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Células Madre y su Función en la Recuperación de Tejidos Cerebrales Dañados
Gad Rozenel Tuachi
Colegio Hebreo Tarbut
Ciudad Universitaria 22 de marzo de 2007
A quien corresponda:
Tomando en cuenta el excelente trabajo teórico desarrollado por el alumno Gad
Rozenel y además de acudir de manera constante al laboratorio AL-201 del Instituto
de Fisiología Celular, donde además de recibir asesoria participó activamente
durante el desarrollo de los experimentos ahí realizados, tomando en cuenta esa
disponibilidad e interés por la investigación científica, como asesor doy visto
bueno al trabajo desarrollado.
Sin mas por el momento.
Atte:
EDDIC WILLIE MORALES SANCHEZ.
MCP, Estudiante de doctorado.
A quien corresponda:
Quisiera comentar que después de leer el trabajo del alumno Gad Rozenel puedo
decir que lo encuentro muy bien estructurado, de alto nivel y claro. Con
fluidez y definiendo los términos nuevos que luego son utilizados a lo largo
del trabajo.
Es de remarcar el entusiasmo que muestra hacia este proyecto así como su
definida inclinación hacia la ciencia y la seriedad con que trabaja.
Atentamente
M.C J.L. Lilian Portnoy G.
Resumen
En las últimas décadas se ha logrado demostrar que el sistema nervioso central
es capaz de regenerarse, ya que existen en este sistema células madre multipotenciales
encontradas en la zona subventricular y en la zona subgranular del giro dentado del
hipocampo. Se han hecho varios intentos de repoblar un área lesionada del cerebro pero
ningún intento ha tenido éxito totalmente. Hasta ahora el método que mejor parece
funcionar es la terapia celular, que consiste en estimular de manera endógena el
crecimiento celular o de transplantar células al área de lesión para que ayuden a repoblar
la región afectada. Recientemente se hizo un descubrimiento en los laboratorios del
Instituto de Fisiología Celular de la UNAM que podría ayudar a darles una mejor salud y
calidad de vida a las personas que padecen de Mal de Parkinson, éste consiste en
transplantar células cromafines al cerebro lesionado, lo que genera una recuperación
parcial de los tejidos dañados en un modelo murino.
Células Madre y su Función en la Recuperación de Tejidos Cerebrales Dañados
Introducción
Se denomina células madre a todas aquellas células que son multipotenciales o
pluripotenciales, es decir que su linaje o células hijas, producto de su división mitótica,
pueden diferenciarse en varios tipos de células especializadas. Uno de los ejemplos más
claros y conocidos son las células de médula ósea, lugar donde se lleva a cavo la
hematopoyesis. Estas células tienen capacidad de auto renovación, proliferación y
diferenciación en otras células progenitoras progresivamente comprometidas hacia una
línea de células sanguíneas específica.
Las células madre o “stem cells” varían en el potencial entre unas y otras. Las de
mayor potencial, son las totipotenciales. Se trata de las células del cigoto y la mórula,
estas tienen la capacidad de dar origen a un embrión
En segundo lugar están las pluripotenciales obtenidas del embrión. Éstas son
capaces de diferenciarse en cualquier tipo de célula que esté dentro del linaje con el que
ya estén comprometidas, ya sea ectodérmico (sistema tegumentario, nervioso, etc),
mesodérmico (aparato digestivo, respiratorio, etc) o endodérmico (médula ósea,
músculo, etc.)
En tercer lugar tenemos las células multipotenciales, que se encuentran en varios
de los tejidos adultos. Están mucho más comprometidas con el linaje que pertenece al
tejido u órgano donde se encuentran.
