias (Fig. 19) (McCarty, 1999).
Figura 19. Reacciones enzimáticas catalizadas por la amonio-monooxigenasa (AMO) y la
hidroxilamina-oxidorreductasa en Nitrosomonas europaea (McCarty, 1999)
58
Así como se ha demostrado la presencia de HA en los tratamientos con nutrición
amoniacal de 1 y 5 mM mencionados, es interesante también el análisis de los resultados
encontrados en el tratamiento control, cuya nutrición es a base de nitrato como fuente de N.
Se observó que tanto en parte aérea como en raíz de A. thaliana no se dio producción de
NH2OH. Esto puede explicarse precisamente por la diferencia entre los mecanismos de
absorción y transformación de nitrato y amonio en la planta. El tratamiento control presenta
una concentración de 20 mM de nitrato de amonio (NH4NO3) en el medio final y de 18,79
mM de nitrato de potasio (KNO3), por lo cual la producción de HA se vería muy reducida
al no propiciarse una reducción del nitrato, lo que concuerda con la acumulación en forma
de nitrato y nitrito (Fig.2). Aunque han sido pocos los estudios en los que se ha
comprobado la producción de HA en plantas, en algunos estudios con suspensiones
celulares de Nicotiana tabacum se ha demostrado que existe producción de NO a partir de
NH2OH (Rümer et al., 2009).
A diferencia de lo que ocurre en A. thaliana, no se detectó HA en Pisum sativum en
parte aérea o en raíz. Algunos trabajos realizados en guisante han demostrado que es una
especie que muestra tolerancia al amonio cuando es la única fuente de N (DomínguezValdivia et al., 2008). Se estableció también que bajo nutrición nítrica, el nitrato se
acumula en hojas y raíces lo cual sustenta lo obtenido en la presente investigación para P.
sativum (Fig.4 y 5).
Se ha encontrado también que las diferencias entre la nutrición con amonio o con
nitrato son claramente significativas, puesto que los tejidos de las plantas crecidas con
amonio no presentaron acumulación de nitrato en sus tejidos, y que el tratamiento de 5 mM
de NH4+ no mostró valores de nitrato en la parte aérea ni en la raíz. Sin embargo, se pudo
diferenciar que en el tratamiento con 1 mM de NH4+ si aparecieron pequeñas
concentraciones de NO3-, por lo que no se podría afirmar que la ausencia de este anión sea
total en los tejidos de plantas crecidas con amonio, ya que su presencia fue claramente
detectable, hecho que también ha ocurrido con algunas variedades de guisante (DomínguezValdivia et al., 2008). Por ello, aunque no se haya detectado HA, nuestros resultados
59
sugieren que se debe a que la NH2OH es oxidada a NO2- y NO3- y que la vía oxidativa de
NH4+ también está presente en esta leguminosa.
Es importante también señalar que algunos autores aseguran que la especie Pisum
sativum L. es sensible a la nutrición amoniacal (Britto y Kronzucker, 2002) por lo que la
tolerancia a este tipo de nutrición, puede estar restringida a ciertas variedades de las
especies denominadas tolerantes, así como depender de las concentraciones de amonio
aportadas y de las condiciones de crecimiento de cada estudio. Sin embargo, en este estudio
se ha comprobado que las plantas de guisante tuvieron un buen desarrollo foliar y radical en
los tratamientos con amonio, a diferencia por ejemplo de A. thaliana, donde fue evidente la
disminución de su crecimiento (esto se detallará en el apartado de análisis morfológico).
En cuanto al contenido de nitrato y nitrito en las muestras de A. thaliana, se
detectaron mayor concentraciones en el tratamiento control que corresponde a la nutrición
con nitrato que en los tratamientos con 1 y 5 mM de NH4 (Fig. 2 y 3), lo cual puede
explicarse debido a que, como es sabido, la absorción de nitrato en la planta permite
almacenar mayor cantidad de este compuesto en sus tejidos (así como de nitrito) con
respecto a la nutrición amoniacal, siendo en este caso preciso que después de la absorción
se generen ciertas oxidaciones para obtener nitrato y nitrito. Algunos autores han descrito
que el ion nitrato puede acumularse en las vacuolas por lo que existe una tolerancia a
concentraciones muy altas de este compuesto por parte de las plantas sin evidencias de
toxicidad (Barker et al., 1966).
