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“TESIS DE DIPLOMA”
Caracterización de la fertilidad y resistencia
al moho azul (Peronospora hyoscyami) desde
estadios de semillero en híbridos interespecíficos
de Nicotiana tabacum x Nicotiana megalosiphon.
Rasiel González García.
Tutor: M.Sc.Humberto García Cruz.
Año: 2015.
Facultad de Biología
Ciudad de La Habana
2015
“TESIS DE DIPLOMA”
Caracterización de la fertilidad y resistencia al moho azul (Peronospora hyoscyami) desde
estadios de semillero en híbridos interespecíficos de Nicotiana tabacum x Nicotiana
megalosiphon.
Autor: Rasiel González García.
Tutor: M.Sc. Humberto García Cruz
Instituto de Investigaciones del Tabaco
Correo electrónico: [email protected]
Facultad de Biología, Universidad de La Habana
Año: 2015
A mis abuelos Mirka y Evaristo
AGRADECIMIENTOS.
Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas e instituciones
que por su inestimable colaboración me han permitido realizar el presente trabajo.
Especial agradecimiento a mi tutor Humberto García Cruz por su ayuda incondicional y en
todo momento, por el apoyo, la educación, la formación y los consejos que me ha dado
durante el desarrollo de este trabajo.
A Emilio por su ayuda incondicional en este proyecto, por facilitarnos realizar los
experimentos en el laboratorio de microscopía del CEA (Centro de Estudios Avanzados)
A Leixys Rodríguez Rodríguez por ayudarme en los diferentes experimentos y guiarme en
la confección de este trabajo.
A todos los integrantes del Departamento de genética del Instituto de Investigaciones del
Tabaco que de una forma u otra contribuyeron en este proyecto.
A María del Carmen Castro Fernández por su apoyo, consejos y enseñanzas.
A Humbertico, Alejandro y Javier por toda la ayuda prestada a lo largo de este trabajo
A Eglis por su ayuda en la preparación del material objeto de este estudio.
A mi Mamá y mi Papá por el apoyo el ánimo y los consejos.
A todos ¡Muchas Gracias!
1
Índice.
Índice……………………………………………………………………………………………...1
Resumen………………………………..………………………….…………………………...….2
Abstract………………………………..………………………….…………………...…………..3
1 Introducción………………………………..………………………….…………………...…4
1.1 Hipótesis de trabajo………………………………………………….………………….….....6
1.2 Objetivos.……………….….....………..………………………….……………………..……6
1.3 Tareas. …………………………..………………………….…………………………………6
1.4 Antecedentes del estudio. …………………………..……………………………………...…6
1.5 Importancia de la investigación. ……………………………….………………………..……8
1.5.1 Importancia teórica. …………………………..………………………………….…………8
1.5.2 Importancia práctica. ……………………..…………………………………..……………8
2 Revisión Bibliográfica…………..………………………….……………...…………………9
2.1 Generalidades del género Nicotiana…………………………………………………………..9
2.2 Clasificación del género Nicotiana…………………………………………………………..10
2.3 Características de Nicotiana tabacum……………………………….……………………....10
2.4 Características de Nicotiana megalosiphon …………………………………………………11
2.5 Características de los híbridos interespecíficos, importancia en el mejoramie genético.…...12
2.6 Mejoramiento genético en Cuba de Nicotiana tabacum………………………………………….14
2.7 Moho azul (Peronospora hyoscyami)……………………………………………………………...17
2.8 Grano de Polen………………………………………………………………………………20
2.8.1 Polen: características e importancia en la hibridación interespecífica……………………..20
2.8.2 Estructura de un grano de polen…………………………………………………………...20
2.8.3 Viabilidad del polen………………………………………………………………………..20
2.8.4 Principales técnicas utilizadas para determinar la viabilidad del polen…….……………..21
2.8.5 Germinación………………………………………….……………………………………23
3 Materiales y métodos…………………………………………….…………………………23
3.1 Prueba de resistencia al moho azul en semillero…………………………………………….25
3.2 Análisis de viabilidad del polen………………………..……………………………………26
3.2.1 Tinción con acetocarmín (Muñoz et al, 2006)……………….…………………...………27
3.2.2 Crecimiento in vitro del tubo polínico (Shivanna y Rangaswamy 1992) ………………..….27
3.2.3 Crecimiento in vitro del tubo polínico (Brewbaker y Majumder, 1961)……………...……28
3.3 Conteo de semillas……………………………………………………………………………29
4 Resultados. ………………………………...……..………………………………………….31
4.1 Datos cualitativos de la prueba de resistencia al moho azul………..………………………...31
4.2 Porcentajes de polen viable obtenidos según el método (Muñoz et al, 2006)……..………...32
4.3 Porcentajes de polen viable obtenidos según el método (Shivanna y Rangaswamy 1992) …...32
4.4 Porcentajes de polen viable obtenidos según el método (Brewbaker y Majumder, 1961).....34
4.5 Promedio de semillas por cápsulas…………………………………………………………..34
5 Discusión: ………………………….………………………………………………………..34
6 Conclusiones: ………………………………..………….………………………………..…37.
7 Recomendaciones: ……………………………….…………….……………………………38
8 Bibliografía…………………………….…………….……………………..………………..39
2
Resumen
Las variedades de tabaco (Nicotiana tabacum) son, desde estadios tempranos, sumamente
susceptibles al moho azul (Peronospora hyoscyami), para resolver este problema se ha empleado
la hibridación interespecífica con el fin de trasferir los genes de resistencia a este patógeno, de
esta manera se produce un híbrido poco estable genéticamente, o con esterilidad parcial o total.
Los objetivos generales del presente trabajo consistieron en caracterizar la resistencia al moho
azul desde estadios de semillero, en un hibrido interespecífico resultante del cruce entre
Nicotiana tabacum y Nicotiana megalosiphon como parte de un programa de mejoramiento
desarrollado en el Instituto de Investigaciones del Tabaco, además de la realización del análisis
de la viabilidad del polen y el conteo de semillas con el fin de evaluar la fertilidad de dichas
plantas. La determinación de la resistencia al moho azul en semillero de los progenitores, el
hibrido y el testigo susceptible, se realizó en parcelas experimentales expuestas a la infección del
patógeno bajo condiciones naturales, donde se obtuvo 100% de resistencia a la enfermedad por
parte del genotipo híbrido, lo que no ha sido reportado en la literatura consultada.. El análisis de
viabilidad del polen se llevó a cabo por tres métodos diferentes; tinción de colorante vital con
acetocarmín al 2%, donde se obtuvo un 55.59% de polen viable en el genotipo híbrido, lo que
representa una viabilidad media, y por dos métodos de crecimiento in vitro del tubo polínico, el
primero arrojo resultados muy pobres en cuanto a porciento de polen viable para todos los
genotipos, posiblemente debido a las condiciones en que fue desarrollada la prueba, y el segundo
dio como resultado un 40% de polen viable, todo ello comparado con los resultados obtenidos en
los restantes genotipos. El genotipo híbrido rindió como promedio 42 semillas por cápsulas lo
que constituye una baja producción de las mismas respecto a lo informado con relación a las
variedades comerciales. Los híbridos interespecíficos entre Nicotiana tabacum y Nicotiana
megalosiphon desarrollados en el Instituto de Investigaciones del Tabaco son resistentes al ataque
3
del moho azul (Peronospora hyoscyami) desde estadios de semillero, su polen es medianamente
viable y presentan una baja producción de semillas.