Las células madre tratadas en este proyecto residen en el cerebro, principalmente
en la zona subventricular (ZSV) existen también células en la zona subgranular del giro
dentado (GD) del hipocampo. Se trata de células multipotenciales capaces de reconstruir
el cerebro ante lesiones menores. Pero, ¿Qué pasa con el cerebro ante procesos
neurodegenerativos progresivos como el Mal de Parkinson o la Enfermedad de
Alzheimer ante los cuales el cerebro no es autosuficiente para reparar el daño?
Investigación teórica
Las células madre en adultos se encuentran en casi todos los órganos del cuerpo
exceptuando, posiblemente, el corazón. En la mayoría de los tejidos, la población de
células madre no rebasa el 2% del total del número de células. Estas células funcionan
debido a la necesidad de auto renovación de órganos y tejidos producto del deterioro
natural de la célula o de lesiones causadas por agentes externos. Por ejemplo, la
proliferación neuronal aumenta después de una lesión cerebral o ante el efecto de
enfermedades neurodegenerativas.
Las células madre tienen un mecanismo de reproducción o ciclo celular lento para
evitar mutaciones o errores al sintetizar el ADN.
Una célula madre puede permanecer en su estado multipotencial, diferenciarse
en un tipo específico de célula o sufrir un proceso de muerte celular programada
dependiendo del microambiente del que esté rodeada, obviamente bajo influencia de
factores extrínsecos proporcionados por hormonas, factores de crecimiento, y por
contactos célula-célula, e intrínsecos proporcionados por la información genética de la
célula.
Se ha comprobado en estudios recientes que las células madre en adultos tienen
una plasticidad mayor a la pensada hasta hace unos años. Un experimento hecho en
ratones con patología en el hígado con pronóstico fatal, consistía en realizar un
transplante de células de médula ósea. El hígado se repobló gracias a las células del
transplante.
Teniendo esto en mente actualmente se llevan a cabo estudios sobre la
neurogénesis o producción de neuronas nuevas en el cerebro adulto partiendo del
descubrimiento de Joseph Altman en la década de los 60’s. Más adelante se corroboró
la existencia de este proceso en el cerebro humano adulto gracias a los trabajos de
Eriksson, quien descubrió neurogénesis en el giro dentado (GD) en tejido humano post
mortem. Sanai, posteriormente, descubrió nuevos astrocitos en los ventrículos laterales
y sugirió que los astrocitos de la zona subventricular (ZSV) eran las células progenitoras
neuronales (CPN) del cerebro humano adulto. después reportó que no existían cadenas
migratorias de neuroblastos hacia el bulbo olfatorio (BO) como ocurría en otros
mamíferos, señalando la particularidad de la neurogénesis en el cerebro humano.
En el cerebro existen dos tipos de células con actividad mitótica: las células
troncales que tienen la capacidad de generar células troncales nuevas y también originar
al segundo tipo de células con actividad mitótica, las CPN que pueden generar astrocitos
(un tipo de células gliales), oligodendrocitos y neuronas maduras.
Otros estudios muestran que las células progenitoras provienen de células de tipo
astrocítico. Visto de otro modo podemos declarar que una población de glía radial o
células gliales en desarrollo puede originar precursores neurales, los cuales a su vez dan
origen tanto a neuronas como a células de la glía, es decir que la glía se puede revertir
para dar origen a un precursor neural.
Otra hipótesis determina que a partir de una célula neuroepitelial (nombre que se
le da a las células primitivas que no han perdido su capacidad mitótica y que pueden
diferenciarse en varias células dentro de su linaje) se puede generar una célula troncal,
o una glía radial. Esta última puede revertirse, originar un astrocito o una CPN. El
astrosito también se puede revertir u originar un progenitor neuronal que a su vez origina
neuroblastos (células neuronales aun no comprometidas con una función específica).
