Download TESIS DOCTORAL Funciones biológicas de la fosfolipasa A2

TESIS DOCTORAL
Funciones biológicas de la fosfolipasa A2 independiente de calcio de
grupo VIA en las células humanas U937*
Rebeca Pérez Fernández
Instituto de Biología y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),
Universidad de Valladolid, 47003 Valladolid, España
Fecha de defensa: 13 julio 2006
*Esta es una versión condensada y sin gráficos de la tesis doctoral presentada por Rebeca Pérez Fernández para la obtención
del título de doctor por la Universidad de Valladolid.
serina en el sitio catalítico, son las PLA2 citosólicas
dependientes de calcio (cPLA2), las PLA2 citosólicas
independientes de calcio (iPLA2) y las acetilhidrolasas
del factor activador de plaquetas (PAF-AH) (2,3); la
clasificación de las PLA2 están continuamente
cambiando porque aparecen nuevas proteínas, la última
ha sido la PLA2 de grupo IVD (4).
1. INTRODUCCION
1.1. La familia de las fosfolipasas A2
Las fosfolipasas A2 (PLA2) hidrolizan los ácidos grasos
de la posición 2 de los fosfolípidos (PL), liberándose un
ácido graso y formándose un lisofosfolípido (lisoPL).
Esta reacción es de particular importancia cuando el
ácido graso que se libera es el ácido araquidónico (AA),
porque este ácido puede convertirse en compuestos
biológicamente activos llamados eicosanoides. Entre los
principales eicosanoides están las prostaglandinas (PG),
los leucotrienos y las lipoxinas. El otro producto de la
reacción, el lisoPL sirve de precursor para la biosíntesis
de compuestos biológicamente activos como el factor
activador de plaquetas (PAF) y puede que tenga
actividad biológica por sí mismo.
El AA y los
lisoPL participan en muchas rutas de señalización
provocadas por estímulos extracelulares, para entender
estos procesos es necesario conocer los mecanismos de
acción y regulación celular de las diferentes formas de la
PLA2 que están en las células.
Sin embargo se usa una clasificación más cómoda para
agrupar las PLA2 basándose en sus similitudes
bioquímicas. Según esta clasificación, hay cuatro
familias importantes: las sPLA2, las cPLA2, las PAFAH y las iPLA2. Aunque esta clasificación tiene algún
que otro pero, es la más clásica por su comodidad para
generalizar en cuanto a las propiedades bioquímicas y
también para incluir las PLA2 que no están definidas
claramente.
Hasta el momento en mamíferos la familia de las iPLA2
tiene sólo dos miembros. La mejor estudiada es la
iPLA2-VIA que es la primera iPLA2 para la que se han
visto dos papeles, uno en la homeostasis y otro en la
activación. En esta introducción primero se verá el papel
de la iPLA2-VIA en la homeostasis (5-8); y después los
recientes avances en la regulación de la actividad
enzimática durante la estimulación.
Hasta el momento, 22 proteínas diferentes que poseen
actividad PLA2 se han identificado y clonado en
mamíferos. Según el criterio establecido por Six y
Dennis (1), las PLA2 se clasifican en 14 grupos según la
secuencia de nucleótidos del gen que codifica la enzima,
en algunos de estos grupos hay varios miembros. La
tabla 1 muestra las PLA2 que tienen una histidina en su
sitio catalítico y se conocen como PLA2 secretadas
(sPLA2) (2,3); en la tabla 2 aparecen las PLA2 con una
La otra enzima de la familia de las iPLA2 mamíferas (911) fue identificada en el año 2000 y se la denominó
iPLA2-VIB (1-3); es una enzima con múltiples tamaños
según los distintos tipos celulares en donde está
presente, además su actividad se inhibe con la
1
una inserción de 54 aminoácidos ricos en prolina.
Debido a esta inserción, la serina catalítica cambia a la
posición 519. Las dos isoformas tienen un dominio rico
en glicina antes de la serina catalítica, y es un posible
sitio de unión para la calmodulina que puede contribuir
a la regulación enzimática de la iPLA2-VIA en las
células (ver sección 5.1 y 5.3).
bromoenol lactona (BEL) (12). Esta enzima está
presumiblemente unida a la membrana y muestra muy
poca homología con la iPLA2-VIA en el extremo Nterminal. Sin embargo, hay varias secuencias altamente
conservadas en las dos enzimas en la mitad del extremo
C-terminal, esta última región es responsable de la
actividad enzimática (11). Se conoce muy poco sobre
esta enzima y su función celular (12,13); aunque se sabe
que es capaz de hidrolizar una gran variedad de ácidos
grasos en la posición 2 de la fosfatidilcolina (PC), lo que
indica que posee actividad PLA2. Murakami et al.
transfectando esta enzima en células HCA-7 han visto
que aumenta la hidrólisis de la membrana celular y la
producción de PG (13).
Dos de las variantes de la iPLA2, la anquirina-1 y la
anquirina-2, poseen los dominios repetidos de anquirina,
pero carecen de actividad enzimática ya que no poseen
el sitio activo. Se piensa que estas proteínas actúan
como inhibidores de las variantes activas (ver sección
5.4). La quinta variante de la iPLA2-VIA es la iPLA2VIA-3 que es idéntica a la iPLA2-VIA-2 excepto en el
extremo C-terminal que está truncado por la presencia
de un codón de terminación prematuro. La iPLA2-VIA3 contiene la secuencia lipasa y probablemente posea
actividad enzimática, aunque esta actividad no se ha
comprobado experimentalmente.
Recientemente en las bases de datos se han encontrado
tres nuevas proteínas que contenían el nucleótido y la
secuencia consenso de las lipasas igual a la de la iPLA2VIA. Las tres poseen actividad PLA2, pero también
poseen actividades triacilglicerol lipasa y acilglicerol
transacilasa (14). No se ha determinado, si estas tres
proteínas pueden considerarse verdaderas enzimas
PLA2, o son lipasas generales con amplia especificidad.
Además de la actividad fosfolipasa, la iPLA2-VIA tiene
otras actividades como la actividad lisofosfolipasa y la
actividad fosfolipídica transacilasa. Si se miden las tres
actividades en condiciones similares la actividad
fosfolipasa es significativamente mayor que las otras
dos (21). La iPLA2-VIA no muestra especificidad por el
ácido graso que está presente en la posición 2 del PL ni
por el grupo de cabeza polar presente en la posición 3
del PL. Otra característica de esta enzima es que puede
hidrolizar PAF y PLs oxidados imitando la acción de las
PAF-AH (15).