Como se puede observar en el tratamiento sobre las plantas de guisante en el que se
aplica una mayor concentración de NH4+, se da un mayor contenido de NO2- y NO3- en la
raíz que en la parte aérea (Fig. 3), lo cual se explica por la capacidad de algunas plantas de
metabolizar el nitrato en las hojas a diferencia del amonio, que es habitualmente asimilado
en las raíces, teniendo mayor actividad de la enzima nitrato reductasa (NR) en la parte aérea
(Lasa et al., 2001). Esto se da para evitar la acumulación de iones de amonio en las hojas
que puede resultar tóxico (Bloom et al., 1992).
60
5.2
Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática
La presencia de compuestos intermediarios del proceso de nitrificación fue
detectada en los ensayos realizados a partir de NH3 y de NH2OH. En los resultados
obtenidos a partir de NH3 como sustrato a pH 9.0 (Fig. 6), se obtuvieron pequeñas
concentraciones de NO2-, muy similares en el ensayo 1 y 2 correspondientes a la adición de
XOD/xantina y XOD/xantina/FeSOD respectivamente. Como se conoce, el complejo
XOD/xantina genera especies reactivas de oxígeno (ROS), generando principalmente en
este caso radical superóxido (O2-), habiendo sido descritos recientemente como un medio
de inducción de la oxidación del NH3 a NO2-, aunque en condiciones de pH ligeramente
ácido (Rümer et al., 2009).
El sistema en el cual se observó una mayor producción de NO2- fue el generado por
riboflavina/FeSOD/Hb I/NADH. La enzima SOD actúa como un antioxidante, dismutando
el O2- para convertirlo en oxígeno (O2) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Se sabe que la
riboflavina es el componente principal de los cofactores FAD y FMN y es un agente
reductor eficiente que tomaría en este caso electrones del NADH y los cedería a las
hemoglobinas (Hbs). Estas, una vez reducidas, podrían tomar el NO generado a partir de la
NH2OH (por medio del H2O2 producto de la reacción de la FeSOD) y convertirlo en nitrito
(Kim-Shapiro et al., 2004). Podría pensarse el H2O2 es capaz de oxidar el amonio y la
NH2OH de modo directo convirtiéndolos en una siguiente especie de la vía, el NO2-,
aunque esto parece improbable dado que nuestros experimentos in vitro con H2O2 no
produjeron oxidación de amonio detectable (apartado 4.2. a.) Por eso, no es descartable que
el efecto se deba a una acción catalítica de la hemoglobina I de arroz, la cual recientemente
ha demostrado tener actividad peroxidasa (Violante-Mota et al., 2010). Aunque se ha
indicado que la función peroxidasa de la Hb I no es de importancia fisiológica, es posible
que esta pseudo-actividad le permita catalizar la oxidación de amonio usando H2O2 y un
reductor como pueda ser el NADH.
61
Se ha establecido que las hemoglobinas pueden estar involucradas en la
transformación de NO. Algunos resultados han sugerido que las hemoglobinas inducidas
por estrés pueden funcionar como dioxigenasas desintoxicando el NO producido durante la
hipoxia en plantas mediante algunas rutas metabólicas como se muestra en la figura 18.
Dentro de este contexto se sustenta la importancia del rol de las hemoglobinas en la
producción de NO2- (Dordas et al., 2003).
También se ha visto que algunos estudios han reportado la compatibilidad de la
SOD con la reducción reversible de NO a NO-, usando cianamida y catalasa para generar
NO- en presencia de SODs, midiéndose el NO por la conversión de HbO2 a MetHb
(Murphy y Sies, 1991). Esta información sustentaría la presencia de NO2- en ensayos con
FeSOD, ya que al ser mediadas estas reacciones por esta SOD, se propiciaría la producción
de NO que sería captado por la HbI y podría oxidar este NO. Esto explicaría que la LbII no
de reacción ya que LbII muestra menores afinidades por el NO (Fig. 20).
