Download Imprima este artículo - Corpoica Ciencia y Tecnología Agropecuaria

AUTORINVITADO
y suPotencial
enel
Transgénicos
LosAnimales
Animal
delaBiotecnología
Desarrollo
JorgePiedrahitar
A B STRACT
Title: Transgenic animals and
their potential in the development
of animal biotechnology
The developmentof new technologiesin
animal sciences,haveallowed the
production of transgenicanimals as an
alternativeto improve some
characteristics.Transgenicanimals have
a huge importance in human and
veterinary biomedicine and in animal
production. Theseanimals are being
usedasresearchmodels in medicine. For
example,apolipoprotein E deficient
mice that show susceptibilityto
arteriosclerosis,are good models to
study the factors involved in the
developmentof this disease.Several
important proteins in human and
veterinary medicine obtained from
human or animal tissues,are as
expensiveas loooo dollars per milligram.
Thesecostscould be reducedby using
the mammary gland as a bioreactor to
produce theseproteins in the
recombinant form. However,one the
major difficulties to produce transgenic
animals is the impossibility to predict
the regulation and expressionlevel of
the genein the animal obtained. In this
paper,technologicalalternativesthat are
being evaluatedto improve gene
inclusion and to control the expression
of the genein the transgenicanimal are
'
critically reviewed.
RESUMEN
Las nuevastecnologíasen las cienciasanimaleshan permitido la producción de animalestransgénicoscomo una alternativapara el mejoramiento de ciertascaracterísticasgenéticasen los individuos de una especie.El uso de los animalestransgénicostiene
amplia repercusiónen la biomedicina humana y veterinaria,al igual que en producción animal. Los animalestransgénicosestánsiendo utilizados como modelos de investigaciónen medicina humana; un ejemplo, es la obtención de ratones deficientes
en apolipoproteínaE que muestran alta susceptibilidada la arterioesclerosisy con los
cualesse facilita el análisisde los factorescomprometidos en el desarrollo de estaenfermedad. Actualmente, varias proteínas de importancia en medicina veterinaria y
humana seobtienen de tejidos animaleso humanos,con costosque llegan a los ro millones de pesospor miligramo de proteína pura; estoscostospodrían reducirseal producirlas en forma recombinante,mediante el empleo de la glándula mamaria como
un biorreactor natural. Sin embargo,una de las grandesdificultadesen la producción
de animalestransgénicoses la imposibilidad de predecir el nivel de regulación y de
expresióndel geneen el animal resultante. En el presenteartículo semuestran las alternativastecnológicasque seestánevaluandopara permitir una mayor incorporación
de los genesy un mejor control de la expresiónde los mismos en los animales
transgénicos.
producción animal, animalestransgénicos,recombinación de genes,
PalabrasClavesz
expresiónde genes.
INTRODUCCION
A
llcruelunNra
existentres técnicasde
transgénicos:la
mamlferos
producción de
inyección pronuclear, el uso de vectores
retroviralesy Ia recombinaciónhomóloga
en células embrionarias madres (células
Eu). Thnto la inyecciónpronuclearcomo
el uso de los vectoresretroviralessebasan
"artificial" o
en la introducción de un gene
"transgene"enun cromosomadelembrión
todaen desarrollo.Desafortunadamente,
vía no esposiblepredecirel lugar de inserción del transgene,por lo cual,esnecesario
Key Words:animal production,
construir genesartificialesque funcionen
transgenicanimals,recombinant genes,
en cualquierparte del cromosoma(el progeneexpressron.
cesode insercióndel transgeneen la técnicade inyecciónpronuclearesreferido como
recombinaciónilegítima). Por estarazón,
el transgenedebecontenertodala información necesariaparaun control adecuadode
de epN
transcripción.Entre lassecuencias
involucradas en el control de expresión de
1. Departamento de Anatomía Veterinaria y
un geneseencuentran,entreotros,los proCentros de Genética Animal y Biotecnología Aniintensificadoresy lasregiones
motores,los
Station,
mal, Universidad de TexasA&M, College
de fijación a la matriz nuclear (vten)
Texas,usA22843-458.
(Klintworth, r99o;Brooks et al.,1994).Ese-mail: [email protected]
R E V I S TCAO R P O I C AV. O t l . N o l ' O C T U B R E1 9 9 6
tas secuenciasreguladorasson dificiles de
identificar y aislar y, máxime si setiene en
cuenta, que su nivel de expresión y su regulación apropiada están afectadasPor
áreasadyacentesde Ia cromatina.Esoquiere
decir que, si se producen diez animales
transgénicoscon el mismo transgene,cada
uno de ellos será diferente debido a que
contieneel eoN artificial en diferentesáreas
cromosómicas.Esteefecto,llamadoel efecto de localizacióno efectoposicional,esla
causamás importante de la imposibilidad
paraproducir animalestransgénicosde especiesdomésticasque regulenla expresión
del transgenede una manera apropiada
(Klintworth, r99o).
