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I
nada
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarias.
“Establecimiento in vitro de explantes de maguey
mezcalero (Agave angustifolia Haw)”
TITULACIÓN POR TESIS
PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERA BIOTECNÓLOGA
PRESENTA
MAYRA XITLALIC RAMÍREZ VILLALOBOS
CD. OBREGÓN, SONORA
MAYO DE 2007
ÍNDICE
i
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE FIGURAS
vi
ÍNDICE DE TABLAS
viii
RESUMEN
x
I. INTRODUCCIÓN
1
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
7
2.1 Generalidades.
7
Historia del agave en México.
7
2.2 Descripción botánica del Agave angustifolia Haw.
10
2.2.1 Clasificación taxonómica.
10
2.2.2 Anatomía del Agave angustifolia Haw.
10
2.2.3 Metabolismo ácido de crasuláceas.
11
2.2.4 Importancia ecológica de la fijación nocturna de C02 por plantas MAC.
12
ÍNDICE
ii
2.2.5 Principales requerimientos físicos y de nutrición.
12
2.2.5.1 Temperatura.
12
2.2.5.2 Fluctuación fotosintética.
13
2.2.5.3 Nutrición.
13
2.2.6 Tipo de reproducción.
14
2.2.7 Distribución geográfica.
14
2.2.8 Cultivo y manejo del Agave angustifolia.
16
2.2.9 Establecimiento y Manejo.
17
2.2.10 Usos.
18
2.3 Micopropagación vegetativa por cultivo de tejido in vitro
19
2.3.1 Definición e Importancia.
19
2.3.2 Condiciones in vitro en las Cactáceas y el género Agave.
20
2.4 Fases de la micropropagación in vitro.
21
2.4.1 Fase 1. Establecimiento del explante de los cultivos axénicos.
21
2.4.2 Fase 2. Multiplicación del tejido.
21
2.4.3 Fase 3. Elongación y enraizamiento.
22
2.4.4 Fase 4. Adaptación.
22
2.5 Técnicas de esterilización y manipulaciones asépticas.
23
2.5.1 Importancia de las condiciones de esterilidad.
23
2.5.2 Agentes químicos utilizados en el control de organismos patógenos.
24
2.5.3 Oxidación en el cultivo in vitro.
25
2.5.4 Heridas y estímulos mecánicos en hojas.
26
2.6 Medios de cultivo in vitro de los tejidos vegetales.
27
ÍNDICE
iii
2.6.1 Medio de cultivo.
27
2.6.2 Agua.
28
2.6.3 Agar.
28
2.6.4 Fuentes de carbono.
28
2.6.5 Vitaminas y otros elementos orgánicos.
28
2.6.6 Complejos orgánicos.
29
2.6.7 Nutrición mineral.
29
2.6.8 Macronutrientes.
30
2.6.9 Micronutrientes.
31
2.7 Reguladores in vitro.
32
2.7.1 Reguladores de crecimiento.
32
2.7.2 Auxinas.
32
2.7.3 Citocininas.
33
2.7.4 Giberelinas.
33
2.7.5 Ácido abscísico.
33
2.8 Propagación masiva vía Células callosas.
34
2.8.1 Embriogénesis somática.
34
2.8.2 Organogénesis.
36
2.9 Cultivo de tejidos en agave.
36
III. MATERIALES Y METODOS
38
3.1 Preparación del medio de cultivo.
38
3.2 Preparación de soluciones desinfectantes hipoclorito de sodio (NaCIO),
ÍNDICE
iv
fungicida y bactericida.
39
3.3 Preparación de antioxidantes.
40
3.4 Experimento I. Establecimiento aséptico de cultivos
41
Tratamientos de desinfección superficial del material vegetal.
42
3.5 Experimento II. Inducción de células callosas de Agave angustifolia
Haw, utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l), y BA (0.0,
0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l).
46
3.6 Experimento III. Inducción de células callosas de Agave angustifolia
Haw, utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/l), y BA (0.0,
0.25, 0.75, 1.0 mg/l).
48
3.7 Experimento IV. Inducción de organogénesis sobre tejillo calloso del
Agave angustifolia Haw.
50
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
52
4.1 Experimento I. Establecimiento aséptico de cultivos.
52
4.2 Experimento II. Inducción de células callosas de Agave angustifolia
Haw, utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l), y BA (0.0,
0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l).
55
4.3 Experimento III. Inducción de células callosas de Agave angustifolia
Haw, utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/l), y BA (0.0,
0.25, 0.75, 1.0 mg/l).
57
4.4 Experimento IV. Inducción de organogénesis en tejido calloso de Agave
angustifolia Haw.
58
ÍNDICE
v
CONCLUSIONES
62
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
ABREVIATURAS Y GLOSARIO
63
68
76
ÍNDICE
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Agave laughing.
8
Figura 2. Agave tequilana.
9
Figura 3. Anatomía del agave.
11
Figura 4. Distribución Geográfica del Agave angustifolia Haw.
15
Figura 5. Proceso de la embriogénesis somática.
35
Figura 6. Porcentajes de contaminación y oxidación entre tratamientos, sobre
el tejido de hoja Agave angustifolia Haw, en el periodo de un mes (primer
ensayo). ITSON 2005-2006.
53
Figura 7. Porcentajes de contaminación y oxidación entre tratamientos, sobre
el tejido de hoja Agave angustifolia Haw, en el periodo de un mes (segundo
ensayo). ITSON 2005-2006.
53
Figura 8. Porcentajes de contaminación y oxidación entre tratamientos, sobre
el tejido de hoja Agave angustifolia Haw, en el periodo de un mes (tercer
ensayo). ITSON 2005-2006.
Figura 9. Inducción de callo a partir de hojas de plantas de Agave angustifolia
Haw. Tratamiento 7 (a), tratamiento 3 (b), tratamiento 2 (c), y tratamiento 14
54
ÍNDICE
(d). ITSON 2005-2006.
vii
56
Figura 10. Inducción de callo a partir de hojas de plantas de Agave
angustifolia Haw. Tratamiento 7 (a), tratamiento 9(b), tratamiento 15 (c) y
tratamiento 25 (d).ITSON 2005-2006.
58
Figura 11. Inducción de organogénesis sobre tejido calloso de Agave
angustifolia Haw. ITSON 2005-2006.
59
Figura 12. Organogénesis in vitro de Agave angustifolia Haw. De los 5
tratamientos: (a) 10 mg/l BA, (b) 0 mg/l BA, (c) 2.5 mg/l BA, (d) 7.5 mg/l BA y
(e) 5 mg/l BA. Todas muestran estructuras globulares verdes (nódulos) y la
figura (a) muestra raíces (rizogénesis). ITSON 2005-2006.
60
Figura 13. Organogénesis in vitro de Agave angustifolia Haw. Formación de
raíces (r) rizogénesis (a); Formación de estructuras globulares verdes (no)
nódulos (b). ITSON 2005-2006.
61
ÍNDICE
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación Taxonómica de la especie Agave angustifolia Haw.
10
Tabla 2. Composición elemental de un tejido vegetal, expresado en
porcentaje del peso seco correspondiente a cada elemento (Barcelo et al.,
1992. modificado).
30
Tabla 3. Reactivos, materiales y equipo.
40
Tabla 4. Tratamientos de auxina y citocinina utilizados para la inducción de
47
células callosas de Agave angustifolia Haw.
Tabla 5. Tratamientos de auxina y citocinina utilizados para la inducción de
células callosas de Agave angustifolia Haw.
49
Tabla 6. Tratamientos utilizados para la inducción de organogénesis.
50
Tabla 7. Efecto del hipoclorito de sodio en dos tiempos de exposición,
flutolanil
(Moncut)
y
sulfato
de
gentamicina
con
clorhidrato
de
69
oxitetraciclina (Bactrol) en explantes de hoja de Agave angustifolia Haw.
Tabla 8. ANOVA. Efecto del diámetro de callo entre los tratamientos y las
semanas en explantes de hoja de Agave Angustifolia Haw.
70
Tabla 9. Significancia al 0.05. Muestra las medias del factor A (diámetro de
callo entre las semanas).
70
ÍNDICE
ix
Tabla 10. Prueba de t, con una significancia al 0.05. Muestra las medias
del Factor B (diámetro de callo entre los tratamientos).
71
Tabla 11. ANOVA. Efecto del diámetro de callo entre los tratamientos y las
semanas en explantes de hoja de Agave Angustifolia Haw.
72
Tabla 12. Prueba de t, con una significancia al 0.05.Muestra las medias
del factor A (diámetro de callo entre la semanas).
72
Tabla 13. Prueba de t, con una significancia al 0.05. Muestra los
promedios del diámetro de callo entre los tratamientos.
73
Tabla 14. ANOVA Efecto del diámetro de callo entre tratamientos y las
semanas en explantes de hoja de Agave Angustifolia Haw.
74
Tabla 15. Prueba de t, con un nivel de significancia al 0.05. Muestra las
medias del Factor A (diámetro del callo entre las semanas), tratamientos
(semanas).
74
Tabla 16. Prueba de t, con un nivel de significancia al 0.05. Muestra las
medias del Factor B (diámetro de callo entre los tratamientos).
75
Tabla 17. Prueba de t, con un nivel de significancia al 0.05. Muestra las
medias del Factor B (diámetro de callo entre los tratamientos),
tratamientos (BA mg/l).
75
RESUMEN
x
RESUMEN
Se estableció un protocolo in vitro para la micropropagación del Agave angustifolia
Haw. Se utilizaron hojas de plantas recolectadas en el campo y se desinfectaron,
probando cuatro tratamientos diferentes: NaClO al 5% durante 25 minutos, NaClO al
5% durante 45 minutos, fungicida flutolanil (Moncut) 3 g/l, y antibiótico sulfato de
gentamicina con clorhidrato de oxitetraciclina (Bactrol) 1 g/l. Las hojas se
seccionaron en explantes de 1cm2, y éstos se sembraron en un medio de cultivo
suplementado con tiamina-HCl, 1mg/l; mio-inositol, 100 mg/l; sacarosa, 30 gr/l; agar,
8 gr/l; bencilaminopurina (BA), 0.1 mg/l; ácido naftalenacético (ANA), 0.1 mg/l; ácido
cítrico, 150 mg/l y ácido ascórbico, 100 mg/l. Las condiciones ambientales fueron
16/8 horas luz y temperatura de 25°C. En este experimento no se encontraron
diferencias significativas entre los tratamientos.
En la inducción de callo a partir explantes de hojas, se desinfectaron los explantes
con NaClO al 5%, durante 25 minutos y se siembra en el mismo medio de cultivo
suplementado con la combinación de diferentes concentraciones de reguladores de
crecimiento ácido diclorofenolacético (2,4-D) (0.0, 0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l), y BA
(0.0, 0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l). Las condiciones ambientales fueron 16/8 horas luz y
temperatura de 25°C. Se obtienen resultados a la segunda semana de cultivo y
muestran que existe diferencia altamente significativa para diámetro del callo entre
las semanas y los tratamientos, se realizó la prueba t, con una significancia al 0.05.
Se obtuvo mayor diámetro de callo con el tratamiento 14 con dosis de 1.5 mg/l de
2,4-D y 1 mg/l de BA. Se realiza un nuevo experimento utilizando otras
combinaciones de fitorreguladores 2,4-D (0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/l), y BA (0.0,
0.25, 0.75, 1.0 mg/l). Se obtienen resultados a la tercera semana de cultivo y
RESUMEN
xi
muestran que existe diferencia altamente significativa para diámetro del callo entre
las semanas y los tratamientos, se realizó la prueba t, con una significancia al 0.05.
Se obtuvo mayor diámetro de callo con el tratamiento 7 con dosis de 0.25 mg/l de
2,4-D y 0.25 mg/l de BA. Se registró un 100% de asepsia en estos dos experimentos.
La organogénesis indirecta fue exitosa partir de tejido de callo mostrando estructuras
globulares verdes (nódulos), y formación de raíces (proceso organogénico) en
presencia de altas concentraciones de BA.
I. INTRODUCCION
1
CAPITULO I. INTRODUCCIÓN
El género agave que significa noble (del griego agaue), fue descrito por primera vez
por el botánico sueco Carlos Von Linneo en 1753. Los agaves tienen hojas gruesas y
puntiagudas que se despliegan del cogollo, el cual tiene hojas adheridas (Nobel,
1998).
A pesar de la diversidad e importancia etnobotánica y económica de muchas
especies de agaves, sólo especies como Agave tequilana, A. fourcoydes o A. sisilana
se cultivan en forma extensiva utilizando variedades de propagación vegetativa
(Malda y Ruiz, 2004).
La reproducción de Agave angustifolia en el Estado de Sonora es de forma natural y
no se tiene un control de la cantidad anual producida, este tipo de plantas tiene un
período de 1 a 3 años para poder producir hijuelos, estos hijuelos son transplantados
a campo para que pasen entre 6 a 8 años para ser utilizados en la elaboración de
bacanora.
El Bacanora es un destilado de agave, similar al tequila y mezcal diferenciándose por
las características de la planta utilizada, por las condiciones climáticas imperantes en
la región serrana de Sonora, el tipo de levaduras silvestres utilizadas y el proceso
empleado para su elaboración. Posee características de sabor, aroma y cuerpo que
lo diferencian y lo sitúan como una bebida ampliamente aceptada (CONACYT, 2003).
I. INTRODUCCION
2
Un problema que requiere de atención inmediata es la disminución acelerada de las
poblaciones silvestres del maguey Agave angustifolia, producto de la explotación
inmoderada de este recurso. En ese sentido, distintas instituciones como la
SEMARNAT, la Fundación Produce Sonora y la Secretaria de Desarrollo Económico
y Productividad del Gobierno del Estado de Sonora, promueven la domesticación y la
producción en plantaciones comerciales de maguey de bacanora, para respaldar la
industria con materia prima segura y de buena calidad (CONACYT, 2003).
Otra estrategia para resolver la sobreexplotación del agave es usar la
micropropagación para generar líneas clónales de plantas élite con biotipos de las
diferentes áreas de la sierra sonorense. Esto permitirá la multiplicación rápida y
eficiente de cultivares valiosos y la propagación de plantas libres de enfermedades,
más vigorosas y de rápido crecimiento, lo cual podría incrementar significativamente
la producción (CONACYT, 2003).
La micropropagación es ampliamente recomendada como una herramienta
biotecnológica para estudiar y conservar especies amenazadas. Esta herramienta
permite un rápido desarrollo de brotes en comparación con plántulas germinadas en
invernadero (Ault y Blackmon, 1987 citado por Garcés, 2003), además de plántulas
libres de patógenos, siendo también una buena alternativa para propagar especies
que no producen brotes laterales (Clayton et al., 1990, citado por Garcés, 2003).
