Download En este trabajo de tesis se investigaron los efectos fungicidas in

Discusión y Conclusiones
En este trabajo de tesis se investigaron los efectos fungicidas in vitro de AEs y se
determinó la CIM en un modelo bidimensional. Los resultados obtenidos fueron utilizados
posteriormente para evaluar la capacidad antitoxigénica de los AEs con mayor capacidad
inhibitoria en los experimentos in vitro sobre la producción de FB1 por Fusarium
verticillioides MRC 826. A continuación se transfirieron los resultados del modelo
bidimensional a un estudio in situ donde se utilizó granos de maíz como sustrato y se
determinó la capacidad inhibitoria del AEC y AEO sobre la toxicogénesis de F.
verticillioides. Además se comparó el efecto de los componentes mayoritarios del AEO y
con el AE completo.
Se caracterizaron los efectos del consumo de FB1 y AEO en modelos de
micotoxicosis subcrónicas inducidos en ratas que ingirieron dietas experimentales. Se
estudiaron las alteraciones histopatológicas producidas por FB1, el AEO y la mezcla. Estos
resultados permitieron correlacionar el comportamiento de la mezcla de AEO y FB1, con
respecto a sus efectos individuales.
5.1. Composición cualitativa y cuantitativa de los AEs seleccionados.
El carvacrol y el timol son los monoterpenos que caracterizan a algunas de las
especies de la familia Lamiaceae, principalmente en los oréganos (Origanum spp.) y los
tomillos (Thymus spp.). Las concentraciones en que estos componentes son encontrados en
las diferentes muestras de los AEs presentan una importante variabilidad debido a la
existencia de gran cantidad de subespecies de Origanum vulgare subsp. hirtum, y a otros
numerosos parámetros significativos que afectan la composición química de esta planta,
principalmente la localización geográfica y las condiciones climáticas y ambientales
(Vokou et al., 1993).
Según lo descripto por Vokou et al. (1993) y Daferera et al. (2003), varios AEs de
Origanum vulgare subsp. hirtum de diferentes orígenes geográficos mostraron que los
73
Discusión y Conclusiones
componentes mayoritarios son el carvacrol, en la mayoría de las muestras estudiadas, el
timol, en un número menor de casos, o una sumatoria de estos dos compuestos fenólicos
conformando entre el 50 y 90% del total del AE. Como componentes secundarios están
descriptos en estos trabajos, el p-cimeno y al γ terpineno en todas las muestras analizadas.
En el presente trabajo de tesis se observaron algunas variaciones en la composición
química del AEO obtenido de plantas regionales, con respecto a lo descrito anteriormente.
Si bien los componentes mayoritarios fueron el timol, el terpineol y el γ terpineno, el
porcentaje del primero fue significativamente menor en comparación a lo informado por
Vokou et al. (1993). La presencia del terpineol estaría relacionado con una vía biosintética
común a la de producción del γ terpineno, el cual es un componente habitual en los AEs de
Origanum vulgare.
El mentol fue el único componente caracterizado del AE de M. piperita utilizado en
esta investigación (de características similares a una droga pura, 95% del total del aceite).
Otros autores han señalado al mentol, como componente mayoritario del AE de M. piperita
(Gherman et al., 2000; Hashem & Sahab, 1999) aunque en cantidades mucho menores,
alrededor del 50% del total del aceite.
La composición cualitativa y cuantitativa del AE de A. triphylla estudiado, coincide
con lo observado por Zygadlo et al. (1994; 1995a) en plantas silvestres y plantas cultivadas
de la provincia de Córdoba. Por otro lado, Ricciardi et al. (1999) informaron que la tujona
y el germacreno son componentes habituales en algunas plantas del género Aloysia,
mientras que la mircenona, no fue descripta anteriormente en esta especie. En cosechas
posteriores, en los AEs extraídos de A. triphylla no se detectó la presencia de mircenona,
mientras que el resto de los componentes se mantuvieron dentro del rango de variabilidad
esperado para esta especie.
5.2. Actividad fungistática de los AEs de Aloysia triphylla, A. polystachya, Mentha
piperita y Origanum vulgare sobre el desarrollo de Fusarium verticillioides MRC 826.