Afortunadamente, durante los ultimos
años se ha desarrolladouna técnica que
permite la introducción del transgeneen
del cromosoma(Smithies
áreasespecíficas
et al., 1985;Koller y Smithies,r99z). Es decir, haceposiblepredecirel sitio en donde
terminará localizado el transgene,y no es
necesarioque esteseaautosuficiente,ya
endóque se puedenusar las secuencias
¡0
Losanimales
transgénicos
genasreguladorasque seencuentranen el
áreadonde seestá tratando de introducir
el transgene.Estatécnica,llamadarecombinación homóloga, hace uso, como su
nombre lo indica, de regionesde homología entre el etN exógeno(el transgene)
y el eoN endógeno(cromosómico),para
insertar el transgeneen áreasespecíficasdel
cromosoma.En otraspalabras,usandoesta
técnicase puedeseleccionarel lugar en el
cromosoma donde seleccionarel ¡tN
exógenoirá a terminar.
Como sepuedever en la figura r, el gene
endógeno,o geneX, estácompuestodevarios intrones y exonesque definen su identidad. Esta secuenciade eor.r es única en
cada región, por lo que se puede definir
"huella
como una
dactilar" genética.Utilizando métodos de ingenieríagenética se
construyeel transgeneconteniendolasregionesde eoN, tanto intrones como exones,
quedefinenel geneX. Al introducir el ¡oN
exógeno en la célula, las regiones de
homología entre el gene endógenoy el
exógenoactúancomo pequeñosimanesy
seatraenmutuamente.Estaatracciónhace
que el eoN exógenoidentifique, entre el
ADNcromosomalcompleto,el ¿,orsendógeno que contienelasmismasregionesde
homología(Koller y Smithies,r99z).
Una vez encontradaslas regionesde
homología, el transgenereemplazaal elN
endógenohaciendo uso del procesode
recombinaciónhomóloga.En estetipo de
inserciónel ¡ou es intercambiado y difiere de aquel que ocurre en la inyección
pronuclear y los vectoresretrovirales en
los cuales durante la recombinación
homóloga, el e¡N es añadido. Tanto el
procesode insercióncomo el resultadofinal son diferentes. En el caso de la
recombinación homóloga el ¡.p¡¡ del
transgeneinteractúacon el ¡oN endógeno
a travésde regioneshomólogas e induce
un intercambio de noN entre el transgene
y el eow cromosómico(Koller y Smithies,
t99z).En el casode la inyecciónpronuclear Ia secuenciadel transgeneno influye en el procesode inserciónya que el eoN
cromosómico no interactúa con el transgenede manera específica.
Similarmente,el sistemade inserción
en los retrovirusno estábasadoen secuenciasdel lpN cromosómico,sino en la presencia de una enzima viral llamada
integrasay unas secuenciasde ¡nN en el
retrovirus llamadasrepeticionesterminales largas(LIR; Van der Putten, 1985).La
necesidaddel transgenede interactuarcon
una región específicaen el sistemade
recombinaciónhomóloga,haceque la frecuenciade inserción específicasearelati-
vamentebaja. Estabajaeficienciadel pro- técnica es conocida como inactivación
cesode recombinaciónhomóloga no per- insercionaly permite el aniílisisde la funmite su uso directoen embriones,sino que ción de genesespecíficosen la fisiologíade
obliga a su utilización en células pluriun organismo.Esasícomo,utilizando esta
potencialesobtenidasdel embrión, llama- técnicaha sido posible determinar la fundascélulasembrionariasmadreso células ción de diferentesgenesy la generaciónde
EM.
animalescon síndromessimilaresa los
Las células EM son aisladas de la masa
encontrados en ciertas enfermedadesde
celular interna (rr.rcr)de un embrión en los humanos (Koller y Smithies,r99z). En
el período de preimplantación.Básica- nuestro laboratorio, por ejemplo, hemos
mente, las célulasde Ia lrcr se separande desarrolladoun ratón deficienteen la apolas célulastrofoblásticasy se cultivan en lipoproteína E, una proteína involucrada
condicionesque permitan su prolifera- en el transporte del colesterol(Piedrahita
ción, pero que evitensu diferenciación.En et al., 199z). Estos ratones desarrollan
estascondiciones,Ias célulascontinúan arteriosclerosis
prematura,lo cuallos hace
dividiéndosesin perder su habilidad de un modelo excelentepara el análisisde
diferenciarse normalmente (Evans v factoresque afectan,tanto positiva como
Kaufman,r98r;Martin, r98r).Estoimpli- negativamentela incidenciade la enfermeca que el material genéticode estascélu- dad (Zhanget al., r99z).