Abstract:
Varieties tobacco (Nicotiana tabacum) are, from early stages, extremely susceptible to blue mold
(Peronospora hyoscyami), to solve this problem has been used interspecific hybridization in
order to transfer the resistance genes to the pathogen, thus a hybrid occurs genetically unstable, or
with partial or total sterility. The general objectives of this study were to characterize the
resistance to blue mold from seedling stages, resulting in a interspecific hybrid crossing between
Nicotiana tabacum and Nicotiana megalosiphon as part of a breeding program developed in the
Tobacco Research Institute, plus performing the analysis of pollen viability and seed count in
order to evaluate the fertility of said plant. The determination of the resistance to blue mold in
seed parent, the hybrid and the susceptible check was carried out on experimental plots exposed
to the infection of the pathogen under natural conditions, where 100% resistance was obtained
disease by hybrid genotype, which has not been reported in the literature. The pollen viability
analysis was carried out by three different methods; vital dye staining with acetocarmine 2%,
where 55.59% of viable pollen in the hybrid genotype was obtained, representing an middle
viability, and two methods of in vitro pollen tube growth, the first yielded very poor results as
percentage of viable pollen for all genotypes, possibly due to the conditions under which the test
was developed, and the second resulted in 40% of viable pollen, all compared with the results
obtained for the other genotypes. The hybrid genotype yielded an average 42 seeds per capsule
which is a low production of seed regarding the information provided in relation to commercial
varieties. Interspecific hybrids between Nicotiana tabacum and megalosiphon developed in the
4
Tobacco Research Institute are resistant to attack blue mold (Peronospora hyoscyami) from
seedling stage, its pollen is middle viable and have a low seed production.
Palabras Claves: Nicotiana, moho azul, resistencia, semillero, híbrido interespecífico,
viabilidad, polen, fertilidad.
Introducción.
El género Nicotiana está constituido en su mayoría por especies que, aunque no tienen una
importancia económica directa, ofrecen un potencial genético primordial que puede ser
aprovechado en el mejoramiento genético de las especie
Nicotiana tabacum. El tabaco
(Nicotiana tabacum) presenta grandes ventajas para el mejoramiento genético entre las que se
pueden mencionar, la facilidad de cruzamiento que presenta por la forma tamaño y estructura de
la flor la cual es cómoda para la manipulación, también el hecho de que es una planta autógama.
Por estas y otras características esta es una de las plantas más estudiadas y en la que se han
realizado más investigaciones, particularmente en el área de la genética, y específicamente en el
mejoramiento genético de variedades de interés comercial con la utilización de especies del
mismo género. La hibridación interespecífica han servido como método para transferir genes de
resistencia a diferente patógenos como el moho azul del tabaco (Peronospora hyoscyami) y otras
enfermedades que afectan a los cultivos, por lo que la caracterización de la fertilidad y la
expresión correcta de los genes de resistencia trasferidos es de gran importancia.
La hibridación interespecífica es el cruzamiento de diferentes especies taxonómicas con la
conservación de ciertos tipos producidos a partir de los productos de segregación (Allard, 1970).
Se realiza entre especies del mismo género. Generalmente lo que se persigue con ella en el
mejoramiento genético de las plantas cultivadas, es la transferencia de algunos caracteres de una
especie silvestre a una cultivada sin daño de su integridad taxonómica, o sea lo que ocurre es un
5
pequeño enriquecimiento de una especie con genes de la otra, aumentando su variabilidad
genética e incrementando los productos de recombinación que se pueden conseguir de ella
(Allard, 1960).
Esta técnica se usa con diferentes objetivos como por ejemplo: introducir en una especie
resistencia a enfermedades, mejorar el porte, el rendimiento, el color, elevar la calidad, regular el
contenido de alcaloides u otra característica que porta la otra especie. En el caso específico del
tabaco, la hibridación interespecífica ha sido una herramienta muy valiosa para la obtención de
variedades resistentes a numerosas enfermedades que afectan este cultivo, como por ejemplo el
moho azul, tan importante para la economía cubana, sin embargo los genomas de las especies del
género tienen diferencias que provocan que generalmente el híbrido sea poco estable
genéticamente y presente una esterilidad parcial o total. Por esta razón el conocimiento y análisis
del comportamiento de los híbridos constituyen aspectos que debe conocer el fitomejorador
(Cornide et al, 1985). Herramientas tales como el análisis de viabilidad del polen en las plantas
resultantes es muy útil para el estudio del desarrollo de estas en los programas de mejoramiento.
A su vez los estudios relacionados con la calidad del polen son de gran importancia en
investigaciones relacionadas con la reproducción sexual, pues permiten asegurar el éxito de las
hibridaciones e incrementar la eficiencia del mejoramiento. Además proveen información sobre
cuál estrategia favorece el éxito de los cruces interespecíficos. El control de la producción de
semillas, en el caso de que fueran producidas por las plantas producto de este cruzamiento,
permite al investigador evaluar cuantitativamente el nivel de fertilidad alcanzada por la
descendencia híbrida en cuanto a este carácter.
Teniendo en cuenta todos los aspectos expuestos anteriormente, se consideró la siguiente
6
Hipótesis de trabajo:
A partir del cruzamiento sexual entre Nicotiana tabacum y Nicotiana megalosiphon es posible
obtener plantas hibridas resistentes al moho azul desde estadios de semillero con una fertilidad
que permita la obtención de sucesivas generaciones.
Objetivos.
- Medir la resistencia al moho azul desde estadios de semillero en híbridos interespecíficos
resultantes entre el cruce de Nicotiana tabacum y Nicotiana megalosiphon provenientes de un
programa de mejoramiento desarrollado en el Instituto de Investigaciones del Tabaco.
- Evaluar la viabilidad del polen de las plantas que superaren la prueba de resistencia en
semillero al moho azul.
- Determinar el nivel de producción de semillas.
Tareas.
 Pruebas de resistencia al moho azul en estadios tempranos.
 Selección en semillero de las plántulas resistentes al moho azul.
 Cultivo de estas plántulas resistentes hasta la adultez.
 Análisis de la viabilidad del polen de las plantas adultas.
 Conteo de semillas por cápsulas.
Antecedentes del estudio.
Nicotiana se encuentra entre los géneros de mayor número de especies de la familia Solanaceae.
Ellas son empleadas en la mejora genética con el objetivo de aumentar las producciones,
mantener o incrementar su calidad comercial y abaratar los costos por concepto de insumos (Siva
Raju et al, 2008). Durante mucho tiempo, se cultivaron en Cuba variedades comerciales de
7
tabaco de la especie Nicotiana tabacum sin afrontar graves daños y pérdidas debido a enemigos
naturales. Sin embargo a partir del siglo XX, numerosas plagas afectan al cultivo en todo el
mundo, conspirando contra el desarrollo de éstos. Los patógenos de mayor interés, por las
cuantiosas pérdidas que provocan en las plantaciones del cultivo del tabaco son: Peronosphora
hyosciamy f.sp tabaciana Adam, causante de la plaga moho azul, Phytophtora parasítica var
nicotianae Breda de Haan, que provoca la plaga conocida como pata prieta, y los virus Y de la
papa y del mosaico del tabaco (Espino et al, 2000). Es por ello que los cruzamientos
interespecíficos son de gran importancia pues constituyen una vía para transferir genes de
resistencia a las variedades comerciales.
El mejoramiento genético en el que se emplea la hibridación, brinda la posibilidad de obtener
nuevas combinaciones de genes, lo que aumenta la variabilidad genética de las especies y la
capacidad de éstas de responder ante los cambios ambientales, tanto bióticos como abióticos
(Pérez, 2002). En Cuba, los programas de mejoramiento genéticos han estado dirigidos desde sus
inicios, a la búsqueda de nuevas variedades mejor adaptadas a las condiciones de cultivo del país,
con características agronómicas de interés económico, resistentes a los principales patógenos y
que a la vez conserven las cualidades organolépticas que caracterizan al tabaco cubano y por lo
que ha alcanzado su fama mundial (Espino, 1988). Todas las variedades cubanas que se siembran
comercialmente en nuestro país presentan diferentes grados de resistencia al moho azul, pero en
todos los casos esa resistencia se manifiesta partir de la tercera semana de trasplantadas las
posturas, aun cuando su resistencia proviene de diferentes fuentes, lo que significa que en los 60
días precedentes hay que prestarle adecuada protección fitosanitaria con el obligatorio empleo de
productos químicos, fuerza de trabajo (inversión económica) y agresión al medio ambiente.
8
Muchas de las diversas especies del género Nicotiana son portadoras de genes de resistencia al
moho azul, algunas de ellas son casi inmunes a esta enfermedad, tal es el caso de Nicotiana
exigua, Nicotiana megalosiphon, y Nicotiana exelxior en ese mismo orden.