En general se pudo observar que la actividad fungistática de los AEs evaluados
evidenció una diferencia notable en la capacidad inhibitoria de los diferentes extractos
74
Discusión y Conclusiones
vegetales. A pesar de ello, la tendencia en todos los casos evaluados fue un aumento
proporcional de la inhibición en el desarrollo de la cepa fúngica con relación a la
concentración de los AEs administrada al medio de cultivo. El AE de A. polystachya
demostró una actividad inhibitoria significativa en los experimentos en el modelo
bidimensional. En una investigación sobre levaduras, Oliva (2005) informó que el AE de
A. polystachya fue efectivo para la inhibición de Rhodotorula sp., Hansenula sp. y
Cándida albicans en concentraciones de 280 µL/mL de medio de cultivo. No obstante, en
nuestra investigación, a la concentración más elevada utilizada, no se observó actividad
fungicida. Para explicar este comportamiento algunos autores mencionan un fenómeno de
antagonismo entre los diferentes compuestos antimicrobianos (Parish & Davidson, 1993).
Se sugiere que uno de los componentes mayoritarios, la α-tujona se caracteriza por
presentar niveles significativos de toxicidad (Rietjens et al., 2005; Schmid, 1969), es posible
que puedan producirse interacciones con el resto de los componentes del AE, actuando
sobre el mismo sitio activo del organismo blanco y la posible interacción química (directa
o indirecta) entre ellos, podría disminuir su acción como agente fungicida (Larson, 1984).
El limoneno, otro de los componentes mayoritarios de este AE, podría producir el efecto
antagónico mencionado, ya que según informado por Tampieri et al (2005), este
monoterpeno no tuvo ningún efecto apreciable en el desarrollo de Cándida albicans
cuando se lo administró en 1000 ppm en un sistema SAAS.
Aloysia triphylla ha sido empleada en la medicina folklórica debido a sus
propiedades terapéuticas (Valentao et al., 2002; Zamorano-Ponce et al., 2004).En una
investigación realizada por Oliva (2005) en levaduras y bacterias, se observó que el AE de
A. triphylla fue efectiva en la inhibición del crecimiento de levaduras. En este trabajo, el
AE de A. triphylla evidenció una significativa actividad fungistática con respecto a los
otros AEs evaluados. Este AE fue el más efectivo en la inhibición del desarrollo fúngico,
esta capacidad antimicrobiana podría explicarse de dos maneras: una de ellas es por la
actividad de la mircenona y α-tujona, los componentes mayoritarios. La mircenona es un
terpeno cetónico con una estructura química de un monociclo abierto. Este tipo de
estructura facilita una interacción más directa con los componentes de la membrana
fúngica, desorganizando la arquitectura normal de la misma y como consecuencia origina
alteraciones en la permeabilidad selectiva de dicha membrana (Sikkema et al., 1994). La
otra hipótesis que no excluye lo expresado en el párrafo anterior podría originarse a partir
75
Discusión y Conclusiones
de interacciones sinérgicas de los componentes del AE. Este “pool” de sustancias
heterogéneas podrían inhibir en forma secuencial alguna vía bioquímica vital para el
desarrollo del organismo. Otra explicación es que su acción podría deberse a la
combinación de los efectos de estos agentes sobre los sitios activos de la pared celular que
permitirían y favorecerían el ingreso de otros compuestos al interior de la célula (Sikkema
et al., 1995).
En el caso del AE de Mentha piperita, la actividad fungistática fue producida por el
mentol, coincidiendo con lo reportado por otros autores (Ezzat, 2001; Tampieri et al.,
2005). Este terpeno oxigenado cíclico, es parcialmente soluble en agua lo que permite una
mayor interacción en la fase lípido- agua de las membranas de los microorganismos,
aunque los mecanismos de acción para inhibir el desarrollo fúngico no han sido elucidados.