Figura 20. Posibles vías de formación de óxido nítrico e interacción con hemoglobinas, que pueden
estar involucradas en la adaptación a estrés por hipoxia (Dordas et al., 2003)
En los ensayos a partir de NH3 neutralizado a pH 5.8 se obtuvo una pequeña
cantidad de producción de NH2OH en la mayoría de los tubos y sólo en uno de ellos
(XOD/xantina/FeSOD) se obtuvo NO2- (Fig. 7), lo cual sugiere que el factor pH puede estar
teniendo importancia. Debemos recordar que de las reacciones químicas que se dan en el
proceso de nitrificación. La reacción primera de oxidación del amonio (Ec. 1) es
62
endergónica, es decir, no espontánea. Esta reacción, sin embargo podría verse favorecida a
pH ácido (Ec. 1), lo que se corresponde con los resultados a partir de NH3
a pH
ligeramente ácido (Fig. 7), en donde en la mayoría de ensayos se obtuvieron pequeñas
cantidades de hidroxilamina.
NH4+ + H2O NH2OH + 3H+ + 2e1/2O2 + 2e- + 2H+ H2O
NH4+ + 1/2O2 NH2OH + H+
∆G’º(pH 7)= +16 Kj/mol (Ec. 1)
Por el contrario, a pH alcalino, esta reacción endergónica no es posible, y se debe
acoplar a un proceso exergónico como es la oxidación de NH2OH a NO2- según la Ec. 2.
También, a partir de NH2OH y usando un pH ligeramente ácido (5.8), ya sea con mayor o
menor concentración de Fe-proteínas, se puede ver cómo la NH2OH se va consumiendo, y
solamente en tres de los tubos se detecta NO2- (Riboflavina/Lb II/NADH; riboflavina/Hb
I/NADH; y riboflavina/FeSOD/Hb I/NADH), lo cual sugiere que bajo estas condiciones se
propiciaría el paso este siguiente compuesto de la hipotética vía de nitrificación, que es el
NO2-, como se ve en la Ec. 2.
NH2OH + H2O NO2- + 5H+ + 4eO2 + 4H+ + 4e- 2H2O
NH2OH + O2 NO2- + H2O + H+
∆G’º= -228 Kj/mol
(Ec. 2)
Paradójicamente, se ha detectado la presencia de NO2- en algunos de los blancos de
las experimentaciones in vitro realizadas (Fig. 6 y 9). Estos resultados pueden sustentarse
con la hipótesis de que hay posibilidad de que se dé una autooxidación del amonio,
siguiendo la Ec. 1 y/o Ec. 2.
La NH2OH en presencia de O2 produce NO2-, siendo una reacción fácilmente
propiciada por el pH ligeramente ácido del medio y porque la energía libre de Gibbs (∆G’º)
63
es negativa, lo que le da características de ser una reacción altamente exergónica y con la
premisa de que las reacciones exergónicas transcurren espontáneamente, se sustenta que se
dé una oxidación espontánea en los ensayos control (Anderson, 1964).
Ha sido demostrado que en microorganimos nitrificantes la oxidación de amonio a
nitrito transcurre con la formación de NH2=H como intermediario, en una reacción
catalizada por la monoamino oxidasa (Hollocher et al., 1981). También se ha propuesto que
el cobre puede tener una función en la oxidación del amonio (Anderson, 1965), lo que
sustenta el papel de la Cu/ZnSOD en la oxidación del amonio (Rümer et al., 2009). Sin
duda nuevos experimentos deberían ser realizados para confirmar los datos preliminares
aquí presentados con el objeto de certificar su significación, así como para estudiar con más
detalle la función de las Hbs en la oxidación de amonio.
5.3
Estudio morfológico
El efecto de los medios de cultivo con las concentraciones de NH4+ de 1 y 5 mM se
observó sobre todo en el crecimiento y desarrollo del vegetal. En A. thaliana fue obvia la
disminución de crecimiento, siendo esto uno de los efectos de la nutrición amoniacal
ampliamente descritos en la literatura. La reducción del crecimiento es un factor claramente
identificable en una gran variedad de especies con respecto a las crecidas con nutrición
nítrica (Cramer y Lewis, 1993; Miller y Cramer, 2004; Domínguez-Valdivia et al., 2008).
Al aumentar la concentración de NH4+, las plantas redujeron su crecimiento con
respecto al tratamiento de 1 mM de lo que se deduce que la concentración de 5 mM de
NH4+ podría provocar una situación de estrés a las plantas de A. thaliana, concentración a
la cual, este cultivar superaría su umbral de tolerancia al catión (Fig. 10-15).