las se pueda modificar en cultivo y
En segundolugar, y de mayor utilizasolamentedespuésde seleccionaraquellas ción en la industria animal,estála produccélulasque contienen el cambio deseado, ción de animales transgénicos que
seproduceel animal transgénico.Como se produzcanproteínasmodificadasen cierpuedever en la Figura z, la manerade ob- tos órganos, especialmenteen la glándutener un organismo completo de una cé- la mamaria.Paralograr estaregulacióntan
Iula en cultivo es a travésde la inyección específicaes necesariono solo que todos
de las célulasembrionariasmadrestrans- los reguladoresde la transcripción del
génicasen un embrión huésped.Debido epN esténintactos en el transgene,sino,
a que las célulasdel embrión huéspedno más importante aún, que éstese encuenson capacesde distinguir entresuspropias tre en el lugar cromosómicoque le correscélulasdel ucl y las célulasnu, las seña- ponde. La única forma de lograr que se
lesresponsablesdel control del desarrollo cumplan esosdos requerimientos,es innormal de lascélulasdel ucr también son troduciendo un geneen el animal de marecibidaspor las célulasEM. Estascélulas nera que quede bajo control de un gene
nu respondena las señalesy se desarro- endógeno que seaexpresadoapropiadallan normalmente.El resultadode esteco- mente.En el casode la glándulamamaria,
desarrollode lascélulasnrvrylas célulasdel seríaun geneque codifica a una proteína
embrión huéspedesla producción de un única de la leche como la caseína, la
animal compuestopor dos tipos de tejido; lactoglobulina, o la proteína ácidica del
uno procedentede lascélulasdel embrión suero(wee), (Wilmut et al.,r99ra,r99rb).
huésped,y otro de las célulasnvr (Bradley Como se puede observar en la Figura 3,
et al.,1984).Esteanimal "mixto" seconoce esteobjetivo sepuedecompletar utilizancomo una quimera y puedeproducir pro- do la técnicade recombinaciónhomóloga.
genie con el genotipo tanto del embrión Básicamente,el transgeneestácompueshuéspedcomo de las célulastransgénicas. to de áreashomólogas al gene del wep,
Esto quiere decir que la mutación que se pero adicionalmentecontieneun segunintrodujo en cultivo puedesertransmitida do gene (en este ejemplo el gene del
a través de los espermatozoideso de los activador de plasminógenode tejidosoocitosa lasfuturasgeneraciones.
ree) codificador de la proteína que sedesea producir en la glándula mamaria.
Animales Tiansgénicosen la
Mediante las zonashomólogasesposible
Biomedicina Humana y Veterinaria.
lograr que el transgeneseincorpore en el
La utilización coniunta de la recom- lugar cromosómico que contiene el gene
binación homóloga con la habilidad de del w¡p endógeno a través de una reacdiferenciaciónde las célulasevr luego de ción de recombinación homóloga. El resu modificación genética,han permitido sultado de estareacción es el cambio del
el desarrollo de dos técnicasnuevasde gene endógeno por el transgene.Si el
manipulación del material genético en transgeneestabien diseñado,es posible
mamíferos.En primer término, ha permi- obtenerexpresióntanto del w¡p como de
tido la inactivación de genesespecíficos rpn. Lo importante es que a nivel de la
mediantela inserción de un transgeneen transcripción,el geneestécontrolado por
un geneactivo,causandosu bloqueo.Esta los reguladoresdel wer,los cualesno solo
REVISIA
C O R P O I C AV. O l "| . 1 { o t . O C T U B RtE9 9 6
Losanimales
transgénicos
5l
han quedadointactossino que estánen el
Iugar cromosómico donde normalmente
funcionan.
El interésen los estudiosde la glándula mamaria se debe a que actualmente,
proteínas de importancia en medicina
humana y veterinaria seobtienen de material humano o animal, a costosexorbitantes que llegan a alcanzar los 5-ro
millonesde pesospor miligramo de proteínapura.Estoscostossepuedenreducir
utilizando proteínas recombinantesproducidasya seapor bacterias,levaduras,
célulasen cultivo o empleando animales
comobioreactores,
Un sistemaidealde producción de proteínas recombinantesdebe llenar los siguientesrequisitos:Primero, el sistema
debeproducir altascantidadesde la proteína de interés.Segundo,la proteínadebeser
activa biológicamentey ser idéntica a la
proteínaendógena.