Células madre en la zona subventricular
Está demostrado que en la ZSV existen cuatro tipos diferentes de células de
acuerdo con su morfología, estructura, propiedades electrofisiológicas y marcadores
específicos que permiten su identificación. Estos cuatro tipos son: 1-Células ependimales
ciliadas (células tipo E) participan en la circulación del líquido cerebroespinal. 2Neuroblastos proliferativos (Tipo A) presentan migración en cadena hacia el BO 3Células astrocíticas de proliferación lenta (tipo B) 4-Células transitorias amplificadoras
(tipo C) con proliferación activa y que forman montones entre las cadenas constituidas
por las células tipo A en toda la ZSV.
Otros trabajos muestran a las células astrocíticas como las protagonistas de la
neurogénesis en la ZSV. Esto lo descubrieron administrando un antimitótico que mata
las células tipo A y C, las B las deja intactas. Al cesar el tratamiento, se restituye la
población de células C y posteriormente de células A. Por lo que se concluye que las
células tipo B dan origen a las tipo C y estas a su vez a las tipo A.
Con los trabajos de Merkle se ha descubierto que los astrocitos neurogénicos de
las etapas adultas derivan de la glía radial que origina neuronas, astrocitos, células
ependimales y oligodendrocitos antes de desaparecer a los pocos días del nacimiento.
Con este trabajo se concluyó que la glía radial es la célula precursora de neuronas y células
gliales en la etapa neonatal, además de que genera a las células tipo B de la ZSV, las cuales
continúan generando nuevas neuronas a lo largo de la vida adulta.
Las células tipo A, formadas a partir de los astrocitos subventriculares migran a
través de la vía rostral migratoria (VRM) para alcanzar el BO. Al alcanzar la parte media
del BO las nuevas neuronas se separan de las cadenas formadas por las células tipo A
y migran hacia otras regiones del BO, donde llegan como neuronas inmaduras y más
adelante se diferencian en neuronas maduras.
Factores que regulan la neurogénesis en el cerebro adulto
Se sabe que la proliferación y diferenciación de células nuevas en el cerebro están
influidas por varios factores.
Factores internos
Genéticos y moleculares
Entre los genes que inducen la neurogénesis embrionaria se encuentran el gen
Notch, BMP, Ephrinis, Noggin y Shh. Éstos participan también regulando la proliferación
y diferenciación de las células en zonas neurogénicas en adultos.
Factores de crecimiento
La expresión de diversos factores de crecimiento implicados en la regulación del
destino celular puede determinar el tamaño de la población neuronal o glial tanto en
cerebros en desarrollo como en adultos. Estos factores actúan principalmente ante
procesos neurodegenerativos en los cuales participan como factores protectores del
daño neuronal o como factores inductores de generación y diferenciación de células
nuevas que reemplacen a las células lesionadas.
Se ha demostrado que administrando estos factores dentro de los ventrículos
cerebrales se estimula la neurogénesis en el cerebro adulto.
Neurotransmisores
Se sabe que varios neurotransmisores regulan la neurogénesis en el cerebro
adulto. Los más estudiados son el glutamato y monoaminas como la serotonina,
noradrenalina y dopamina.
El glutamato es el neurotransmisor más importante para la función del encéfalo,
además regula la neurogénesis en el hipocampo de animales adultos.
Se ha estudiado que el receptor del glutamato, NMDA (N-metil-D-aspartato),
complejo proteico formado por diferentes combinaciones de varias subunidades,
disminuye la proliferación de las células en el hipocampo. Por lo tanto, al suministrar el
antagonista del NMDA, aumenta la neurogénesis.
Algunos reportes indican que otros receptores glutamatérgicos están involucrados
en la regulación de la proliferación celular en el hipocampo.
También se ha estudiado la participación de la 5-HT (serotonina), neurotransmisor
que interviene en diversas funciones del sistema nervioso central, influyendo en
funciones cerebrales como sueño, función cognoscitiva, percepción sensorial, actividad
motora, regulación de la temperatura, apetito, conducta sexual y secreción de hormonas.
Se sabe que al inhibir la síntesis de esta sustancia, disminuye la proliferación en el
hipocampo y en la ZSV.