Los síntomas reportados de toxicidad por NH4+ en plantas son ampliamente
conocidos, y por lo general aparecen con concentraciones externas de NH4+ por encima de
0,1 a 0,5 mmol . L-1 (Peckol y Rivers, 1995; van Katwijk et al., 1997). En algunas especies
64
sensibles, los síntomas más notables son la clorosis en las hojas y la supresión total de
crecimiento. Algunos cambios químicos en la planta inducidos por la exposición a NH4+
incluyen también la baja concentración de cationes esenciales como el K+, el Ca2+, y el
Mg2+ en la célula vegetal. Esta disminución está acompañada por el incremento de los
niveles de aniones inorgánicos como el Cl-, el sulfato y el fosfato (Troelstra et al., 1995;
Gloser y Gloser, 2000).
En el caso de las plantas de Arabidopsis es muy acusado el efecto de enrojecimiento
de las hojas. Se ha descrito en varios cultivares de maíz, trigo y alubias que la deficiencia
de nutrientes esenciales como el K+ causa atrofia y que se da un color amarillo en los
bordes exteriores de la hoja. En algunos casos se da una coloración roja y la deficiencia
severa puede acelerar la necrosis. Sin embargo, puede estar más relacionado con el efecto
desacoplante descrito para el amonio sobre los cloroplastos (Bloom et al., 1997), lo cual
induce una degeneración de moléculas antena y su degradación. No es descartable, que se
esté produciendo también deficiencia de N lo cual da como síntomas la disminución de
clorofila, por lo que también disminuye la coloración verde en las hojas (Wong, 2005), lo
cual puede sustentar los efectos visuales mostrados en las plantas de A. thaliana bajo
nutrición amoniacal (Fig.10-15), y más experimentos serían necesarios para elucidar este
síntoma.
Al mismo tiempo, es importante mencionar que la nutrición en plantas con NH4+
normalmente acidifica el medio externo (Goodchild y Givan, 1990; Schubert y Yan, 1997),
por lo que el eflujo de protones de la planta es un medio para compensar el desequilibrio de
carga y la absorción de aniones se da en exceso en relación a los cationes. No obstante, las
diferencias en la captación de protones y extrusión a lo largo del eje longitudinal de la raíz
entre los dos tipos de nutrición amoniacal y nítrica es un hecho mucho más complicado de
explicar, por lo que aún es necesario realizar más estudios al respecto (Henriksen et al.,
1992; Taylor y Bloom 1998).
En general, se puede decir que como respuesta a la nutrición amoniacal el resultado
es la acidificación del medio, la deficiencia de cationes importantes y por consecuencia el
65
desequilibrio iónico en las células vegetales, y estos se consideran como las causas
principales de la toxicidad de este compuesto. En los resultados de la presente
experimentación son evidentes los efectos de toxicidad descritos en las plantas de A.
thaliana, donde se obtuvieron plantas con disminución del crecimiento y desarrollo,
clorosis y aumento en la producción radical.
Tratamiento 1: MS con sales sustituidas
En el tratamiento 1 se realizó una sustitución de sales del medio MS control para
cambiar las sales que contenían nitrato y garantizar que la única fuente de N fuese amonio
(Tabla 10). En los resultados obtenidos (Fig. 10) se observó un escaso crecimiento de las
plantas de A. thaliana, a diferencia de las del tratamiento control. Como se ha mencionado
anteriormente, se ha descrito que una de los principales respuestas a la nutrición amoniacal
es la disminución en el crecimiento, y adicionalmente, se sabe que el amonio induce
cambios en el desarrollo por causar alteraciones en el balance hormonal (Lasa et al., 2000).
Se pudo observar diferencias en la biomasa de las raíces de las plantas crecidas con
amonio con respecto a las crecidas con nitrato, donde las primeras presentaron un mayor
crecimiento radical principalmente en el tratamiento de 1mM de NH4+. Referente a esto,
algunos estudios han sugerido que las ramificaciones de la raíz proliferan por la mayor
resistencia del tejido como un sumidero de carbono, facilitando concentraciones de auxinas
en la raíz (Gerendás et al. 1997).
Asimismo, se observó un cambio de coloración en las hojas, dando un color caférojizo. Se ha descrito que la toxicidad por amonio se caracteriza por una restricción
inmediata de la tasa de crecimiento, marchitez, necrosis y clorosis marginal intervenal de
las hojas terminales, y finalmente la muerte de la planta entera (Cox y Reisenauer, 1973).