1.2. Estructura y características de la iPLA2-VIA
La iPLA2-VIA fue purificada y clonada en diferentes
mamíferos (15-19) y se ha clasificado como iPLA2 de
grupo VIA (1). Aunque esta enzima no tiene una
secuencia homóloga con la cPLA2α las dos enzimas
comparten características bioquímicas, como son la
localización citosólica en células sin activar, una masa
molecular en torno a 85 kDa y la presencia de una serina
catalítica. Pero se diferencian en que la cPLA2α
hidroliza los PL que contienen AA, mientras que la
iPLA2-VIA no muestra preferencia por el ácido graso
sobre el que se produce la hidrólisis. En algunos
artículos se refieren a la iPLA2-VIA como iPLA2β (20)
o, simplemente iPLA2.
1.3. Inhibición de la iPLA2-VIA
La iPLA2-VIA se inhibe por compuestos como BEL
(15,22), metil araquidonil fluorofosfonato (MAFP)
(16,23), trifluorometil cetona y tricarbonilo (22,24). De
entre todos, sólo el BEL es selectivo para las iPLA2
frente a las otras PLA2s (25,26), y esta selectividad ha
permitido definir los posibles papeles de la iPLA2 en el
funcionamiento celular. Hay que señalar sin embargo,
que cuando se utiliza el BEL sobre las células, éste
interacciona con otras muchas enzimas celulares además
de la iPLA2-VIA (6,15), y esto se debe tener en cuenta
cuando se interpreten resultados basados únicamente en
la inhibición por BEL. Además de la iPLA2-VIA se
inhiben por BEL la quimotripsina y otras proteasas (27),
la fosfatidato fosfohidrolasa dependiente de magnesio
La iPLA2-VIA tiene al menos 5 diferentes variantes de
procesamiento (Fig. 1). Dos de ellas se ha demostrado
que poseen actividad enzimática y son la VIA-1 y VIA2. La iPLA2-VIA-1 es una enzima de 85 kDa con 8
dominios de anquirina en la mitad del extremo Nterminal seguidos de la secuencia GXSXG común a
muchas lipasas que contiene a la Ser465, que es el
aminoácido catalítico del sitio activo. La iPLA2-VIA-2
es casi idéntica a la iPLA2-VIA-1 excepto porque el
dominio de la octava anquirina se ve interrumpido por
2
observado en estos animales es que los machos
producen espermatozoides con menor movilidad, lo que
disminuye de forma importante su fertilidad (45).
(PAP-1) (28-31), la anandamida hidrolasa (32) y la
iPLA2-VIB (10).
Para distinguir los efectos que provoca el BEL sobre la
iPLA2-VIA frente a los que provoca sobre las PAP-1, se
ha usado con cierto éxito el propranolol (33). El
propranolol a concentraciones relativamente altas (e 150
µM) inhibe la fosfohidrolasa pero no la iPLA2-VIA, es
decir, si un proceso se inhibe por BEL, pero no por
concentraciones elevadas de propranolol se puede
descartar la participación de la PAP-1. Aunque
descartemos la participación de la PAP-1 no confirma
que el efecto se deba a la iPLA2-VIA.
1.4. Funciones homeostáticas
El AA es un ácido graso importante a nivel fisiológico
que no entra en los PL celulares por acilación de glicerol
fosfato/dihidroxiacetona fosfato o ácido lisofosfatídico
(es decir, por la ruta de novo); lo hace en una etapa
posterior por acilación de aceptores lisofosfolipídicos
preexistentes (ciclo de Lands). Los lisoPL se producen
por la acción de las PLA2 sobre los PL, esta clase de
enzimas juega un papel clave en la incorporación de AA
dentro de los PL. La incorporación inicial de AA dentro
de los PL tiene lugar principalmente en la PC; lo que
señala a la lisofosfatidilcolina (lisoPC) como el aceptor
lisofosfolipídico (46). En muchas células, los niveles
basales de lisoPC se mantienen por la acción de la
iPLA2 sobre los fosfolípidos celulares (6); esto se vio
porque una disminución en la actividad de la iPLA2
provocaba una disminución de la producción de lisoPC
y como consecuencia se inhibía la incorporación de AA
dentro de los PL.
Recientemente, Jenkins et al. (34) separaron el BEL en
dos enantiómeros y vieron que el isómero S es más
potente sobre la iPLA2-VIA que sobre la iPLA2-VIB.
Por el contrario, el isómero R inhibe a la iPLA2-VIB
más que a la iPLA2-VIA (34). Por lo tanto el uso de
enantiómeros podría ser una importante herramienta
para diferenciar las contribuciones de la iPLA2-VIA y la
iPLA2-VIB sobre un determinado proceso celular (34).
El uso combinado de BEL y de otros inhibidores de la
serina catalítica, como el MAFP y la trifluorometil
cetona sirve para determinar si en un proceso participa
la iPLA2-VIA. Si una reacción es inhibida por el BEL y
no por el MAFP o por la trifluorometil cetona, implica
que no está envuelta la iPLA2-VIA y es otra actividad
iPLA2 desconocida la responsable de estos efectos. Una
actividad iPLA2 sensible al BEL y no al MAFP se
detectó en las células del túbulo proximal del riñón (35).
Resultados negativos con el MAFP y con
la
trifluorometil cetona se interpretan como una falta de
participación de la cPLA2α.
Cuando el AA se ha incorporado dentro de la PC por la
acción de la aciltransferasa dependiente de CoA hay una
remodelación de dicho ácido hacía otros lisoPL,
principalmente a la lisofosfatidiletanolamina (lisoPE),
en un proceso que tarda varias horas, y está dirigido por
la transacilasa independiente de coenzima A (CoA-IT)
(46). Para la eficiente incorporación de AA dentro de los
PL, deben de estar disponibles en las células al menos
dos clases de aceptores lisofosfolipídicos.
Estudios de la incorporación de AA dentro de los PL en
macrófagos de ratón han demostrado que este proceso es
independiente de calcio (47), y se pensó que la actividad
PLA2 responsable de la producción de aceptores
lisofosfolipídicos para la incorporación de AA podría
deberse a la enzima iPLA2 (47). Estudios posteriores en
macrófagos de ratón P388D1 demostraron que esta
actividad pertenecía a la iPLA2-VIA (36,48). En
diferentes sistemas celulares, como neutrófilos humanos
(49), células ductales de submandibula de rata (50), y
células estromales uterinas de rata (51); se llegó a la
misma conclusión.
Como el uso de inhibidores químicos no da respuestas
definitivas al papel de la iPLA2-VIA en procesos
celulares, se han buscado otras técnicas más selectivas
para inhibir la iPLA2-VIA. Se han empleado técnicas de
oligonucleótidos antisentido (36-39) y de RNA de
interferencia (40,41), con ellas se ha visto que en ciertas
condiciones son técnicas útiles para bloquear
específicamente la iPLA2-VIA. Además se ha usado con
éxito células que sobreexpresan la iPLA2-VIA (42-44).