El AE de Origanum vulgare mostró en todos los experimentos realizados una
significativa acción inhibitoria sobre el desarrollo de Fusarium verticillioides MRC 826. Si
bien A. triphylla fue el mejor de los agentes inhibidores estudiados en este trabajo, el AEO
tuvo un comportamiento dosis dependiente con una respuesta lineal para las
concentraciones utilizadas en esta investigación. Estos datos coinciden con lo informado
por Daferera et al. (2003) quienes evaluaron los efectos inhibitorios del AEO sobre los
patógenos de plantas: Botrytis cinerea, Fusarium solani, F. sulphureum y Clavibacter
michiganensis. El autor describe al AEO empleado en este experimento como rico en timol
(aproximadamente el 60% del total del AE) y obtuvo como resultado de su administración,
la inhibición de B. cinerea con una concentración de 200 ppm y a Fusarium spp. con una
concentración de 150 ppm. Cabe aclarar que la cuantificación realizada por Daferera et al
(2003) fue con la aplicación del método de inhibición sobre el crecimiento del diámetro de
la colonia, en medio agar papa dextrosa. Velluti et al. (2004) realizaron una experiencia
similar, utilizando como sustrato agar extracto de harina de maíz e informaron una CIM de
1000 ppm de AEO sobre el desarrollo de F. verticillioides, F. proliferatum y F.
graminearum. En este caso el componente mayoritario encontraso en el AE fue el carvacrol
(alrededor del 70% del total del aceite).
La capacidad antimicrobiana del AEO podría ser atribuida a la presencia de los
compuestos monoterpénicos fenólicos, principalmente timol y carvacrol. Se ha informado
la reactividad de los grupos hidroxilofenólicos, formando enlaces puentes de hidrógenos
con sitios activos de ciertas enzimas (Farag et al., 1989). Además estos compuestos atacan
la membrana citoplasmática del microorganismo destruyendo la capacidad selectiva y
76
Discusión y Conclusiones
permitiendo el escape de componentes intracelulares (Nychas, 1995) lo que sumado a su
capacidad de inactivar enzimas, explicaría la actividad contra el desarrollo microbiano.
5.3. Bioactividad del AEC y AEO sobre la toxicogénesis de Fusarium verticillioides en
semillas de maíz como sustrato.
En esta etapa se evaluó la actividad antitoxigénica del AEC y del AEO en un
modelo que utilizó como sustrato semillas de maíz enteras. El experimento consistió en la
inoculación de las semillas de maíz y la administración a diferentes tiempos de los AEC y
AEO en una concentración constante, para observar los efectos sobre la cinética de
producción de FB1. Los resultados obtenidos en dichas experiencias se utilizaron para tener
una concentración subletal, que no afectara el desarrollo fúngico. Se pudo observar que la
respuesta más significativa a la acción del AEC y del AEO en la toxicogénesis fue a los 20
días de haberse inoculado el sustrato con la cepa fúngica estudiada.
Los resultados obtenidos mostraron que el AEC, en una concentración de 45 ppm
estimuló significativamente la producción de FB1 por F. verticillioides cuando se
administró a los 20 días posterior a la inoculación. Este comportamiento se podría explicar
teniendo en cuenta los siguientes factores: el primero es la respuesta metabólica en la
especie fúngica, a una situación de estrés ocasionada por la inserción de los aceites
esenciales y el segundo factor tiene que ver con las propiedades químicas del extracto
utilizado. Zygadlo et al. (1995b) observaron que los componentes mayoritarios del AEC,
α-tujona, mircenona y algunos de sus isómeros, demostraron actividad prooxidante cuando
fueron agregados en aceites de origen vegetal. La presencia de estos compuestos en el
sustrato de desarrollo de F. verticillioides podría inducir alteraciones en el metabolismo
fúngico facilitando las esterificaciones y oxidaciones involucradas en las etapas finales de
la biosíntesis de fumonisinas. Esto estaría incrementando las oxidaciones de los
precursores de FB1 y dando como resultado un aumento significativo en la producción de
este metabolito secundario, con respecto a las condiciones normales de producción de esta
micotoxina (Sweeney & Dobson, 1999).
77
Discusión y Conclusiones
En este modelo experimental los resultados obtenidos con la administración de
AEO fueron dosis dependiente. De manera similar a lo observado con AEC, el AEO
mostró sus efectos a los 20 días posteriores a la inoculación. Sin embargo en oposición a lo
observado con el AEC, cuando se administró 30 ppm de este AE, la producción de FB1
disminuyó significativamente. Resultados similares fueron informados por Velluti et al.