Algunos estudios sostienen que la necrosis y clorosis en hojas se da debido al desequilibrio
de pH en la planta, ya que el amonio reduce la absorción de otros cationes, lo que
disminuye el pH del tejido (Fig. 21). Así, el cambio en el factor pH puede causar la
inactivación del Fe en la planta (Haynes y Gho, 1978), y también afectar al proceso de
66
fotosíntesis, desacoplando electrones y disminuyéndose la tasa fotosintética (Bloom et al.,
1997; Claussen y Lenz, 1999).
Figura 21. Diagrama de la disipación de los gradientes de pH. El lado izquierdo representa el
estroma, matriz o citoplasma en donde el pH es alto; el lado derecho representa el lúmen, espacio
intermembranoso, o vacuola en donde el pH es alto y la membrana representa el tilacoide, el interior
mitocondrial, o la membrana de tonoplasto al cloroplasto, o la célula de la raíz, respectivamente. La
red resulta de la reacción mostrada, entre la concentración de OH- en el lado izquierdo y la
concentración de H+ en el lado derecho que se ha visto disminuida; esto provoca que el gradiente de
pH se disipe (Bloom, 1997).
Tratamiento 2: MS suplementado con K+ (40 mM).
Las plantas a las que se aplicó el tratamiento con mayor concentración de K+ (40
mM), presentaron un crecimiento superior a las del tratamiento 1 (Fig.11). Sin embargo,
tampoco se obtuvo un desarrollo óptimo para que la planta sobreviviera. La producción de
biomasa siguió el mismo patrón que el tratamiento anterior con un mayor desarrollo de la
raíz que de la parte aérea, aunque con un mayor peso seco de la planta.
Es sabido que el proceso de fijación de amonio se da cuando algunos cationes como
Ca2+, K+, Mg2+ y Na+ son reemplazados por iones de NH4+, y la descompensación de este
tipo de cationes provoca daños en el sistema vegetal causando síntomas de toxicidad
(Santa-María et al., 2000). Así, también es importante el hecho de que la cinética de
absorción de NH4+ y de K+ son muy similares, por lo cual se ha deducido que la
concentración de K+ limita la absorción de amonio, permitiendo a la planta dosificar los
67
niveles de NH4+ y proporcionando mejor capacidad para el desarrollo en la planta
(Szczerba et al., 2008). Dentro de este contexto, se sustentan los resultados de mayor
cantidad de biomasa en el tratamiento con aplicación de K+, a diferencia del tratamiento
con sustitución de sales.
Tratamiento 3: MS suplementado con K (40 mM) y Mg (5 mM)
El desarrollo de la parte aérea y raíz de las plantas crecidas bajo en este tratamiento
presentó mejoras con respecto al tratamiento en el que únicamente fueron sustituidas las
sales, muy similar al tratamiento 2, pero con la diferencia de que en este caso se dio mayor
crecimiento en la parte aérea que en la raíz en la planta (Fig.12). Seguía existiendo necrosis
y cambio de color, y las plantas no lograron completar su desarrollo y murieron. Se sugiere
que la contribución que presenta la aplicación de magnesio al mayor desarrollo de la
biomasa de la parte aérea viene dado precisamente por la mejora que se da en el proceso
principal en las hojas de la planta: la fotosíntesis. Es conocido que el Mg2+ tiene muchas
funciones dentro del proceso fotosintético, ya que está relacionado con el control del
apilamiento de los tilacoides, formando parte además de las clorofilas. El bombeo de Mg2+
de los tilacoides hacia el estroma en presencia de luz sirve para activar la ribulosa-1,5bisfosfato carboxilasa (RuBisCO). También se conoce que muchas reacciones enzimáticas
requieren este catión como promotor (Portis y Heldt, 1976).
Dadas estas implicaciones en el proceso fotosintético, se podría explicar los
resultados obtenidos en la parte aérea (Fig.12). Algunos estudios también sustentan
resultados similares en ensayos con girasol, donde se estudian los efectos de las fuentes de
N nítrica y amoniacal y las interacciones del magnesio en varios procesos fisiológicos. Se
determinó una baja tasa fotosintética en plantas crecidas con NH4+ sin adición de Mg2+, no
así en plantas con suministro de este catión en donde se determinó una importante mejora
en el proceso fotosintético de la planta (Lasa et al., 2000).