Por otro lado, estudios realizados por Backhaus et al., 1999, citado por Garcés, 2003,
demuestran que las cactáceas sometidas a condiciones de cultivo in vitro pueden
fijar CO2 de manera continua, comportándose como plantas C3 facultativas, de lo
que se deduce que el crecimiento de éstas puede ser acelerado a través del cultivo
de tejidos in vitro.
Por tal motivo la necesidad de micropropagar plantas de agave, para reforestar
zonas áridas y contribuir a la economía del Estado de Sonora, ya que este producto
I. INTRODUCCION
3
se utiliza en la elaboración de bacanora, y como fibra textil en la fabricación de
costales.
La micropropagación de Agave angustifolia es una alternativa del cultivo de tejidos
vegetales, ya que se pueden obtener una cantidad amplia de plantas en cortos
periodos de tiempos, estas plantas presentan una serie de ventajas ya que son libres
de patógenos, se pueden obtener en cualquier periodo del año, y estas plantas
tienes la capacidad de mantener las características genotípicas del material inicial
seleccionado.
Justificación.
En nuestra región, el bacanora es la bebida típica y su nombre no tiene relación con
el producto en si, sino que lo toma de un poblado situado en la sierra Este de
Sonora; además su origen está asociado a la cultura ópata que se desarrolló en esas
regiones, la producción de bacanora representa una actividad productiva de gran
importancia económica, cultural y social y podría generar una fuente de divisas,
debido a que su producción puede ser exportada y es una fuente de empleo.
En la actualidad la utilización de agaves para la producción de bacanora, se ha visto
afectada debido al tiempo de reproducción del agave siendo este periodo extenso
(entre 1 y 3 años); además de lo anterior la planta de agave tiene un periodo entre 8
a 10 años para poder ser utilizado en la industria de bebidas alcohólicas tales como
el bacanora.
Por este motivo se justifica la utilización de las herramientas de cultivo de tejidos
vegetales, para disminuir su tiempo de generación, así como obtener plantas sanas
libres de enfermedades o plagas y aumentar su producción, para su utilización por
productores de bacanora, que actualmente dependen de lo que pueden recolectar en
el campo y que se da en forma natural o silvestre y que amenaza con agotarse.
I. INTRODUCCIÓN
4
Esta investigación consistió en obtener la organogénesis indirecta a partir de
donadores de explantes de hojas obtenidas de los jardines del ITSON
unidad
Obregón-Náinari, en Cd. Obregón, Sonora. Se utilizaron diferentes desinfectantes:
hipoclorito de sodio al 5%, un funguicida y un antibiótico, para evaluar el de mejor
efecto; también se evaluaron diferentes reguladores de crecimiento: ácido
naftalenacético (AIA), 2-4 diclorofenoxiacético (2,4-D), y bencilaminopurina (BA), en
diferentes concentraciones.
Distintas instituciones como la SEMARNAT, la Fundación Produce Sonora y la
Secretaria de Desarrollo Económico y Productividad del Gobierno del Estado de
Sonora, promueven la domesticación y la producción en plantaciones comerciales de
maguey de bacanora. Así mismo la Norma Oficial Mexicana NOM-061-ECOL-1994
especifica que: “Las solicitudes para aprovechamiento de recursos forestales en
terrenos que contengan especies de flora silvestre raras, amenazadas, en peligro de
extinción, sujetas a protección especial, requieren a presentación de una
manifestación de impacto ambiental en su modalidad general” Entre los siguientes
instrumentos normativos que podrían considerarse en el aprovechamiento forestal
del A. angustifolia se encuentran Ley Agraria, Ley Forestal, Ley de las Aguas
Nacionales, Ley de Caza, Ley de Conservación del suelo, Ley federal de Sanidad
Vegetal, Ley General de Salud, Ley Federal sobre Metrología y Normalización, Ley
General de Bienes Nacionales, Ley Orgánica de Administración Publica Federal, Ley
General del Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente (LGEEPA), leyes
relacionadas con la Ley General que sean competencia de la Secretaria,
reglamentos de la Ley General en materia, normas oficiales mexicanas, leyes y
reglamentos estatales, reglamentos municipales, resoluciones de impacto ambiental,
ordenamiento técnicos establecidos por la PROFEP, CNA, SIUE, o DEA (Núñez,
2004).
El Agave angustifolia es una planta que ha sido aprovechada por los pobladores de
la sierra en la producción de BACANORA, esto ha ocasionado que la especie se
encuentre en peligro de extinción, es por eso que se han desarrollado técnicas
I. INTRODUCCIÓN
5
biotecnológicas que son benéficas para el ambiente y su aprovechamiento
representa ingresos económicos.
El ITSON se ha caracterizado por el estudio al medio ambiente y se encuentra dentro
de los programas de estudio. El lugar donde se realizó el establecimiento aséptico
del A. angustifolia, fue en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales situado en el
edificio 700 de biotecnología del ITSON, la unidad Obregón-Náinari.
Objetivos.
Objetivo general:
Establecimiento aséptico in vitro de la especie agave mezcalero (Agave angustifolia
Haw), para la multiplicación masiva.
Objetivos específicos:
♦ Determinar el desinfectante idóneo para lograr el establecimiento aséptico de los
explantes de agave mezcalero (Agave angustifolia Haw).
♦ Determinar la dosis de los desinfectantes para lograr el establecimiento in vitro
del agave mezcalero (Agave angustifolia Haw).
♦ Determinar los tiempos de exposición a los desinfectantes para lograr el
establecimiento in vitro del agave mezcalero (Agave angustifolia Haw).
♦ Determinar los efectos de distintas dosis de reguladores de auxinas y citocininas,
en la inducción de callo a partir de explantes de hojas del Agave mezcalero (Agave
angustifolia Haw).
I. INTRODUCCIÓN
6
♦ Determinar los efectos de distintas dosis de citocininas, para organogénesis
indirecta, a partir de tejido de callo.
Hipótesis.
Las hipótesis planteadas en base a los objetivos anteriores son que:
♦ Existe un desinfectante óptimo para lograr el establecimiento aséptico del los
explantes.
♦ Existe una dosis adecuada de desinfección para lograr el establecimiento
aséptico de los explantes.
♦ Existe el tiempo idóneo de exposición al desinfectante para lograr el
establecimiento aséptico.
♦ Existe una dosis adecuada de reguladores de auxinas y citocininas, para la
inducción de callo a partir de explantes de hojas de agave.
♦ Existe una adecuada dosis de citocininas para la organogénesis indirecta a partir
de tejido calloso.
Supuestos.
El genotipo de las variedades de Agave angustifolia no tiene efecto en los métodos
de generación de organogénesis ni en el tipo de fitohormona utilizado.
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
7
CAPITULO II. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
2.1 Generalidades
Historia del Agave en México
El agave (del griego agaus, que significa “admirable” o “noble”) se ha utilizado
históricamente como fuente de alimentación, bebida y fibra por las diferentes tribus
indígenas del Sureste de los Estados Unidos y el Norte de México (Castetter, Bell y
Grive 1938; Gentry, 1982, citado por Núñez, 2004).
Los agaves son plantas adaptadas a condiciones de aridez. Son de raíces someras
y ramificadas, cutícula gruesa, suculentos, estomas hundidos, metabolismo
fotosintético y metabolismo ácido crasuláceos (MAC) son algunos de los atributos
que les permite establecerse en zonas carentes de agua (Granados, 1999).
Mesoamérica y Árido América -como los antropólogos han dividido a México- es
escenario del origen y evolución del maguey (Agave spp). En ambas regiones esta
planta ha sido utilizada, desde los primeros pobladores hasta la actualidad, para
satisfacer y complementar una serie de necesidades básicas: como alimento, forraje,
medicamento y construcción entre otras (Granados, 1999).
Cabe resaltar que de este vegetal se obtienen bebidas embriagantes dentro de las
cuales sobresale el pulque. Esta bebida tiene un registro que data de 300 años a.c.;
representa un importante papel social, ya que por motivos religiosos estaba
contenida de fuerzas espirituales que se asociaba con una gran cantidad de dioses,
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
8
entre los más representativos la diosa del “Mayahuel” (figura 1), que están
plasmados en la mayoría de los códices Mexicanos (Granados, 1999).
Fuente: http://dana.ucc.nau.edu/~md276/pictures/agave-sideview.gif
Figura 1. Agave laughing.
Desde épocas remotas las plantas de Agave o de Maguey, como se les llama
comúnmente en México, han representado una importante fuente de alimentos,
fibras, medicamentos y bebidas para las culturas prehispánicas de América del
Norte. El aprovechamiento de estas plantas fue de vital importancia para los grupos
indígenas asentados en las zonas semiáridas del México antiguo, en lo que
actualmente es el Noroeste de México y Sudoeste de Estados Unidos (IMADES,
2002).
Entre las culturas prehispánicas que habitaban a lo largo de la costa del Pacífico
mexicano, desde Sonora hasta Oaxaca, era común el consumo de bebidas
fermentadas preparadas a partir de Agaves, las cuales se ingerían especialmente
durante las ceremonias religiosas. Sin embargo, con la introducción de la técnica de
destilación por los misioneros españoles en el siglo XVI, las bebidas fermentadas se
sustituyeron por los destilados de Agave, los cuales, desde entonces han
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
9
evolucionado en diferentes productos destacando entre ellos el tequila en Jalisco, el
mezcal en Oaxaca, el bacanora en Sonora, y en el centro del país el pulque que no
es un destilado
Cada región tiene una bebida característica. En Sonora se llama bacanora (Agave
angustifolia), en Chihuahua se llama sotol, en Chiapas se llama comiteco, en la
costa de Jalisco, las serranías de los Altos y el oeste de Michoacán se llama raicilla
(de producción casi clandestina y muy fuerte), en Oaxaca se le llama mezcal
(Agave espadín de Oaxaca o Agave angustifolia Haw, arroqueño o Agave
americana L. variación del oaxacensis Gentry, tobasiche o agave karwinskii zucc,
barril o Agave rodacantha zucc, mexicano o agave macrocantha, maguey
cincoañero o Agave cantala roxb y el agave silvestre más apreciado por la calidad
de mezcal que origina es el Agave potatorum zucc o tobalá) y se llama tequila
(Agave tequilana weber azul) en Jalisco (figura 2).
(http://elportaldemexico.com/bebidas/mezcales_y_tequilas.htm9).
Fuente: http://www.fotomas.com/tequila_futures.htm
Figura 2. Agave tequilana.
. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
10
2.2 Descripción botánica del Agave angustifolia Haw.
2.2.1 Clasificación taxonómica.
Taxonómicamente el género agave se ubica en la familia Agavaceae ver Tabla 1. En
el continente Americano se reportan aproximadamente 310 especies, de las cuales
en México existen 272, por ello se considera a este país como centro de origen del
género (Granados, 1999).
Tabla 1. Clasificación Taxonómica de la especie Agave angustifolia Haw.
Reino:
Phylum:
Clase:
Orden:
Familia:
Género:
Especie:
Nombre común:
Plantae
Angiospermae
Monocotiledónea
Liliales
Agavaceae
Agave
angustifolia Haw
Maguey espadín o maguey mezcalero
CONAFOR (s.f); Nobel, 1998
2.2.2 Anatomía del Agave angustifolia Haw.
El Agave angustifolia, presenta un ciclo de vida entre 5 y 20 años, al final del cual la
planta florea, libera sus semillas y muere, sus pencas son suculentas, muy
numerosas y están colocadas en forma de espiral formando una roseta basal, lo cual
les ayuda a capturar la poco agua de lluvia disponible de una manera más eficiente
(Gentry, 1982, citado por Núñez, 2004).
Los márgenes de sus pencas están armados con dientes rígidos y sus ápices en la
mayoría de los casos terminan en una espina fuerte y rígida ver figura 3. La mayoría
de los agaves están muy bien adaptados a los ambientes áridos, la principal
característica, es que los agaves poseen el metabolismo ácido de las crasuláceas
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
11
(MAC), el cual le permite efectuar fotosíntesis y sobrevivir en condiciones de extrema
sequía (IMADES, 2002).
Fuente: http://www.acamextequila.com.mx/noflash/elagave/anatomia.gif
Figura: 3. Anatomía del agave.
2.2.3 Metabolismo ácido de crasuláceas.
Las plantas de este tipo tienen un origen tropical seco y un metabolismo fotosintético
adaptado a los medios áridos denominados metabolismo ácido crasuláceas (MAC),
muy parecido a las plantas C4 excepto en la secuencia de la enzima que reacciona
en la oscuridad y con demandas evapotranspirativas bajas. Por esto, fijan
un
máximo de CO2 en la noche (cuando el potencial hídrico de perdida es bajo), cuya
asimilación
fotosintética
ocurre
durante
el
subsecuente
periodo
de
luz;
almacenamiento, los estomas se encierran disminuyendo así la pérdida de agua
(Granados, 1999).
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
12
Las plantas (MAC o CAM) son suculentas y están representadas en las familias
Cactaceae, Crassulaceae, Agavaceae etc. La suculencia representa sólo un sistema
de acumulación de agua, tanto en los tejidos fotosintéticos como en aquellos que no
lo son. Por otra parte la sobrevivencia de las plantas MAC en condiciones naturales
con sequías prolongadas y erráticas depende mas de la posesión de una cubierta
exterior, notablemente impermeable al agua la cual impide la desecación, que de una
alta eficiencia en el uso de agua la asimilación de carbono, posibilitada por la fijación
nocturna de CO2 (Medina, 1987, citado por Granados, 1999).
2.2.4 Importancia ecológica de la fijación nocturna de C02 por plantas MAC.
La importancia ecológica de la fijación nocturna de C02 por plantas MAC radica en su
contribución a la sobrevivencia de las mismas al proveer un mecanismo de
recirculación interna de CO2 en condiciones de sequía severa, que evita la inhibición
del aparato fotosintético cuando el cierre estomático impide la absorción de CO2
externo; además, la vía MAC contribuye a la producción de materia orgánica y
crecimiento de la planta (Medina, 1987, citado por Granados, 1999).
2.2.5 Principales requerimientos físicos y de nutrición.
2.2.5.1 Temperatura.
El factor temperatura es importante desde el punto de vista fisiológico ya que
determina la apertura de los estomas y por ende el intercambio gaseoso. La
temperatura óptima para la fotosíntesis puede cambiar o ser igual a la temperatura
ambiental de las plantas, tales como cambios
se consideran adaptaciones,
aclimataciones que tienen bases bioquímicas y que pueden ocurrir en periodos
cortos de tan solo un día. Las plantas MAC abren sus estomas en la noche, cuando
la temperatura del tejido es considerablemente baja y así la concentración de vapor
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
13
va del tejido al aire, se ha reportado que de 10 a 15oC es la temperatura óptima
para la fijación de CO2. Los cambios de temperatura de las plantas MAC depende
de la sensibilidad de los estomas y del clorénquima (Granados, 1999).
