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Distribuidora de Reactivos y Agentes de Diagnóstico para Laboratorio
Blvd. J. Alonso de Torres 312 PTE. Col. San Jerónimo León Gto.
(477) 718-5948 [email protected]
Inserto Antígeno Prostático Específico Total Elisa
MONOBIND, INC.
ANTIGENO PROSTÁTICO ESPECIFICO (tPSA)
Código de Producto: 2125-300
Intención de uso:
La determinación cuantitativa de la concentración del antígeno prostático específico
total (tPSA) en suero humano por un análisis Inmunoenzimométrico de Microplaca.
Después de que se logre el equilibrio, la fracción anticuerpo-atado es separado del
antígeno desatado por la decantación o la aspiración. La actividad enzimática en la
fracción anticuerpo-atado es directamente proporcional a la concentración nativa
del antígeno. Utilizando diversas referencias del suero de los valores sabidos del
antígeno, una curva de la reacción a cierta dosis puede ser generada de la cual la
concentración del antígeno de un desconocido puede ser comprobada.
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA
El antígeno prostático específico (PSA) es un protease del suero con actividad
parecida al cimotripsin (1.2). La proteína es una glicoproteína de cadena individual
con un peso molecular de 28.4kDA (3). El PSA deriva su nombre de la observación
que es un antígeno normal de la próstata pero no se encuentra en ningún otro
tejido fino normal o maligno. El PSA se encuentra como cáncer de próstata
benigno, malo y metastático. Puesto que el cáncer de la próstata es la segunda
forma más frecuente de enfermedad masculina, la detección de los niveles
elevados de PSA desempeña un papel importante en el diagnostico temprano. Los
niveles del suero de PSA se han encontrado demasiado más útiles que la fosfatasa
ácida prostática (PAP) en el diagnostico y en el manejo de los pacientes debido a
la sensibilidad creciente (4).
En este método, el calibrador de PSA, el espécimen paciente o el control primero
se agrega a un pozo cubierto de streptavidin biotinilado monoclonal y los
anticuerpos etiquetados enzima (dirigidos contra epitopes distintos y diversos de
PSA) se agregan y se mezclan los reactivos. La reacción entre los anticuerpos
varios de PSA y el PSA nativo forma un complejo de sándwich que ata con el
streptavidin cubierto al pozo.
Después de la terminación del período requerido de incubación, el anticuerpo de la
enzima-PSA atada a la conjugación es separada de la conjugación desatada de la
enzima-PSA por la aspiración o la decantación. La actividad de la enzima presente
en la superficie del pozo es cuantificada por la reacción con un sustrato
conveniente para producir color. El empleo de niveles de varias referencias de
suero conocidos del antígeno prostático específico (PSA) permite la construcción
de una curva a la reacción de cierta dosis de la actividad y de la concentración. De
la comparación de la curva a la reacción a cierta dosis, la actividad de un
espécimen desconocido se puede correlacionar con la concentración de PSA.
REACTIVOS
PRINCIPIO
Nota 1: No utilice los reactivos más allá de la fecha de vencimiento del kit.
Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) días cuando están
almacenados en 2-8ºC.
Nota 3: Los reactivos son para una solo microplaca de 96-pozos
ANALISIS INMUNOENZIMOMÉTRICO (TIPO 3):
Los reactivos esenciales requeridos para un análisis inmunoenzimométrico
incluyen una alta afinidad y especificidad de anticuerpos (enzima e inmovilizado),
con reconocimiento diverso y distinto del epítope, en exceso, y el antígeno nativo.
En este procedimiento, la inmovilización ocurre durante el análisis en la superficie
de un pozo en una microplaca con la interacción de streptavidin cubierto en el pozo
y exógeno agregado biotinilado al anticuerpo monoclonal del antígeno de PSA.