Tercero,el costodeproduccióndebeserrelativamentebajo en relación con el valor probablede la proteína
en el mercado. Desafortunadamente,las
bacteriasno procesanIa proteína de una
maneraiguala lascélulasde losmamíferos,
lo que puederesultaren una proteínaque
causeuna reaccióninmunológicaen el paciente.Aunque la proteína producida por
célulasen cultivo, y hastacierto punto por
laslevaduras,no tieneproblemascon reacciones inmunológicas debido a procesamientosirregulares,loscostosdeproducción
y el niveltécnicorequeridoparasu producción sonmuy altos.
honólogo
Figura5. Proceso
derecombinoción
poroproducción
defórmocos
enloglóndulo
ácrda
nanorio.
a)Cene
endógeno
delaproteína
(WAP)
losreguladores
delsuero
contodos
para
suexpresión
enIaglándula
necesarios
que
b)Transgene
mamaria
durante
lalactancia.
lasregiones
dehomología
conelgene
contiene
para
lainducción
delproceso
endógeno,
necesari¿s
Adicionalmente,
el
homóloga.
derecombinacrón
activador
del
fasgene
contiene
elgene
plasminógeno
(TPA),
origen
ala
detelidos
dando
producción
defusión
compuesta
deunaproteína
porelWAP
y elTPA.
endógeno
delWAP
c)Gene
Deesta
derecombinación.
luego
delproceso
enlaglándula
manera
elTPA
será
expresado
laIactancia.
mamaria
durante
\,/
^'.
REV|STA
C O R P O T C. AV O t | . N o r . O C T U B R Er 9 9 6
a)
\,/
2 3 4
, A . .1
\1
b)
áreas
específicas.
Esta
honólogo.
a) Región
endógena
concuatro
F¡gurat. Elproceso
derecombinoción
producido
conteniendo
tresáreas
b)Transgene
enel laboratorio
copia
seencuentra
enelcromosoma.
Adicionalmente
contiene
elgenedelaneomicina,
elcualpermite
idénticas
a lasdelaregión
endógena.
quecontienen
l,lly lll delgeneendógeno
hansido
eltransgene.
c) Lasáreas
seleccionar
lascélulas
porlasáreas
homóloga
1,2y 3 deltrasgene
durante
el proceso
derecombinación
reemplazadas
hasidointroducido
enel cromosoma,
d¿ndo
comoresultado
elgenedelaneomicina
Adicionalmente
porunADNproducido
enel laboratono
especÍfica
delcromosoma
finalelreemplazo
deunaregión
6
cétutasEMen cuttivo
't, - f 5 célulasEM
\ooo
oo;,foooo
d
a4
0
lnvección al
Bíastocisto
\
\
\-
kr'fuI
J-lrf=-=-
t>
,s:
rr_-=-é
\D
Animales
Transgénicos
.#
)
l-t-I,
\( i(/
o
^
'3'
.,,iffffiro']:"
(incubadora)
receotora
))l
Quimerá
nodres(EM).Lascélulas
loscélulosenbrionorios
tigwa2. Producción
dequinerosutilizondo
y ungrupodel2 a l5 seinyectan
huésped.
Los
enunblastocisto
sondisociadas
EMtransgénicas
queactúa
comoincubadora.
Los
a unareceptora
sincronizada
embriones
sontrasferidos
y naceunaquimera.
Laquimera
tiene
sedesanollan
enelúterodelareceptora
embriones
huésped.
Estos
tejidos
mixtos
EMy tejidos
derivados
delembrión
tejidos
derivados
delascélulas
gametos
pueden
derivados
delas
o losovarios,
esdecir,
sepueden
obtener
incluir
lostestículos
puede
qurmeras
conunapareja
normal
darunaprogenie
EM.Elcruzamiento
deestas
células
quecontiene
introducido
EMencultivo.
eltrasgene
enlacélula
\1
'
'
t2
Losanimales
transgénicos
Estosproblemascon los mét odosin vitro
han llevado al desarrollo de métodos de
producción de proteínasinvivo. En particular, se han generado animales transgénicosque producen proteínasexógenas
de interésmédico en la glándulamamaria.
El método de producción de estosanimales ha sido a travésde la inyecciónpronuclear de un transgeneque contiene las
de la
regionesreguladorasresponsables
expresióndel geneúnicamenteen la glándula mamaria y del geneque expresala
proteínade interés.Lastres regionesmás
utilizadashan sido las reguladorasde la
ovalbumina ovina, de la caseínabeta de la
rata, y de la proteína acidica del suero
(wer), (Pittius et al.,1988;Shamayet al.,
r99r;Wilmut et a1.,:.99ra).
Utilizando la inyecciónpronucleary las
secuenciasreguladoras de la glándula
mamaria,tanto la industria privada como
loslaboratoriosuniversitarioshan desarrollado cerdos,ovejasy cabrastransgénicas,
produciendo proteínas heterólogasen Ia
glándula mamaria. Estasproteínas incluyen alfa-r-antitripsina(anti-inflamatorio),
colágeno(tratamiento de fracturasy quemaduras), factor vrll y rx (hemofilia),
fibrinógeno (quemaduras,cirugía),hemoglobinahumana (transfusiones),proteína
C (deficiencia de proteína C), y el
activadorde plasminógenode tejido (rre)
(ataquescardiacos,trombosis,embolismo
pulmonar) (Rucker,comunicaciónpersonal). Los nivelesde producción fluctúan
entre1oo-2oomg por díahastamásde roo
gramosdiarios de la proteína de interés
pura. Con nivelesde producciónde roo
gramosdiarios, secalculaque dos animalestransgénicosseríansuficientespara satisfacer la necesidadde factor tx de la
humanidad.Esto afectaríalos costosde
factor rx de una maneracasiinconcebible
con reduccionesde precio de mas de
r.oooTo(de US$r.ooo/mga US$r/mg).