El sistema noradrenérgico también está implicado en la neurogénesis del cerebro
adulto. Manipulando este sistema, podemos lograr que las interneuronas en el BO
aumenten su tiempo de vida.
La dopamina influye en la neurogénesis del GD y de la ZSV del cerebro adulto
siendo la que activa los receptores dopaminérgicos de las CPN y promueve así la
proliferación celular.
Hormonas
Los esteroides ováricos y los estrógenos endógenos estimulan la neurogénesis.
Un estudio en ratas demuestra que durante el embarazo la taza de neurogénesis
aumenta en un 65%, alcanzando su auge justo antes del parto.
Factores externos
Medioambientales
La tasa de neurogénesis también depende del microambiente. Se sabe que la
actividad física, los ambientes enriquecidos, la restricción energética y la modulación de
la actividad neuronal entre otros, actúan como reguladores positivos de la neurogénesis.
El aislamiento social, consumo de alcohol, estrés y falta de sueño son factores que
disminuyen la neurogénesis.
Los animales que viven en un ambiente enriquecido presentan un incremento en
la neurogénesis de la capa subgranular del GD. Los animales que viven en condiciones
de estrés tienen una taza baja o nula de neurogénesis debido al efecto de los
glucocorticoides liberados en respuesta al estrés.
Transplante de CPN en el sistema nervioso central lesionado
Estudios demuestran que el cuerpo recibe mejor a las células transplantadas
durante un proceso neurodegenerativo o una lesión porque las poblaciones endógenas
de CPN se encuentran activas.
En un modelo animal de Mal de Parkinson (PD por sus siglas en inglés), se
inyectaron células indiferenciadas derivadas del blastocisto embriónico. Las células se
asemejaban a neuronas dopaminérgicas productoras de tiroxina-hidroxilasa (TH)
después de 14 a 16 semanas. Después de 7 semanas se observó una recuperación
significativa, pero el 20% de los ratones desarrollaron teratomas mortales.
Recuperación de tejido cerebral dañado por la
neurodegenaración causada por la enfermedad de Parkinson: Parte
experimental de la investigación
La enfermedad de Parkinson fue descrita por primera vez por el doctor James
Parkinson en Inglaterra en 1817. Es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que
tiene mayor incidencia en personas de la tercera edad. En algunos casos la enfermedad
puede ser hereditaria, pero en la mayoría de los casos se desconoce su etiología exacta.
Esta patología se presenta cuando el área motora del cerebro se daña o lesiona
y desencadena la inhibición de la producción de dopamina, un importante
neurotransmisor relacionado con el movimiento muscular voluntario, el placer y el estado
de ánimo.
El trabajo del Dr. Oscar Arias Carrión, llevado a cabo en el Instituto de Fisiología
Celular de la UNAM, finalizado en el año 2006, del que trataremos a continuación se
enfatiza en el estudio de una nueva forma de tratamiento para la enfermedad de
Parkinson que consiste principalmente en el transplante de células cromafines, neuronas que pertenecen a la vía eferente simpática (parte del sistema nervioso
periférico), se encuentran en la médula suprarrenal y secretan adrenalina y/o
noradrenalina- seguido de terapia de impulsos magnéticos transcraneales (TMFS por
sus siglas en inglés)
Se reportó al final de la investigación que la destrucción unilateral de la sustancia
nigra (SN), en conjunto con el injerto de células cromafines (CCs) en el cuerpo estriado,
induce la aparición de numerosas células que expresan TH+ en la región que cubre el
ventrículo lateral. Podemos saber que las CPN en la ZSV cambiaron su programa de
desarrollo ya que en cerebros sanos no se encuentran células con marcadores TH en la
zona ventricular. Las células TH+ son capaces de liberar dopamina.
Procedimiento
Lesión de la rata
Se lesiona la rata en una región específica del cerebro llamada sustancia nigra
pars compacta, que es donde se fabrica la dopamina.