Mezclando el anticuerpo monoclonal biotinilado, el anticuerpo enzima-etiquetado y
un suero que contiene el antígeno nativo, resultados de la reacción entre el
antígeno nativo y los anticuerpos, sin competición u obstáculo esteárico, de formar
un complejo soluble de sándwich. La interacción es ilustrada por la ecuación
siguiente:
MATERIAL PROVEEIDO
A. Antígeno específico prostático (PSA) 1ml/vial - frascos del A-F Seis (6)
frascos del antígeno de las referencias PSA en los niveles de 0(A), 5(B), 10(C),
25(D), 50(E) y 100(F) ng/ml. Almacén en 2-8ºC. Se ha agregado un preservativo.
Nota: Los calibradores, basados en suero humano, fueron calibrados usando una
preparación de la referencia, que fue probada contra el 1st IS 96/670.
B. Reactivo Enzima de PSA – 13ml/frasco - Icono
Un (1) frasco que contiene el anticuerpo etiquetado de enzima, biotinilado
monoclonal IgG de ratón en solución, tinte, y preservativo. Almacén en 2-8º
C. Microplaca Cubierta de Streptavidin - 96 pozos - Icono ?
Un microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en un bolso de
aluminio con un elemento deshidratador. Almacén en 2-8ºC.
D. Concentrado de Solución de lavado - 20 ml - icono
Un (1) frasco que contiene un surfactante en salino protegida. Se ha agregado un
preservativo. Almacén en 2-30ºC.
A
E. Substrato A -- 7ml/vial - botella del icono S
Un (1) frasco que contiene el tetrametilbenzidina (TMB) en solución. Almacén en 28ºC.
B
F. Substrato B -- 7ml/vial - botella del icono S
Un (1) frasco que contiene el peróxido de hidrógeno (H2O2) en solución. Almacén
en 2-8ºC.
G. Solución de paro -- 8ml/vial - icono
Un (1) bote que contiene un ácido fuerte (1N H Cl). Almacén en 2-30 ºC.
MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:
1. Pipeta capaz de entregar los volúmenes de 25µl y 50µl con una precisión de
mejor de 1.5%.
2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volúmenes 0.100ml y 0.300ml
con una precisión de mejor de 1.5%.
3. Lavador de Micro placas o una botella del apretón pizeta (opcional).
4. Lector de Micro placa con capacidad de absorbancia con una longitud de onda
de 450nm y 620nm.
5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la microplaca.
6. Plástico envolvente o tapa para la microplaca para los pasos de la incubación.
7. Aspirador de vacío (opcional) para los pasos de lavado.
8. Contador de tiempo.
9. Materiales del control de calidad
PRECAUCIONES
Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a través de la alta afinidad
con la reacción del streptavidin y el anticuerpo biotinilado.
Esta interacción es ilustrada como sigue:
Para el uso de diagnóstico in Vitro no para el uso interno o externo en seres
humanos o animales
Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser
no-reactivos para el antígeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH
1&2 y de HCV por los reactivos con licencia de la FDA. Puesto que ninguna prueba
sabida puede ofrecer el aseguramiento de que los agentes infecciosos están
ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como
potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos
procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden
encontrar en el centro para el control de enfermedad/el instituto nacional de la
salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos," 2da Edición,
1988, publicación No. (CDC) 88-8395 de HHS.
RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION
Los especimenes serán la sangre, suero en tipo y las precauciones generalmente
en la colección de muestras de veni-puntura deben ser observados. Para la
comparación exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno
del suero de la mañana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo
llano de venipuntura de tapón rojo sin los añadidos o anticoagulantes. Permita que
la sangre coagule. Centrifugue el espécimen para separar el suero de las células.
Las muestras se pueden refrigerar en 2-8°C. por un período máximo de cinco (5)
días. Si el espécimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra se
puede almacenar en las temperaturas de -20°C. por hasta 30 días. Evite congelar y
deshelar. Cuando está probado en duplicado, 0.100ml del espécimen se requiere.
Nota: El software de la reducción de datos de la computadora diseñado para los
análisis de ELISA se puede también utilizar para la reducción de datos.