2.2.5.2 Fluctuación fotosintética.
Fluctuación fotosintética depende de una secuencia integrada de los eventos
metabólicos que incluyen las reacciones fitoquímicas, la enzimología del carbón y
el transporte de los intermediarios fotosintéticos entre los compartimentos
subcelulares, el inherente potencial de la planta y las restricciones impuestas por
las condiciones ambientales; determinado así la situación de una planta en un
tiempo dado (Foster et al., 1983, citado por Granados, 1999).
2.2.5.3 Nutrición.
El buen desarrollo de una planta depende en gran aparte de la cantidad de
nutrimentos (macro y micro) que existan en su cuerpo. El aporte de estos
elementos en su mayoría los toma del suelo en forma de humus (restos de
organismos aun no descompuestos) que constituyen una reserva que se va
agotando; a largo plazo, los nutrientes provienen de los minerales que se
meteorizan lentamente (Hernández y Mendieta, 1987, citado por Granados,1999).
El nitrógeno es un elemento esencial para las respuestas fotosintéticas, pues
cuando sus niveles son bajos también la fotosíntesis es baja y su intensidad, lo que
se debe a que el nitrógeno es componente estructural de las enzimas que
intervienen en el proceso (Mandujano, 1988, citado por Granados, 1999). Por otro
lado Nobel et al., 1983 en un trabajo con varias especies de cácteas observaron
que el nitrógeno y el sodio son elementos indispensables en el MAC ya que la
síntesis de ácidos orgánicos incrementan.
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
14
En general los agaves viven en suelos rocosos arcillosos y bien drenados; ricos en
nutrientes especialmente -nitrógeno, que parece ser el elemento más limitante e la
actividad metabólica de algunos agaves. Los niveles de elementos en el suelo
afectan la distribución de su hábitat nativo. Estas plantas son relativamente
sensibles a la salinidad, sobre todo en su estado juvenil; pero no son muy sensibles
a las altas concentraciones de Ca y metales como el Cu, el Zinc. El pH óptimo de
crecimiento es entre 5 y 8, fuera de este rango son muy sensible (Granados, 1999).
2.2.6 Tipo de reproducción.
El Agave angustifolia, presenta dos tipos de reproducción: asexual y sexual. La
primera es por medio de retoños los cuales nacen en la base o bien mediante
propágulos que brotan eventualmente a partir de la inflorescencia. Los individuos que
se producen mediante esta forma son genéticamente idénticos a la planta madre.
Este método de propagación es lento, ya que cada planta empieza a dar “hijuelos” a
los tres años en adelante. En cuanto a la reproducción sexual, esta se realiza a base
de semillas, la desventaja de esta forma de reproducción es su bajo índice de
germinación. Sin embargo la planta está sujeta a presentar una alta variabilidad
genética (IMADES, 2002).
2.2.7 Distribución geográfica.
Las agaváceas sólo se desarrollan en forma natural en el continente Americano. Se
hallan desde el nivel del mar, donde crecen sobre las dunas costeras, hasta los
bosques mesófilos de montaña a los 3,300 msnm; sin embargo su abundancia es
mayor entre los 800 y 2,500 msnm. Es común observarlos en sitios soleados,
pedregosos, en las laderas de las montañas o barrancas de los ríos y a veces en
lugares planos, siempre sobre terrenos con buen drenaje. A pesar de la amplitud de
esta área, el país donde se concentra el mayor número de especies es México,
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
15
seguido por los territorios contiguos del sur de los Estados Unidos, Guatemala y
Cuba.
Los magueyes mezcaleros se encuentran distribuidos principalmente en la parte
occidental de México, en los estados de Oaxaca, Puebla, Sonora, Durango, San Luís
Potosí, Chihuahua y Jalisco. También hay en Nayarit, Sinaloa, Colima, Michoacán,
Guerrero, Zacatecas, Tamaulipas y en casi todos los estados de la República,
excepto en Tabasco (Figura 4).
Illesley, 2003
Figura 4. Distribución Geográfica del Agave angustifolia Haw.
La mayoría de los magueyes silvestres sólo crecen en México y en una pequeña
parte del desierto en Estados Unidos, América Central y del Sur. México es el centro
de origen de los magueyes, así como lo es del maíz (CIANOBIO, 200).
La especie de Agave angustifolia, tiene la distribución más amplia de agaves en
Norte América, se extiende de Costa Rica hasta el Desierto Sonorense (IMADES,
2002).
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
16
2.2.8 Cultivo y manejo del Agave angustifolia.
Semillas
El Aprovechamiento de semillas tiene una ventaja: la gran cantidad que se producen
por planta, de 3 a 20 mil semillas viables por escapo floral. Es factible cosechar en
abril a julio antes de las lluvias de verano, ya que esta ocasiona que la baya se abra
y la semilla caiga al suelo, haciendo imposible su recolección. La emergencia varia
según la época de establecimiento del almácigo: 85-90% de mayo a septiembre y 4055% de enero a abril. Esto se ha presentado en almácigos establecidos en los
municipios de Bacanora, Moctezuma, Sahuaripa, entre otros. Además del bajo
porcentaje de emergencia observado de septiembre a febrero, el crecimiento es muy
lento y si la temperatura mínima alcanza los –70C, se presenta una mortalidad del
45% en viveros. Una desventaja de este método es que es de lento crecimiento de
las plantas. Se requiere de 30 a 36 meses bajo vivero, hasta alcanzar el peso y altura
apropiado para sobrevivir en el agostadero o en condiciones de crecimiento
sostenido (Valenzuela y Cervantes, 2000, citado por Núñez, 2004).
Bulbillos
En relación con los bulbillos (hijuelos del escapo floral), éstos se forman de manera
natural en ciertos predios ganaderos, principalmente de Bacanora, Moctezuma y
Nacori Chico. Por general se presentan en cañadas, siendo distantes los agaves
entre sí, pero muy cerca de árboles o arbustos de la misma altura o más grandes que
los escapos y en continuo rozamiento. Durante los años 2000 y 2001 se recolectaron
en estos sitios alrededor de 15,000 bulbillos. La tasa de crecimiento es de 40%
mayor que en plantas de semilla y genéticamente igual a la madre. Es factible
promover la aparición de bulbillos mediante la emasculación de los botones florales
para evitar la formación de semillas y disponer así de bulbillos durante los meses de
mayo a agosto (Venezuela y Cervantes, 2000, citado por Núñez, 2004).
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
17
Hijuelos
Con respecto a los hijuelos, el A. angustifolia, empieza a producir de rizomas entre
cinco años de edad, según la región, el tipo de suelo y la precipitación. La ventaja de
utilizar este método de propagación es la rapidez con que se obtienen plántulas de
buen tamaño idénticas a la madre. La desventaja es que son poca las poblaciones
silvestres con hijuelos, para que sea económicamente viable la recolección de los
mismos (Núñez, 2004).
2.2.9 Establecimiento y Manejo.
Una vez que se disponen de material vegetativo apropiado, el siguiente paso es el
establecimiento de dichas plántulas en lugar donde se desarrollarán los siguientes
ocho o nueve años. Las temperaturas, de –3 a –7 0C, son la limitante principal para
el crecimiento inicial del agave, sobre todo en condiciones de agostadero. Es de
primordial importancia elegir los sitios apropiados para la plantación. Deben ser
laderas suaves, expuestas hacia el suroeste, o mesas con abundantes vegetación y
los suelos de color pardo rojizo, con pH de 7.0 a 7.5, textura franco-arcillosa y con
exposición al norte. En estos sitios la sobrevivencia no rebasa al 5%, debido a las
bajas temperaturas
Cuando se dispone de hijuelos, plantas de semillas o bulbillos de tres años de edad,
se procede a eliminar la mayor parte de las raíces y las puntas de las hojas. Lo
primero, para promover la aparición de raíces más vigorosas y que se adapten al
sitio definitivo de plantación, y lo segundo para facilitar el manejo de la planta. Para
prevenir enfermedades fungosas, se recomienda la aplicación de fungicidas antes de
la siembra (Venezuela, Cervantes, 2000, citado por Núñez, 2004).
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
18
2.2.10 Usos.
Debido a que la caza de animales era difícil y algunas veces estacional, los
indoamericanos primitivos usaban las plantas de su entorno para cubrir las
necesidades básicas de su dieta. En el proceso se convirtieron en verdaderos
expertos en agaves. Alrededor de la mitad de los excrementos humanos
momificados con 9000 años de antigüedad, encontrados en cavernas de Tamaulipas,
Puebla y México, contenían remanentes de agaves (Nobel, 1998).
Alimento
La clave para hacer apetecible los agaves es su alto contenido de azúcar; y la clave
para desdoblar los azucares, que se producen de manera natural en los tejidos
almidonosos; es el calentamiento. Al cocerlos se transforman en polisacáridos, en
azucares simples mas dulces y de fácil digestión. La cabeza es una piña grande que
se utiliza para elaborar tequila. Los agaves cocidos se comen como alcachofas: las
hojas se raspan con los dientes para aprovechar la parte comestible, dejando la fibra
(Nobel, 1998).
En cierta parte de México se cosecha como alimento las flores del maguey. Otra
delicia de los agaves son los gusanos que atacan a la base del tallo. Las larvas de
las palomillas pardas de género Agathymus y Megathymus se consumen fritas
(Nobel, 1998).
Bebidas
La clave para la producción de bebidas del agave es la acumulación de
carbohidratos, como azúcares y almidones. Los carbohidratos se acumulan en los
tallos y en la base de las hojas, y los más rendidores por lo general tiene los tallos
robustos y las bases de las hojas más gruesa. La bebida del agave más antigua que
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
19
aun se produce es el pulque, conocido por los aztecas, otras bebidas son el agua
miel, mezcal, tequila y el bacanora; este ultimo se produce en la sierra de Sonora
(Nobel, 1998).
Fibras
Desde hace tiempo se reconoce la fuerza que tienen las fibras del maguey, en la
extensión de las hojas. Con certeza tales fibras se han usado en la fabricación de
cordeles, tejidos, redes, sacos, muebles, carpetas, rellenos, para cojines, tapicería,
cojines para sillas, cobertores, canastos, brazaletes, bandas para la cabeza,
sandalias, ropa y otros objetos de tejidos, escudos, cepillos, hilo para pescar,
instrumentos musicales, objetos para ceremoniales y mas recientemente como
material de construcción, papel y tableros de dardos (Nobel, 1998).
2.3 Micopropagación vegetativa por cultivo de tejido in vitro.
2.3.1 Definición e Importancia.
Al conjunto de técnicas que permiten el establecimiento, mantenimiento y desarrollo
de cualquier parte de una planta, desde una célula hasta un organismo completo,
bajo condiciones artificiales, axénicas y controladas se le conoce como Cultivo de
Tejidos Vegetales (Pérez et al., 1999).
Toda célula vegetal viva, cualquiera que sea su especialización, desde él momento
en que está viva posee un núcleo capaz de reproducir las características de la planta
de la cual proviene. A esta notable capacidad denominada totipotencia celular, el
cultivo in vitro debe toda su extensión. Debido a ella, todo individuo del reino vegetal
puede o podrá cultivarse in vitro; no hay excepciones. Sin embargo esto no quiere
decir que el desarrollo actual de los medios de cultivo y el conocimiento que se
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
20
pueda tener del comportamiento de las diferentes especies vegetales permitan
realizar de inmediato y sin problemas el cultivo in vitro de todas las plantas que
existen en la tierra (Auge, 1986, citado por Gómez, 1999).
La técnica de propagación por cultivo de tejidos o micopropagación, representa una
forma de propagación vegetativa que ofrece ventaja sobre los métodos tradicionales.
Por ejemplo, permite la multiplicación clonal de plantas libres de enfermedades en un
ambiente controlado evitando así las variaciones esenciales impredecibles de las
condiciones medio ambientales en ecosistemas naturales (Lara, 2006).
El cultivo de células y tejidos vegetales ha permitido la manipulación de especies con
diversos fines sin necesidad de tener la planta completa. Los estudios sobre el
análisis del crecimiento y desarrollo de cultivos in vitro a nivel estructural permiten
determinar: a) el momento en que los tejidos constituidos por células diferenciadas
se empiezan a desdiferenciar, b) en que tipo de células o tejidos ocurre la
desdiferenciación, c) el estado de diferenciación de los cultivos in vitro d) los
procesos morfogenéticos (formación de órganos o embriones adventicios). Por lo
anterior es posible plantear estrategias relacionadas con la manipulación o manejo
biotecnológico adecuado de las especies, como: el tiempo de exposición de los
explantes a ciertos fitorreguladores y demostrar los eventos morfogenéticos, entre
otros (Gómez et al., 2003).
2.3.2 Condiciones in vitro en las Cactáceas y el género Agave.
Se ha demostrado que las condiciones del cultivo in vitro estimulan los ritmos de
crecimiento de cactáceas, principalmente por alterarse su patrón de fijación de CO2
(metabolismo fotosintético CAM), mismo que presentan especies del género Agave.
Por ejemplo, las plantas derivadas in vitro de Coryphantha mínima y Obregonia
denegrii presentan tamaños dos veces más grandes que las obtenidas por semilla en
invernadero en un mismo período de tiempo. Esto es consecuencia de que la
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
21
actividad fotosintética se ve favorecida pues se demostró que la fijación de CO2 se
incrementa durante la noche y se extiende a los períodos con luz; representando
entonces una alteración del metabolismo CAM (Malda y Ruiz, 1999 citado por Malda
y Ruiz, 2004) inducido por el cultivo in vitro. Por otro lado, el medio de cultivo
comúnmente utilizado para este tipo de propagación (medio Murashige-Skoog) es
muy rico en nitrógeno, lo cual también puede ser un factor que influya en las tallas
mayores de plantas tipo CAM cultivadas in vitro.
Dado que los agaves son plantas CAM facultativas, es posible esperar un
comportamiento similar si se someten al cultivo in vitro; considerando también que
factores típicos del ambiente in vitro como la alta disponibilidad de agua y nutrientes
puedan jugar un papel importante en el crecimiento de las plantas (Malda y Ruiz,
2004).
2.4. Fases de la micropropagación in vitro.
2.4.1 Fase 1. Establecimiento del explante de los cultivos axénicos.
Consiste en la elección del explante y la esterilización del mismo para iniciar el
cultivo axénico. La elección del explante depende de la especie y del sistema de
proliferación. Es de esperarse un bajo porcentaje de establecimiento exitosos de los
tejidos in vitro debido a los problemas de adaptación y contaminación; sin embargo,
no se requiere mucho material para iniciar la etapa 2, ya que es ésta en donde se
dará la proliferación.
2.4.2 Fase 2. Multiplicación del tejido.
Es donde se realiza verdaderamente la micropropagación, obteniéndose un gran
número de nuevos brotes a partir de cantidades mínimas de tejido. Existen tres vías
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
22
para la multiplicación in vitro: la organogénesis, la embriogénesis somática y la
multiplicación por yemas, ápices o meristemos. Los sistemas de organogénesis y
embriogénesis somática, aunque pueden ser más rápidos y/o productivos que la
propagación por yemas, ápices o meristemos, son más susceptibles a la generación
de variantes en las plantas obtenidas, lo cual puede ser negativo en un esquema de
propagación clonal.