68
Tratamiento 4: MS con L-Glutamina
Las plantas de A. thaliana crecidas con L-glutamina como fuente de N presentaron
gran desarrollo radical y aparentemente un mejor desarrollo general, y a pesar de presentar
clorosis en sus hojas, siendo varias de color amarillento, se disminuyó el número de hojas
rojizas y aumentó el número de hojas verdes (Fig.13).
La mayor producción de biomasa se explica por el hecho mencionado
anteriormente: se da como respuesta al estrés al que se encuentra sometida la planta por
tener otra fuente de N, lo que hace que exista mayor desarrollo radical como sumidero de
carbohidratos y generación de esqueletos carbonados para disponer el N absorbido
(Gerendás et al. 1997).
La contribución en el desarrollo de las plantas por parte de la L-glutamina viene
dada por el papel fundamental que juegan los aminoácidos en la absorción y metabolismo
del N. Como es conocido, la asimilación de N inorgánico en esqueletos carbonados
representa un proceso fisiológico de mucha importancia para el crecimiento vegetal y su
desarrollo. Esta asimilación se da mediante la formación de aminoácidos como la glutamina
(Gln) y la asparragina (Asn), que desempeñan un papel fundamental en el transporte de N
en la planta.
Se ha establecido que la asimilación primaria de NH4+ en aminoácidos se produce a
través de la acción de la glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa (2-aminotransferasa
oxoglutarato, GOGAT). El paso inicial consiste en la aminación del glutamato a glutamina
por la GS, con la hidrólisis de ATP. La glutamina formada transfiere el grupo amido al 2oxoglutarato, dando lugar a dos moléculas de glutamato en una reacción catalizada por la
GOGAT. Las reacciones que catalizan estas enzimas se conocen como “ciclo GSGOGAT”, el cual es fundamental en el metabolismo del N en plantas (Lea y Miflin, 1980;
Esposito et al., 2005).
69
Como se puede ver en la figura 22 ya sea como nitrato o como amonio, mediante
varias reacciones enzimáticas dentro del ciclo GS-GOGAT, se da la incorporación de N a
compuestos carbonados generando aminoácidos lo cuales están disponibles dentro de la
planta.
Figura 22. Representación esquemática de la asimilación de nitrógeno. Los sistema enzimáticos
son: a, nitrato reductasa; b, nitrito reductasa; c, glutamina sintetasa; d, glutamato sintetasa; e,
transaminasa (Lea y Miflin, 1974).
De esta manera, se corrobora la mejora en la tasa de supervivencia (datos no
mostrados) de plantas con L-glutamina, ya que estaría actuando como una fuente de N de
fácil asimilación en la planta, donde el gasto de energía por ende sería menor y la planta
contaría con una fuente de N de absorción rápida. Se evitarían también los efectos tóxicos
ya mencionados generados por el NH4+ en la planta. Sin embargo, es necesario considerar
que tampoco se da un crecimiento normal y aún existe clorosis, lo cual descartando los
efectos de descenso de pH y desequilibrio iónico por el NH4+, podría ser un efecto generado
por deficiencia de N, ya que con la concentración aplicada no se alcanzarían los altos
niveles que A. thaliana requiere de este compuesto (10 mM respecto a 60 mM que es la
concentración total de N en el control MS en el cual se ha comprobado que su crecimiento
es óptimo).
70
Esto parece indicar que las plantas de A. thaliana requieren elevadas
concentraciones de NO3- para su crecimiento efectivo y las dosis de 1 y 5 mM amonio
podría resultar deficitarias. No está claro si también existe deficiencia en condiciones de
nutrición con Gln. En este sentido se realizó un experimento con la aplicación de 5, 10, 15
y 60 mM de Gln, en donde se determinó que la concentración con mejor respuesta en la
planta fue la de 10mM, sugiriendo que la concentración aplicada tiene efecto sobre el
crecimiento de las plantas.