La especie Nicotiana megalosiphon, probada en nuestras condiciones en múltiples ocasiones,
presenta resistencia al patógeno desde los primeros estadios de vida. En el Instituto de
Investigaciones del Tabaco se ha llevado a cabo un programa de mejoramiento genético
encaminado a lograr líneas básicas de mejoramiento genéticamente estables, con la resistencia al
moho azul que caracteriza a Nicotiana megalosiphon ( estadios de semilleros ) y que puedan ser
usados en el mejoramiento de variedades comerciales de Nicotiana. tabacum.
Importancia de la investigación.
Importancia teórica.
No existe en este momento plantas de Nicotiana tabacum resistentes al moho azul desde el
estadio de semillero, por lo que sería un gran avance para el cultivo del tabaco la obtención de
dicha planta. Las características que presenten los híbridos en cuanto a su respuesta ante la
enfermedad moho azul permitirán evidenciar y corroborar la presencia de los genes de resistencia
a este patógeno, además la viabilidad del polen y la producción de semillas, servirían como
herramienta para mejorar la eficiencia en el mejoramiento, y ampliarían los conocimientos
relativos a la hibridación interespecífica y sus resultados en este género.
Importancia práctica.
Se lograría demostrar el nivel de resistencia que poseen los híbridos desde semillero al moho
azul, y de acuerdo a los resultados es posible obtener una línea básica para ser utilizada en
programas de mejoramiento y en la obtención de variedades comerciales de tabaco con esas
características, lo que disminuiría drásticamente la utilización de fungicidas contaminantes,
evitando su importación y con ello disminuiría la agresión al medio ambiente, reduciría la fuerza
9
de trabajo utilizada para este cultivo y todo ello contribuiría a la reducción de los costos de
producción. Se obtendrían datos cuantitativos acerca de la fertilidad de los híbridos
interespecíficos en cuanto a viabilidad del polen y producción de semillas.
Revisión Bibliográfica.
Generalidades del género Nicotiana.
El género Nicotiana constituye dentro de la familia Solanaceae el sexto entre los de mayor
número de especies, después de Solanum L, Lycianthes Hassl., Cestrum L., Physalis L. y Lycium
L. (Chase et al, 2003). Las que en su mayoría se consideran especies silvestres. Sólo Nicotiana
tabacum L. y Nicotiana rustica L. son cultivadas extensivamente en las regiones tropicales y
subtropicales por su interés comercial, pues tienen importancia en la economía de muchos países
(Emilie, 2005). Ellas son empleadas en la mejora genética con el objetivo de aumentar las
producciones, mantener o incrementar su calidad comercial y abaratar los costos por concepto de
insumos (Siva Raju et al, 2008). Las especies silvestres del género Nicotiana poseen un amplio
reservorio genético y constituyen una valiosa fuente de resistencia a enfermedades, que puede ser
incorporada a las variedades de N. tabacum mediante la hibridación sexual. Un ejemplo de lo
anterior es la resistencia del tabaco al moho azul. La especie silvestre Nicotiana megalosiphon
Van Heurck et Müller es altamente resistente al ataque del moho azul desde los primeros estadios
de su ciclo biológico. Inclusive, la especie es resistente a otras enfermedades importantes del
tabaco como: Pseudomona syringae pato. var. tabaci raza 0, Chalara elegans, Erysiphe
cichoracerum (Stavely, 1979), a Phytophthora parasitica (Dast.) var.nicotianae (B. de Haan)
Tucker (Li et. al., 2006) y se ha descrito su resistencia a varios virus.
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Clasificación del género Nicotiana.
Tabla I: Clasificación del género Nicotiana según Knapp et al, (2004). Se incluyen los tres
subgéneros, secciones y especies que lo integran.
Características de Nicotiana tabacum.
El género Nicotiana se divide en tres sub-géneros: Rustica, Tabacum y Petunioides basado en la
morfología, posibilidades de cruce, número cromosómico y comportamiento de híbridos
11
interespecíficos (Siva et al, 2009). Nicotiana tabacum (2n=48) es la especie de Nicotiana de
mayor importancia y más conocida.
N. tabacum es un anfiploide natural cuyo surgimiento se piensa está ubicado en el este de los
Andes de Bolivia o al norte de Argentina, y pudiera ser un producto de la unión entre dos
gametos diploides o por hibridación entre dos especies progenitoras 2n=24 seguida de una
duplicación cromosómica (Goodspeed 1954; Gerstel y Sisson 1995). Aunque existen referencias
a un origen reciente para la especie (de 6000-10000 años) en escritos de origen no científico, si
ha sido demostrado mediante el uso de herramientas moleculares que la especie presenta menos
de 200 000 años (Leitch et al, 2007).
Características de Nicotiana megalosiphon.
Las especies constituyen reservorios de genes interesantes y disponibles para incorporar a un
cultivo mediante determinado programa de mejoramiento. Para el caso específico del cultivo del
tabaco, algunas características de las especies son particularmente tentativas como es el caso de
genes presentes en la especie N. megalosiphon (2x=2n=40) de origen australiano, la cual se
muestra prácticamente inmune a Peronospora hyoscyami sp. tabacina Adam. (moho azul), hongo
fitopatógeno responsable de una de las enfermedades más devastadoras del cultivo, y su
resistencia se manifiesta desde los primeros estadios de desarrollo (Durbin, 1979). Recientemente
han sido identificados genes que son inducidos durante la interacción N. megalosiphon- P.
hyoscyami). N. megalosiphon es una planta herbácea de crecimiento anual. Mide
aproximadamente 90 cm, muy pubescente, con abundante pelos glandulares; crece en forma de
roseta y presenta hojas delgadas, usualmente pecioladas, y punteadas. La inflorescencia es
panicular con algunas ramas, el cáliz mide de 10-20 cm de largo. Las flores son blancas,
alargadas y con forma de trompeta, presentan alrededor de 5 pétalos. Tiene propiedades tóxicas.
12
Características de los híbridos interespecíficos y su importancia en el mejoramiento
genético.
La hibridación o el proceso de reproducción sexual entre miembros de especies diferentes o
biotipos entre especies, produce plantas que poseen material genético de ambos progenitores. En
la mayoría de los casos, los eventos iniciales de hibridación resultan en plantas híbridas que son
anfiploides de cada genoma, en otras palabras, presentan un solo cromosoma homólogo de cada
conjunto de cromosomas parental. Como los cromosomas homólogos son normalmente pareados
durante la metafase I, la presencia de solo uno de cada par de cromosomas homólogos puede
alterar el funcionamiento normal de la meiosis. De hecho, la mayoría de los gametos producidos
en los híbridos presentan anomalías, tanto los granos de polen como los óvulos de la planta
híbrida son estériles o de baja viabilidad. Aunque los híbridos pueden obtenerse de muchas
especies diferentes, la hibridación de gametos haploides normales genera muy raramente plantas
fértiles, en algunos casos, las células sexuales que son producidas presentan más de un
cromosoma homólogo (Halfhill y Warwick, 2008). Cuando los cromosomas homólogos se
separan durante la meiosis pueden generar gametos con el juego de cromosomas completo del
progenitor (gametos no reducidos). Si dos gametos no reducidos se fertilizan, el híbrido
resultante puede poseer el genoma completo de cada especie parental. En este caso, la meiosis
puede funcionar normalmente, y la planta híbrida representa una nueva especie de único número
de cromosomas. Las especies que contienen múltiples genomas o múltiples juegos de
cromosomas más allá del nivel de diploidía se denominan poliploides (Halfhill y Warwick,
2008).
Las consecuencias genéticas de la segregación en cruzamientos entre subespecies son la
segregación y recombinación de los alelos responsables de importantes diferencias morfológicas,
fisiológicas y de adaptación que separan las especies. Si los conjuntos de genes de los
13
progenitores representan combinaciones génicas equilibradas, existen muchas posibilidades de
que estas nuevas combinaciones de genes sean inferiores a las originales, y la nueva población
híbrida tendrá una adaptación menor que cualquiera de los tipos progenitores.
La hibridación es un proceso importante que ocurre en el desarrollo de muchos cultivos agrícolas.
Muchos cultivos poliploides han sido desarrollados por una combinación de gametos no
reducidos o por duplicación de cromosomas posterior a la hibridación de gametos haploides. La
hibridación interespecífica y la subsiguiente introducción de la porción del genoma de una de las
especies en la otra, es frecuentemente reconocido como una fuente de variación genética y una
novedad genética, en algunos casos eventos de hibridación exitosos promueven una rápida
radiación hacia la especiación (Halfhill y Warwick, 2008).
