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Transcript
Materia
Biotecnología Vegetal
Responsable
M.C. Rocío Calderón Pascacio
Grado y grupo / Carrera
2º A, B, C, D, E / TSU Agrobiotecnología
Unidad temática
I. Importancia de la biotecnología y
requerimientos para el cultivo in vitro
Fecha y horario
Semana 4, Lunes 28 Enero
Laboratorio
Biotecnología Vegetal, ed. B
Práctica 3. Establecimiento del cultivo aséptico in vitro.
Introducción
La fase de establecimiento del cultivo aséptico es de vital trascendencia en el cultivo de
células, tejidos y órganos, ya que se requiere para poder establecer el cultivo en
condiciones adecuadas y poder lograr el desarrollo o regeneración de plántulas.
Existen cuatro fuentes de infección: la planta (su exterior o su interior), el medio nutritivo
(mala esterilización), el aire y el operador (trabajo poco preciso). La más importante de
estas condiciones es la planta misma, el material vegetal debería ser bien esterilizado
antes de su aislamiento in vitro.
Existen diversas formas de esterilización de los tejidos o explantes vegetales en el cual se
pueden utilizar diferentes agentes desinfectantes; estos pueden ser NaClO (hipoclorito de
sodio), CaClO (hipoclorito de calcio) entre otros, los cuales se pueden utilizar a
concentraciones bajas y resultan muy eficientes para el control de agentes contaminantes
externos. Por otra parte en algunas ocasiones es necesario controlar infecciones
sistémicas o internas para ello, pueden usarse previo diagnóstico y un manejo adecuado,
antibióticos o antimicóticos en los medios de cultivos.
En la presente práctica se pretende que el alumno experimente, el efecto de los diferentes
agentes y dosis en el control de agentes infecciosos, así como lograr establecer cultivos
viables necesarios para la demás fases.
Objetivo
•
Conocer la técnica para la desinfestación de los tejidos vegetales
•
Evaluar el efecto de hipoclorito de calcio y de sodio a diferentes dosis en el control
de agentes infecciosos para el establecimiento del cultivo aséptico
Materiales, reactivos y equipos de laboratorio
2 vasos de precipitado de 500 mL (estéril)
2 vasos de precipitado de 250 mL (estéril)
2 cajas Petri de 90mm (estéril)
1 pipeta de 10mL (estéril)
2 probetas de 500 mL (estéril)
1 pinza de disección (estéril)
1 mango para bisturí núm. 4 (estéril)
1 bisturí núm. 22 (estéril)
1 Mechero de alcohol
Frascos con medio de cultivo (estéril)
Alcohol etílico al 96%.
Tween-20.
Agua destilada (estéril)
1 agitador magnético
1 parrilla eléctrica
Cámara de flujo de aire laminar (cámara de
cultivo).
Material que el alumno deberá traer
Hojas, ápices, yemas, embriones, tallos, etc.
Alcohol etílico al 70% (farmacia)
Hipoclorito de sodio (cloro comercial) diluido
al 10 ó 20%.
Hipoclorito de calcio (4%)
Encendedor o cerillos
Franela
Detergente
Marcador indeleble
Plástico adherente (para sellar los frascos)
Metodología
1.- Lavar el material vegetativo a utilizar con agua corriente y detergente para eliminar
residuos de polvo.
2.- Sumergir el material vegetativo en una solución de fungicida y/o bactericida (captan o
agrimicin) por un periodo de 10-15 min en agitación constante utilizando un agitador de
matraces en agua destilada.
3.- En condiciones de asepsia bajo una campana de flujo laminar, enjugar los tejidos con
agua estéril y transferirlos a una solución de alcohol al 70% por 1 o 2 min.
4.- Transferir los tejidos a una solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 10% v/v o
hipoclorito de calcio al 10% p/v) conteniendo unas gotas de tween 20 u 80 por 10 min.
5.- Enjuagar con agua estéril los tejidos, previa eliminación de solución desinfectante
durante 3 veces.
6.- Realizar los cortes de tejidos utilizando pinzas y bisturí estériles; para ello se flamean
con alcohol al 96%.
7.- Realizar la siembra al medio de cultivo.
8.- Sellar los frascos o tubos y etiquetarlos debidamente (Nombre del cultivo, tratamiento,
fecha, grado y grupo)
9.- Posteriormente colocarlos en la cámara de incubación.
10.- Revisar a las 24 o 48h y una semana después de realizada la siembra.
11.- Calcular el porcentaje de contaminación, identificar el tipo de microorganismo
(bacterias u hongos).
12.- Discutir acerca de las probables causas de contaminación, proponer medidas para
evitar de nuevo la contaminación.
13.- Elaborar el reporte de práctica
Bibliografía
Margara, J. 1988. Multiplicación vegetativa y cultivo in vitro (los meristemos y la
organogénesis). Editorial Mundi - Prensa. España (Madrid).0237 pp.
Merino, M. M. E. 1987. Medio de cultivo, En: Hurtado, M. D. V. y Merino M. M. E. (Eds.),
Cultivo de tejidos vegetales. Trillas. México, D. F. Pp. 67-85.
Pierik, R. L. M. 1988. Preparación y composición de los medios de cultivo, En: Cultivo in
vitro de las plantas superiores. Mundi - Prensa. Madrid. Pp. 49-84.