Aunque eiste la tecnologíapara la generación de estosanimales,loscostosde producción limitan su aplicación a proteínas
de muy alto valor comercial.
aumento en la eficienciade utilización del
alimento yen el nivel de crecimiento,aparecían en el animal tratado con la hormona
problemas ffsicosque no permitían su comercialización. Recientemente,sehan obtenido cerdos transgénicosconteniendo
IGF-I y el oncógenecSKI; sin embargo,
como en el casoanterior, no se alcanzaton
los resultadospositivoslogradoscon la aplicación de esta tecnología en ratones
transgénicos.Es asícomo, a pesarde más
de r5 añosde investigaciónen estaáreano
existeun animal transgénicode valor comercialcon un nivel de crecimientomodificado (Wall, 1996).
Otra áreade investigaciónen el sector
pecuario,es la producción de animales
resistentesa enfermedadesespecíficas.
Aunque estatecnologíaha dado resultado
en ratones,hastaahora no se ha podido
reproducir exitosamenteen especiesdomésticas.Recientemente,Clements et al.
(gg+), reportaron la producción de ovejastransgénicas
produciendopartículasdel
virus visna. Resultadospreliminaresindican que las ovejascontienenanticuerpos
dirigidos a estevirus, masno indican todavía si la expresiónde estaproteínaconfiere
resistenciaa la enfermedad.
En la actualidad, la aplicación más
parepromisoriade animalestransgénicos,
ceserla producción de lana modificadaen
sereportóla producovejas.Recientemente
ción de una ovejatransgénicaexpresando
IGF-I controlado por el regulador de la
keratina (Bullock et al., 995). La producción de Iana fué roolomayor en ovejas
transgénicasque en las no-transgénicas.
Actualmente,seestáanalizandola calidad
de la lana, y si se demuestraque esta se
mantiene, sería el primer animal
transgénicode valor comercialen sistemas
de producción pecuaria.
Tal vezlas razonesprincipalesdel lento progresoen la producción de animales
domésticostransgénicosson,el alto costo
de estatecnologíay su concentraciónen
muy pocos laboratorios.Esto limita no
solo el número de experimentosque se
pueden desarrollar en un cierto tiempo,
sino también, la masa crítica disponible
para el avancede estaáreacientífica.
laboratorioscon altosrecursoso la industria privada puedan emprender programas de estetipo.
En el momento los costosde producción de una vaca transgénicase calculan
en US $z5o,oooy de un cerdoUS $5o,ooo.
La conjunción entre los altos costosy la
incertidumbre de los resultados,explican
el bajo uso de estatecnología.Obviamente, la habilidad para determinar los cambios exactos ocurridos luego de una
modificación genéticay la capacidadde
usarlos reguladoresendógenos,hacepensar que el uso de la recombinación
homóloga aumentaríala eficaciade producción de animalestransgénicos.
Desafortunadamente,en el momento
estatécnica solo se ha podido utilizar en
roedores.debidoa la dificultad de aislarlas
célulasEM en otras especies.Investigacionesprevias(Piedrahitaet al.,r99oa;r99ob)
han demostradola posibilidadde aislarcélulas ¡u en porcinos; sin embargo,no se
ha logrado identificar las condicionesque
ayudena mantenerestascélulasEM en un
estado genéticamenteestablepor largos
períodosde tiempo. En bovinos, los problemas técnicos son similares;algunos
grupos reportan,la capacidadde aislarlas
célulaspero no han tenido éxito en mantener su estadopluripotencial. Solo un
grupo ha reportado la obtención de progenieutilizando célulasen cultivo yla técnica de transferencianuclear (Simms y
First, 1993).A pesar de la intensa investigación realizadapor varios laboratorios,
no ha sido posible replicar estosresultados.En estemomento la investigaciónen
el áreade aislamiento de las célulasnvl en
bovinos, ovinos y porcinos, se enfoca al
descubrimientode protelnasembrionarias
o uterinasque permitan la proliferación e
inhiban la diferenciaciónde estascélulas
Etr.in vitro. Recientementesereportó la que
ciertas citoquinas como la interleukina-6,
oncostantina-M, el factor inhibitorio de
Animales Transgénicos
leucemia(ur), y el factor ciliar neuroen la Producción Animal
trófico (cNrr), pueden facilitar el aislaDebido a los altoscostosde producción
miento de las células EM en ratones
Tecnologíasen Desarrollo
de animalestransgénicosen el momento,
(Yoshidaetal.,t994). En nuestro laborael
se
mencionaba
anteriormente,
Como
la aplicaciónde estatecnologíaesmuy litorio
se ha desarrolladoun sistemautiliproblema
la
producción
de
animales
interés
con
Inicialmente
hubo
mucho
mitada.