Recientemente, se han diseñado ratones con una
interrupción del gen que codifica para la iPLA2-VIA
(45). Los estudios con estos ratones serían de gran ayuda
para confirmar la importancia de la iPLA2-VIA en
condiciones fisiopatológicas. Es importante indicar que
hasta ahora, el único defecto fenotípico que se ha
La contribución de la iPLA2-VIA en el mantenimiento
de las reservas de lisoPL para facilitar la incorporación
3
ninguna de las PLA2s identificadas previamente; aunque
como la respuesta es independiente de calcio se piensa
en la participación de una iPLA2 diferente a la de grupo
VI. Todos estos experimentos se hacen con
concentraciones
de
inhibidores
que
inhiben
completamente la correspondiente actividad PLA2
(53,54), y así se evita que exista alguna actividad PLA2
residual que pueda proveer de lisoPE a la CoA-IT.
de AA parece depender del tipo celular. En estudios de
inhibición de iPLA2 con BEL, la contribución de la
enzima va desde el 90 % en células ductales de
submandibular de rata (50), al 50-60 % en células
fagocíticas (36,48,49), y sólo al 20-25 % en células
estromales uterinas de rata (51). Las células deben
poseer otros mecanismos, además de la iPLA2-VIA,
para generar y mantener los niveles apropiados de
aceptores lisofosfolipídicos.
En islotes pancreáticos de rata (30), la inhibición de la
iPLA2 con BEL no disminuye la incorporación de AA
dentro de los PL; sin embargo en estas células la
iPLA2-VIA contribuye al menos en un 20 % en los
niveles basales de lisoPL, por lo que en los islotes la
enzima tiene una importante actividad housekeeping.
Recientes estudios de incorporación de AA en células
que sobreexpresan la iPLA2-VIA demuestran que el
exceso de lisoPL producido en estas condiciones, no
incrementa la tasa de incorporación de ácidos grasos
(52). Con estos datos se llega a la conclusión de que es
necesario un nivel umbral de lisoPL para mantener la
incorporación de AA dentro de los PL. El incremento de
los lisoPL celulares por encima de este nivel umbral no
aumenta la incorporación de AA, por lo que la
incorporación de AA dentro de los PL en estas células
depende de otros factores además del de la
disponibilidad de lisoPL.
1.5. Mecanismos de regulación de la actividad iPLA2
Durante la señalización celular poco se sabe de como las
células controlan y regulan la actividad iPLA2-VIA,
mientras que hay mucha información disponible de los
mecanismos de activación de la cPLA2a por ejemplo
por calcio o por fosforilación mediada por MAP
quinasas (55). Debido a que las células poseen
diferentes variantes de procesamiento de la iPLA2-VIA
(6), es posible que la enzima esté regulada por múltiples
mecanismos que serán distintos según el tipo celular y
las condiciones de estimulación (56).
En diferentes estudios se ha visto que en las células
activadas hay un aumento de la actividad iPLA2 tanto
en las fracciones subcelulares como en los
homogeneizados (38,57-61). Estos estudios vislumbran
la posibilidad de que en ciertas condiciones la iPLA2
sufra cambios que modifiquen su actividad específica
y/o su localización subcelular. Se han propuesto varios
mecanismos para explicar la activación de la iPLA2 en
diferentes condiciones, y los mejores descritos se
discuten a continuación:
En células U937 sin activar, así como en los macrófagos
P388D1 y neutrófilos (36,48,49), la incorporación de
AA dentro de los PL es independiente de calcio e
inhibible por BEL. Pero el BEL inhibe parcialmente la
incorporación de AA, por lo que debe existir otro
camino independiente de calcio en el que no participe la
iPLA2-VIA sensible a BEL.
1.5.1. Ca2+/calmodulina - Se ha sugerido que la iPLA2VIA interacciona in vitro con la calmodulina si hay
Ca2+ (62). En presencia de Ca2+, la calmodulina se une
a la iPLA2-VIA e inhibe su actividad enzimática. En
ausencia de Ca2+, la calmodulina se separa y no inhibe
a la iPLA2-VIA (62). Se ha identificado cerca del
extremo C-terminal de la iPLA2-VIA una región de 15
kDa (aminoácidos 694-705) que participa en la unión de
la calmodulina a la iPLA2-VIA en presencia de Ca2+
(62). Aunque no se puede descartar que existan otros
sitios de unión para la calmodulina dentro de la iPLA2VIA.
En muchos tipos celulares, después de la incorporación
de AA principalmente en PC, hay una lenta
transferencia del ácido graso hacía fosfatidiletanolamina
(PE) gracias a la acción de la CoA-IT sobre los PL
celulares (46). Una PLA2 es la responsable de proveer
aceptores lisofosfolipídicos para las reacciones de
remodelación conducidas por la CoA-IT (46). La
naturaleza de esta PLA2 se ha investigado en
macrófagos P388D1 (53) y en linfocitos T (54)
midiendo la transferencia de AA de PC a PE en
presencia de distintos inhibidores de las PLA2. Se
usaron los inhibidores de la cPLA2 (MAPF), de la
iPLA2 (BEL) y de la sPLA2 (LY311727); ninguno de
ellos provocó cambios en la transferencia de AA de PE a
PC. Por lo tanto la PLA2 envuelta en este proceso no es
1.5.2 Fosforilación - Aunque no se han descrito
secuencias consenso de fosforilación en la iPLA2-VIA
(15-18), existen varios estudios que señalan que en la
regulación de la actividad enzimática de la iPLA2-VIA
4
1.5.4 Oligomerización mediada por dominios de
anquirina - Una característica importante de la iPLA2VIA es la presencia en la mitad del extremo N-terminal
de la proteína, de siete u ocho dominios idénticos de
anquirina (siete en la variante VIA-2 y 8 en la variante
VIA-1); esta repetición de anquirinas facilita la
interacción proteína-proteína (67). En experimentos de
inactivación por radiación se demuestra que las especies
activas de iPLA2-VIA son tetrámeros (68); si se
eliminan las anquirinas eliminando los 150 primeros
aminoácidos de la iPLA2-VIA, la enzima se inactiva
(15). Probablemente la repetición de anquirinas permita
la oligomerización y la expresión total de la actividad
iPLA2-VIA. Hay muchas células que expresan
fragmentos de la proteína iPLA2 truncada y aún
teniendo las anquirinas repetidas no tienen actividad,
estos fragmentos actúan como reguladores de la iPLA2VIA y lo que hacen es impedir la oligomerización de los
fragmentos activos a través de las anquirinas (17,69). Se
ha comprobado que al transfectar uno de estos
fragmentos inactivos en la iPLA2-VIA se reduce de
manera importante la actividad de la enzima activa
(17,69). Con los últimos estudios de Manguikian y
Barbour se reafirma este modelo de regulación de la
actividad de la iPLA2-VIA (70), estos estudios
demuestran por inmunoprecipitación la asociación de los
fragmentos inactivos de la iPLA2-VIA a la iPLA2-VIA
activa (ver sección 6.1).