2.4.3 Fase 3. Elongación y enraizamiento.
En la etapa 2 generalmente se obtienen pequeños brotes, en la mayoría carentes de
raíz y poca probabilidad de adaptarse con éxito a las condiciones ambientales
externas. En esta etapa se pretende que los brotes formen su sistema radical al
mismo tiempo que se elonguen para facilitar su manipulación y hacer más probable
su adaptación a las condiciones ambientales externas.
2.4.4 Fase 4. Adaptación.
Las plantas generadas in vitro presentan varias características peculiares que
dificultan su adaptación al medio externo una vez concluido el periodo de cultivo. A
continuación se detallan las más importantes:
•
La humedad relativa dentro de los recipientes del cultivo suele ser muy alta, lo
que provoca que las plantas generadas in vitro carezcan de algunos sistemas
normales para evitar la pérdida de agua. Es por ello que el proceso de
adaptación debe de ser gradual para permitir así el desarrollo paulatino de los
sistemas de protección de la planta contra la desecación.
•
Las plantas durante su cultivo in vitro no realizan una figurasíntesis normal y
sus requerimientos de carbono son satisfechos por el medio. Es por ello que el
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
23
paso de las plantas generadas in vitro hacia la autotrofía debe de ser gradual,
exponiéndola a incrementos paulatinos en la intensidad luminosa.
Una evidencia para determinar el momento en que la adaptación puede considerarse
exitosa, es la aparición de hojas nuevas después de la transferencia al substrato
(Pérez et al., 1999).
2.5 Técnicas de esterilización y manipulaciones asépticas.
2.5.1 Importancia de las condiciones de esterilidad.
Son de fundamental importancia las condiciones de esterilidad en un laboratorio de
Cultivo de Tejidos Vegetales debido a que los medios empleados contienen
nutrientes que favorecen al crecimiento de microorganismos los cuales compiten con
el tejido sembrado provocando un lento crecimiento o inhibición por la producción de
toxinas. Es por ello que el material vegetal se desinfecta superficialmente antes del
cultivo in vitro en condiciones de asepsia en una cámara de flujo laminar (Hurtado y
Merino, 1987).
Un aspecto importante de la micropropagación es el control de organismos
patógenos y para obtener un cultivo completamente estéril deben eliminarse los
organismos patógenos presentes en el explante según Imay, 1997. En cultivo de
tejidos el crecimiento de la mayoría de los microorganismos es muy acelerado por lo
que su presencia se hace visible a pocos días de haberse iniciado el cultivo. Sin
embargo, existe una minoría para los cuales el medio no resulta apropiado por lo que
son de lento crecimiento y no son fácilmente detectables y estos son los
responsables en la mayoría de los casos del llamado efecto de halo alrededor de los
explantes. Existen dos fuentes de contaminación:
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
24
1. La manipulación. Es aquella que proviene de los instrumentos utilizados y las
condiciones en que se manipulan los mismos.
2. El explante. Es lo más difícil de controlar, ya que las superficies vegetales son
el hábitat natural de un gran número de microorganismos potencialmente
contaminantes. Además de los endofíticos, cuyo hábitat se encuentra dentro
de los tejidos vegetales entre los espacios intercelulares e incluso dentro de
las células.
El cultivo de tejidos se volvió posible con el descubrimiento de desinfectantes
efectivos, tales como el hipoclorito de calcio y sodio. Tanto la efectividad del
tratamiento como el daño del tejido viviente aumenta como respuesta al tiempodosis, de manera que se busca un equilibrio de esos factores (Tamayo, 1998).
La esterilización superficial de los tejidos se realiza utilizando compuestos químicos
microbicidas; sin embargo, el daño no sólo es causado al microorganismo, sino
también al tejido. El método general consta de hacer un lavado previo con agua
corriente y un detergente suave; seguido de un tratamiento con un agente químico, y
el enjuague con agua destilada estéril en un ambiente aséptico (Pérez et al., 1999).
2.5.2 Agentes químicos utilizados en el control de organismos patógenos.
Sulfato de gentamicina con clorhidratos de oxitetraciclina (Bactrol).
Es un bactericida humectable, que tiene un amplio espectro de control sobre
enfermedades bacterianas de importancia económica en México. Sus ingredientes
activos son antibióticos de sulfato de gentamicina con clorhidratos de oxitetraciclina.
Se utiliza en cultivos de papa y pera.
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
25
La efectividad “in vitro” de los antibióticos puede ser una alternativa para el
establecimiento aséptico de cultivos in vitro, cuando son tomados a nivel campo. La
mezcla de sulfato de gentamicina con clorhidratos de oxitetraciclina ha sido utilizado
en cepas de bacterias fitopatógenas Erwinia caratovora subsp. Atroseptica y
Xanthonomas vesicatoria (ANÓNIMO, 2003).
Flutolanil (Moncut 50 WP).
Es un fungicida en polvo humectable, sus ingredientes activos son flutolanil. Se
utiliza en cultivos de papa.
El efecto in vitro del fungicida flutolanil, ha sido utilizado en el control de cepas de
Trichoderma Sp y una de Screrotina sclerotiorum (LIB) Bary., con el objetivo de
evaluar el comportamiento de las dos cepas de Trichoderma, sobre el crecimiento y
esporulación de los hongos en presencia del fungicida flutolanil, en el control de
Sclerotinia sclerotiorum, obteniendo resultados de inhibición frente a este funguicida
(Mavares, 2002).
2.5.3 Oxidación en el cultivo in vitro.
Es común que se presente el fenómeno de oxidación del explante y del medio de
cultivo en la micropropagación de especies vegetales. Cuando se extrae un explante
de la planta madre, la primera respuesta del tejido es la exudación de compuestos
fenólicos en el sitio del corte, provocando un severo oscurecimiento del tejido y del
medio circundante, lo que limita la respuesta del explante, provocando inclusive la
muerte del mismo. Para mantener la capacidad de regeneración de los explantes, es
importante la aplicación de agentes antioxidantes o absorbentes, que eviten la acción
de los exudados fenólicos (Nahuat et al., 2003).
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
26
Según García y Rafael, 2003, en el establecimiento de microesquejes de café (coffea
arabica “CATIMOR”). La utilización de una mezcla
de antioxidante de ácido
ascórbico y ácido cítrico, permitió obtener microesquejes sanos que crecían
apropiadamente en un medio de cultivo previamente seccionado. En algunos cultivos
se utiliza en el medio nutritivo, o directamente en el explante, sustancias
antioxidantes ácido cítrico y ácido ascórbico o incluso adsorbentes (carbón activado)
para destoxificar el medio (Tamayo, 1998).
En la micropropagación de Dracaena deremensis var. Janet Craig. El ácido ascórbico
utilizado en la fase inicial de la preparación de los explantes y durante la desinfección
con el NaClO redujo la oxidación del tejido durante la disección e inoculación in vitro
de los explantes (Blanco et al., 2004).
2.5.4 Heridas y estímulos mecánicos en hojas.
Se sabe desde hace mucho tiempo, que la estimulación mecánica de los tejidos, de
la hoja causa un aumento en la respiración por un tiempo corto, generalmente de
unos minutos a una hora. El doblarla y el cortarla o fracturarla parece estimular al
máximo la respiración los mecanismos son desconocidos. El herir o romper los
tejidos estimulan mucho la respiración por tres razones:
♣ La primera es la rápida oxidación de los compuestos fenólicos que tiene un
lugar cuando la organización, que mantiene a estos substratos separados de
sus oxidasas, se rompen.
♣ La segunda, son los procesos normales de glicólisis y catabolismo oxidativo
que aumenta conforme la disrupción de la célula o células causa una mayor
accesibilidad de los substratos a la maquinaria enzimática de la respiración.
♣ Tercero, la consecuencia general de la herida es la reversión de ciertas
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
27
células en estado meristemático, seguido por la formación de callo y la
”curación” o reparación de la herida (Bidwell, 1979).
2.6 Medios de cultivo in vitro de los tejidos vegetales.
2.6.1 Medio de cultivo.
El medio de cultivo debe de proporcionar a los tejidos nutrientes y factores de
crecimiento necesarios para su diferenciación y crecimiento. El medio de cultivo esta
constituido por dos grandes grupos: el medio basal (sustancias orgánicas e
inorgánicas) y los reguladores de crecimiento. El medio más utilizado para el cultivo
de tejidos vegetales es el medio MS, formulación desarrollada por Murashige y
Skoog reportada en 1962 (ver anexo 2). En teoría los requerimientos nutricionales de
los tejidos vegetales cultivados in vitro deben de ser similares a los que se presentan
en la planta completa bajo condiciones normales. Deben de tomarse las siguientes
consideraciones:
1. No son autótrofos, por lo que requieren de la adición de fuentes de carbono
orgánico.
2. Requiere de sustancias orgánicas que no son capaces de producir como la
timina.
3. La manera de obtener los nutrientes, es decir, en condiciones ex vitro las
plantas los toman por medio de la raíz y en los cultivos la células expuesta al
medio no son especializadas y son las responsable en adquirirlos (Ayerbe,
1990).
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
28
2.6.2 Agua.
Constituye el 95% del medio nutritivo. Para los trabajos de investigación se
recomienda que el agua sea destilada, y en caso de trabajar con protoplastos o
meristemos, se debe de utilizar bidestilada (Ayerbe, 1990).
2.6.3 Agar.
Es un polisacárido con una elevada masa molecular, que tiene capacidad para
gelificar los medios. La concentración usual para el agar es 0,6 – 0,8%. Si se utiliza
una concentración más baja (0,4%), el medio nutritivo permanece sin cuajar, sobre
todo cuando el pH es bajo. Si la concentración es muy alta (1,0 %), el medio nutritivo
queda muy sólido, haciendo difícil la inoculación. Si se utiliza una concentración del
0,6%, y el medio no adquiere rigidez, debe corregirse el pH; si el pH es más bajo que
4,5-4,8, un medio con 0,6% de agar no gelifica adecuadamente (Ayerbe, 1990).
2.6.4 Fuentes de carbono.
Generalmente se usa una concentración de 1-5% de sacarosa, ya que este azúcar
se sintetiza y se transporta de forma natural por las plantas. La concentración
depende del tipo y edad del material vegetal, no causa toxicidad in vitro (Pérez et al.,
1999).
2.6.5 Vitaminas y otros elementos orgánicos.
En condiciones normales, las plantas tienen la capacidad de sintetizar todas las
vitaminas requeridas para su metabolismo, sin embargo, por alguna razón los tejidos
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
29
cultivados in vitro pierden total o parcialmente la capacidad de producirlas (Pérez et
al., 1999).
•
Vitaminas. Una o varias de las siguientes vitaminas se utilizan: inositol
(mio -inositol, meso – inositol; 100-200 mg/L); B1 (tiamina, aneurina, 0,1 –
5,0); ácido fólico (0,1 – 5,0), riboflavina (0,1 – 10), tocoferol (1-50). El
mioinositol estimula el crecimiento de la mayoría de los tejidos.
•
Poliaminas. Están relacionados con la diferenciación celular y el
desarrollo durante la embriogénesis (Ayerbe, 1990).
2.6.6 Complejos orgánicos.
Estimulan el crecimiento de los tejidos debido a la presencia de sustancias no
identificadas pero requeridas para las células. Con este fin se utiliza agua de coco,
extracto de levadura y de malta, endospermo de maíz, jugo de tomate, de naranja y
piña, y el extracto de plátano. Deben de tomarse como último recurso, debido al poco
control que se tiene sobre los componentes de los mismos (Pérez et al., 1999).
2.6.7 Nutrición mineral.
Si se elimina toda el agua de una planta y se determina luego su peso, la cantidad
obtenida es llamada peso seco y corresponde a todas las restantes sustancias,
inorgánica y orgánicas, contenidas en esa planta; y esa proporción se muestra en la
tabla 2 (Pérez y Martínez- Laborde, 1994).
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
30
Tabla 2. Composición elemental de un tejido vegetal, expresado en porcentaje del
peso seco correspondiente a cada elemento (Barceló et al., 1992, citado por Pérez y
Martínez- Laborde, 1994.)
Elemento
Símbolo
Proporción
(en % del peso seco)
Carbono
C
45
Oxígeno
O
45
Hidrógeno
H
6
Nitrógeno
N
1.5
Potasio
K
1
Calcio
Ca
0.5
Magnesio
Mg
0.2
Fósforo
P
0.2
Azufre
S
0.1
Cloro
Cl
0.01
Hierro
Fe
0.01
Manganeso
Mn
0.005
Cinc
Zn
0.002
Boro
B
0.002
Cobre
Cu
0.0006
Molibdeno
Mo
0.00001
El 5 al 10% del peso seco corresponde a los macro y micronutrientes
2.6.8 Macronutrientes.
•
Nitrógeno (N): es el más importante y abundante en la planta. Su esencialidad
se debe a que forma parte de proteínas, bases nitrogenadas, coenzimas,
clorofila, alcaloides, etc.
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
•
31
Fósforo (P): forma parte de los nucleótidos, ácidos nucleicos, fosfolípidos y
algunas coenzimas. Es necesario para la formación de enlaces anhidros de alta
energía (ATP) y para la activación de varios metabolitos (azúcares-fosfatos).
•
Potasio (K): necesario para la activación de enzimas en la síntesis de proteínas
y de la respiración, así como regulador del potencial osmótico.
•
Calcio (Ca): forma parte de las paredes celulares y lámina media, interviene en
la permeabilidad de las membranas y en la formación del huso acromático
durante la mitosis. Cofactor de enzimas hidrolíticas.
•
Magnesio (Mg): forma parte de la clorofila y es cofactor de algunas coenzimas.
•
Azufre (S): forma parte de tres aminoácidos esenciales: cistina, cisteína y
metionina (Pérez y Martínez- Laborde, 1994).
Además de los macronutrientes anteriores, tanto las plantas normales como los
tejidos cultivados in vitro requieren de otros compuestos inorgánicos en
concentraciones generalmente menores. Estos actúan básicamente como cofactores
enzimáticos y algunos en sistemas de transporte de electrones
2.6.9 Micronutrientes.
•
Hierro (Fe): forma parte de los citocromos y otras enzimas que intervienen en el
transporte de electrones mediante reacciones de óxido-reducción; como
cofactor y es necesario para la síntesis de clorofila.
•
Manganeso (Mn): cofactor en enzimas e interviene en la figurasíntesis
•
Cobre (Cu): forma parte de enzimas y participa en reacciones de óxidoreducción.
•
Molibdeno (Mo): en la reductasa del nitrato; en la nitrogenasa en la fijación del
nitrógeno.