en la manipulación del crecimientoa tra- transgénicosusandoinyecciónpronuclea¡ zando embrionesde cerdo que permite
vésde la inyecciónde la hormona de creci- esla imposibilidad de predecir el nivel de evaluarlos efectosde estasproteínassobre
miento en cerdos(Purselet al.,1989;Ebert regulacióny de expresióndel animal re- el desarrollo de la masa celular interna
et al.,r99r;Wall,1996).Desafortunadamen- sultante.Debido a los altoscostosde pro- (Moore y Piedrahita,1996).Utilizando este
te,losresultadosde estosexperimentosde- ducción de estos animales en especies sistemay proteínas obtenidasde ratones
mostraron que, simultáneamentecon el domésticas,se percibe que solo aquellos o humanos, hemos observadola incapa-
1996
R E V I S f AC O R P O I C .Av o t | . N ' l . O C T U B R E
5if
transgénicos
[os animales
cidad de estasproteínaspara actuar sobre
el embrión porcino. Estosignifica,que las
proteínasheterólogasno son activasen el
cerdo, o que el cerdo no tiene los receptores para aquellasproteínas.Para resolver esapregunta hemos aisladolos genes
de cNrr y el rtr porcino y estamosen el
procesode expresarlasproteínaspara determinar su bioactividad en el embrión
porcino. Paralelamente,estamosutilizando métodosbasadosen la reacciónen cadena de la polimerasaque nos permitan
analizarla expresiónde los receptorespara
estetipo de proteínasen un solo embrión.
Alternativamente,el desarrollode células embrionariasmadres en ratones,se
puedeconseguirutilizando no solo embriones sino también célulasgerminales
obtenidasde embriones antes de la diferenciación sexual (Matsui et al., r99z).
Utilizando técnicassimilares,y nuestra
experiencia sobre el efecto de ciertas
citoquinas en el estadode diferenciación
del embrión porcino, hemos obtenido
variaslíneascelularescon morfología y
marcadoresde diferenciaciónsimilaresa
aquellosdetectadosen lascélulasembrionariasmadres.Actualmente,estamosinvestigandola capacidadde estaslíneas
celularespara participar en la formación
de una quimera una vez inyectadaen un
embrión huésped.A pesarde no contar
todavíacon los resultadosfinales de esta
investigación,el hecho de haber logrado
mantenerla morfología y la expresiónde
por variassemamarcadoresespecíficos
nas,indica que estamosaproximándonos
a las condicionesnecesariaspara el aislamiento de estetipo de líneascelulares.
Dado que el desarrollode lascélulasEvt
en especiesdomésticas,posiblemente,no
selogre en el corto plazo,varios laboratorios incluyendo el nuestro,estanbuscando alternativasde producción de animales
transgénicospara incrementar la eficienciay el control de regulaciónexistente,sin
haceruso de las célulasembrionariasmadres.Debido a los altos costosde investigación,estetipo de trabajosestálimitado
en esta etapaa ratones.Los dos enfoques
principalesen estainvestigaciónson, el
desarrollo de técnicasque bloqueen el
efectoposicional,y el desarrollode técnicas que incrementen la proporción de
embriones inyectadosque incorporen el
transgene.
Para reducir el efecto posicional,
1996
R E V T S TCA0 R P O I C AV. O I | . N o l . O C T U B R E
3
+ t
l,nn,n/+ I
una
porlo enzinocre Larecombinasa
creidentifica
mediodo
Figura4. Reconbinoción
puede
estesitio,laenzima
loxPUnavezreconocido
llamada
resiónde32nucleótidos
Iapresencia
ocurra
esnecesario
Paraqueestareacción
rinainserción
o unadeleción.
inducir
deADNenun
inserción
tantodecausar
laenzima
escaPaz
loxPEsdecir,
dedossecuencias
pordosloxP
porloxP,
unáreadeADNenmarcada
comoderemover
lugarmarcado
McKnight et al. (t992), incluyeron en el
transgenelas secuenciasde la región de
fijación alamatriz (vren) obtenidas del
genede la lisozima.Estasregionesde fijación aislan físicamenteuna región de
cromatina de Ia otra y teóricamentepueden evitar que nivelesde expresiónde una
de ellasafectenla expresiónen otra región.
Susresultadosdemostraronque en el caso
del genewet, las regionesvren fueron
capacesde aislar el gene de una manera
significativa.El porcentajede fetos vivos
que expresabanel transgeneaumentó del
6oolosin u,tn al roo%ocon u¡n. Lamentablemente,los nivelesde producción de
la proteína exógenano se aumentaron y
al.canzaronsolo un to-zoo/ode los niveles
endógenos.Estosresultadosindican que
"aisladores"podrá mejorar el
estetipo de
nivel de regulación y proteger contra el
efectoposicional,sin embargo,serequiedomésticas.Tamre su estudioen especies
bién indican, que para aumentar el nivel
de expresiónse debenidentificar secuenciasdiferentesa Ios lren.