participan reacciones de fosforilación. Es posible que no
ocurra una fosforilación directa de la iPLA2-VIA, sino
una fosforilación de una proteína reguladora asociada a
la iPLA2-VIA. Se puede pensar que una quinasa actúe
como cofactor, independientemente de su actividad
quinasa intrínseca, para la activación de la iPLA2-VIA
(esto ya se describió con la proteína quinasa C que
regula la fosfolipasa D (PLD)) (63). Recientemente se
ha visto en las células β de los islotes pancreáticos que
la
proteína
quinasa
IIβ
dependiente
de
Ca2+/calmodulina interacciona con la iPLA2-VIA y el
resultado de esta asociación es que las actividades de las
dos enzimas aumentan (64). Como se sabe que la
iPLA2-VIA interacciona directamente con la
calmodulina (ver sección 5.1) parece interesante
descifrar los mecanismos de regulación de la interacción
de estas tres proteínas.
En un estudio en los promonocitos U937 estimulados
con interferon-γ (65) se activa la iPLA2-VIA gracias a la
proteína quinasa C. Ya se había descrito que en los
macrófagos P388D1 estimulados con zimosan la
proteína quinasa C regula a la iPLA2-VIA (39), y se
piensa que la traslocación de la iPLA2-VIA a fracciones
de membrana se debe a la isoforma α de la quinasa (66).
También la isoforma ε de la proteína quinasa C participa
en la asociación de la iPLA2 a las fracciones de
membrana (57). Pero no se sabe si la actividad iPLA2 de
este estudio pertenece a la iPLA2-VIA o a otra enzima.
1.5.5 Procesamiento proteolítico - Otra característica
importante de la iPLA2-VIA es la presencia de varias
secuencias de ruptura por caspasas (DXXD), al menos
las células usan tres de esas secuencias, formándose
fragmentos de la iPLA2-VIA con mayor actividad
biológica. Atsumi et al. (71,72) demuestran que una
ruptura dentro de la primera anquirina cerca del extremo
N-terminal, por el Asp183 de la iPLA2-VIA (ver figura
2), produce una proteína de 70 kDa con mayor
funcionalidad biológica.
En células vasculares del músculo liso estimuladas con
trombina hay evidencias de que la p38 MAP quinasa
participa en la regulación celular de la iPLA2-VIA. En
estas células la iPLA2-VIA participa en los procesos de
liberación de ácidos grasos y de síntesis de DNA (58),
estos procesos se bloquean cuando se usan inhibidores
de p38 MAP quinasa. La trombina incrementa la
actividad de la iPLA2 en los extractos celulares, y este
aumento también se inhibe si los extractos se preparan
con células tratadas con inhibidores de MAP quinasa
(58).
Lauber et al. han identificado los otros dos sitios de
ruptura por caspasas que producen proteínas activas
(73). El primero de ellos está muy cerca de la serina
catalítica, y el segundo está próximo al extremo Cterminal de la molécula (ver Fig. 2). La ruptura por
caspasa de los dos sitios produce un fragmento de 24-26
kDa, y la ruptura sólo del primer sitio produce un
fragmento de 32 kDa. Estos fragmentos se corresponden
a los aminoácidos 514-806 y 514-733 de la secuencia de
la iPLA2-VIA-2 representada en la figura 2 y a los
aminoácidos 459-752 y 459-679 en la secuencia de la
1.5.3 ATP - En ciertas condiciones en ensayos in vitro
(18), la actividad específica de la iPLA2-VIA es mayor
en presencia de ATP. La secuencia GXGSXG rica en
glicinas se encontró en dos variantes activas de la
iPLA2-VIA. Los efectos del ATP no siempre se han
podido demostrar (15), y otros autores afirman que el
ATP no activa directamente la iPLA2 sino que evita que
la enzima pierda su actividad (21).
5
y a la CTP: fosfocolina citidilil transferasa (CT) que es
la enzima que regula la síntesis de PC. Cuando en
distintos tipos celulares se ha sobreexpresado la CT se
ha visto un incremento en la síntesis de PC, pero la masa
de PC no aumenta si hay un incremento de la
desacilación vía iPLA2 (75,76).
iPLA-VIA-1. La sobreexpresión de los dos fragmentos
aumenta la producción de lisoPC mediada por la iPLA2VIA (73), esto último llama la atención debido a que los
dos fragmentos carecen de anquirinas y estudios
recientes de mutagénesis han establecido que para que
exista actividad enzimática son necesarias las anquirinas
(15).
Barbour et al. (75) destacaron que tanto la actividad
como la masa de la iPLA2-VIA se regulan por el
incremento de la síntesis de PC al sobreexpresar la CT.
En trabajos posteriores se vio que la iPLA2-VIA
participa en la regulación del ciclo celular (70,77), y se
estudió el mecanismo que regula a la enzima en estas
circunstancias (70). Durante la proliferación de las
células T, la actividad iPLA2-VIA es más alta en la fase
G2/M; cuando se tratan las células con BEL o con un
oligonucleótido antisentido específico para la iPLA2VIA se reduce la división celular (77). Esto se comprobó
en las células CHO-K1 (70); en estas células, la
actividad iPLA2 máxima se da durante la fase G2/M y
durante la fase S tardía, mientras que la actividad es
menor en la transición de G1/S a la fase S temprana
(70). Como se esperaba, cuanto mayor es la
acumulación de PC menor es la actividad iPLA2. Los
cambios en la actividad de la iPLA2-VIA durante el
ciclo celular pueden deberse a la expresión de las
variantes de procesamiento inactivas de la iPLA2-VIA
que interfieren en la oligomerización normal de la
iPLA2-VIA (70).