La producción de híbridos interespecíficos también es de utilidad para la introducción de genes
de importancia desde otras especies. Después de obtener híbridos interespecíficos, se requieren
variados métodos para su incorporación a los programas de mejoramiento. En el caso de que los
híbridos interespecíficos de la F1 sean fértiles, los descendientes de la F2 y las generaciones
posteriores heredan los genes de ambos parentales, esto ocurre sin dificultad entre especies muy
relacionadas (ejemplo el cruce entre Primura vulgaris y Primura veris) (Richards, 1993). Sin
embargo, cuando los híbridos F1 son total o parcialmente estériles, se considera que la
composición genómica entre ambos parentales es más o menos diferente. En tales casos, es
necesario propagar vegetativamente a las progenies F1 estériles que heredan aquellos caracteres
de interés de los progenitores.
La producción de híbridos interespecíficos se ve afectada por la existencia de varias barreras
reproductivas, que se clasifican en dos categorías: barreras de pre-fertilización y post-fertilización
respectivamente. Particularmente, las barreras de post-fertilización incluyen los defectos o
crecimiento anormal del endospermo, y el crecimiento anormal o el aborto del embrión híbrido
14
debido a desbalances genéticos. La inviabilidad de los híbridos frecuentemente se refiere como
letalidad híbrida, se observa en algunas especies vegetales, incluyendo a Nicotiana (Hidaka et al,
1979). Para el género Nicotiana, la letalidad híbrida se clasifica en cuatro tipos basándose
síntomas superficiales como sigue: Tipo I, marchitez en ápices de brotes; Tipo II, marchitez en
hipocótilos y raíces; Tipo III, amarillamiento de hojas verdaderas; y Tipo IV, formación de brotes
(Hidaka el al, 1979)
No obstante a ello, el rescate de embriones puede ocurrir con el empleo de técnicas de cultivo,
entre ellas la germinación in vitro de gran importancia para obtener plantas interespecíficas
(Woodell, 1960). La relativa dificultad en obtener híbridos F1 interespecíficos es proporcional a
la relación taxonómica entre los progenitores (mientras más distantes sean las especies más
difíciles es la obtención del híbrido). Algunos híbridos F1 son estables cuando son llevados a
poliploides fértiles, incluso híbridos provenientes de progenitores muy diferentes pueden mostrar
alguna homología cromosómica. Existen ventajas en mantener reservas de semillas alopoliploides
obtenidas por autopolinización, particularmente si es difícil de obtener el híbrido mediante cruces
convencionales (Fitzmaurice, 2002).
Mejoramiento genético en Cuba de Nicotiana tabacum.
Durante mucho tiempo, se cultivaron en Cuba variedades comerciales de tabaco de la especie N.
tabacum sin afrontar graves daños y pérdidas debido a enemigos naturales. Sin embargo a partir
del siglo XX, numerosas plagas afectan al cultivo en todo el mundo, conspirando contra el
desarrollo de éstos. Los patógenos de mayor interés, por las cuantiosas pérdidas que provocan en
las plantaciones del cultivo del tabaco son: Peronospora hyosciamy f.sp tabaciana Adam,
causante de la plaga moho azul, Phytophtora parasítica var nicotianae Breda de Haan, que
provoca la plaga conocida como pata prieta, y los virus Y de la papa (PVY) y del mosaico del
tabaco (TMV) (Espino et al, 2000). Es por ello que los cruzamientos interespecíficos son de gran
15
importancia pues constituyen una vía para transferir genes de resistencia a las variedades
comerciales. En Cuba, los programas de mejoramiento genéticos han estado dirigidos desde sus
inicios, a la búsqueda de nuevas variedades mejor adaptadas a las condiciones de cultivo del país,
con características agronómicas de interés económico, resistentes a los principales patógenos y
que a la vez conserven las cualidades organolépticas que caracterizan al tabaco cubano y por lo
que ha alcanzado su fama mundial (Espino, 1988).
La hibridación interespecífica ha sido una de las vías principales por las que se han originado las
plantas cultivadas e incluso ha permitido la formación de nuevas especies,
por tanto, el
conocimiento y análisis del comportamiento de los híbridos constituyen aspectos que debe
conocer el fitomejorador (Cornide et al, 1985). El mejoramiento genético en el que se emplea la
hibridación, brinda la posibilidad de obtener nuevas combinaciones de genes, lo que aumenta la
variabilidad genética de las especies y la capacidad de éstas de responder ante los cambios
ambientales, tanto bióticos como abióticos (Pérez, 2002).
Se conoce que las especies N. debneyi, N. exigua Wheeler, N megalosiphon, N. goodspeedii HM. Wheeler, N.rustica L, N. excelsior J.M.Black y N. velutina poseen genes de resistencia al
moho azul, enfermedad causada por el hongo Peronospora hyosciamy f.sp tabacina Adam
(Delon et al, 1999). De ahí que las variedades comerciales hayan incorporado estos genes de
algunas de estas fuentes, las que pueden manifestar diferente tipo de herencia y comportamiento
frente al patógeno (Delon, 1992).
En la actualidad se desarrollan proyectos dirigidos a introducir genes de resistencia al moho azul,
mediante cruzamientos interespecíficos con N. megalosiphon, la cual tiene la ventaja de expresar
la resistencia desde la etapa de semillero. De esta manera se desarrollan investigaciones con
vistas a la obtención de híbridos entre N. megalosiphon y dos variedades de N. tabacum, la BH-
16
13 (Pérez et al, 2003) y la VR-14 (García et al, 2008), en los que se han combinado el método de
cruzamiento interespecífico con el método biotecnológico haploide-diploide.
La mayoría de los métodos de mejoramiento incorporan la hibridación sexual como método para
generar nueva variación genética. La hibridación puede ocurrir de manera natural, como en el
caso del cruce entre especies, o puede requerir de una manipulación tediosa de flores en el caso
de ser provocada por el mejorador por medio de una polinización intencional entre especies. En
casos especiales, la hibridación sexual ha sido utilizada como método que combina
características de especies que raramente resultan de un cruce fértil. Los métodos para obtener
híbridos en especies que se autofecundan requieren de emasculación (remoción de anteras) e
introducción de polen de otras plantas. La sincronía en los pasos, y los métodos de mejores
resultados son críticos. Otra manera de obtener híbridos interespecíficos, aún cuando pueda
existir incompatibilidad entre las especies, es mediante la hibridación somática por la fusión de
protoplastos, que permite además la transmisión biparental de los orgánulos citoplasmáticos. Esto
no es posible por fecundación, pues el gameto femenino es el que aporta prácticamente la
totalidad del citoplasma al formarse el cigoto (Ilcheva et al, 2000).
La irregularidad en la meiosis de los híbridos que se obtienen por cruzamientos interespecíficos,
no es un impedimento para el empleo de estas especies en el mejoramiento, ya que se ha
demostrado que mediante el cultivo de óvulos o anteras del híbrido, seguido de la duplicación del
genoma de las plantas haploides obtenidas, ya sea por métodos químicos o biotecnológicos, se
logra la regularidad de la meiosis en las líneas isogénicas resultantes (método haploide–diploide)
(Wernsman, 1999). De esta forma, se puede emplear la diversidad genética que poseen las
especies no comerciales del género Nicotiana para ampliar la base genética de las variedades
comerciales.
17
En Cuba, García et al, (2008) informaron avances en la obtención de híbridos interespecíficos
entre N. megalosiphon y N. tabacum, con el objetivo de transferir la fuente de resistencia al moho
azul que posee N. megalosiphon, dado que a diferencia de otras fuentes, ésta confiere resistencia
desde la etapa de semillero, lo que permitirá finalmente establecer una variedad comercial de N.
tabacum con este tipo de resistencia incorporada y con ello se reducirían las pérdidas por el
ataque del hongo durante esta primera etapa del cultivo.
Moho azul (Peronospora hyoscyami).