Con el fin de mejorar la eficiencia de
producción de animales transgénicos,
nuestro grupo estáadelantandolos estudios inicialesparaestablecerla posibilidad
de usar una enzima llamada cre para aumentar el número de eventosinsercionales
(Sauer y Henderson, rgg4; Rucker y
Piedrahita,1995).La técnicaestábasadaen
la observaciónde que la enzima cre escapazde identificar una secuenciade,t¡N de
3z bases,Ilamada lox| y de cafalízarla
recombinación de dos moléculas conteniendo cadauna de ellasun secuencialoxP
(figura 4). Estotrae dosbeneficios:primero, que al integrar inicialmente un gene
con la secuencialox| el gene,o el área
"marcada"para el
cromosómica, queda
evento secundario;y segundo,que la inpor una enzima,proserciónescatalizada
ceso que es más eficiente que las
insercionesno enzimáticas,como Ia que
ocurre durante la recombinación homóloga o recombinación ilegítima. La combinación de la habilidad para introducir el
a travésde la
transgeneen áreasespecíficas,
inserciónde una secuencialoxP en el área
de interés,y el incremento en la eficiencia
por el uso del cre, permitirá optimizar la
producción de animalestransgénicoscon
mejor regulación.
A pesarde las dificultadesexistentesse
prevéque en Iospróximos5 añossevan a
dilucidar las condicionesque permitan el
aislamientode célulaspu en los bovinos,
ovinos,y porcinos. Una vezlascélulaseM
seanaisladas,no seanticipa ninguna dificultadparaproducir los cambiosgenéticos
por medio de recombinación homóloga,
ya que seha demostradoque las enzimas
responsables de facilitar este tipo de
recombinación están conservadasen las
especiesmamíferas,Estosavances,y los
obtenidosen el aumento de la eficienciay
el control de regulación de animales
transgénicosproducidos por la inyección
pronuclear,indican que la investigaciónen
esta área de la producció resultará en la
generaciónde animalesde gran beneficio
para la humanidad.Esel momento de que
Colombia decidasi selimita a sercomprador de los productos de estatecnologlao
invierte en la capacitacióndel recursohumano y en la infraestructura física necesaria para el desarrollo de su propia
industria; una industria destinadaa revolucionar los sistemasagropecuariosy
biomédicos en el siglo xxI.
14 Losanimales
transgénicos
srsrrocnerÍe
Ebert, K.M., and Selgrath f.P.
rggr.Changesin domestic livestock through
genetic engineering. In Animal Applications
of Researchin Mammalian Development.pp.
2j3-266.
BradleandAM, EvansM, Kaufinan M
and RobertsonE. 1984.Formationofgermline chimerasfrom embrando-derived
teratocarcinomacell lines.Nat\re 3o9i255256.
Brooks,A.R., Nagand B.P.,Taandlor S.,
Simonet S.,Thandlor f.M., and LevandWilliam B. ry94. Sequencescontaining the
secondintron enhancerare essentialfor
transcription of the human apolipoprotein B
genein the livers of transgenicmice. Mol.
Cell Biol. :14:22432256.
Bullock, D.W., Damak S.,faand N.P.,Su
H.AND., and Barrel G.K. 1995.Improved
wool production from transgenicsheep
expressinginsulinJike growth factor driven
band the keratin promoter. In: Miller (ed)
Biotechnologand'sRole in the Genetic
Improvement of Farm Animals. Beltsville
SandmposiumXX, pg.8S.
Clements,f.E.,Wall R.J.,Naraandan O.,
Haver D., Schomberg R., Sheffer D., Powell
,4'.,Carroth L.M., ZinkM.C., and Rexroad
C.E. t994. Development of transgenicsheep
that expressthe visna virus envelopegene.
Virologand 2oo:37
o - 38o.
EvansM and Kaufman MH: r98r.
Establishmentin culture of pluripotent cells
from mouse embrandos.Nature z9z:154-156.
Klintworth G.K. r99o. Pathologicstates
produced band transgenicmice. Adv. Pathol.
3:43-299.
Koller, B. and Smithies,O. 1992.AJtering
genes in animals band genetargeting. Anual
Reviewsin Immunologan d,rc: 7o5-73o.
Martin G.R. 1981. Isolationof a
pluripotent cell line from earlandmouse
embrandoscultures in medium conditioned
to teratocarcinomastem cells.Proc. Natl.
Acad.Sci. 78:7q4-798.
Matsui,AND., Zsebo K., and Hogan
B.L.M. 1992.Derivation of pluripotential
embrandonicstemcellsfrom murine
primordial germ cellsin culture. Cell 7o:84r847.