(2003) quienes analizaron la actividad antifúngica y antitoxicogénica de cinco AEs. Los
autores utilizaron los AEs de canela, clavo de olor, pasto limón, orégano y palo rosa, de los
cuales solo los AEs de canela y orégano fueron efectivos en la inhibición del desarrollo y la
toxicogénesis de F. proliferatum. Estos AEs se caracterizaron por tener un elevado
porcentaje de terpenos fenólicos. Otros autores informaron un significativo efecto inhibidor
de algunos AEs con alto contenido en eugenol carvacrol o timol, (canela, clavo y tomillo)
sobre la toxicogénesis de Aspergillus flavus y A. parasiticus (Jayashree & Subramanyam,
1999; Soliman & Badeaa, 2002).
La actividad antitoxicogénica del AEO fue observada en experimentos posteriores,
sin embargo, como ha sido reportado anteriormente esta actividad es dosis- dependiente.
En otro experimento realizado, se observó que la administración del AEO y sus
componentes mayoritarios en una concentración menor (20 ppm y 4 ppm respectivamente),
tuvieron una respuesta estimulante, en contraste al efecto inhibidor que se había registrado
anteriormente (30 ppm de AEO y 6 ppm de sus componentes mayoritarios). Jayashree y
Subramanyam (1998) informaron un caso similar en donde utilizaron eugenol como agente
antiaflatoxigénico y obtuvo niveles significativos de inhibición de crecimiento y
producción de aflatoxinas. No obstante, cuando administró concentraciones mas bajas,
observaron que este compuesto podía inducir el desarrollo de Aspergillus parasiticus y
estimular la producción del aflatoxinas.
Se comparó, además, el efecto del AEO, del timol y del terpineol, insertados a
diferentes días en concentraciones de 30 ppm y 6 ppm respectivamente. En este
experimento, la actividad antitoxigénica del timol y del AEO, se observó en todos los
tratamientos realizados. El timol demostró ser altamente efectivo en la inhibición de la
toxicogénesis de F. verticillioides, cuando fue administrado en esta concentración, en
comparación con la actividad del AEO. Este comportamiento sería originado por la
complejidad de la composición química del AEO, donde algunos de los componentes
podrían interferir con la acción del timol (Parish & Davidson, 1993). Un ejemplo de este
78
Discusión y Conclusiones
comportamiento inconstante son los datos obtenidos de la administración del terpineol y la
mezcla de timol y terpineol, en estos ensayos, donde no se encontró correlación entre los
días de administración y la acción inhibitoria.
Finalmente, la explicación de la capacidad del AEO de inhibir la toxicogénesis de
F. verticillioides, podría atribuirse a las características antioxidantes que presentan los AEs
con alto contenido en compuestos fenólicos (Tsimidou & Boskou, 1994). En una revisión
sobre la bioactividad de los componentes de los AEs, Zygadlo & Juliani (2000),
informaron que el eugenol, el timol, el isoeugenol y el carvacrol presentaron la acción
antioxidante más importante entre estos componentes. En el AEO utilizado en esta
investigación, el timol fue uno de los compuestos presentes en mayor proporción. Por otra
parte Jayashree & Subramanyam (1999); Thompson et al. (1993) y Torres et al. (2003)
reportaron la actividad antitoxicogénica de antioxidantes sintéticos como el BHT y el
propil parabeno, utilizados en la industria de los alimentos, sobre cepas de A. flavus, A.
parasiticus, F. verticillioides y Penicillium spp. El mecanismo por el cual la capacidad
antioxidante de los compuestos fenólicos (naturales y de síntesis) interfieren con la
producción de FB1 no ha sido aún elucidado. Se piensa que, en la biosíntesis de las
fumonisinas, luego de la condensación de la alanina y de la unión de los grupos metilos vía
s-adenosil metionina transferasa, se suceden oxidaciones y esterificaciones hasta la
formación del producto final (Desjardins et al., 1996). Es en la alteración de la actividad
enzimática involucrada en la metilación y oxidación donde los compuestos fenólicos
intervendrían reduciendo la producción de los precursores de estas toxinas. Como se
explicó anteriormente los compuestos cíclicos con un grupo hidroxil-fenol libre tienen alta
capacidad de enlazarse a sitios específicos de enzimas, interrumpiendo en este caso el
proceso de oxidación. Estos hallazgos sugerirían que la actividad antitoxigénica del AEO
no es acompañada por una inhibición del desarrollo con lo cual el metabolismo primario
del hongo no sería afectado (Praveen Rao et al., 1998).