•
Cobalto (Co): se requiere para la fijación simbiótica del N2 (Pérez y MartínezLaborde, 1994).
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
32
De los micronutrientes mencionados el Fe suele ser el más limitante debido a su
tendencia a precipitar en los medios de cultivo, para evitarlo se suministra en forma
de EDTA.
2.7 Reguladores in vitro.
2.7.1 Reguladores de crecimiento.
Son compuestos orgánicos sintetizados por la propia planta, que en pequeñas
cantidades alteran el crecimiento o los patrones de desarrollo vegetal. Es por ello que
el manejo de los tipos, concentraciones y combinaciones de estos compuestos
pueden obtenerse como respuestas la formación de tejido células callosas, brotes,
embriones somáticos y raíces. Los más utilizados en el cultivo de Tejidos Vegetales
son los pertenecientes al grupo de las auxinas y citocininas, ya que son los que
regulan los procesos de crecimiento y organización en los cultivos (Pérez et al.,
1999).
Para el desarrollo óptimo del cultivo in vitro de tejidos y órganos es necesario que, en
adición a los nutrientes, se incluya en el medio de crecimiento una o más sustancias
reguladoras como auxinas y/o citocininas, y en algunos casos también giberelinas o
ácido abscísico. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varían
considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de estos
reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro (Lara, 2006).
2.7.2 Auxinas.
Se
relacionan
con
la
elongación,
tropismo,
dominancia
apical,
abscisión,
enraizamiento y otros. En cultivo in vitro las auxinas son utilizadas principalmente
para la diferenciación de raíces y la inducción de callo. Las auxinas más utilizadas
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
son:
IBA
(ácido
33
indol-3-butírico),
NAA
(ácido
naftalenacético),
IAA
(ácido
indolacético) y 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético). El IBA y el NAA son usados
frecuentemente para enraizamiento. El 2,4-D es muy efectivo para la inducción de
callos.
2.7.3 Citocininas.
Están implicadas en la división celular, modificación de la dominancia apical,
diferenciación de tallos y otros. En los medios para cultivo in vitro se incorporan
citocininas para promover la división celular y la inducción de yemas adventicias en
callos y órganos. Además se usan estos compuestos para la proliferación de tallos
axilares por la ruptura de la dominancia apical. Las citocininas más usadas son: BAP
(bencilamino purina), cinetina y 2-iP (isopentenil-adenina).
2.7.4 Giberelinas.
Existen multitud de giberelinas conocidas. La de mayor uso es el ácido girébelico
(GA3), pero debe tenerse en cuenta que es muy sensible al calor. Comparado con
las auxinas y citocininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayoría de los
explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas. Cuando se
aportan giberelinas al medio de cultivo, su función principal es el alargamiento de las
regiones subapicales (Lara, 2006).
2.7.5 Ácido abscísico.
El ácido abscícico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo
en los cultivos in vitro, en
determinados casos promueve la maduración de
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
34
embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de la
división celular.
2.8 Propagación masiva vía células callosas.
Las células callosas es una masa amorfa de células vegetales poco diferenciadas y
de rápida proliferación; que muestran características similares a las células
parenquimatosas. Una de las características más importantes es la friabilidad que es
la tendencia de disgregarse de las células. Por lo general, las altas concentraciones
de auxina favorecen a la friabilidad. El tejido de células callosas puede ser un paso
intermedio para la regeneración de plantas por las vías de embriogénesis somático u
organogénesis.
2.8.1 Embriogénesis somática.
Es la capacidad de formar embriones por medio de un proceso asexual por lo que la
nueva planta será exactamente igual a la donadora de la célula inicial. El proceso
consta de varias etapas ver figura 5, de las cuales se requieren estímulos y
fenómenos diferentes:
1. Inducción: es le proceso de conversión de una célula somática a una célula
proembriogénica.
2. Histodiferenciación: las células proembriogénicas se diferencian formando
embriones
somáticos
mediante
una
división
y
diferenciación
celular
simultánea. Durante esta etapa los embriones pasan por una serie de
estadios; en el caso de la dicotiledóneas son: globular, corazón y torpedo.
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
35
3. Maduración: consiste básicamente en la elongación celular y sin división ya
que un embrión en el estadio de torpedo no tiene la capacidad de germinar.
4. Germinación. Es el proceso de elongación y reactivación metabólica de un
embrión somático maduro para convertirse en una plántula (Pérez et al.,
1999).
Se pueden distinguir 2 tipos de embriogénesis somática:
•
Directa: se origina directamente a partir de una célula o tejido, sin que se
produzca células callosas.
•
Indirecta: primero se forma un células callosas, a partir del cual se forman
después los embriones (Ayerbe, 1990).
Fuente:http://www.umanitoba.ca/afs/plant_science/COURSES/39768/l15/embryogenesis.gif
Figura 5. Proceso de la embriogénesis somática.
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
36
2.8.2 Organogénesis.
Se basa en la llamada totipotencialidad celular, donde cada célula posee toda la
información genética necesaria para constituir una planta completa. Sin embargo se
ha visto que no todos los tipos celulares son capaces de desencadenar el proceso de
organogénesis; y esto puede ser por tres cosas:
1. Genético: no existe la totipotencialidad celular real o se carece de algún factor
genético indispensable.
2. Epigénico: bloqueo reversible en la expresión de los genes responsables del
proceso de organogénesis.
3. Fisiológico: a la falta de estímulos como los fitorreguladores, luz, entre otros
para desencadenar el proceso.
La organogénesis puede ser directa o indirecta. La primera sucede cuando se genera
a partir de un explante inicial; la segunda cuando se parte de tejido células callosas.
Para determinar la eficiencia de un sistema se toman como parámetros el número
promedio de brotes por explante así como el porcentaje de explantes que presentan
brotes. Para ello es aconsejable el parámetro la Capacidad de Formación de Brotes
(Pérez et al., 1999).
2.9 Cultivo de tejidos en Agave.
En el género Agave, se ha reportado la embriogénesis somática para A. victoriareginae (Rodríguez-Garay et al., 1996) partiendo de explantes de hoja, en un periodo
de 2 a 6 semanas de cultivo en medio MS adicionado con un grupo de vitaminas
denominado L2 y 0.3 mg/l de 2,4-D; con la germinación de embriones somáticos en
medio MS de fuerza media en un lapso de 8 semanas y en medio SH de fuerza
media en un lapso de 4 semanas, ambos careciendo de reguladores de crecimiento.
Para A. tequilana Webber var azul se ha reportado embriogénesis somática indirecta,
II. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA
37
siendo los mejores explantes para la formación de callos y la posterior producción de
embriones somáticos, explantes de hoja de plántulas mantenidas in vitro (RodríguezGaray et al., 1996; Lara, 2006).
Para A. cocui Trelease, un agave de Venezuela, se estableció un protocolo para su
propagación masiva mediante organogénesis indirecta a partir de hojas de plántulas
mantenidas in vitro, obtenidas éstas, a su vez por medio de organogénesis directa;
en medio MS adicionado con 2 mg/l de benzilaminopurina (BA) y 0.1 mg/l de ácido
naftalenacético (www.funflc.org.ve/webfunda/programas/agave/croi4).
Para A. parrasana Berger, un Agave utilizado como planta ornamental nativo del
estado de Coahuila, México, se reporta un método eficiente para su propagación in
vitro. Se logró la obtención de brotes de buena calidad en medio MS adicionado con
L2 vitaminas y con una concentración de benciladenina (Yépez et al., 2002).
También para el henequén (Agave fourcroydes Lem.), es importante para la industria
cubana, no solo por ser fuente de fibra si no también por sus subproductos. Se
desarrollo una metodología para el mejoramiento genético, con el empleo de técnicas
biotecnológicas y radiomutagénicas, así como métodos de propagación in vitro. Se
establece una metodología de desinfección para el establecimiento in vitro con mas
de un 98.50% de efectividad, utilizando concentración de NaClO 5% (hipoclorito de
sodio al 5%) y se establece la obtención de callos en el medio Km. con 0.1 mg/l y 6
mg/l de ANA; y para la regeneración de plantas de plántulas vía organogénica, en el
medio suplementado con 3 mg/l de BAP donde se obtienen de 20 a 30 plántulas por
callo a los 60 días (Muñoz et al., 2002).
III. MATERIALES Y METODOS
38
CAPITULO III. MATERIALES Y METODOS
Localización
El presente estudio se llevó a cabo, en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales
LV-717, del edificio 700 de biotecnología ubicado en la unidad Obregón-Náinari,
ITSON.
Materiales
Material Vegetal
Se colectaron explantes de hojas del Agave angustifolia obtenidas de los jardines en
la unidad Obregón-Náinari, ITSON en Ciudad Obregón Sonora.
3.1 Preparación del medio de Cultivo.
Los medios de cultivo, el agua y demás instrumentación de trabajo y materiales
inherentes a este tipo de actividad fueron previamente esterilizados en auto clave 16
lb./in2 y 121oC durante 20 minutos.
Para ello se requirió preparar soluciones madres tanto de fitorreguladores como de
sales inorgánicas de Murashige-Skoog (MS) para la preparación de los medios, los
cuales fueron preparados de la siguiente manera:
III. MATERIALES Y METODOS
39
Se pesaron 100 mg de 2,4-D, 100 mg de ANA y 100 mg de BA y se disolvieron
respectivamente en agua destilada estéril en vasos de precipitado de 100 ml,
posteriormente se pasaron a un matraz de aforación de 100 ml para llevarlos a la
concentración final de 1 mg/l. Sin embargo, se presentó dificultad para disolver la
bencilaminopurina por lo que fue necesario realizar una dilución de la solución madre
aforando de nuevo a un volumen final de 500 ml; es decir a una concentración de 0.2
mg/l de citocinina. Una vez preparadas se transfirieron a frascos ámbar estériles, se
etiquetaron y se guardaron en refrigeración.
Se pesaron los gramos correspondientes de cada compuesto (ver anexo 1) para la
preparación de las soluciones madres de Nitratos, Sulfuros, Halógenos, Fosfatos y
EDTA con agua destilada estéril.
Una vez preparadas se transfirieron a frascos ámbar estériles para proteger el
compuesto activo de la luz; se etiquetaron y se guardaron en refrigeración. Una vez
realizados los medios se ajustó el pH a 5.6 ± 0.1; se distribuyeron 20 ml de medio por
frasco tipo gerber en cada una de las concentraciones, después se esterilizó en el
autoclave a 16 lb/pulg2 por 20 minutos.
3.2 Preparación de soluciones desinfectantes hipoclorito de sodio (NaClO),
fungicida y bactericida.
La preparación de soluciones desinfectantes para el establecimiento aséptico del
explante Agave angustifolia se realiza en un ambiente aséptico (en medio de dos
mecheros y con área asperjada con etanol al 70% con una espátula estéril.
Hipoclorito de sodio
Con una pipeta de 10 ml estéril, se extrajeron 10 ml de “cloro” comercial (que
contiene 5% de hipoclorito de sodio) y se añadieron 95 ml de agua destilada
estéril.
III. MATERIALES Y METODOS
40
Flutolanil (Moncut).
Con una espátula estéril se tomó 3 g de funguicida, y se aforó a un litro con
agua destilada estéril, se agito y tapó para disolver.
Sulfato de gentamicina y clorhidrato de oxitetraciclina (Bactrol)
Con una espátula estéril se tomó 0.1 g de bactericida y se aforó a un litro con
agua destilada estéril, se agitó y tapó para disolver.
3.3 Preparación de antioxidantes.
Ácido cítrico y ácido ascórbico
La preparación de la solución de antioxidantes se trabajó en un ambiente estéril, al
igual que los desinfectantes (Tabla 3), con una espátula estéril se pesó 150 mg de
ácido cítrico y 100 mg de ácido ascórbico, se añadieron a un litro con agua destilada
se agitó y se tapo para disolver, y se esterilizó en el autoclave a 16 lb/pulg2 por 20
minutos.
Tabla 3. Reactivos, materiales y equipo.
Reactivos
Material de laboratorio
Equipo
2,4 - Diclorofenoxiacético
Probetas: 50, 100 y 1000 ml
Refrigerador
Ácido naftalenacético
Frascos de vidrio tipo gerber
Bencilaminopurina
Tapas de plástico
Balanza analítica
Sales Murashige
Bisturí
Autoclave
Agar – agar
Pinzas
Sacarosa
Cajas petri
Hidróxido de sodio
Pipetas: 0.02, 1, 5 y 10ml.
Campana de flujo
laminar
III. MATERIALES Y METODOS
41
Ácido clorhídrico
Algodón
Mioinositol
Gasas estériles
Tiamina-HCL
Plástico adherente
Hipoclorito de sodio
Matraz Elenmeyer: 500,
1000 y 2000 ml
Alcohol
Matraz aforado:
Alcohol etílico: 96%, 70%,
Cubre bocas
Agua destilada
Frascos ámbar
Flutolanil (Moncut 50 WP).
Cofias
Sulfato de gentamicina con
clorhidrato de oxitetraciclina
Espátulas
(Bactrol).
Mechero Bunsen
Termómetro
Guantes de asbesto
Baño maría
3.4 Experimento I. Establecimiento aséptico de cultivos.
La finalidad de esta etapa es obtener un cultivo aséptico. Para esto se requiere que
el explante pueda ser transferido sin problemas a un medio nutritivo sintético y que
presente una buena reacción.
III. MATERIALES Y METODOS
42
Tratamientos de desinfección superficial del material vegetal.
La micropropagación del Agave angustifolia, se inició con la desinfección
del
material vegetal provenientes del campo (hijuelos). En este procedimiento se
realizaron tres ensayos, los cuales se hicieron a prueba y error. Se analizaron el
efecto de los siguientes tratamientos.
Tratamiento I: Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5% durante 25 minutos.
Tratamiento II: Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%, durante 45 minutos.
Tratamiento III: Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%, + funguicida flutolanil
(Moncut), 3 gr/l (Imay, 1997).
Tratamiento IV: Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%, + antibiótico sulfato de
gentamicina con clorhidrato de oxitetraciclina (Bactrol), 1 gr/l.
Seleccionar una planta y tomar una porción de la planta de Agave angustifolia, para
ser llevada por un proceso de desinfección.
Tratamiento I: Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%.
1. Se lavó el material vegetal con agua jabonosa, durante 1 minuto.
2. Se enjuagó el material vegetal con agua de la llave y luego con agua destilada
estéril.
3. Se cortaron las secciones de 5 cm2, con un bisturí estéril.
4. Se sumergió el material vegetal con alcohol al 70%, por 30 segundos (a través
de la gasa estéril).
5. Se colocó en hipoclorito de sodio al 5%, por 25 minutos (a través de la gasa
estéril).
6. En la campana de flujo se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril.
7. En la campana de flujo se cortaron los explantes de 1 cm2
8. Se sumergieron los explantes en una solución estéril de antioxidantes (150
mg/l ácido cítrico + 100 mg/l ácido ascórbico) por un minuto (Tineo, 1989).