Para este fin se anestesia a la rata con ketamina. Se le suministra .25ml a una
rata Wistar de 250g.
Se coloca la rata en el estereotáxico (aparato que sirve para fijar a la rata y medir
coordenadas tridimensionales para insertar una aguja con precisión milimétrica).
Se rasura a la rata, se abre la piel, con bisturí y tijeras de disección. Las
coordenadas estandarizadas para localizar la SN se miden a partir de bregma (unión de
los huesos frontal y parietales).
Coordenadas:
4.80 mm caudales, 1.6 mm laterales y 8.2 mm ventrales.
Se marca un punto sobre la superficie del cráneo que será taladrada usando las
primeras dos coordenadas y luego se inserta un catéter con una aguja muy delgada
hasta la profundidad indicada por la tercera coordenada.
Se le suministra a la rata 4 g de 6-OHDA (6-hidroxidopamina) para lesionar
exclusivamente la SN, junto con .2 g/l de 1-ascorbato para estabilizar la operación.
Usando una micro bomba podemos contar fácilmente con la precisión requerida.
Se deja la aguja unos minutos dentro del animal esperando a que la sustancia de
lesión se asiente en los tejidos para evitar retirarla junto con la aguja.
Después de retirar la aguja se sutura y se le pone un antiséptico a la rata.
Pruebas de conducta de rotación
Para corroborar qué tan efectiva fue la lesión, se llevan a cabo pruebas de rotación
en la rata después de cuatro semanas de que le lesión fue hecha. Éstas se hacen
suministrando anfetaminas que tienen un efecto estimulante en la rata, lo que provoca
que la rata corra en círculos virando hacia el lado lesionado ya que sus funciones motoras
están atrofiadas.
Para inducir la rotación, se le suministra diferentes dosis de anfetaminas que van
de 1 a 5 mg/Kg.
Para medir el número de rotaciones se usa un mecanismo sencillo que consiste
en un arnés amarrado a la rata, y un cable que va del arnés a un medidor que se activa
con cada vuelta completa. Se restringe el área de movimiento de la rata con una pared
redonda.
Otra forma de medir la rotación es dejar a la rata en un espacio abierto y contar
las vueltas manualmente.
Las mediciones entre estos dos métodos pueden ser diferentes debido a todos los
factores de distracción que puede encontrar la rata.
El pico máximo de rotación de la rata con una dosis de 5 mg/Kg es alrededor de
los 50 minutos después de la inyección, es entonces cuando el animal llega a dar
aproximadamente 15 rotaciones por minuto.
Transplante de células cromafines
Se extraen células cromafines del cuerpo de una rata recién nacida. Se ponen en
un cultivo adecuado para mantenerlas con vida.
Se crean 2 grupos, uno con ratas lesionadas en la SN sin transplante de células
cromafines vivas y el segundo grupo con ratas lesionadas en la SN con transplante de
CCs vivas.
El primer grupo tiene subdivisiones según el tratamiento aplicado: 1- Sólo la
lesión.
2- Inserción de la aguja sin inyectar nada. 3- Inyección de 4 l de solución salina
estéril. 4- Inyección de 4 l de medio de cultivo estéril. 5- Inyección de 4 l de medio de
cultivo conteniendo CCs muertas. Ninguno de los procedimientos del grupo 1
aumentaron significantemente el número de proliferación celular en comparación al
grupo que no recibió tratamiento alguno.
Al grupo dos se le injertó una solución, que contenía 1000,000 CCs, en el núcleo
caudado o cuerpo estriado, del mismo lado de la lesión. Con coordenadas a partir de
bregma: 3mm laterales, 5mm ventrales.
Extracción del cerebro de la rata para su estudio
Después de nueve semanas se procedió a extraer los cerebros.
El proceso de extracción de cerebros se debe hacer apropiadamente para
después poder observar las muestras en el microscopio confocal y asegurar resultados
correctos. Si la extracción no se hace como se debe, se pueden llegar a dañar los tejidos.