79
Discusión y Conclusiones
5.4. Perfil nutricional y órganos blanco de acción de FB1 en la micotoxicosis subcrónica
en ratas:
5.4.1. Efectos del consumo de AEO sobre la alimetación
La concentración de AEO utilizada fue de 30 ppm en el alimento, y tuvo efectos directos
sobre la alimentación de los animales. Se pudo observar una significativa disminución del
consumo alimento en el segundo y tercer mes de tratamiento, y este comportamiento
influyó en el resultado de los otros parámetros evaluados. El peso y la ganancia de peso
fueron significativamente menores en este desarrollo experimental. En un estudio realizado
en corderos de corta edad, Villalba y Provenza (1996) reportaron que en determinadas
concentraciones, la ingesta de orégano, produjo en estos animales aversión post –
ingestión, y el rechazo, cuando se suministraba nuevamente el alimento. Bampidis et al.
(2005) examinaron la administración de diferentes concentraciones de orégano en aves de
corral y encontraron que a las más altas concentraciones hubo una disminución
significativa en el consumo de alimento. Por otra parte, en los parámetros bioquímicos, no
se observaron diferencias con respecto a los animales alimentados con la DEC y los
estudios histológicos realizados, no mostraron alteraciones en los órganos estudiados.
5.4.2. Micotoxicosis inducida por el consumo de DEFB1:
La disminución en el consumo de alimentos, ganancia de peso corporal, y peso
corporal registrados en las ratas durante el tercer mes de alimentación con la DEFB1;
concuerdan con los resultados de Dilkin et al. (2003), quienes informaron que la ingestión
de 30 ppm de FB1 durante un mes, producía menores consumo de alimento y ganancia de
peso corporal en cerdos. Además, en un modelo de micotoxicosis subcrónica con FB1 en
ratones, en nuestro laboratorio se han registrado cambios en el consumo de alimentos
durante el tercer mes del esquema de alimentación (Casado et al., 2001). Estas
observaciones indican que FB1 puede inducir modificaciones en los parámetros
nutricionales mediante una acción tóxica acumulativa. Los hallazgos histopatológicos en
los animales que consumieron la DEFB1 podrían estar relacionados con dichos efectos.
Los infiltrados linfocitarios, y el aumento del número de mitosis por base de cripta en
intestino delgado de estos animales, están asociados con un cambio en la funcionalidad
80
Discusión y Conclusiones
intestinal normal, pudiendo existir una menor capacidad de absorción de nutrientes. En este
grupo de animales se observó, además, que hígado y riñón fueron los órganos blanco de
acción de FB1. Las modificaciones en la arquitectura hepática podrían estar también
asociadas con una disminución en la capacidad de conversión de nutrientes y,
consecuentemente, con las variaciones observadas en los parámetros nutricionales de estas
ratas. La presencia de células apoptóticas y de áreas de necrosis en los riñones de ratas
intoxicadas con DEFB1, lograron reproducir las alteraciones histopatológicas renales
inducidas por FB1 que habían sido descriptas por otros investigadores (IPCS, 2000). El
aumento de la actividad FAL sérica de animales intoxicados con DEFB1 podría estar
relacionado con las modificaciones en la histología normal de hígado, intestino delgado y
riñón, identificadas en estas ratas. Aunque el hígado es la fuente principal de FAL, en
ciertos casos en los que se encuentra modificado el metabolismo del intestino, la isoforma
intestinal de la enzima puede contribuir de manera importante a la actividad FAL presente
en suero. Un efecto similar se obtiene cuando existe necrobiosis o necrosis de células
epiteliales de los túbulos contorneados proximales en riñón, las cuales pueden aportar una
fracción importante de la actividad FAL detectada en suero (Kaplan, 1993).