Otros estudios señalan que pueden existir otras rupturas
de la iPLA2-VIA a través de otras proteasas que no sean
caspasas. En las células INS-1 832/13 sensibles a
glucosa, en las células INS-1 y en los islotes
pancreáticos, la forma predominante de iPLA2 es una
forma de 70 kDa y no la clásica iPLA2-VIA de 85 kDa
(74). Si se analiza el mapa tríptico de la forma de 70
kDa aparecen fragmentos idénticos a los que se obtienen
después de realizar una digestión tríptica de la clásica
enzima de 85 kDa, lo que indica que las dos enzimas
deben de estar relacionadas. Como la proteína de 70 kDa
no parece que proceda de un mecanismo de
procesamiento alternativo, podemos pensar que deriva
de un mecanismo de procesamiento proteolítico aún
desconocido que tiene lugar en la mitad del extremo Cterminal de la molécula (74). Esta variante de 70 kDa es
activa y se piensa que en las células β nativas los
papeles biológicos que se atribuyen a la clásica iPLA2VIA de 85 kDa (ver sección 6.4) podrían deberse a la
forma de 70 kDa (74).
Con estos datos se piensa que las alteraciones en la
actividad y/o en la expresión de la iPLA2-VIA pueden
tener importantes efectos sobre el metabolismo
fosfolipídico y afectar al crecimiento celular. Este papel
de la iPLA2-VIA en la regulación del metabolismo de la
membrana fosfolipídica no se observa en todos los tipos
celulares; debido a que en algunas células la iPLA2-VIA
no parece que controle la desacilación de la PC (30,52);
y puede que este papel lo cumplan otras enzimas PLA2.
1.6. Funciones de señalización celular
La iPLA2-VIA es una enzima que participa en la
regulación homeostática de las reacciones de
desacilación/reacilación, pero hay muchas evidencias de
la participación de la enzima en la señalización celular.
Para conocer los papeles de señalización en los que
interviene la iPLA2-VIA, además del BEL, se utilizan
otras herramientas como la inhibición de la expresión de
la iPLA2-VIA por oligonucleótidos antisentido, el RNA
de interferencia, y la sobreexpresión estable y transitoria
de la enzima. Los resultados que implican a la iPLA2VIA no se justifican sólo con el BEL sino también con
alguna otra de las otras herramientas citadas.
1.6.2 Biosíntesis de eicosanoides - Los eicosanoides son
una familia de compuestos que derivan de la
oxigenación del AA y participan en la reacción
inflamatoria. Para buscar las rutas bioquímicas que
durante la inflamación producen eicosanoides ha sido de
gran utilidad el diseño de ratones knockout sin cPLA2α
(78,79). Estos animales sin cPLA2α no muestran
respuesta inflamatoria, lo que demuestra que esta
enzima tiene un importante papel en la biosíntesis de
eicosanoides durante la inflamación (55,79,80).
1.6.1 Crecimiento celular - En las membranas celulares
de los mamíferos la PC es el PL más abundante y juega
un importante papel estructural. Para mantener la
homeostasis de la PC se necesita regular distintas rutas
catabólicas y biosintéticas. En algunas células, los
niveles de PC se mantienen gracias a la iPLA2-VIA (11)
6
Se ha visto que la enzima no muestra preferencia hacia
el ácido graso que hidroliza en la posición 2 del PL; y es
capaz de hidrolizar prácticamente a cualquier ácido
graso, incluso el ácido acético y ácidos grasos oxidados
(15), al activarse la iPLA2-VIA además del AA se
liberarán otros ácidos grasos (58,71,72,87).
Las células fagocíticas participan en las reacciones
inflamatorias. En estas células la movilización de AA
provoca la biosíntesis de eicosanoides a través de
receptor o por agonistas solubles sobre los que el BEL
no tiene ningún efecto; en este proceso la iPLA2-VIA
no jugaría ningún papel. Entre estas células están los
macrófagos P388D1 estimulados con PAF y zimosan
(26,81), las células mesangiales estimuladas con
peróxido de hidrógeno (H2O2) (82), los macrófagos
peritoneales estimulados con lipoproteína oxidada (83),
los neutrófilos humanos estimulados con péptido
formilo (84) y los promonocitos U937 estimulados con
ionóforo de calcio o con concanavalina A (Con A)
(31,53).
En las células HEK293 transfectadas con la iPLA2-VIA,
el ionóforo de calcio aumenta la liberación de AA, y
este AA se transforma en PG gracias a la
ciclooxigenasa-1 (COX-1) (42,88); sin embargo, en
respuesta a interleuquina-1β no se produce el mismo
aumento en la liberación de AA; lo que indica que
dentro de la misma célula pueden existir múltiples
mecanismos que liberan AA (42). Un resultado
llamativo es que el ionóforo de calcio aumente la
liberación de ácidos grasos y la producción de PG
cuando las células se transfectan con la iPLA2-VIA,
esto hace pensar que en algunas condiciones la enzima
se podría regular por calcio o por factores dependientes
de calcio (ver sección 5.1 y 6.8). La sobreexpresión de
la iPLA2-VIA en cultivos celulares es posible que no
refleje la verdadera regulación in vivo de esta enzima,
ya que en células con niveles normales de iPLA2-VIA
tratadas con ionóforo de calcio la liberación de AA no
varía en presencia de BEL (31,53,89).
Otros trabajos señalan que en ciertas condiciones, la
movilización de AA y la producción de eicosanoides si
que podrían estar controladas por la iPLA2-VIA. Por
ejemplo, si los macrófagos RAW 264.7 estimulados con
óxido nítrico (85) o los neutrófilos estimulados con
ionóforo de calcio (86) se tratan con BEL, disminuye la
movilización de AA, lo que induce a pensar en la
participación de una iPLA2 sensible a BEL; pero debido
a que el BEL no es específico para la iPLA2-VIA (6,15)
estos datos se deben comprobar por otros mecanismos.
En dos estudios recientes, con macrófagos P388D1
estimulados con zimosan (38) y con promonocitos U937
estimulados con interferon-γ a través del receptor Fcγ-RI
(65), se han encontrado indicios de la participación de la
iPLA2-VIA en la movilización de AA y en producción
de PG debido a que la inhibición de la iPLA2-VIA por
BEL o por oligonucléotidos antisentido específicos para
la iPLA2-VIA, disminuye la movilización de AA y la
producción de PG.
La iPLA2-VIA en las células pancreáticas tratadas con
D-glucosa más carbacol regula la liberación de AA y la
producción de prostaglandina E2 (PGE2) (90). Si se
sobreexpresa la iPLA2-VIA aumenta la liberación de
AA, el tratamiento de las células con BEL inhibe dicha
liberación (43,90,91).