Lo primero para extraer el cerebro de la rata es anestesiarla profundamente. Es
necesario perfundir el tejido cerebral para eliminar todo rastro de sangre. Ya teniendo a
la rata sedada, se le hace un corte en la cavidad torácica. Se rompe el esternón y se
dobla hacia la cabeza. Lo que estamos haciendo es una disección para llegar al corazón.
Se hacen a un lado todos los órganos que nos estorben la vista del corazón. Se inserta
una aguja de punta chata, por la que introduciremos una solución que conserva intactos
los tejidos, dentro del ventrículo izquierdo, poniendo especial atención en introducirla lo
más que podamos dentro de la arteria aórtica. Se fija con pinzas esta aguja para que no
se salga del corazón al latir. Se pinzan el esófago, la vena cava y la aorta para que toda
la solución fluya hacia la cabeza.
Se cortan las dos aurículas para poder drenar la sangre que queremos expulsar
del organismo. Con ayuda de una bomba de perfusión se bombea esta solución hasta
que ya no salga sangre a través de nuestros orificios de drenaje. Cuando ya hemos
drenado toda la sangre, sacamos la aguja del corazón y procedemos a cortar la cabeza
con la guillotina. Es necesario perfundir el tejido cerebral para eliminar todo rastro de
sangre.
El proceso de extracción del cerebro es sencillo pero debe ser muy meticuloso
para no dañar el órgano. Usando diferentes herramientas de cirugía y disección vamos
rompiendo poco a poco el cráneo, luego separamos al cerebro de la cavidad craneal.
Prueba inmunohistoquímica
Se rebana el cerebro en muestras de 30 m de espesor ayudándonos de un
criostato (aparato que congela las muestras).
Procedemos a hacer la prueba inmunohistoquímica con fin de identificar la
existencia de células que expresen el antígeno TH+, esto quiere decir que sean capaces
de producir dopamina.
Esta prueba se hace sumergiendo las secciones de cerebro en una solución que
contenga anti-TH como anticuerpo. Nos detenemos en este paso durante algunas horas
esperando a que ocurran todas las reacciones bioquímicas que deben marcar a las
células deseadas para poderlas distinguir.
Pasamos las muestras al microscopio confocal y por medio de una iluminación y
filtros especiales, podemos distinguir fácilmente las ahora coloreadas células con
potencial dopaminérgico.
Prueba Electrofisiológica
Otro grupo de ratas a las que se le hizo transplante de CCs, fue sacrificado 4
semanas después del transplante, rápidamente los cerebros son extraídos, tratados para
mantenerlos in vivo y rebanados en muestras de 350 m de espesor. Algunas muestras
fueron sometidas al paso de corriente eléctrica a través de ellas para ver si son
funcionales en la medida que deben.
Prueba de producción de dopamina
Esta es una prueba compleja que consta de varios pasos y reacciones
bioquímicas que al final nos informa sobre la existencia de células dopaminérgicas
mostrándonos un resultado cuantitativo.
Resultados
Pruebas de conducta de rotación
Se notó un cambio en la conducta de rotación de las ratas excitadas por
anfetaminas. Las ratas lesionadas en la SN tratadas con impulsos magnéticos
transcraneales, mejoraron su capacidad motora asimétrica en un .7% comparadas con
su propio control hecho antes del tratamiento, y mejoraron un 25.1% comparadas con un
grupo control lesionado en la SN sin tratamiento de TMFS.
Las ratas que recibieron transplantes de CCs, mostraron una mejora en la
conducta de giro del 38.4%, en comparación con su propio control hecho antes del
transplante, y del 62.8% en comparación con un grupo control lesionado sin recibir
tratamiento de TMFS ni transplante de CCs.
Examen inmunohistoquímico para marcar tiroxina hidroxilasa
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