PREPARACION DE LOS REACTIVOS
1. Solución Lavadora (Wash)
Diluya el contenido de la solución de lavado en 1000ml con agua destilada o
desionizada en un envase adecuado de almacenaje. Almacénese a temperatura
ambiente 20-27°C. hasta por 60 días.
2. Solución de Trabajo sustrato
Vierta los contenidos del frasco ámbar dentro del frasco etiquetado con Solución
“A” dentro del frasco transparente que diga Solución “B”. Coloque la tapa amarilla
en el frasco para una fácil identificación. Mezcle y etiquete acordemente.
Almacénese a 2-8°C. Nota: No utilice el sustrato de trabajo si parece azul.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Antes de proceder con el análisis, tenga todos los reactivos, referencias del suero y
controles a temperatura ambiente (20 - 27°C.).
1. Ajuste el formato de los pozos de las microplacas para cada referencia del
suero, control y espécimen del paciente sean probados en duplicado. Coloque
cualquier tira sin usar de micro pozo nuevamente dentro del bolso de aluminio,
séllela y almacénela en 2-8°C.
2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25µl) de la referencia, del control o del espécimen
apropiado del suero en el pozo asignado.
3. Agregue 0.100 ml (100µl) del reactivo de enzima de PSA en cada pozo. Es muy
importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo cubierto.
4. Agitar la microplaca suavemente por 20-30 segundos. Mezcle y cubra.
5. Incube 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Deseche el contenido de la microplaca por la decantación o la aspiración. Si
decanta, cubra, voltee y golpee ligeramente la placa con el papel absorbente.
7. Agregue 300µl del buffer lavador (véase la sección de la preparación el reactivo),
decántelo (golpee contra el papel absorbente o aspírelo). Repita dos (2) veces
adicionales para un total de tres (3) lavadas. Un lavador automático o manual de
placas puede ser utilizado. Siga la instrucción del fabricante para el uso apropiado.
Si se emplea una botella del apretón o pizeta, llene cada pozo presionando el
envase (que evita burbujas de aire) para dispensar la lavada. Decante la lavada y
repita dos (2) veces adicionales.
8. Agregue 0.100 ml (100µl) de solución activadora del sustrato a todos los pozos
(véase la sección de la preparación el reactivo). Agregue siempre los reactivos
en el mismo orden para reducir al mínimo diferencias del tiempo de reacción
entre los pozos.
9. Incube a temperatura ambiente por quince (15) minutos.
10. Agregue 0.050ml (50µl) de la solución de paro a cada pozo y mézclese
suavemente por 15-20 segundos. Agregue siempre los reactivos en la misma orden
para reducir al mínimo diferencias del tiempo de reacción entre los pozos.
11. Lea la absorbancia en cada pozo a los 450nm (con una longitud de onda de
referencia de 620-630nm para reducir al mínimo imperfecciones del pozo) en un
lector de microplaca. Los resultados se deben leer en el plazo de treinta (30)
minutos de agregar la solución de paro.
CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe probar controles en los niveles de rango bajo, normal y
elevado para supervisar el funcionamiento del análisis. Estos controles se deben
tratar como desconocidos y valores determinados en cada método de prueba
realizado. Las cartas del control de calidad se deben mantener para seguir el
funcionamiento de los reactivos provistos. Los métodos estadísticos pertinentes se
deben emplear para comprobar tendencias. La desviación significativa del
funcionamiento establecido puede indicar el cambio inadvertido en condiciones o la
degradación experimental de los reactivos del kit. Los reactivos frescos se deben
utilizar para determinar la razón de las variaciones.
RESULTADOS
Una curva de la reacción a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentración
de PSA en especimenes desconocidos.
1. Registre la absorbencia obtenida del listado del lector del micro placas conforme
al ejemplo 1.
2. Trace la absorbancia para cada referencia duplicada del suero contra la
concentración correspondiente de PSA en ng/ml en el papel de gráfico linear (no
haga un promedio de los duplicados de las referencias del suero antes de trazar).