McKnight, ShamaandA., SankaranL.,
Wall R.J.,and HennighausenL. 1992.
Matrix-attachmentregionscan impart
position-independentregulation of a tissuerspecificgenein transgenicmice. Proc. Natl.
Acad.Sc.USA 89:694-6947.
Moore K., and Piedrahita J.A.1996. Effect
of leukemia inhibitorand factor (lif) and
culture media on in vitro differentiation of
isolatedporcine ICM. InVitro Cell Dev. Biol.
(in press).
Piedrahita,J.A.,Anderson, G.B. and
BonDurant, R.H. r99o. Influence of feeder
laander tandpe on the efficiencandof
isolation of porcine embrando-derivedcell
lines. Theriogenologand34:865-877.
Piedrahita, 1.A.,Anderson, G.B and
BonDurant, R.H. r99o. On the isolation of
embrandonic stem (ES) cells:Comparative
behavior of murine, porcine, and oüne
embrandos.Theriogenologand,34:879-9 ot.
Piedrahita, J.A.,Zhang, S.H. Hagaman,
I.R. Clark, P.M. and Maeda,N. t992.
Generation of mice carranding a mutant
apolipoprotein E geneinactivatedband gene
targeting in mouse embrandonic stem cells.
Proccedingsof the National Academandof
Sciences,
U SA 89:447
t -4475.
Pittius, C.W., Sankaron,L. Topper,AND.
and Henninghausen,L. 1988.Comparison of
the regulation ofthe wheand acidic protein
genewith that ofa handbrid genecontaining
the wheand acidic protein promoter in
transgenicmice. Mol. Endocrinol. z:roz77032.
Pursel,V.G.,Pinkert, C.A., Miller, K.F.,
Bolt, D.J.,Campbell, R.J.,Palmiter, R.D.,
Brinster, R..L. and Hammer, R.E: 1989.
Genetic engineeringof livestock.Science
244ir28r-7288.
Rucker,E.B.,and Piedrahita,J.A.tg91.
Cre-mediateddeletion at a targetedmouse
WheandAcidic Protein (MWAP) locus.In:
Miller (ed) Biotechnologand'sRole in the
Genetic Improvement of Farm Animals.
BeltsvilleSandmposiumXX, pg.SS.
Sauer,B. and Henderson,N. 1994.
Thrgetedinsertion of exogenousDNA into
the eukarandoticchromosomeband the cre
recombinase.New Biol. z:44r-449.
Shamaand,A., Solinas,S. Pursel,V.G.
McKnight, R.A.Alexander,L. Beattie,C.
Hennighausen,L. andWall, R.]. r99r.
Production of the mouse wheand acidic
protein in transgenicpigs during lactation. f.
Anim. Sci.. 69:45524562.
Sims M., and First, N.L. 1993.Production
of calvesband transfer of nuclei from
cultured inner masscells.Proc. Natl. Acad.
Sci.USA 9o:6143-6147.
Smithies,O., Gregg,R.G. Boggs,S.S.
Koralewski,M.A. and Kucherlapati,R.S.1985.
Insertion of DNA sequencesinto the human
chromosomalbeta-globin locus band
homologous recombination. Nature 3r7:z3o234.
Van der Putten, H., Botteri, F.M. Miller,
A.D. Rosenfeld,M.G. Fan, H. Evans,R.M.
andVerma, I.M. 1985.Efficient insertion of
genesinto the mouse germ line via retrovirus
vectors.P¡oc. Natl. Acad. Sc.USA 8z:6r+86t52.
Wall R.J. 1996.TiansgenicLivestock:
Progressand prospectsfor the future.
- 69.
Theriogenologand 45:57
Wilmut, I., Archibald, A.L. McClenaghan,
M. Simmons, f.P.Whitelaw C.A. and Clark,
A.f. r99r. Modification of milk composition.
f. Reprod.and Fertil. 43:265-275.
Wilmut, I., A¡chibald, A.L. McClenaghan,
M. Simmons, ].P.Whitelaw,C.A. and Clarh
A.J. rgqr. Production of pharmaceuticalsin
milk. Experientia47:9o5-9t2.
ANDoshida, K., Chambers,I., Nichols, J.,
Smith, A., Saito,M., ANDasukawa,K.,
Shoandab,M., Thga,T. and Kishimoto, T.
1994.Maintenanceof the pluripotential
phenotandpeof embrandonic stem cells
through direct activation of gpr3o signalling
pathwaands. Mechanism Dev. 45ir63-r7r.
Zhang, S.H.,Reddick R..L.,Piedrahita,
J.A.and Maeda,N. 1992.Spontaneous
handper-cholesterolemiaand arterial lesions
in mice lacking apolipoprotein E. Science
258i468-47r.
REVISTC
A O R P O I C.AV O L | . N o l . O C T U B R E
t996