Tratamiento 5y 6: Rigaud y Puppo (R y P) con sacarosa y sin sacarosa
Los tratamientos 5 y 6 son los que dentro del grupo de pruebas realizadas para
obtener un medio de cultivo óptimo para el crecimiento de A. thaliana contienen una
composición diferente, como se puede observar en el apartado 4.5 de materiales y métodos;
y es precisamente según los resultados de biomasa y de morfología el que mejor resultados
presentó, ya fuese con o sin fuente de sacarosa. En el caso del tratamiento 5 correspondió a
medio Rigaud y Puppo sin aplicación de sacarosa y el tratamiento 6 el mismo medio pero
con suplemento de sacarosa (Fig. 14 y 15)
La comparación de los componentes de este medio de cultivo y el medio MS no
mostró mayores diferencias en cuanto a macro y micronutrientes. Sin embargo, la principal
particularidad del medio RyP es la sustitución del CaCl22H2O del medio MS por
CaSO4.2H2O, y con esta variante la concentración del Cl- en el medio es aproximadamente
del orden de tres veces menor, lo cual sugeriría que la contribución de este medio al
desarrollo, crecimiento y estado general de la planta viene dado por la menor concentración
de este compuesto, que se ha registrado puede ser perjudicial para las plantas generando un
estrés abiótico.
Se ha registrado que el cloro como tal tiene una serie de funciones no específicas en
la plantas en pequeñas cantidades, sin embargo, su aumento puede causar varios problemas
en los tejidos vegetales. Está estrechamente relacionado con el metabolismo del N ya que
71
se ha visto que los iones de Cl- pueden sustituir a los de NO3-, por lo tanto puede descender
la absorción de NO3- por la competencia de estos dos iones (Van der Boom et al., 1990).
La diferencia de componentes del medio de R y P basado en los efectos dañinos del
Cl- sugiere ser la razón por la que este medio contribuye a un mejor crecimiento y
desarrollo de A. thaliana.
El tratamiento 5 generó una mayor biomasa, siendo éste el que no contenía sacarosa.
No obstante, se escogió el medio que contenía sacarosa como óptimo, basado en el criterio
que ya se ha mencionado sobre la importancia de contar con un suministro importante de
compuestos carbonados que sirvan como esqueletos para facilitar el proceso de asimilación
de N en condiciones de nutrición amoniacal y adicionalmente porque en este tratamiento
las plantas pudieron completar su ciclo hasta la floración.
72
6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
1.- Las plantas de Pisum sativum) y Arabidopsis thaliana crecidas en cultivo axénico
con NH4+ como única fuente de N muestran contenidos NO3-, NO2-, y en su caso NH2OH
tanto en la parte aérea como en la raíz, lo cual demuestra la existencia de una vía oxidativa
de amonio hasta NO3-.
2.- Los datos de las reacciones químicas in vitro a partir de NH3- y de NH2OH
indican que ciertos niveles de NO2- y NH2OH pueden ser producidos de modo no
enzimático aunque este efecto parece residual. Sin embargo, parece que la presencia de Feproteínas induce la formación de estas especies de N oxidado, especialmente las mediadas
por compuestos como la xantina, la XOD y la FeSOD.
3.- El importante papel de la Hb I en la movilización y suministro eficiente de
oxígeno se evidenció al propiciar en reacciones in vitro junto con riboflavina la obtención
de NO2- a partir de NH2OH. También parece esencial la función de la FeSOD en esta
reacción.
4.- Las plantas de A. thaliana presentaron signos de sensibilidad al crecimiento con
+
NH4 como clorosis, enrojecimiento, disminución del crecimiento y desarrollo. Sus hojas
fueron más pequeñas y su número disminuyó en la roseta formada por este tipo de especie y
la formación de raíz se vio aumentada con respecto al de la parte aérea, lo que sugiere que
esta especie no presenta tolerancia al NH4+.
5.- De los diferentes medios de cultivo testados se determinó que el medio Rigaud y
Puppo con sacarosa es el que mejor crecimiento reportó a la planta, sin embargo por la
sensibilidad de esta especie al NH4+ el desarrollo siempre se vio disminuido. Se dio una
mayor biomasa con 1mM de amonio por lo que se puede decir que la concentración de
5mM presenta mayor nivel de toxicidad en esta especie.
73
6.- Las plantas de Pisum sativum no presentaron dificultad para crecer en un medio
con presencia de NH4+ como única fuente de N en las condiciones ensayadas,
estableciéndose así exitosamente el cultivo in vitro sin que se afecte a su crecimiento y
desarrollo. No existieron diferencias entre el las concentraciones de 1 y 5 mM de amonio.
74
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