1.6.3. Apoptosis - Atsumi et al. (71,72) pensaron que la
iPLA2-VIA podría jugar algún papel durante la
apoptosis. El tratamiento de los promonocitos U937 con
ligando de fas o con factor de necrosis tumoral α
(TNFα) más cicloheximida, produce la apoptosis de las
células y demuestra la participación de la iPLA2-VIA en
la liberación de distintos ácidos grasos (71,72). En las
células U937 la apoptosis se asocia con la ruptura de la
iPLA2-VIA por la caspasa-3, una proteasa que actúa en
algunas rutas de la apoptosis. El resultado de esta
ruptura es que la iPLA2-VIA pierde su región Nterminal, lo que provoca que la enzima sea más activa y
se acelere así la destrucción de la membrana
fosfolipídica (72). Si se inhibe la iPLA2-VIA con
MAFP disminuye la apoptosis temprana, aunque el
MAFP no tiene efecto a tiempos largos (72). Se piensa
que la iPLA2-VIA participa en la producción de las
En los promonocitos U937 tratados con PAF los
mecanismos de regulación del AA se deben a la
cPLA2α (65), lo que indica que en un mismo tipo
celular pueden existir distintas PLA2 que regulen la
movilización de AA. Atsumi et al. (71,72) fueron los
primeros en señalar que podría existir una colaboración
entre las dos enzimas. La activación de estas PLA2
podría depender del tipo celular y de los estímulos. Otra
posibilidad sería que en ciertas condiciones de
estimulación existan interferencias entre la iPLA2-VIA
y la cPLA2α, y la inhibición de la iPLA2-VIA afectaría
a la actividad de la cPLA2α.
En células de origen no leucocitario se ha estudiado la
participación de la iPLA2-VIA en la producción de PG.
7
La secreción de insulina estimulada por glucosa en
células pancreáticas β y en otras líneas celulares
relacionadas, aumenta la hidrólisis de PL (30,74). Se
cree que en este proceso participa la iPLA2-VIA, ya que
si se tratan las células con BEL se inhibe tanto la
hidrólisis de PL como la secreción de insulina (74). En
las células INS-1 transfectadas con la iPLA2-VIA
(43,91) el tratamiento con agentes que aumentan el
AMPc aumenta la receptividad a glucosa, y sobre todo
aumenta la secreción de insulina (43). Estos agentes
inducen la traslocación de la enzima a la región nuclear
(43,91), el AA va a ser la molécula de señalización que
produzca la secreción de la insulina mediada por la
iPLA2-VIA. Un trabajo posterior señala que es posible
que en este proceso no participe la clásica enzima
iPLA2-VIA de 85 kDa sino una forma de 70 kDa que
deriva del procesamiento proteolítico de la de 85 kDa
(74).
señales accesorias (llamadas señales de atracción) que
aparecen con el propio proceso apoptótico (92).
Recientemente Lauber et al. (73) han demostrado que la
iPLA2-VIA tiene un papel clave en la emisión de
señales que atraen a los fagocitos hacía las células
muertas. En este estudio han encontrado un potente
quimioatractor para los fagocitos, la lisoPC secretada
por las células apoptóticas.
Existen otros datos que apoyan la hipótesis de la
participación de la iPLA2 en la producción de señales
accesorias que permiten la separación de las células
apoptóticas por los fagocitos (93). La lisoPC obtenida de
la hidrólisis de la iPLA2 se expone en la superficie de
las células T apoptóticas y así facilita la unión de IgM y
factores de complemento
que permiten el
reconocimiento y separación de las células apoptóticas
por parte de los fagocitos (93). Este estudio, que implica
a la iPLA2, se basa únicamente en el uso del BEL, y no
está claro por tanto si es la iPLA2-VIA, la iPLA2-VIB o
ambas, o incluso otra fosfolipasa sin identificar la que
participa en este proceso.
El tratamiento de las células U937 con el
oligonucleótido antisentido específico para la iPLA2VIA disminuye los niveles de lisoPC y disminuye la
secreción de lisozima (94); además la movilización de
AA (proceso mediado por la cPLA2α) no cambia (94).
Experimentos de reconstitución, demuestran que la
lisoPC es el lisoPL capaz de restaurar la secreción de
lisozima
(94),
y
no
otros
lisoPL
como
lisofosfatidilserina (lisoPS) o lisoPE. Por lo tanto, la
iPLA2-VIA es la enzima encargada de la
reincorporación de los ácidos grasos dentro de los PL de
las membranas y de generar la lisoPC necesaria para la
secreción total de la lisozima. La cPLA2α no tiene
ningún papel en este proceso (94).
Un trabajo reciente en células de insulinoma INS-1
describe la participación de la iPLA2-VIA en la
apoptosis inducida por tapsigargina (74). Cuando se
sobreexpresa la iPLA2-VIA aumenta la tasa de
apoptosis y si se usa BEL este aumento desaparece (74).
En estas condiciones la apoptosis se debe a la ruptura de
la iPLA2-VIA por la caspasa 3, y de dicha ruptura se
obtiene un fragmento de 62 kDa que se asocia al núcleo
(74).
En las células PC12, experimentos con el RNA de
interferencia muestran la traslocación de la iPLA2-VIA
al núcleo durante la muerte celular por hipoxia,
provocando la contracción nuclear sin que se produzca
la ruptura por caspasas (42).
1.6.5 Quimiotaxis - Se piensa que tanto la cPLA2α
como la iPLA2-VIA participan en la respuesta
quimiotáctica de los monocitos frente a la proteína-1
quimioatrayente de monocitos (MPC-1) (37) La
inhibición de las dos enzimas con oligonucleótidos
antisentido inhibe la respuesta (37). El ácido
lisofosfatídico es capaz de restaurar la respuesta en las
células deficientes en iPLA2-VIA, pero no en las
deficientes en cPLA2α. Mientras que el AA restaura la
respuesta de los monocitos deficientes en cPLA2α, y no
lo hace en los monocitos deficientes en iPLA2-VIA.
Otros estudios muestran que ambas enzimas, la iPLA2VIA y la cPLA2α siguen caminos de regulación
paralelos (38).
1.6.4. Secreción - Las enzimas PLA2 intervienen en la
reorganización de la membrana de dos maneras
distintas. Por un lado, estimulan o inhiben las vías de
transducción de señales generando moléculas de
señalización; por otro lado, las PLA2s afectan de forma
directa a la estructura de la membrana debido a la
acumulación de lisoPL y de ácidos grasos. En los
últimos años, se han llevado a cabo distintos estudios
que proponen que la iPLA2-VIA está relacionada con la
secreción de las proteínas que participan en alguno de
estos mecanismos.
1.6.6. Regulación de la expresión génica – Algunos
autores señalan que la iPLA2 participa en la regulación
8
isquémica, lo que no se ha podido es identificar a la
enzima iPLA2 responsable (98) .
transcripcional de ciertos genes (61,95,96). Se cree que
una iPLA2 participa en la acumulación del RNA de
doble cadena tras varias etapas de replicación viral, este
RNA activa la respuesta antiviral en células infectadas.