3. Dibuje la curva a través de los puntos trazados.
4. Para determinar la concentración de PSA para un desconocido, localice la
absorbancia media de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical del
gráfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y lea la concentración (en
ng/ml) del eje horizontal del gráfico (los duplicados del desconocido se pueden
promediar según se indica). En el ejemplo siguiente, la absorbencia media (1.142)
interseca la curva de la reacción a cierta dosis en (23.6ng/ml) la concentración de
PSA (véase el cuadro 1).
Los datos presentados en el ejemplo 1 y el cuadro 1 son ilustrativos solamente y no
se deben utilizar en lugar de una curva de la reacción a cierta preparación de cada
ensayo.
PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD
En orden de que los resultados del análisis sean considerados válidos, deben ser
resueltos los siguientes criterios:
1. La absorbencia (OD) del calibrador F debe ser > 1.3.
2. Cuatro fuera de seis pools del control de calidad deben estar dentro de los
rangos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
A. Funcionamiento del Análisis.
Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo sea llevado a cabo
constante para la reproducción de resultados. El medir con una pipeta de muestras
no debe extender más allá de diez (10) minutos para evitar la deriva del análisis. Si
se utiliza más de una (1) placa, se recomienda para repetir la curva de la reacción
a cierta dosis.
2. La adición de la solución del sustrato inicia una reacción cinética, que es
terminada por la adición de la solución de paro. Por lo tanto, la adición del sustrato
y de la solución de paro debe agregarse en la misma secuencia para eliminar en
cualquier momento la desviación durante la reacción.
3. Los lectores de la placa miden verticalmente. No toque el fondo de los pozos.
4. La falta de remover la solución adherida adecuadamente en los pasos de la
aspiración o de la decantación puede dar lugar a la réplica pobre y a resultados
falsos.
5. Muestras que estén contaminadas microbiológicamente, no se debe utilizar en el
análisis. Lipemica alta o hemolizada del espécimen(es) no debe ser utilizado.
6. Los especimenes de pacientes con concentraciones de PSA sobre 100 ng/ml
pueden ser diluidos (por ejemplo 1/10 o más alto) con el suero femenino normal
(PSA = 0 ng/ml) y ser re-analizados. La concentración de la muestra es obtenida
multiplicando el resultado por el factor de dilución (10).
B. Interpretación
1. Si la reducción de datos controlados de la computadora se utiliza para interpretar
los resultados de la prueba, es imprescindible que los valores predichos para los
calibradores bajen dentro del 10% de las concentraciones asignadas.
2. El PSA se eleva en la hipertrofia prostática benigna (BPH). Clínicamente, un
solo valor elevado de PSA no es valor de diagnóstico como prueba específica
para el cáncer y debe utilizarse conjuntamente con otras manifestaciones clínicas
(observaciones) y procedimientos de diagnóstico (biopsia de la próstata). Las
determinaciones libres de PSA pueden ser provechosas en vista de la
discriminación de BPH y condiciones del cáncer de próstata (5).
RANGOS ESPERADOS Y VALORES
Se espera que los varones sanos tengan valores debajo de 4 ng/ml. (4).
TABLA I
Valores Esperados para la Prueba de PSA de ELISA.
Varones Sanos
<4 ng/ml
Es importante tener en mente que el establecimiento del un rango de valores los
cuales pueden ser esperados para encontrarse por un método dado para una
población de personas “normales” es dependiente a una variedad de factores: la
especificidad del método, la población analizada y la precisión del método en las
manos de los analistas. Por estas razones cada laboratorio debe depender solo de
los rangos de valores esperados establecidos por el fabricante solo hasta que un
rango local pueda ser determinado por los analistas usando el método con un
población indígena al área en la que el laboratorio esté localizado.
E. Especificidad
No se detectó ninguna interferencia con el funcionamiento de Monobind
AccuBind™ PSA Elisa sobre la adición de cantidades masivas de las sustancias
siguientes a un pool humano del suero.