La enfermedad del moho azul puede causar síntomas variables, tanto en los semilleros y
plantaciones de tabaco. En semilleros, ocurre el amarillamiento y la reducción en forma acopada
de las hojas, las cuales eventualmente adquieren una coloración marrón y mueren (Kucharek,
2001). También, antes de la elongación del tallo, es posible el desarrollo de una infección
sistémica severa, las hojas se distorsionan, se tornan de color amarillo y puede ocurrir una
decoloración vascular (Kucharek, 2001). En los campos donde se establece la infección, las
plantas adultas presentan manchas de varias formas y tamaño, las cuales usualmente comienzan
de color amarillo y luego adquieren un color marrón (Kucharek, 2001).
Las nuevas
esporulaciones se localizan en la superficie abaxial de la hoja y presentan una coloración desde
blanco a azul grisáceo que con la edad adquieren un color marrón (Kucharek, 2001). Síntomas
característicos de la enfermedad del moho azul del Tabaco producido por Peronospora
hyoscyami f sp. tabacina : amarillamiento y reducción acopada de hojas en plantas jóvenes,
presencia de manchas amarillas en hojas de plantas adultas, presencia de manchas de color
marrón en hojas de plantas adultas y esporulación en hojas.
El uso de variedades resistentes es una de las tácticas empleadas para el manejo integrado del
moho azul. A partir de 1970, debido a que todas las variedades comerciales de tabaco eran
susceptibles a esta enfermedad, se desarrollaron en Cuba nuevos programas de mejoramiento
18
genético, utilizando como única fuente de resistencia a N. debneyi, para la obtención de
variedades resistentes (Espino y col., 1998).
De estos programas, surgieron las variedades comerciales Habana 92 y Habana 2000 (Espino,
1996), las cuales en el año 1993 comenzaron a sembrarse a gran escala en algunas de las
provincias centrales. Posteriormente, se extendieron a las provincias occidentales, lo que permitió
una reducción de los niveles de inóculo en los primeros dos a tres años (Espino, 1996).
También se desarrollaron otras variedades como Criollo 98, Corojo 99 y Habana Vuelta Arriba,
las cuales son empleadas en los programas de mejoramiento por su resistencia a la enfermedad
(Espino y col., 1998). Sin embargo, en las últimas campañas las variedades comerciales actuales
se han comportado de manera susceptible.
En Nicotiana tabacum, la resistencia al moho azul es baja (Rufty, 1989) y la mayoría de los
cultivares comerciales son altamente susceptibles (Lea, 1963; Clayton y col., 1967). Por este
motivo, es importante la búsqueda de nuevas fuentes de resistencia para ser introducidas en los
programas de mejoramiento. Un ejemplo de ello lo constituyen las especies silvestres N. exigua
(Hill, 1966), N. goodspeedii (Clayton, 1968), N. megalosiphon (Pérez y col., 2003), N. obtusifolia
(Heist y col., 2004) y N. langsdorffii (Zhang y Zaitlin, 2008), las cuales son prácticamente
inmunes a la enfermedad.
En el caso específico de N. megalosiphon y N. exigua, estas son fuentes de resistencia a las razas
APT1, APT2, APT3 y PT-2 descritas para P. hyoscyami f sp. tabacina (Hill, 1966; Jankowski,
1971).
Se conoce que la resistencia al moho azul está determinada por tres pares de genes (Lucas, 1965)
y un número indeterminado de genes modificadores, esto da lugar a una herencia cuantitativa que
determina grados de resistencia. Es lógico pensar que ciertas combinaciones genéticas ofrezcan
mayor protección que otras ante una invasión del patógeno, por lo que el éxito de un programa de
19
mejoramiento recae, en un elevado porcentaje, en la estrategia de selección de los genotipos
resistentes. Mc Intyre y col. (1981), mostraron que en plantas de N. tabacum que contenían el
gen N, al ser inoculadas en las hojas inferiores con el TMV se indujo la respuesta SAR,
proporcionando protección contra la infección posterior con P. hyoscyami f sp. tabacina. Ensayos
mediante el empleo del cultivar de tabaco KY14, que contiene el gen N, revelaron que la
inoculación inicial con TMV o P. hyoscyami f sp. tabacina, incrementó la actividad de las ß-1-3glucanasas (PR-2) (Ye y col., 1990). Además, se observó a través del uso de plantas transgénicas,
que la expresión de las PR-2 tiene un papel importante en la protección de plantas contra este
patógeno (Ryals y col., 1996; Lusso y Kuc 1996).
Los cruzamientos interespecíficos han sido utilizados fundamentalmente como una vía para
transferir genes de resistencia a las variedades comerciales (Pérez et al, 2008). Por lo tanto, se
incrementa la importancia de identificar, entre las especies consideradas silvestres, aquellas que
puedan constituir fuentes de resistencia a las principales plagas que afectan el cultivo (Siva Raju
et al, 2009 y Valdés et al, 2010). En la literatura se ha descrito la presencia de genes de
resistencia al moho azul Peronospora hyoscyami f.sp tabacina Adam en las especies Nicotiana
debneyi Domim, Nicotiana megalosiphon Heurck y Mueller, Nicotiana goodspeedii Wheeler,
Nicotiana rustica Linneaus, Nicotiana excelsior Black y Nicotiana velutina Wheeler (Delon et al,
1999). De ahí que se hayan incorporado, en las variedades comerciales, genes de algunas de las
fuentes mencionadas, que permiten manifestar diferente tipo de herencia y comportamiento frente
al patógeno (Delon, 1992). En Cuba la fuente de resistencia al moho azul más utilizada es la
proveniente de N. debneyi, que tiene el inconveniente de expresarse después de varias semanas
del trasplante y alcanzar el máximo grado de expresión en la etapa de floración. Por esta razón,
pueden ocurrir pérdidas por el ataque de este patógeno en la etapa de semillero y primeras
semanas de trasplantadas las posturas, si no se toman las medidas necesarias (Espino, 2009). Es
20
por ello que en la actualidad se desarrollan proyectos dirigidos a introducir genes de resistencia al
moho azul, mediante cruzamientos interespecíficos con N. megalosiphon, la cual tiene la ventaja
de expresar la resistencia desde la etapa de semillero (Pérez et al, 2008).
Grano de Polen
Polen: características e importancia en la hibridación interespecífica.
Los estudios de viabilidad del polen son importantes para los programas de mejoramiento y para
los estudios de fertilidad e incompatibilidades, por sólo citar algunos ejemplos. Los estudios
relacionados con la calidad del polen son de gran importancia en investigaciones relacionadas
con la reproducción sexual, y especialmente en las condiciones del trópico cálido y húmedo, pues
permiten asegurar el éxito de las hibridaciones e incrementar la eficiencia del Mejoramiento.
Además proveen información sobre cuál estrategia favorece el éxito de los cruces
interespecíficos.
Estructura de un grano de polen
Un grano de polen está formado por una cubierta externa dura: la exina. En esta cubierta existe
un poro que puede ser más o menos visible. En su interior la célula vegetativa que contiene un
núcleo y los gametos masculinos (Wikipedia, 2013).
Un grano de polen de tamaño grande por tener mayores reservas nutritivas en el citoplasma, pude
desarrollar un tubo polínico de mayor longitud a mayor rapidez que uno de polen pequeño
(Kumar et al, 2006). Sin embargo, observan que la mayor capacidad del grano de polen para
competir en la fecundación no siempre depende de su tamaño, sino de su habilidad para fecundar.
(Soto et al, 2004).
Viabilidad del polen
La viabilidad de los granos de polen ex situ, usualmente es determinada empleando métodos de
tinción con colorantes como acetocarmín, yoduro de potasio, azul de metileno y fucsina básica,
21
orceína, búfalo black, etc. (Singh, 2007). En estas pruebas, se consideran granos de polen viable a
los intensamente coloreados y estéril a los menos coloreados o acromáticos. No obstante, la
mayoría de estos métodos se basan en la afinidad de las células por determinadas sustancias
colorantes, que generalmente sobrestiman la fertilidad del polen y escasamente pueden
determinar el poder germinativo real de los granos de polen o la capacidad de extensión de los
tubos polínicos (Jahier, 1996). Para evaluar con mayor precisión la fertilidad masculina de
numerosas especies vegetales se han establecido procedimientos in vitro que hacen posible la
germinación del polen bajo condiciones controladas (Heslop-Harrison, 1971; Singh, 1996).