En macrófagos de ratón y en células RAW 264.7 esta
respuesta provoca la expresión de varias citoquinas
proinflamatorias cómo la interleuquina 1α o 1β y la
producción de la óxido nítrico sintasa (NOS) (61). El
BEL es capaz de inhibir el RNA de doble cadena y de
inhibir la expresión de NOS (61), pero no provoca
ningún cambio ni en las proteasas ni en PAP-1. Si se usa
la metil lisoplasmenil colina, un análogo de lisoPC, se
restaura parcialmente la expresión de NOS (61). En un
artículo reciente (97) se ha identificado a la iPLA2-VIA
como la enzima capaz de expresar NOS cuando los
macrófagos se tratan con el virus de la
encefalomiocarditis (EMCV), además el isómero S del
BEL inhibe la inducción de NOS, la producción de
óxido nítrico y la actividad de la iPLA2-VIA. En
macrófagos de ratón sin iPLA2-VIA el EMCV no es
capaz de inducir la expresión de NOS (97).
Mancuso et al. (99) han demostrado que en ratones
transgénicos tratados con una iPLA2-VIA de corazón
hay indicios de que en un miocardio sano la isquemia es
capaz de activar a la iPLA2-VIA y como consecuencia
ocurre una hidrólisis fosfolipídica que puede provocar
taquiarritmias ventriculares letales. En las zonas
isquémicas de estos ratones la obstrucción de las arterias
coronarias de los corazones perfundidos con el sistema
de Langendorff provoca la liberación de ácidos grasos y
la acumulación de lisoPC, esta liberación y acumulación
de lisoPC no ocurre si se adiciona BEL unos minutos
antes de inducir la isquemia (99).
1.6.8. Entrada de calcio - Cuando disminuyen las
reservas de Ca2+ intracelular debido a distintos
agonistas se activan los canales que lo almacenan y
comienza la entrada de Ca2+ (100), lo que no se sabe es
como la membrana plasmática puede conocer el estado
de estas reservas. Una posibilidad es que se genere un
mediador debido a la pérdida de Ca2+ y que este
mediador difunda de los compartimentos intracelulares
hacia la membrana plasmática, la naturaleza de este
mediador conocido como factor de entrada de calcio se
desconoce (100).
En otro estudio en miocitos cardiacos tratados a tiempos
largos con interleuquina 1β se originan una serie de
respuestas como son: la producción de nitrito, la
inducción de NOS, la liberación de AA y la producción
de PGE2; todas estas respuestas se inhiben con BEL
(96). Pero la interleuquina 1β provoca una disminución
de aproximadamente un 50 % en la expresión de la
iPLA2-VIA; por lo que los efectos del BEL puede que
no sean sobre la iPLA2-VIA.
Los grupos de Gross (101) y Turk (102) fueron los
primeros en sugerir una posible relación entre la iPLA2VIA y las señales de calcio, ambos demuestran que en
las células del músculo liso de rata y en los islotes
pancreáticos, al disminuir las reservas de Ca2+
intracelular se observa un aumento de la hidrólisis
fosfolipídica debida a la iPLA2, lo que provoca que se
acumulen distintos ácidos grasos, entre ellos el AA. La
posible participación de la iPLA2 se basa únicamente en
el uso del BEL, por lo que estos resultados hay que
corroborarlos con otras técnicas.
En monocitos humanos una iPLA2 es la enzima
responsable de controlar el procesamiento de la prointerleuquina 1β (96). En estas células la nigericina
inducida por potasio provoca que madure antes la
interleuquina 1β y así se forma la glicerofosfocolina,
tanto la maduración interleuquina 1β como la formación
de glicerofosfocolina se inhiben con BEL. Se puede
descartar que el BEL tenga algún efecto sobre PAP-1,
además la adición de lisoPC exógena no impide la
inhibición por BEL (96).
Bolotina et al. usando distintas técnicas de inhibición de
la iPLA2-VIA han visto que esta enzima es necesaria
para que se activen los canales que almacenan Ca2+ y
permitir su entrada; los tipos celulares que usaron
fueron: células vasculares del músculo liso, Jurkat,
plaquetas y células leucémicas basófilas de rata (39).
1.6.7 Isquemia cardiaca – Cuando comienza una
isquemia miocárdica se acelera el catabolismo de PL.
McHowat et al. (98) han visto en miocitos ventriculares
aislados que en una situación de hipoxia aumenta la
actividad iPLA2 sensible a BEL provocando una
liberación de AA y una acumulación de lisoPL. Tanto el
AA como los lisoPL pueden contribuir a la enfermedad
En un trabajo posterior, se propone un mecanismo
distinto para activar las reservas de Ca2+ en el que la
iPLA2-VIA juega un papel central (103). Según sus
autores, cuando disminuyen las reservas de Ca2+ se
produce un factor de entrada de calcio intracelular que
9
proteínas respectivamente, presentan la máxima
absorbancia. El cociente A260/A280 indica la pureza del
RNA. Se considera que las muestras son adecuadas
cuando los valores de este cociente están comprendidos
entre 1,8 y 2. La concentración de RNA en µg/µl se
calcula con la siguiente fórmula: [RNA] µg/µl = A260 x
factor de dilución x 40 (factor de absorbancia del RNA)
x 1/ 1000
desplaza a la calmodulina de la iPLA2-VIA, activando
la enzima y produciendo lisoPL. Con ello se activan los
canales que almacenan Ca2+ y comienza su entrada.
Cuando se han llenado las reservas, cesa la producción
del factor de entrada de calcio, la calmodulina se
reasocia a la iPLA2-VIA y ésta queda nuevamente
inhibida, se inactivan los canales que almacenan Ca2+ y
ya no entra más Ca2+ (103).
2.3. Síntesis del DNA complementario (cDNA) – Se
diluye 1 µg de RNA hasta un volumen de 40 µl en H2O
DEPC en presencia de primers aleatorios, se calienta a
65º C durante 5 min. Las muestras se dejan 10 min. a
temperatura ambiente y se añade: tampón de RT,
dNTPs, inhibidor de RNasa, y RT; hasta un volumen
final de 50 µl y se incuba a 37º C durante 1 h. Después
se calienta a 90º C durante 5 min. Las muestras se
guardan a – 20º C.