Acido Acetil salicílico
Acido Ascórbico
Cafeina
CEA
AFP
CA-125
hCG
hLH
hTSH
hPRL
100µg/ml
100µg/ml
100µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
10,000 U/ml
1000 IU/ml
10 IU/ml
100 mIU/ml
100 µg/ml
CARACTERISTICAS DE ACTUACION
A. Precisión
La precisión en y entre el análisis del procedimiento de PSA ELISA Microplaca fue
determinada por análisis en tres diversos niveles de los sueros del control. El
número, el valor medio, la desviación de estándar y el coeficiente de variación para
cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 2 y tabla 3.
Muestra
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
TABLA 2
Precisión dentro de la prueba (Valor en ng/ml)
N
X
S.D.
C.V.
20
0.7
0.05
7.1%
20
4.5
0.20
4.4%
20
28.3
1.07
3.7%
TABLA 3
Precisión entre las muestras* (Valores en ng/ml)
Muestra
N
X
S.D.
C.V.
Nivel 1
10
0.8
0.09
11.3%
Nivel 2
10
4.3
0.25
5.8%
Nivel 3
10
27.5
1.42
5.2%
*Según lo medido en diez experimentos en duplicado.
B. Sensitividad
El procedimiento de PSA tiene una sensibilidad de 0.012 ng. Esto es equivalente a
una muestra que contiene 0.5 concentración de ng/ml PSA.
C. Exactitud
El procedimiento de PSA de Monobind fue comparada con un método de referencia
de Elisa. Fueron probados los especimenes biológicos de concentraciones bajas,
normales, y elevadas. El número total de especimenes fue de 241. La ecuación de
la regresión del último cuadro y el coeficiente de correlación fueron computados
para el PSA ELISA en comparación con el método de referencia. Los datos
obtenidos se exhiben en la tabla 4.
Solamente las pequeñas cantidades diagonales entre el procedimiento de
Monobind PSA ELISA en Microplaca y el método de referencia son indicadas por la
proximidad de los valores medios. La ecuación del último cuadro de regresión y el
coeficiente de correlación indica un acuerdo excelente del método.
REFERENCIAS
1. Christensson A, Laurell CB, Lilja H., Eur J Biochem , 194, 755-A.
63 (1990).
2. Watt KW, et. al., Proc Nat Acad Sci USA, 83, 3166-70 (1986).
3. Chen Z, Prestiglacomo A, Stamey T., Clin Chem,, 41, 1273-82
(1995).
4. Wild D, The Immunoassay Handbook., Stockton Press (1994)
p452.
5. Junker R, Brandt B, Zechel C, Assmann G, Clin Chem, 43, 158894 (1997).
6. Prestigiacomo AF, Stamey TA, ‘Physiological variations of
serum prostate antigen in the (4-10 ng/ml) range in male
volunteers.’ J. Urol 1996;155:1977-80.
7. Stamey TA, McNeal JE, Yemoto CM, Sigal BM, Johnstone IM,
‘Biological determinants of cancer progression in men with
prostate cancer.’ JAMA 1999;281:1395-1400.
8. Chen Z, Prestigiacomo A, Stamey T, ‘Purification and
characterization of Prostate Specific Antigen (PSA) Complexed
to a1- Anticymotrypsin:Potential reference Material for
International Standardization of PSA Immunoassays.’ Clin Chem.
1995;41/9:1273-1282.
9. Horton GL, Bahnson RR, Datt M, Cfhan KM, Catalona WJ and
Landenson JH.’Differences in values obtained with two assays
of Prostate Specific Antigen.’ J. Urol. 1988;139:762-72.
10. Stenman UH, Leinonen J, Alfthan H, Rannikko S, Tuhkanen K
and Alfthan O.’A complex between prostate specific antigen and
a1-anticymotrypsin is the major form of prostate specific antigen
in serum of patients with prostate cancer:assay of complex
improves clinical sensitivity for cancer.’ Cancer
Res.1991;51:222-26.