El polen de tabaco almacenado a 0 ºC y menos del 50 % de humedad relativa, mantiene la
viabilidad para 136 semanas con tendencia a continuar viable por un largo tiempo (Dean, 1965).
Uno de los factores que influye en la fecundación es la autoincompatibilidad fisiológica
controlada genéticamente para producir frutos por autofecundación: se debe a que el polen no
llega a germinar y si lo hace el tubo polínico no logra penetrar a través del estigma o crece tan
lentamente que no alcanza a efectuar la fecundación; en probable que la velocidad de crecimiento
de los tubos polínicos este influida por el sistema genético que controla la incompatibilidad
(Pérez et at., 1997).
La alteración en la viabilidad del polen es un indicador de la existencia de cambios en el genotipo
de las plantas (Solis et al, 2005). La calidad del polen depende de factores diversos, incluyendo
la estabilidad genética de la variedad, el ambiente en el cual las plantas crecen hasta floración y
los métodos de colecta y almacenamiento de polen; es necesario disponer de polen con alta
viabilidad para propósitos de mejoramiento genético exitosos, y con frecuencia la información
sobre este tópico es escasa(Johri, 1984).
Principales técnicas utilizadas para determinar la viabilidad del polen.
22
Para determinar la germinación del polen in vitro es imprescindible encontrar un método de
cultivo adecuado. Generalmente se utiliza agar y sacarosa (Montalti y Selli, 1984; Burgos, 1991);
sin embargo, las concentraciones óptimas de sacarosa pueden variar dependiendo de especie. La
germinación in vitro podría dar una estima próxima a lo que ocurre en la realidad, al evaluar el
porcentaje de germinación y el crecimiento del tubo polínico, en la práctica este método da
resultados de viabilidad inferiores, debido a la dificultad de encontrar el medio de cultivo
adecuado para cada genotipo y a la influencia sobre la germinación de las variables micro
ambientales, las cuales son difíciles de controlar.
De las consideraciones anteriores se deduce la complejidad del proceso de la germinación y la
dificultad de obtener conclusiones. No obstante, los exámenes de laboratorio pueden ser muy
útiles, tanto en la comparación de variedades como en una primera aproximación para estimar el
estado del polen de una especie y las condiciones de nutrición y temperatura que precisa para
germinar. Por lo general, los cruzamientos interespecíficos tienen que ser combinados con otros
métodos que permitan vencer la esterilidad de los híbridos obtenidos, la que se produce como
consecuencia de las irregularidades observadas en la meiosis de los híbridos, debido a la falta de
homología entre los cromosomas heredados de las especies progenitoras, lo que dificulta la
formación de los bivalentes y como resultado se producen una serie de alteraciones durante la
meiosis que tienen como consecuencia la imposibilidad del híbrido de reproducirse (Marubashi y
Onosato, 2002; Tezuka y Marubashi, 2006).
De esta forma, el cultivo de anteras u óvulos y la posterior duplicación del genoma haploide por
métodos químicos, como el empleo de la colchicina o por cultivo de células del nervio central de
la hoja, permiten recuperar en poco tiempo la fertilidad del híbrido mediante la formación de
líneas isogénicas (Palakarcheva et al, 1995).
23
Germinación
La viabilidad del polen está íntimamente relacionada con la germinación de éste, y lo han
señalado otros autores (Bristow y Shawa ,1981; Abbott et al, 1991; Sawidis y Reiss, 1995; Yi et
al, 2003b). El crecimiento del tubo ocurre a una velocidad de varios milímetros por hora,
dependiendo tanto de la especie como de las condiciones climáticas y de la calidad del polen.
Dicho crecimiento se realiza solamente entre los 3-5 μm terminales de la punta del tubo polínico
(Paniagua et al, 2002). La germinación del polen in vitro permite hacer estimaciones confiables
de la fertilidad. Esta técnica simula el desarrollo del tubo polínico en los tejidos estilares, ya que
el medio de cultivo utilizado semeja en su composición al mucílago del estigma (RodriguezRiano & Dafni, 2000; Van Marrewijk, 1993). Existen esencialmente cinco aproximaciones para
evaluar la viabilidad del polen: mediciones de la respiración o de la conductividad química (muy
raramente utilizado); técnicas de tinción (colorantes vitales del citoplasma que son indicadores de
la actividad enzimática); germinación (in vitro e in vivo); contenido de prolina; y capacidad de las
semillas (Stanley y Linskens, 1974). Debido a que no existe “el mejor método” para examinar la
viabilidad del polen, se recomienda emplear diferentes métodos simultáneos para ser más
precisos (Rodriguez- Riano y Dafni, 2000).
Materiales y métodos
Se estudiaron plantas provenientes de un programa de mejoramiento desarrollado en el Instituto
de investigaciones del tabaco localizado en el kilometro 8 ½, de la carretera Tumbadero, San
Antonio de los Baños en la provincia Artemisa, Cuba, donde se analizaron las especies Nicotiana
tabacum y Nicotiana megalosiphon ambas perteneciente al género Nicotiana así como los
híbridos interespecíficos resultantes del cruce entre estas dos especies.
24
Nicotiana tabacum x Nicotiana megalosiphon
F1 X Nicotiana. tabacum
R1 x N. megalosiphon
Reproducción agámica
Obtención del Híbrido (g 1)
Producción de semillas (g 2)
Plantas resultantes
 Prueba de resistencia en semillero al moho azul.
 Análisis de viabilidad del polen.
 Conteo de semillas.
Figura 1: Esquema general del programa de mejoramiento llevado a cabo en el Instituto de
Investigaciones del Tabaco.
25
Prueba de resistencia al moho azul en semillero.
Las semillas utilizadas se obtuvieron de varias plantas en la
población resultante de la
reproducción agámica (primera generación del híbrido interespecífico) para este genotipo y para
los genotipos
Nicotiana tabacum,
Nicotiana megalosiphon y Corojo, se tomaron semillas
colectadas anteriormente en el Instituto de Investigaciones del Tabaco. La siembra se realizó
sobre un sustrato de suelo ferralítico rojo compactado suplementado con una mezcla de materia
orgánica y zeolita (1:1v/v). Se utilizó un diseño de parcelas experimentales de 1 m2 para los
híbridos y se intercaló 0,5 m2 de un control a la enfermedad moho azul, en este caso se utilizó
la variedad Corojo por ser sumamente susceptible a dicha enfermedad, el cual también se usó 0,5
m2 intercalado entre 0,5 m2 de los progenitores Nicotiana tabacum, Nicotiana megalosiphon.
0.5m
2
1m2
m2
m
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 1 )
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 2)
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 3 )
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 4 )
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 5 )
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 6 )
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 7 )
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 8 )
Corojo
Híbrido Interespecifico ( 9 )
Corojo
Híbrido Interespecifico (10)
Corojo
N. tabacum ( 1 )
Corojo
N. tabacum ( 2)
Corojo
N. tabacum ( 3 )
Corojo
N. tabacum ( 4 )
Corojo
N. tabacum ( 5 )
Corojo
N. megalosiphon ( 1 )
Corojo
N. megalosiphon ( 2 )
Corojo
N. megalosiphon ( 3 )
Corojo
N. megalosiphon ( 4 )
Corojo
N. megalosiphon ( 5 )
Figura 2: Croquis para la prueba de resistencia al moho azul en semillero.
0.5m
2
26
El semillero se estableció después que el moho azul se hiso presente en el área experimental, para
garantizar la presencia de la enfermedad en el periodo de germinación de la semilla y crecimiento
de la postura, el día 5 de febrero del 2014. Como control fitosanitario solamente se aplicó
insecticida y el riego se mantuvo con dos frecuencias diarias los primeros diez días y una el resto
del tiempo. La evaluación se realizó el día 17 de marzo del 2014, a los 40 días de sembradas las
semillas, se evaluó cualitativamente los niveles de clorosis en el tejido foliar y esporulación en el
envés de la hoja en los diferentes genotipos.