III. MATERIALES Y METODOS
9. Posteriormente
se
sembraron
43
los
explantes
en
el
medio
nutritivo
suplementado con tiamina-HCl, 1mg/l; mio-inositol, 100 mg/l; sacarosa, 30 gr/l;
agar, 8 gr/l; bencilaminopurina (BA) 0.1 mg/l; ácido naftalenacético (ANA) 0.1
mg/l y 150 mg/l ácido cítrico,100 mg/l ácido ascórbico.(Yépez et al., 2002;
Tineo 1989)
Tratamiento II: Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%, durante 45 minutos
1. Se lavó el material vegetal con agua jabonosa, durante 1 minuto.
2. Se enjuagó el material vegetal con agua de la llave y luego con agua destilada
estéril.
3. Se cortaron las secciones de 5 cm2, con un bisturí estéril.
4. Se sumergió el material vegetal con alcohol al 70%, por 30 segundos (a través
de la gasa estéril).
5. Hipoclorito de sodio doble al 5 %:
a. Se colocó en hipoclorito de sodio al 5%, por 25 minutos (a través de la
gasa estéril).
b. Se colocó en hipoclorito de sodio al 5%, por 20 minutos (a través de la
gasa estéril).
6. En la campana de flujo se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril.
7. En campana de flujo se cortaron los explantes de 1 cm2.
8. Se sumergieron los explantes en una solución estéril de antioxidantes (150
mg/l ácido cítrico + 100 mg/l ácido ascórbico) por un minuto (Tineo, 1989).
9. Posteriormente
se
sembraron
los
explantes
en
el
medio
nutritivo
suplementado con tiamina-HCl, 1mg/l; mio-inositol, 100 mg/l; sacarosa, 30 gr/l;
agar, 8 gr/l; bencilaminopurina (BA) 0.1 mg/l; ácido naftalenacético (ANA) 0.1
mg/l y 150 mg/l ácido cítrico,100 mg/l ácido ascórbico (Yépez et al., 2002;
Tineo 1989).
III. MATERIALES Y METODOS
44
Tratamiento III: Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%, + funguicida flutolanil
(Moncut), 3 gr/l.
1. Se lavó el material vegetal con agua jabonosa, durante 1 minuto.
2. Se enjuagó el material vegetal con agua de la llave y luego con agua destilada
estéril.
3. Se cortaron las secciones de 5 cm2, con un bisturí estéril.
4. Se sumergió el material vegetal con alcohol al 70%, por 30 segundos (a
través de una gasa estéril).
5. Se colocó en hipoclorito de sodio al 5%, por 25 minutos (a través de la gasa
estéril).
6. Se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril.
7. Se sumergió en una solución en funguicida flutolanil (Moncut), 3 gr/l
8. En campana de flujo se cortaron explantes de 1 cm2.
9. Se sumergieron los explantes en una solución estéril de antioxidantes (150
mg/l ácido cítrico + 100 mg/lL ácido ascórbico) por un minuto (Tineo, 1989).
10. Posteriormente
se
sembraron
los
explantes
en
el
medio
nutritivo
suplementado con tiamina-HCl, 1mg/l; mio-inositol, 100 mg/l; sacarosa, 30 gr/l;
agar, 8 gr/l; bencilminopurina (BA) 0.1 mg/l; ácido naftalenacético (ANA) 0.1
mg/l y 150 mg/l ácido cítrico;100 mg/l ácido ascórbico (Yépez et al., 2002;
Tineo 1989).
Tratamiento IV: Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%, + antibiótico sulfato de
gentamicina con clorhidrato de oxitetraciclina (Bactrol), 0.1 gr/l.
1. Se lavó el material vegetal con agua jabonosa, durante 1 minuto.
2. Se enjuagó el material vegetal con agua de la llave y luego con agua destilada
estéril.
3. Se cortaron las secciones de 5 cm2, con un bisturí estéril.
III. MATERIALES Y METODOS
45
4. Se sumergió el material vegetal con alcohol al 70%, por 30 segundos (a través
de una gasa estéril).
5. Se coloco en hipoclorito de sodio al 5%, por 25 minutos (a través de la gasa
estéril).
6. En la campana de flujo se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril.
7. Se sumergió en el antibiótico sulfato de gentamicina con clorhidrato de
oxitetraciclina (Bactrol), 0.1 gr/l
8. En campana de flujo cortar los explantes de 1 cm2.
9. Se sumergieron los explantes en una solución estéril de antioxidantes (150
mg/l ácido cítrico + 100 mg/l ácido ascórbico) por un minuto (Tineo, 1989).
10. Posteriormente
se
sembraron
los
explantes
en
el
medio
nutritivo
suplementado con tiamina-HCl, 1mg/l; mio-inositol, 100 mg/l; sacarosa, 30 gr/l;
agar, 8 gr/l; bencilminopurina (BA) 0.1 mg/l; ácido naftalenacético (ANA) 0.1
mg/l y 150 mg/l ácido cítrico;100 mg/l ácido ascórbico (Yépez et al., 2002;
Tineo 1989).
Los explantes fueron sembrados in vitro en frascos tipo ”Gerber”, se ubicaron el
cámara de crecimiento bajo las siguientes condiciones físicas:
¾ Temperatura: 25 +/-2oC.
¾ Fotoperiodo de 16 /8hr.
¾ Intensidad lumínica de 3000-5000 luxes.
Las variables estudiadas en un periodo de 28 días, se evaluaban cada semana, en
cada uno de los tratamientos en esta etapa fueron las siguientes:
ƒ
Contaminación
ƒ
Oxidación
III. MATERIALES Y METODOS
46
Los datos originados a término de este periodo fueron analizados EXCEL, en un
diseño estadístico completamente al azar.
3.5 Experimento II. Inducción de células callosas de Agave angustifolia Haw,
utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l ), y BA (0.0, 0.5, 0.1, 1.0,
1.5, 2.0 mg/l).
La inducción de células callosas Agave angustifolia se inició utilizando como
explantes de hojas previamente desinfectadas como se indica en el experimento I.
Para la regeneración de callo, a partir de explante de hoja de Agave angustifolia se
utilizó el siguiente medio nutritivo suplementado con tiamina-HCl, 1mg/l; mio-inositol,
100 mg/l; sacarosa, 30 gr/l; agar, 8 gr/l; 150 mg/l ácido cítrico; 100 mg/l ácido,
ascórbico
y
una
combinación
hormonal
de
diclorofenoxiacético
(2,4-D)
y
bencilaminopurina (BA), Los tratamientos utilizados se presentan en la tabla 4.
Las respuestas a los tratamientos fueron tomadas cada semana durante 28 días y
las variables estudiadas fueron las siguientes:
ƒ
Diámetro de células callosas
ƒ
Rizogénesis (Presencia de raíces)
ƒ
Brotación (Presencia de brotes)
ƒ
Contaminación
ƒ
Oxidación
Los datos originados a término del periodo, fueron analizados con el paquete
estadístico FAUANL VERSIÓN 2.5 FACULDAD DE AGRONOMIA UANL Marín N. L.
El diseño estadístico utilizado fue arreglo en parcelas divididas, con una significancia
al 0.05 de la prueba de t.
III. MATERIALES Y METODOS
47
Tabla 4. Tratamientos de auxina y citocinina utilizados para la inducción de células
callosas de Agave angustifolia Haw.
TRATAMIENTO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
5
AUXINA (2,4-D) mg/l
CITOCININA (BA) mg/l
0
0
1.5
0
1.0
0
1.5
0
2.0
0
0
0.5
0.5
0.5
1.0
0.5
1.5
0.5
2.0
0.5
0
1.0
0.5
1.0
1.0
1.0
1.5
1.0
2.0
1.0
0
1.5
0.5
1.5
1.0
1.5
1.5
1.5
2.0
1.5
0
2.0
0.5
2.0
1.0
2.0
1.5
2.0
2.0
2.0
III. MATERIALES Y METODOS
48
3.6 Experimento III. Inducción de células callosas de Agave angustifolia Haw,
utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/l), y BA (0.0, 0.25, 0.75, 1.0
mg/l).
Se diseñó un nuevo experimento, en base a los resultados obtenidos del
experimento anterior, buscando optimizar aún más el proceso. Se utilizó el mismo
medio nutritivo suplementado con tiamina-HCl, 1mg/l mio-inositol, 100 mg/l sacarosa,
30 gr/l; agar, 8 gr/l;150 mg/l ácido cítrico;100 mg/l ácido ascórbico, y otra
combinación de fitorreguladores: diclorofenoxiacético (2,4-D) y bencilaminopurina
(BA). Los tratamientos utilizados se presentan en la tabla 5.
Las respuestas a los tratamientos fueron tomadas cada semana durante 28 días y
las variables estudiadas fueron las siguientes:
ƒ
Diámetro de células callosas
ƒ
Rizogénesis (Presencia de raíces)
ƒ
Brotación (Presencia de brotes)
ƒ
Contaminación
ƒ
Oxidación
Al terminó de los 28 días, los datos originados fueron analizados con el paquete
estadístico FAUANL VERSIÓN 2.5 FACULDAD DE AGRONOMIA UANL Marín N. L.
El diseño estadístico utilizado fue arreglo en parcelas divididas, con una significancia
al 0.05 de la prueba de t.
III. MATERIALES Y METODOS
49
Tabla 5. Tratamientos de auxina y citocinina utilizados para la inducción de células
callosas de Agave angustifolia Haw.
TRATAMIENTO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
AUXINA (2,4-D) mg/l
CITOCININA (BA) mg/l
0
0
0.25
0
0.5
0
0.75
0
1.0
0
0
0.25
0.25
0.25
0.5
0.25
0.75
0.25
1.0
0.25
0
0.5
0.25
0.5
0.5
0.5
7.5
0.5
1.0
0.5
0
0.75
0.25
0.75
0.5
0.75
0.75
0.75
1.0
0.75
0
1.0
0.25
1.0
0.5
1.0
0.75
1.0
1.0
1.0
III. MATERIALES Y METODOS
50
3.7 Experimento IV. Inducción de Organogénesis sobre tejido calloso del Agave
angustifolia Haw.
Para inducir la organogénesis sobre tejido de callo se trabajó con el material de tejido
calloso del experimento II y III. Se utilizó el medio nutritivo suplementado con tiaminaHCl, 1mg/l; mio-inositol, 100 mg/l; sacarosa, 30 gr/l; agar, 8 gr/l;150 mg/l ácido
cítrico;100 mg/l ácido ascórbico, en ausencia de auxina utilizando diferentes
concentraciones de bencilaminopurina (BA), (Tabla 6), Se obtuvieron 25 secciones
de dicho tejido que se distribuyeron en 25 frascos gerber conteniendo 25 ml del
medio de cultivo. Se evaluó el porcentaje de formación brotes en el periodo de 28
días.
Tabla 6. Tiramientos utilizados para la inducción de organogénesis.
AUXINA (BA)
TRATAMIENTO
mg/l
0
1
2.5
2
5
3
7.5
4
10
5
Las respuestas a los tratamientos fueron tomadas cada semana durante 28 días y
las variables estudiadas fueron las siguientes:
ƒ
Diámetro de células callosas
ƒ
Rizogénesis (Presencia de raíces)
ƒ
Brotación (Presencia de brotes)
ƒ
Contaminación
ƒ
Oxidación
III. MATERIALES Y METODOS
51
Los datos fueron analizados con el paquete estadístico FAUANL VERSIÓN 2.5
FACULDAD DE AGRONOMIA UANL Marín N. L. El diseño estadístico utilizado fue
arreglo en parcelas divididas, con una significancia al 0.05 de la prueba de t.
IV. RESULTADOS Y DISCUSION
52
CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Experimento I. Establecimiento aséptico de cultivos.
En esta fase se realizaron tres experimentos a prueba y error; el primero fue con el
fin de evaluar la habilidad en el manejo de los materiales, el equipo y dar respuesta a
los tres primeros objetivos planteados en esta investigación.
Primer ensayo. Durante el periodo de un mes se observó un porcentaje de
contaminación de 100% para el tratamiento flutolanil y el sulfato de gentamicina con
clorhidrato de oxitetraciclina, seguido de un 75% con los tratamientos NaOCl al 5%
(durante 25 minutos) y NaClO al 5% (durante 45 minutos). En cuanto a los
porcentajes de oxidación se observó un 25 % con el tratamiento de NaOCl al 5%
(durante 25 minutos), mientras en los tres restantes se observó un 50%, ver figura 6,
debido a las exudaciones del tejido que se presentan al sufrir el daño por el corte
presentandose un mecanismo de defensa que provoca la liberación de fenoles
(Bidwell, 1979).
Segundo ensayo. Durante este experimento se observó en un mes, en los cuatro
tratamientos la contaminación fue nula. En cuanto a la oxidación se presento un
porcentaje de 25% en todos los tratamientos estudiados (figura 7).
53
IV. RESULTADOS Y DISCUSION
Contaminación (%)
100
75
Contaminación
50
Oxidación
25
0
NaClO 5%
25 min.
NaClO 5%
45 min.
Flutolanil
Sulfato gentamicina
Clorhidrato
oxitetraciclina
Figura 6. Porcentajes de contaminación y oxidación entre tratamientos, sobre el
tejido de hoja Agave angustifolia Haw, en el periodo de un mes (primer ensayo).
ITSON 2005-2006.
ContaminaciÓn (%)
100
75
Contaminación
Oxidación
50
25
0
NaClO
25 min.
NaClO
45 min.
Flutolanil
Sulfato gentamicina
Clorhidrato
oxitetraciclina
Figura 7. Porcentajes de contaminación y oxidación entre tratamientos, sobre el
tejido de hoja Agave angustifolia Haw, en el periodo de un mes (segundo ensayo).
ITSON 2005-2006.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
54
Tercer ensayo. En este último experimento no se presentó oxidación ni
contaminación en los cuatro tratamientos estudiados (figura 8).
ContaminaciÓn (%)
100
75
Contaminación
Oxidación
50
25
0
NaClO
25 min.
NaClO
45 min.
Flutolanil
Sulfato gentamicina
Clorhidrato
oxitetraciclina
Figura 8. Porcentajes de contaminación y oxidación entre tratamientos, sobre el
tejido de hoja Agave angustifolia Haw, en el periodo de un mes (tercer ensayo).
ITSON 2005-2006.