5.4.3. Micotoxicosis inducida por el consumo de DEM:
Los informes acerca de los efectos del AEO en los parámetros nutricionales de
animales son escasos, sin embargo los efectos informados por Daza et al. (2001) no
concuerdan con los datos obtenidos en este trabajo de investigación. Este autor reportó que
una dieta adicionada con 300 ppm de AEs tuvo un significativo efecto positivo sobre la
ganancia de peso en cerdos. Probablemente como fue descrito anteriormente, el efecto que
originó el AEO en la DEM pudo potenciar los efectos de aversión hacia el alimento por las
ratas debido, en parte, a lo informado por Villalba & Provenza (1996) quienes sostienen
que en determinadas concentraciones el AEO produce “rechazo” y además por los efectos
que tuvo la ingestión de FB1 sobre los animales estudiados. La alteración en la histología
de algunos órganos es una expresión de la injuria producida por la ingestión de la toxina, y
este daño probablemente incrementó el malestar causado por este tratamiento. Además, las
determinaciones bioquímicas y los estudios histopatológicos mostraron los mismos efectos
en los animales alimentados con la DEM que las ratas alimentadas con la DEFB1.
81
Discusión y Conclusiones
5.5. Conclusiones
Los AEs de Origanum vulgare, Aloysia triphylla, A. polystachya y Mentha piperita
presentaron diferentes componentes mayoritarios. En el caso de O. vulgare fueron el timol
y terpineol, en Aloysia triphylla mircenona y α-tujona en A. poystachya, α-tujona, carvona
y limoneno y en M. piperita el componente que se identificó, casi en forma exclusiva, fue
el mentol. En cuanto a la evaluación de la bioactividad de estos compuestos el AE de A.
triphylla y de O. vulgare presentaron el mayor efecto inhibidor sobre el desarrollo de F.
verticillioides con una CIM 250 ppm y de 500 ppm respectivamente. Además, sobre
semillas de maíz, solamente el AE de orégano (en una concentración de 30 ppm), es capaz
de inhibir significativamente la producción de FB1 por el hongo, cuando fue insertado 20
días post-inoculación.
De todos los componentes mayoritarios de los AEs estudiados, el timol,
componente principal del AEO, fue el inhibidor más activo de la toxicogénesis de FB1,
cuando fue insertado a 17 días post-inoculación, demostrando mejor actividad inhibitoria
que el terpineol y que el AEO total.
La utilización de los AEs como aditivos para alimentos es una alternativa
interesante porque presenta algunas ventajas con respecto a los compuestos de síntesis
química empleados en la actualidad como antifúngicos. El AEO demostró tener una
significativa actividad en la inhibición del desarrollo de F. verticillioides. Las
concentraciones utilizadas fueron relativamente bajas por lo que los alimentos que reciben
este tratamiento no sufrirían de serias alteraciones en sus características organolépticas. El
proceso de “impregnación” por saturación de vapor del AEO demostró tener actividad
inhibitoria sobre la producción de FB1 cuando se lo administra en una atmósfera confinada.
Los efectos de inhibición del AEO sobre la producción de FB1 son dosis-dependiente y
tiempo dependiente. La correcta administración de las concentraciones es un principio
fundamental para que el tratamiento resulte efectivo. Otro factor importante es que las
semillas sometidas a este tratamiento no se verían afectadas en su capacidad de
germinación en las dosis correctas.
El AEO como agente antimicrobiano y antitoxicogénico presenta dos características
principales: el primer factor es su origen natural que lo convierte en un producto más
82
Discusión y Conclusiones
seguro para las personas y para el medio ambiente que los productos de síntesis empleados
en la actualidad. El segundo factor es el bajo riesgo para el desarrollo de resistencia por
microorganismos patógenos. Es conocido que la probabilidad de que el patógeno desarrolle
resistencia a una mezcla de componentes con, aparentemente, diferentes mecanismos de
actividad antimicrobianos es menor cuanto más compleja sea su composición. Los datos
obtenidos en este trabajo aportan conocimientos con respecto a la eficacia práctica de la
aplicación de aceites esenciales para proteger plantas o productos vegetales sin efectos
fitotóxicos. La Food and Drug Administration de los EE. UU. considera a la planta de
orégano y a sus extractos como sustancias generalmente reconocida como segura (GRAS
del inglés generally recognized as safe) por lo tanto el proceso de aprobación para la
posible utilización de estas sustancias es significativamente menor en relación a un
producto de origen sintético. Nuestra investigación sustenta la posibilidad de implementar
la aplicación de ciertos aceites esenciales para controlar patógenos en cereales
almacenados, tal como F. verticillioides bajo condiciones específicas de aplicación.
83