Análisis de viabilidad del polen
Se trabajó con polen proveniente de tres genotipos, los progenitores Nicotiana tabacum
Nicotiana megalosiphon, y de las plantas híbridas que pasaron la prueba de resistencia al moho
azul en el semillero, este se colectó al inicio del experimento, el día 23 de mayo del 2014 entre
las 9:30 y las10:15 am. Para la obtención del polen primero se colectaron flores aun cerradas (con
anteras de aproximadamente un día antes de la antesis) de 20 plantas híbridas y sus progenitores,
estas fueron almacenadas en frascos de plástico con tapa y se trasladaron al laboratorio. Luego se
procedió a extraer las anteras de cada flor y se colocaron en placas petri tapadas, hasta lograr su
dehiscencia y la exposición de los granos de polen después de ser almacenadas durante 48 horas a
24 º C. Luego de la antesis se tomaron azarosamente las anteras para las diferentes pruebas.
Prueba de viabilidad:
Para analizar la viabilidad del polen se empleó un método de tinción con acetocarmín 2%
(colorante vital) (Muñoz et al, 2006) y dos métodos de crecimiento in vitro del tubo polínico, el
primero descrito por Shivanna y Rangaswamy (1992) con modificaciones según se explica, y el
segundo es el descrito por (Brewbaker y Majumder, 1961) también con algunas modificaciones.
27
Tinción con acetocarmín (colorante vital):
Se tomó una antera con la ayuda de pinzas y se colocó sobre un portaobjetos, luego se le agregó
una gota de acetocarmín al 2 % ; posteriormente se procedió a remover y presionar la antera en la
solución sobre el portaobjetos para de esta manera extraer el polen contenido en ella y así lograr
teñirlo, luego se le colocó un cubreobjetos encima de la preparación y se procedió a su
observación en el microscopio óptico en el momento de terminar la tinción (0 minutos) a un
aumento de 100x, contando el número de granos de polen totales y granos teñidos en fotografías
tomadas a 10 campos con ayuda de una cámara fotográfica Panasonic acoplada al microscopio
óptico marca Carl Zeiss modelo Axiolab y su respectivo software. Se asumió como viables los
granos de polen totalmente teñidos y no viables aquellos con granos acromáticos poco teñidos y
deformes.
Polen viable
Polen inviable
Figura 3: Polen del hibrido interespecífico en una preparación con acetocamìn al 2 % a 100x.
Crecimiento in vitro del tubo polínico.
La primera prueba de germinación in vitro del tubo polínico se realizó siguiendo el método
descrito por Shivanna y Rangaswamy (1992) con algunas modificaciones. Para ello se prepararon
5 soluciones de 10ml cada una, con concentraciones diferentes de sacarosa, 0%, 5%, 10%,20%,
40% e igual concentración de H3BO3 (2x10–3 M) y Ca (NO3)2 (6x10–3 M) en beakers de 10
28
ml cada uno. Para lo cual primero se preparó en un beaker de 600 ml una solución de sacarosa al
50%, usando el agitador magnético, la misma se usó para preparar las soluciones antes
mencionadas. Luego con ayuda de una micropipeta
se vertieron 2 ml de las cinco
concentraciones por separado en diferentes depósitos, y esto se realizó para cada uno de los
genotipos en estudio. Después se procedió a colocar dos anteras de cada tipo en los depósitos con
sus respectivas concentraciones de sacarosa, posteriormente se trasladaron hacia el cuarto de
crecimiento donde se dejaron germinar durante 24 horas a 24 º C. El polen se considera viable
por este método cuando la longitud del tubo polínico excede la longitud del el diámetro del grano
de polen. Transcurrido el tiempo de crecimiento se observó en el microscopio a 100x diez
campos por concentración de sacarosa de cada genotipo contando los granos de polen germinados
de acuerdo con las condiciones antes mencionadas, en fotografías tomadas también con ayuda de
una cámara fotográfica
Polen viable
Polen inviable
Figura 4: Polen del hibrido interespecífico en medio de cultivo con 5% de sacarosa a 100x.
Crecimiento in vitro del tubo polínico.
La segunda prueba realizada de crecimiento in vitro del tubo polínico se llevó a cabo por el
método descrito por Brewbaker y Majumder, (1961) con las modificaciones siguientes; se
prepararon 500 ml del medio adicionando 50 gramos de sacarosa y un gramo de agar, mientras
29
que los restantes elementos del medio de cultivo se mantuvieron en la misma proporción según
los descrito, después de la preparación fue almacenado en placas petri. Se sembraron en tres
placas por cada genotipo cinco anteras por placa de cada uno y se dejó incubar por cuatro horas
a 24 º C. Luego se observaron en el microscopio a 100x 10 campos por cada placa de los tres
genotipos analizados, contando granos de polen totales y germinados. Por este método al igual
que el anterior se considera viable el polen el cual su tubo polínico sea el doble de largo que el
diámetro del grano. Luego se calcularon los porcentajes de polen viable en cada genotipo
analizado.
Conteo de semillas
Para el conteo de semillas se colectó el 6 de junio del 2014 una cápsula de cada planta híbrida,
tomando como tamaño de muestra 20 plantas. Dichas cápsulas fueron colectadas cuando
comenzaban a mostrar signos de madurez, (color carmelita en el extremo distal y amarillo en el
resto) se almacenaron en placas petri durante 5 días a una temperatura de 24 º C y 50% de
humedad relativa.
Figura 5: Cápsulas del híbrido interespecífico con signos de madurez evidentes.
Justo antes de que ocurriese la dehiscencia de las cápsulas se procedió a la extracción de las
semillas, la cual se realizó tomando cada cápsula independiente, y con ayuda de unas pinzas y un
bisturí pequeño se llevó a cabo la separación de la cubierta externa de la misma para así exponer
30
sus semillas, extraerlas y luego contarlas. Todo este proceso se realizó sobre una placa petri
pequeña para evitar la pérdida de alguna semilla durante la manipulación de la cápsula y
apoyándose en un estereoscopio para una mejor visión y precisión en el momento de la
extracción y separación de la cubierta externa. Una vez desnuda la cápsula se retiró las semillas
con ayuda de pinzas y se almacenaron en la placa petri sobre la cual se trabajó. Luego a través de
un estereoscopio se observaron y contaron las semillas de cada una de las cápsulas. Se tomaron
como semillas verdaderas aquellas reniformes con una relación área/volumen proporcional.
Luego se calculó el promedio de semillas por cápsulas.
Figura 6: Semillas del híbrido interespecífico correctamente formadas a 12x.
31
Resultados.
Prueba de resistencia en semillero al moho azul.
Después de 45 días de sembradas las semillas se hizo la evaluación visual y cualitativa de las
plántulas en el semillero contaminado con el moho azul. Durante la evaluación se encontró que
las plántulas del testigo ‘Corojo’ estaban totalmente destruidas, el tejido foliar necrosado y sobre
él, abundante esporulación. En Nicotiana. megalosiphon no se observó, ningún signo o síntoma
de la enfermedad y tampoco hubo respuesta sistémica ni retención del crecimiento.
Corojo (Testigo
susceptible)
Nicotiana Megalosiphon
Figura 7: Respuesta de Nicotiana Megalosiphon (derecha) y el testigo susceptible
Corojo (izquierda) al ataque de moho azul en semillero.
En el parental Nicotiana tabacum tuvo una afectación parcial con cierto nivel de esporulación y
ligera retención del crecimiento.
32
Corojo
Nicotiana tabacum
Figura 8: Respuesta de Nicotiana tabacum (derecha) y Corojo (izquierda) a el ataque de moho
azul en semillero.
En las plantas pertenecientes al genotipo híbrido, se pudo comprobar que ninguna de ellas fueron
afectadas, ni se observó sobres sus hojas daño alguno ni esporulación del patógeno, respuesta
idéntica a la observada en el progenitor Nicotiana megalosiphon.
Corojo
Híbrido
Interespecífico
Figura 9: Respuesta de los híbridos interespecíficos y del testigo susceptible (corojo) al ataque
del moho azul en semillero.
33
Análisis de viabilidad del polen.
Siguiendo el método de tinción con acetocarmín 2% (colorante vital) (Muñoz et al, 2006) se
obtuvieron los siguientes resultados.
Tabla II: Porcentajes de polen viable en los genotipos en progenitores e híbrido interespecífico
según el método de tinción con acetocarmín 2% (colorante vital) (Muñoz et al, 2006).