De acuerdo a los resultados obtenidos se cumplen los tres primeros objetivos
específicos planteados para esta fase de la investigación. Según los resultados
obtenidos el NaClO al 5%, tiene el mismo efecto que los productos comerciales:
flutolanil (Mancut) y sulfato de gentamicina con clorhidrato de oxitetraciclina (Bactrol),
según los análisis de varianza realizados (ver tabla 7, anexo 2). Sobre el tiempo de
exposición para desinfectar los explantes de agave se sugiere que sea de 25 minutos
ya que no existe diferencia significativa entre 25 y 45 minutos que fueron los tiempos
estudiados. Por lo tanto el mejor tratamiento es el de NaClO al 5% por 25 minutos, ya
que si el efecto es el mismo debe considerarse exponer los tejidos a los
desinfectantes por un tiempo mínimo para disminuir el daño a los tejidos vegetales
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
55
por cualquier agente químico que elimine microorganismos (Pérez et al., 1999
citados por Gurrola, 2005).
En estudios realizados para mejoramiento genético del henequén (Agave
fourcroydes), para el establecimiento aséptico de los explantes, se ha utilizado el
NaClO al 5%, con una eficiencia en cuanto a la desinfección, según sea la
concentración utilizada del desinfectante, duplicándose el número de explantes libres
de contaminantes al incrementar la concentración de este compuesto durante 20
minutos y la utilización de NaClO al 5%, (doble tiempo de desinfección) aumentando
considerablemente entre 82.9 % y 99.40 % (Muñoz et al., 2002).
4.2 Experimento II. Inducción de células callosas de Agave angustifolia Haw,
utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l), y BA (0.0, 0.5, 0.1, 1.0,
1.5, 2.0 mg/l).
En esta etapa se obtuvo la desdiferenciación de células diferenciadas de hoja a
células callosas, utilizando diferentes concentraciones de fitorreguladores 2,4–D y
BA. Los explantes fueron escindidos de los hijuelos provenientes de las plantas de
agave, estos explantes fueron desinfectados con el tratamiento de NaClO al 5% (25
minutos), según resultados obtenidos del primer experimento.
Según los resultados obtenidos con el diámetro de callo entre semanas (como
tiempo de obtención), se encontró que existe diferencia altamente significativa entre
los tratamientos estudiados, de acuerdo al ANOVA (ver tabla 8, anexo 2), por lo que
se realizó la prueba de t, con una significancia 0.05 resultando una diferencia mínima
significativa (DMS) 0.3457, y observando que a la segunda semana no existe
diferencia respecto a las demás, es decir que si se quiere obtener células callosas
con 2,4–D y BA, en dos semanas se pueden obtener los resultados deseados (ver
tabla 9, anexo 2).
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
56
Se pudo observar también que existe diferencia altamente significativa entre las
diferentes concentraciones de 2,4 –D y BA estudiadas, según el análisis de varianza
(ver tabla 8, anexo 2). La prueba de t, para este factor con una significancia del 0.05,
muestra las medias del Factor B (diámetro de callo entre los tratamientos) las cuales
se muestran en la tabla 10 (ver anexo 2).
Según (Yépez et al., 2002), la inducción de células callosas en Agave cucui es
factible a partir de secciones de hojas. La obtención de callo es viable a partir de
hojas sembradas en medio de MS (1962) y concentraciones de 1mg/l de 2,4-D y 1
mg/l de BA con condiciones de 16/8 horas de fotoperíodo in vitro.
Las células callosas obtenidas se observaron como estructuras amorfas, friables,
globulares traslúcidas, de color verde (figura 9).
Figura 9. Inducción de callo a partir de hojas de plantas de Agave angustifolia Haw.
Tratamiento 7 (a), tratamiento 3 (b), tratamiento 2 (c) y tratamiento 14 (d). ITSON
2005-2006.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
57
En la tabla 10 (anexo 2), con la prueba de t y con una significancia al 0.05 y DMS
0.4335, se observó que los tratamientos que obtuvieron mejores resultados con
respecto a la variable diámetro de callo son los tratamientos 14 (1.5 mg/l, 2,4 –D, 1.0
mg/l BA) y 7 (0.5 mg/l 2,4 –D y 0.5 mg/l BA) y 3 (1.5 mg/l 2,4 –D y 1.5 mg/l BA).
4.3 Experimento III. Inducción de células callosas de Agave angustifolia Haw,
utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/l), y BA (0.0, 0.25, 0.75, 1.0
mg/l).
Al igual que en el segundo experimento de esta etapa se logró la inducción de
células callosas, los explantes se escindieron de los hijuelos de plantas de agave, los
cuales fueron desinfectados con el tratamiento de NaClO al 5% durante 25 minutos y
se evaluaron las mismas variables del experimento II.
Se analizaron los resultados obtenidos en este experimento con la variable diámetro
de callo, encontrándose que existe diferencia altamente significativa entre las
semanas y con interacción (ANOVA que se observa en la tabla 11, anexo 2), por lo
que se realizó la prueba de t, con una significancia 0.05, DMS 0.5972, tomándose
como Factor A (diámetro de callo entre semanas) y factor B (diámetro de callo entre
los tratamientos), ver tabla 12, anexo 2. Estos resultados muestran que a partir de la
tercera semana no existe diferencia estadística respecto a las demás, es decir que si
se quiere obtener células callosas con los fitorreguladores 2,4 –D y BA, con las
concentraciones utilizadas en esta investigación se logran en tres semanas.
Según el análisis de varianza (tabla 11, anexo 2), se puede observar también que
existe diferencia altamente significativa entre las diferentes concentraciones de 2,4 –
D y BA estudiadas. En la tabla 13, anexo 2, con una significancia al 0.5, DMS 0.3312,
en la prueba de t, se observa al igual que el ANOVA, hay diferencia entre los niveles
de B (diámetro de callo), la prueba de t, En la tabla anterior se observa el mejor
tratamiento es el 7 (0.25 mg/l 2,4-D, 0.25 mg/l BA), figura 10.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
58
Figura 10. Inducción de callo a partir de hojas de plantas de Agave angustifolia Haw.
Tratamiento 7 (a), tratamiento 9(b), tratamiento 15 (c) y tratamiento 25 (d).ITSON
2005-2006.
4.4 Experimento IV. Inducción de organogénesis en tejido calloso de Agave
angustifolia Haw.
En esta etapa se logró la inducción de organogénesis sobre tejido calloso, tomando
como material vegetal los callos obtenidos en etapa de inducción de callo, en un
medio con diferentes concentraciones de citocinina (BA) y sin auxina (figura 11).
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
59
Figura 11. Inducción de organogénesis sobre tejido calloso de Agave angustifolia
Haw. ITSON 2005-2006.
Según los resultados analizados estadísticamente se encontró que existe diferencia
altamente significativa para el diámetro del callo entre semanas y entre tratamientos
para el diámetro de callo con interacción (tabla 14, anexo 2). Por lo tanto se realizo la
prueba t con una significancia 0.05, tabla 15, anexo 2, destacándose una DMS de
0.1024, la mejor semana para la organogénesis es la cuarta. En los resultados
obtenidos, en la prueba de t, con una significancia 0.05, DMS 0.1024, los mejores
tratamientos son: (3) 5 mg/l BA, (4) 7.5 mg/l BA y (5) 10 mg/l BA son iguales ver tabla
16 (anexo 2).
Estadísticamente podemos observar en la tabla 17 ver anexo 2, con una significancia
de 0.05, DMS 0.0939, se observa que todos los tratamientos en la primer semana
son iguales y en la segunda, tercera y cuarta semana los mejores resultados se
obtuvieron en el tratamientos (5) 10 mg/l y (4) 7.5 mg/l BA (figura 12).
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
60
Figura 12. Organogénesis in vitro de Agave angustifolia Haw. De los 5 tratamientos:
(a) 10 mg/l BA, (b) 0 mg/l BA, (c) 2.5 mg/l BA, (d) 7.5 mg/l BA y (e) 5 mg/l BA. Todas
muestran estructuras globulares verdes (nódulos) y la figura (a) muestra raíces
(rizogénesis). ITSON 2005-2006.
En este experimento inducción de organogénesis se puede decir que el tratamiento
10 mg/l BA, es el mejor tratamiento porque dio el mayor diámetro de callo, además
de presentar presencia de nódulos verdes y formación de raíces como se observan
en la figura 13, la contaminación y la oxidación fue nula en todos los tratamientos.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
61
Figura 13. Organogénesis in vitro de Agave angustifolia Haw,. Formación de raíces
(r) rizogénesis (a); Formación de estructuras globulares verdes (no) nódulos (b).
ITSON 2005-2006.
Para la inducción de organogénesis sobre tejido calloso como material vegetal, se
tomo como referencia a Yépez et al., 2002, donde se utilizó un medio de cultivo con
BA en concentración de 10 mg/l en ausencia de auxina, para inducir organogénesis
a través de tejido calloso obteniendo brotes. En observaciones preliminares a este
estudio, se vio que la posterior aparición de brotes se relaciona con la presencia de
nódulos verdes en los callos (Yépez, 1998, citado por Yépez et al., 2002).
Se ha inducido la regeneración de brotes a partir de regiones nodulares de color
verde sobre explantes de rizoma de A. sisalana en presencia de la citocinina BA
(Das, 1992; Yépez et al., 2002). En observaciones preliminares a este estudio, la
posterior aparición de los brotes también se ha mostrado relacionada con la
presencia de nódulos verdes en los callos.
CONCLUSIONES
62
CONCLUSIONES
•
La desinfección es factible en cualquiera de los tratamientos utilizados en la
presente investigación, pero se recomienda el Hipoclorito de Sodio al 5%, con
un tiempo de exposición de 25 minutos.
•
La inducción de tejido de callo en Agave angustifolia Haw, es posible a partir
de secciones de hojas de la planta (hijuelos).
•
La formación de callo sobre tejido de hoja se logra utilizando dosis de auxina
1.5 mg/l (2,4-D) y citocinina de 1 mg/l (BA).
•
La organogénesis indirecta fue exitosa a partir de tejido de callo mostrando
estructuras globulares verdes (nódulos), en presencia de concentración de 10
mg/l de BA, sin auxinas.
BIBLIOGRAFÍA
63
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ANEXOS
68
ANEXOS
Anexo 1. Cuadro de Soluciones concentradas de las sales inorgánicas del medio de
Murashige y Skoog (1962).
Compuesto
Solución Conc.
* Vol. en
100 X (g/l)
(ml)
1. NITRATOS:
Nitrato de amonio ( NH4 NO3)
165.000
Nitrato de potasio (KNO3)
190.000
10
2. SULFATOS
Sulfato de magnesio (MgSO4. 7H2O)
1.690
Sulfato de maganeso (MnSO4. H2O)
0.860
Sulfato de zinc (ZnSO4. 7H2O)
0.0025
10
3. HALÓGENOS
Cloruro de calcio (CaCl2. 2H2O)
44.00
Yoduro de potasio (KI)
0.083
Cloruro de cobalto (CoCl2. 6H2O)
0.0025
10
ANEXOS
69
4. P04, BO3, MoO4
Fosfato de potasio (KH2PO4)
44.000
Acido bórico (H3BO3)
0.620
Molibato de sodio (Na2MoO4.2H2O)
0.025
5. NaFeEDTA
2.784
Sulfato ferroso (FeSO4. 7H2O)
3.724
10
10
Acido Etilen-dinitro-tetra acetato disódico
(Na2-EDTA)
*
Volumen que debe utilizarse para preparar un litro de medio de cultivo.
Fuente:(Murashige, T. y F. Skoog. 1962)
Anexo 2. Análisis Estadísticos.
Análisis de la varianza para el efecto del hipoclorito de sodio y los
desinfectantes comerciales.
Tabla 7. Efecto del hipoclorito de sodio en dos tiempos de exposición, flutolanil
(Moncut) y Sulfato de gentamicina con clorhidrato de oxitetraciclina (Bactrol) en
explantes de hoja de Agave angustifolia Haw.
Causas de
Grados de
Suma de
Cuadrados
F(calc) F(1.05) F(0.01)
Variación
Libertad
Cuadrados
Medios
Tratamientos
3
1,5
0,5NS
3
3,86
6,99
Repeticiones
3
0,5
0,16666667NS
1
3,86
6,99
Error
9
1,5
0,16666667
Total
15
3,5
ANEXOS
70
Análisis de la varianza para diámetro de callo entre los tratamientos y semanas
(utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l), y BA (0.0, 0.5, 0.1, 1.0,
1.5, 2.0 mg/l).
Tabla 8. ANOVA. Efecto del diámetro de callo entre los tratamientos y las semanas
en explantes de hoja de Agave angustifolia Haw.
Causa de
Grados de
Suma de
Cuadrados
F(Calc)
P>F
Variación
Libertad
Cuadrados
Medios
REPETICIONES
4
1.779179
0.444795
7.0699
0.004
FACTOR A
3
16.360031
5.453344**
86.6799
ERROR A
12
0.754963
0.062914
FACTOR B
24
11.402267
0.475094 **
3.8851
0.000
INTERACCION
72
4.634140
0.064363
0.5263
0.999
ERROR B
384
46.957352
0.122285
TOTAL
499
81.887932
C.V. (ERROR B) = 10.7
Tabla 9. Significancia al 0.05. Muestra las medias del factor A (diámetro de callo
entre las semanas).
Tratamientos
Medias
Significancia
Semanas
A
0.05
4
0.4723
a
3
0.4002
a
2
0.3435
ab
1
0.0000
b
DMS= 0.3457
ANEXOS
71
Tabla 10. Prueba de t, con una significancia 0.05. Muestra las medias del Factor B
(diámetro de callo entre los tratamientos).
No. Tratamientos
Medias Significancia
( 2,4-D, BA) mg/l
B
0.05
14
(1.5, 1.0)
0.605
a
7
(0.5, 0.5)
0.5675
ab
3
(1.0, 0.0)
0.4485
abc
2
(1.5, 0.0)
0.425
abcd
9
(1.5, 0.5)
0.41
abcd
12
(0.5, 1.0
0.3325
abcd
13
(1.0, 1.0)
0.325
abcd
6
(0.0, 0.5)
0.2815
abcd
10
(2.0, 0.5)
0.27
abcd
11
(0.0,1.0)
0.255
abcd
8
(1.0, 0.5)
0.25
abcd
15
(2.0, 1.0)
0.2475
abcd
19
(1.5, 1.5).
0.2475
abcd
20
(2.0, 1.5)
0.235
abcd
1
(0.0, 0.0)
0.2175
abcd
24
(1.5, 2.0)
0.215
abcd
5
(2.0, 0.0)
0.1875
abcd
25
(2.0, 2.0 )
0.1825
abcd
4
(1.5, 0.0)
0.165
bcd
17
(0.5, 1.5)
0.1575
bcd
18
(1.0, 1.5)
0.1575
bcd
21
(0.0, 2.0
0.105
cd
16
(0.0, 1.5)
0.0825
cd
22
(0.5, 2.0)
0
d
23
(1.0, 20)
0
d
DMS= 0.4335
ANEXOS
72
Análisis de la varianza para diámetro de callo entre los tratamientos y semanas
(utilizando dosis de 2,4-D (0.0, 0.5, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l), y BA (0.0, 0.5, 0.1, 1.0,
1.5, 2.0 mg/l).
Tabla 11. ANOVA. Efecto del diámetro de callo entre los tratamientos y las semanas
en explantes de hoja de Agave angustifolia Haw.
Causas de
Grados de
Suma de
Cuadrados
Variación
Libertad
Cuadrados
Medios
F(Calc)
P>F
REPETICIONES
4
5.766243
1.441561
7.6756
0.003
FACTOR A
3
4.853905
1.617968
8.6149
0.003
ERROR A
12
2.253725
0.187810
FACTOR B
24
11.798437
0.491602
6.8853
0.000
INTERACCION
72
6.213125
0.086293
1.2086
0.135
ERROR B
384
27.417158
0.071399
TOTAL
499
58.302593
C.V. (ERROR B) = 12,819
Tabla 12. Significancia al 0.05.Muestra las medias del factor A (diámetro de callo
entre las semanas).
Factor A
Medias
Tratamientos
(Semanas)
A
A
1Semana
0.000000
4
0.2609 a
2 Semana
0.176479
3
0.2130 a
3 Semana
0.212978
1
0.1765 b
4 Semana
0.260895
2
0.0000 b
DMS= 0.5972
Medias 0.05
A
ANEXOS
73
Tabla 13. Prueba de t, con una significancia 0.05. Muestra los promedios del
diámetro de callo entre los tratamientos.
Tratamientos
No.
( 2,4-D, BA) mg/l
Medias Significancia
B
0.05
7
(0.25, 0.25)
9
(0.75,0.25)
0.48 b
15
(1.0, 0.5)
0.32 bc
25
(1.0, 1.0)
0.291 bc
23
(0.5, 1.0)
0.2375 bc
18
(0.5, 0.75)
0.2365 bc
21
(0.0, 1.0)
0.21 bc
8
(0.5, 0.25)
0.195 bc
13
(0.5, 0.5)
0.195 bc
4
(0.75, 0.0)
0.1935 bc
22
(0.25, 1.0)
0.1825 bc
10
(1.0, 0.25)
0.1 c
11
(0.0, 0.5)
0.0875 c
14
(0.75, 0.5)
0.075 c
3
(0.5, 0.0)
0.0725 c
19
(0.75, 0.75)
0.0375 c
5
(1.0, 0.0)
0.035 c
1
(0.0, 0.0 )
0 c
2
(0.25, 0.0)
0 c
6
(0.0, 0.5)
0 c
12
(0.25, 0.5)
0 c
16
(0.0, 0.75)
0 c
17
(0.25, 0.75)
0 c
20
(1.0, 0.75))
0 c
24
(0.75, 1.0)
0 c
DMS= 0.3312
0.6275 a
ANEXOS
74
Análisis de la varianza para el diámetro de callo (o nódulos) entre los
tratamientos y las semanas.
Tabla 14. ANOVA Efecto del diámetro de callo entre tratamientos y las semanas en
explantes de hoja de Agave angustifolia Haw.
Causas de
Grados de
Suma de
Cuadrados
Variación
Libertad
Cuadrados
Medios
REPETICIONES
4
0.105461
0.026365
FACTOR A
3
4.931190
1.643730**
ERROR A
12
0.066269
0.005522
FACTOR B
4
0.551476
0.137869**
24.9096
0.000
INTERACCION
12
0.441483
0.036790
6.6471
0.000
ERROR B
64
0.354225
0.005535
0
TOTAL
99
6.450104
F(calc)
P>F
4.7742
0.016
297.6472 0.000
C.V. (ERROR B) = 8.79%
Tabla 15. Prueba de t, con un nivel de significancia (0.05).Muestra las medias del
Factor A (diámetro del callo entre las semanas), tratamientos (semanas).
Factor A
Medias Tratamientos Medias 0.05
(Semanas)
A
A
A
1Semana
0.711000
4
1.23000
a
2 Semana
0.699000
3
0.7462
b
3 Semana
0.746500
1
0.7110
b
4 Semana
1.230000
2
0.6990
b
DMS= 0.1024
ANEXOS
75
Tabla 16. Prueba de t, con un nivel de significancia (0.05). Muestra las medias del
Factor B (diámetro de callo entre los tratamientos).
Factor B
Medias
Tratamientos Medias 0.05
BA mg/l
B
B
B
1.(0)
0.730250
5
0.9225
a
2.(0.25)
0.792500
4
0.9150
a
3.(0.5)
0.872500
3
0.8725
ab
4.(0.75)
0.875200
2
0.7925
bc
5.(10.0)
0.922500
1
0.7303
c
DMS= 0.0939
Tabla 17. Prueba de t, con un nivel de significancia (0.05). Muestra las medias del
Factor B (diámetro de callo entre los tratamientos), tratamientos (BA mg/l)
SEMANA 1
SEMANA 2
SEMANA 3
SEMANA 4
Factor B
Medias
BA mg/L
B
B
1 (0)
0.730250
5
0.7400 a
5
0.7400 a
5
0.7400 a
5
1.4200 a
2 (0.25)
0.792500
4
0.7350 a
4
0.7350 a
4
0.7350 a
4
1.4000 a
3 (0.5)
0.872500
3
0.7200 a
3
0.7200 ab
3
0.7200 ab
3
1.2800 b
4 (0.75)
0.872500
1
0.7000 a
2
0.6600 ab
2
0.6600 ab
2
1.1300 c
5(10.0)
0.922500
2
0.6600 a
1
0.6460 b
1
0.6460 b
1
0.9200 d
DMS= 0.0939
Trat. Medias 0.05 Trat. Medias 0.05 Trat. Medias 0.05 Trat. Medias 0.05
B
B
B
B
B
B
B
ABREVIATURAS Y GLOSARIO
76
ABREVIATURAS Y GLOSARIO
ANA
ácido naftalenacético
BAP
benciIaminopurina
°C
grados Celsius
2,4-D
ácido 2,4-diclorofenoxiacético
EDTA
ácido etilendiamino tetraacético
mg/l
miligramos por litro
MS
Murashige y Skoog (1962)
Adventicio: Desarrollo de órganos (raíces, yemas, vástagos, flores, etc.) o
embriones (estructuras de tipo embrionario), a partir de zonas poco usuales,
incluyendo células callosas. Si los órganos se originan a partir de las células
iniciales, primordios tic, o los embriones se desarrollan a partir de cigotos, el término
adventicio no puede ser usado.
Agar: Un producto de origen vegetal (obtenido a partir de algas), que se utiliza
para
solidificar medios nutritivos.
Agua destilada: Agua producida por destilación, que no contiene compuestos
orgánicos o inorgánicos.
Alcohol. Alcohol etílico (C2H,OH), también llamado etanol.
ABREVIATURAS Y GLOSARIO
77
Aminoácidos: Grupo de compuestos orgánicos que, aparte de otras funciones, son
los constituyentes básicos de las proteínas.
Androgénesis: Partenogénesis masculina. Desarrollo de un individuo haploide a
partir de un grano de polen.
Antioxidantes: Grupo de sustancias químicas que impide la oxidación, por ejemplo,
la vitamina C o el ácido cítrico.
Antiséptico: Que contrarresta la infección, especialmente previniendo el desarrollo
de microorganismos.
Ápice del vástago: Meristemo del vástago, apical terminal, o lateral que contiene
algunos primordios foliares u hojas.
Asepsia: Ausencia de microorganismos.
Aséptico: Libre de cualquier microorganismo (hongos, bacterias, levaduras, virus,
micoplasmas, etc.), estéril.
Autoclave: Aparato en el cual se esterilizan, por medio de vapor a presión, los
medios nutritivos, instrumental de vidrio, etc.
Autótrofo: que no requiere sustancias orgánicas.
ANEXOS
78
Auxinas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que producen
elongación celular, y en algunos casos división celular; frecuentemente inducen la
aparición de raíces adventicias e inhiben el desarrollo de yemas adventicias (en los
vástagos).
Axénico: Aislado de otros organismos.
Axilar. Que se origina en las axilas de las hojas.
Biosíntesis: Síntesis de compuestos por la planta o por células.
Bisturí: Cuchilla pequeña y afilada de uso quirúrgico.
Caja de Petri: Plato redondo y plano, fabricado de vidrio o material sintético, provisto
de tapa.
Células callosas: Tejidos no organizados, formados por células diferenciadas y no
diferenciadas, que se dividen de forma activa y que generalmente se originan en
zonas dañadas (por heridas), o en cultivo de tejidos.
Cámara de cultivo: Cámara para el mantenimiento de cultivos, con luz, temperatura
y humedad controladas.
Cámara de flujo laminar: Cámara para inoculación, que se mantiene estéril por
medio de un flujo no turbulento y continuo de aire estéril.
ANEXOS
79
Cambium: Tejido capaz de dividirse y que en los tallos origina la corteza y la
madera.
Carbohidratos: Grupo de compuestos que sirven como fuente de energía (por
ejemplo glucosa, sacarosa, fructosa, etc.).
Citocininas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que inducen la
división celular y frecuentemente la formación de yemas adventicias (en vástagos).
En la mayor parte de los casos inhiben la formación de raíces adventicias. Las
citocininas disminuyen la dominancia apical.
Clon: Grupo de células, tejidos o plantas que son en principio genéticamente
idénticas. Un clon no tiene por qué ser necesariamente homogéneo.
Cultivo de embriones: Cultivo de embriones sobre medio nutritivo.
Cultivo de órganos: Cultivo de órganos in vitro, de tal forma que permite el
desarrollo y/o conservación del órgano aislado originalmente.
Cultivo de tejidos: Cultivo de protoplastos, células, tejidos, órganos, ebriones o
semillas in vitro.
Cultivo en suspensión: Cultivo en el que las células aisladas y/o agregados
celulares crecen y se multiplican, suspendidos en un medio líquido.
Cultivo primario: Cultivo que se obtiene a partir de células, tejidos u órganos
obtenidos de un organismo.
ANEXOS
80
Desarrollo: Ciclo de semilla a semilla en una planta, o desde la iniciación de los
órganos hasta la senescencia; también los cambios en la forma de la planta debidos
al crecimiento y la diferenciación.
Desdiferenciación de células: Conversión de células diferenciadas en no
diferenciadas (meristemáticas).
Detergente: Sustancia que rebaja la tensión superficial de una solución; se añade
para mejorar el contacto entre las plantas y los agentes esterilizantes.
Diferenciación: El desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o la
regeneración de órganos o estructuras orgánicas (raíces, vástagos, etc.) o
proembriones.
Diploide: Un núcleo es diploide si contiene dos veces el número básico (x) de
cromosomas. La fórmula de su genoma es 2n = 2x.
Dominancia apical: Fenómeno por el que la yema terminal de un vástago impide el
crecimiento de las yemas axilares.
EDTA: Acido etilendiamino tetraacético, compuesto quelante al cual el hierro queda
unido de tal manera, que es asimilable por la planta.
Embriogénesis: Proceso por el cual un embrión se desarrolla a partir de una célula
huevo, o asexualmente a partir de una o un grupo de células.
ANEXOS
81
Estéril: Medio u objeto que no contiene microorganismos perceptibles o viables. Son
necesarias pruebas de esterilidad para comprobación.
Esterilización: Procedimiento para la eliminación de microorganismos.
Esterilizar. Eliminación de microorganismos, como, por ejemplo, por medio de
sustancias químicas, calor, irradiación o filtración.
Explante: Una porción de tejido escindida, u órgano tomado de la planta, para iniciar
un cultivo.
Fase juvenil: Período de la vida de una planta durante el cual no se puede inducir la
floración. Durante la fase juvenil las plantas presentan frecuentemente características
muy especiales (morfológicas, fisiológicas, etc.), que son diferentes de las de la fase
adulta.
Flameado: Técnica de esterilización, que consiste en bañar una porción de un
instrumento en alcohol, haciéndolo arder posteriormente.
Formación de órganos (organogénesis): Formación de una raíz, vástago, yema,
flor, tallo, etc.
Habituación: Fenómeno por el que, después de un número de subcultivos, las
células pueden crecer sin la adición de hormonas, aunque éstas eran necesarias al
principio.
Heterótrofo: Que requiere sustancias orgánicas.
ANEXOS
82
Inducción: Iniciación de un proceso particular, con el resultado del desarrollo de
órganos (raíces, vástagos, flores).
Inocular: Poner en o sobre un medio nutritivo.
In vitro: Literalmente "en vidrio", en un tubo de ensayo, matraz, etc.
In vivo: In situ. Es la planta intacta tal y como crece en el invernadero, en el campo,
etc.
Macroelementos: Grupo de elementos esenciales como N, P, K. Ca y Mg, que son
necesitados normalmente en cantidades relativamente altas (nutrición inorgánica de
la planta).
Matraz Erlenmeyer: Matraz de forma cónica y fondo plano.
Medio nutritivo: Mezcla de sustancias en las cuales pueden crecer células, tejidos u
órganos, con o sin agar.
Meristemo: Conjunto de células en división en el ápice de la raíz o vástago
(meristemo apical), en el cambium intercalar de las yemas, hojas y flores.
Meristemo apical: Grupo de células meristemáticas situadas en el ápice de la raíz o
del vástago, que por división celular originan a las precursoras de los tejidos
primarios de la raíz o el vástago.
ANEXOS
83
Meristemoide: Nódulo de tejido indiferenciado, a partir del cual se pueden producir
nuevas células y/o estructuras adventicias (como meristemos).
Microelementos: Grupo de elementos como el Fe. B, Zn, Mo, Mn, etc., que son
importantes en cantidades relativamente pequeñas para la nutrición inorgánica de las
plantas.
Micropropagación: Propagación vegetativa de plantas in vitro. Monocapa: Una
única capa de células que crecen sobre una superficie.
Morfogénesis: Origen de la forma, y como consecuencia la diferenciación de
características estructurales internas asociadas.
Mutación: Cambio genético.
Partenogénesis: Producción de un embrión a partir de un gameto femenino, sin la
participación del gameto masculino
Pecíolo: tallo de una hoja
pH: Logaritmo de la concentración de iones hidrógeno cambiado de signo.
Primordio: Grupo de células que da origen a un órgano. Primordio de la hoja:
Iniciales de una hoja.
Regulador: Sustancia que regula el crecimiento y desarrollo de células vegetales,
órganos, etc.
ANEXOS
84
Repicar: Trasplantar células, tejidos u órganos, de un medio nutritivo a otro.
Termolábil: Que no resiste el calor, p. e. una sustancia que se descompone cuando
se calienta.
Totipotencia: Potencialidad de las células o tejidos para formar todo tipo de células
y/o regenerar una planta.
Tubo de ensayo: Tubo en el cual se cultivan células, tejidos, etc.
Variación somaclonal: Incremento de la variabilidad genética en las plantas
superiores, que tiene lugar en el cultivo in vitro.
Vitaminas: Grupo de compuestos orgánicos que a veces se añaden al medio
nutritivo (vitamina B, vitamina C, etc.).