Genotipo
Polen Viable (%)
Nicotiana megalosiphon
86,41 %
Nicotiana tabacum
94,83 %
Híbrido interespecífico
55,59 %
Siguiendo el método de crecimiento in vitro del tubo polínico descrito por
(Shivanna y
Rangaswamy 1992) con las modificaciones explicadas se obtuvieron los siguientes resultados.
Tabla III: Porcentajes de polen viable en los tres genotipos analizados según el método descrito
por (Shivanna y Rangaswamy 1992) modificado.
Genotipo
Polen Viable (%)
Nicotiana megalosiphon
18,71 %
Nicotiana tabacum
14,6 %
Híbrido interespecífico
9,59 %
34
El análisis del viabilidad del polen según la capacidad de crecimiento in vitro del tubo polínico
de acuerdo al método de (Brewbaker y Majumder, 1961) con las modificaciones explicadas
arrojó los siguientes resultados.
Tabla IV: Porcentajes de polen viable en los tres genotipos analizados según el método descrito
por ( Brewbaker y Majumder, 1961) modificado.
Genotipo
Polen Viable (%)
Nicotiana megalosiphon
87,41 %
Nicotiana tabacum
83,1 %
Híbrido interespecífico
40,59 %
Conteo de semillas:
El conteo de semillas dio como resultado que en promedio las cápsulas de las plantas hibridas
analizadas contienen un total de 46 semillas.
Discusión:
Prueba de resistencia al moho azul en semillero.
El genotipo hibrido no mostró afectación ninguna en la prueba de resistencia al moho azul en
semillero, respuesta igual que su progenitor Nicotiana megalosiphon, este resultado evidencia
que estos individuos contienen una combinación correcta de genes que le permiten ser resistentes
a este patógeno desde semillero. La relativa resistencia mostrada por el parental Nicotiana
tabacum sobre el testigo susceptible puede deberse a que todas las variedades que se cultivan en
Cuba de tabaco presentan cierta resistencia a este patógeno en semillero, aunque generalmente es
baja. En el genotipo parental Nicotiana megalosiphon, los resultados demuestran la capacidad de
35
resistencia de esta especie a dicho patógeno, lo que se corresponde con los resultados en la
literatura.
Análisis de viabilidad del polen y conteo de semillas.
Una hipótesis que pudiera explicar los resultados de la prueba de germinación in vitro del tubo
polínico según el método descrito por por (Shivanna y Rangaswamy 1992) modificado, es
influencia de factores externos como por ejemplo las condiciones de almacenamiento del polen.
Autores como Dafni (2000) plantean que la germinación in vitro del polen dependen de muchos
factores incluyendo la composición del medio, las temperaturas, la duración del ensayo, el tiempo
de almacenamiento del polen, las condiciones de almacenamiento, la densidad en el medio de
cultivo etc. Para nuestro caso, durante el tiempo que se realizó el experimento existió una alta
humedad relativa que influyó en el desarrollo del experimento de manera negativa,
hiperhidratando el polen durante el proceso de apertura de las anteras e interviniendo con el
proceso de crecimiento del tubo polínico.
Los resultados del análisis de la viabilidad del polen según el método de tinción con acetocarmín
(colorante vital) los cuales mostraron índices medios de viabilidad en el híbrido analizado al igual
que en la prueba de germinación in vitro del tubo polínico según el método descrito por
(Brewbaker y Majumder, 1961) modificado,
pudieran atribuirse a las incompatibilidades
cromosómicas. Estos valores sugieren que la androesterilidad es una causa probable para explicar
la esterilidad de las plantas hibridas y posiblemente la baja producción de semillas obtenidas en
los resultados del conteo de las mismas.
Los valores para el carácter viabilidad del polen son variados en cruces interespecíficos del
género Nicotiana Gressel et al, (2006) reportaron menos del 25 % de viabilidad para híbridos
resultantes del cruce Nicotiana tabacum con otras especies, mientras que para los progenitores
los valores fueron superiores variando entre el 94 y el 100 %. Las anomalías en los procesos
36
meióticos de los híbridos pudieran ser la causa de la baja fertilidad del polen, todas estas
irregularidades conducen a la formación de esporas desbalanceadas, con cantidades desiguales y
distribución azarosa de los cromosomas a los polos celulares. Una meiosis irregular está
directamente conectada a la viabilidad del polen y a la esterilidad masculina según algunos
autores (Binsfeld et al, 2001). Sin embargo, los bajos niveles de viabilidad del polen no
necesariamente son indicadores de la naturaleza híbrida, la meiosis es la causa basal de la
esterilidad pero no influye directamente sobre la viabilidad (Terzić et al, 2006).
La viabilidad del polen en combinaciones híbridas, está bajo la influencia de varios factores.
Según Terzić et al, (2006), las incompatibilidades entre el citoplasma heredado del progenitor
femenino y el material genético proveniente del núcleo del progenitor masculino,
las
irregularidades detectadas durante el apareamiento de los cromosomas en la meiosis y la
diferencia en el numero cromosómico de los progenitores son algunos de ellos. Dado que durante
la hibridación interespecífica en Nicotiana ocurren diversos fenómenos que incluyen
irregularidades de la meiosis como pérdida y ganancia de cromosomas, apareamiento irregular
etc. (Krishnamurty y Satyanarayana, 1962; Lin y Chen, 1990; Pérez et al, 2002).
Según Tezuka et al, (2010) para un cruce sexual entre las especies anteriores, la planta híbrida
analizada debería presentar 44 cromosomas que es la suma del número de cromosomas haploides
de ambos progenitores; sin embargo algunos trabajos informan que para híbridos resultantes del
cruce triespecífico entre (Nicotiana glutinosa (2n=24) x N. trigonophylla (2n=24)) x N.
megalosiphon (2n=40) presentaron entre 33 y 44 cromosomas, aunque teóricamente el número
debería ser 44 (24 cromosmas provenientes del anfiploide y 20 cromosmas provenientes de N.
megalosiphon) (Krishnamurty y Satyanarayana, 1962). Resultados similares fueron detectados
para híbridos resultantes del cruce N. glutinosa (2n=24) x N. megalosiphon (2n=40) para los
cuales el número cromosómico varió entre 2n=28 a 2n=32 (Subhashini et al, 1988) y cuya
37
explicación los autores atribuyeron a las irregularidades genéticas entre ambas especies que
culminaron con la eliminación de cromosomas.
En este caso la explicación más acertada para el comportamiento del genotipo hibrido, el cual
presenta porcentajes de 55 % y de 40,1 % de polen viable en los ensayos de viabilidad por el
método de tinción vital y el de germinación in viro del tubo polínico según Brewbaker y
Majumder, 1961 modificado respectivamente, pudiera ser su propio origen del cultivo de tejido.
Los resultados obtenidos en el conteo de semillas arrojaron una pobre producción de estas por
cápsulas en los genotipos híbridos analizados en comparación con lo reportado en la literatura
para sus progenitores. Según Torrecilla et al, 2001, las cápsulas de las especies Nicotiana
tabacum contienen cada una de e 1500 a 2900 semillas.
Conclusiones:
El híbrido interespecífico entre Nicotiana tabacum y Nicotiana megalosiphon obtenido en un
programa de mejoramiento genético del Instituto de Investigaciones del Tabaco fue totalmente
resistente al ataque del moho azul (Peronospora hyoscyami) en semillero.
Las especies Nicotiana tabacum y Nicotiana megalosiphon presentan mayores niveles de polen
viable que el hibrido interespecífico resultante del cruce entre estas dos especies.
La germinación del tubo polínico es muy sensible a las condiciones ambientales.
Los híbridos interespecíficos entre Nicotiana tabacum y Nicotiana megalosiphon presentan una
baja fertilidad en cuanto a producción de semillas.
38
Recomendaciones:
Continuar con las pruebas de resistencia al moho azul en semillero para garantizar este tipo de
resistencia en las siguientes generaciones.
Utilizar técnicas como cultivo de tejidos u otras para lograr la completa fertilidad de los híbridos
obtenidos.
Realizar estudios citológicos y moleculares para ampliar los conocimientos relativos a los
híbridos obtenidos.
39
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