2. MATERIALES Y METODOS
2.1. Cultivo celular – Las células U937 son células
promonocíticas humanas que crecen en suspensión; se
mantienen en medio RPMI 1640 suplementado con 10
% (v/v) de suero fetal bovino, 2 mM de glutamina, 100
U/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina. Las
células se incuban a 37º C en una atmósfera
humidificada de CO2/O2 (1:19). Las células Jurkat,
THP-1, y RAW264.7 se mantienen en las mismas
condiciones de cultivo. Las células Mono-Mac se
mantienen además con el suplemento OPI. Las células
de pituitaria GH3 se cultivan en medio RPMI 1640
suplementado con 15 % de suero de caballo y con 2,5 %
de suero fetal bovino. Los macrófagos P388D1-GFP se
mantienen con un 5 % (v/v) de suero fetal bovino, 2 mM
de glutamina, 50 U/ml de penicilina, y 50 µg/ml de
estreptomicina. En algunos experimentos se necesita
trabajar con células con los niveles de AA disminuidos,
para conseguirlo se mantienen las células al menos 7
días en medio libre de suero (107,108).
2.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) – Al
cDNA de cada muestra se le añade la siguiente mezcla:
tampón de la DNA polimerasa, dNTPs, primers, DNA
polimerasa y H2O estéril hasta un volumen final de 50
µl. El programa que se uso para la iPLA2-VIA fue: 35
ciclos, desnaturalización a 94º C durante 1 min.,
anillamiento a 59º C durante 1 min. y extensión a 72º C
durante 1 min. Para la cPLA2α: 45 ciclos,
desnaturalización a 94º C durante 30 seg., anillamiento a
58º C durante 30 seg. y extensión a 72º C durante 1 min.
Para la sPLA2 de grupo XII: 45 ciclos,
desnaturalización a 94º C durante 30 seg., anillamiento a
60º C durante 30 seg. y extensión a 72º C durante 1 min.
Cada programa comienza con un calentamiento a 94º C
durante 2 min. y termina con una extensión adicional a
72º C durante 10 min. La amplificación del DNA se
analizó en un gel de agarosa al 2 % y se visualizó con
bromuro de etidio.
2.2. Extracción de RNA total – La extracción del RNA
total de las células se llevo a cabo siguiendo el protocolo
descrito por Chomezynski y Sacchi (109), utilizando
Trizol (una solución monofásica de fenol y tiocianato). 5
x 106 células se resuspenden en 1 ml de Trizol hasta
conseguir una solución homogénea. Se añaden 200 µl de
cloroformo, y tras agitar vigorosamente se centrifuga a
12000 x g durante 10 min. a 4º C. De esta forma se
separan las fases acuosa y orgánica. En la fase acuosa,
en la que se encuentra el RNA, se añade 0,5 ml de
isopropanol para precipitarle. Se centrifuga dicha fase y
se decanta el sobrenadante, el precipitado se lava con 1
ml de etanol al 70 % en H2O DEPC. Una vez lavado, se
deja secar a temperatura ambiente y se resuspende en 25
µl de H2O DEPC. El RNA se mantiene a -80º C en esta
solución acuosa. La cantidad de RNA se determinó por
espectrofotometría midiendo las absorbancias a 260 y
280 nm, longitudes a las que los ácidos nucleicos y las
2.5. Liberación de AA – Se utilizan placas de 12
pocillos, en las que se han distribuido 0,5 x 106 células
por pocillo. Las células se incuban en medio RPMI con
suero y se marcan con 0,5 µCi/ml de [3H]AA durante 18
horas. Pasado este tiempo se lavan dos veces con medio
RPMI sin suero y en presencia de 0,5 mg/ml de
albúmina, se mantienen en este medio durante 1 h y
después se añaden los estímulos. Transcurrido el tiempo
de estimulación se recogen las células, se precipitan por
centrifugación y se toma el sobrenadante. Se determina
la radiactividad de los sobrenadantes con líquido de
centelleo.
10
azul de bromofenol (p/v), pH 6,8] y 2,5 % βmercaptoetanol, se hierven 5 min.
2.6. Tratamiento con el oligonucleótido antisentido para
la iPLA2-VIA y la cPLA2α –
Aproximadamente un
millón de células se lavan dos veces con medio sin suero
y se mantienen en estas condiciones aproximadamente 3
h. Los oligonucleótidos sentido y antisentido se mezclan
con lipofectamina y los complejos que se forman se
mantienen a temperatura ambiente durante 10-15 min.,
después se añaden a las células. Las concentraciones
finales de oligonucleótidos y de lipofectamina son 1 µM
(iPLA2-VIA), 10 µM (cPLA2α) y 10 µg/ml
respectivamente.
Los
oligonucleótidos
fueron
modificados para que fueran fosforotioatos y así limitar
su degradación. Pasadas 4 h se añade 5 % suero fetal
bovino, las células se crecen 48 h antes de usarse para
los
experimentos.
El
tratamiento
con
los
oligonucleótidos y las condiciones de cultivo no fueron
tóxicos para las células como se vio con un ensayo de
exclusión con azul de tripan.
Para separar las proteínas, las muestras se someten a
electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE).
La electroforesis se lleva a cabo en tampón de
electroforesis (25 mM Tris, 0,2 mM Glicina, 1 % SDS)
durante 90 min. a 150 V. A continuación se transfieren
las proteínas a una membrana de nitrocelulosa con una
transferencia húmeda durante 1 h a 200 mA en un
tampón de transferencia (CAPS). La membrana
transferida se bloquea en PBS con 5 % de leche en
polvo desnatada durante 1 h a temperatura ambiente.
Después se incuba durante 1 h con el anticuerpo
primario y se lava 3 veces durante 10 min. con PBS más
Tween 20 al 0,1 %. A continuación la membrana se
incuba con el anticuerpo secundario correspondiente
durante 1 h y se hacen 3 lavados durante 10 min. con
PBS más Tween 20 al 0,1%. Las diluciones de los
anticuerpos primario y secundario se hacen en PBS con
leche desnatada en polvo al 5 % y Tween 20 al 0,1 %.
La detección de la proteína se realiza con el sistema de
aumento de quimioluminiscencia ECL.
La secuencia del antisentido de la iPLA2 se corresponde
con los nucleótidos 59-78 de la secuencia de la iPLA2
de grupo VIA de ratón, esta secuencia se conserva en la
iPLA2 de grupo VIA humana (15,16). El antisentido
usado fue 5’-CTC CTT CAC CCG GAA TGG GT-3’.
Como control se usa la secuencia sentido 5’-ACC CAT
TCC GGG TGA AGG AG-3’. Los oligonucleótidos
antisentido de la cPLA2α humana que se usan en este
trabajo fueron: antisentido es: 5’-GTA AGG ATC TAT
AAA TGA CAT-3’; y el sentido: 5’-GAT GAT CAG
ATA TAC GAT ATT-3’.
2.9. Preparación de los homogeneizados para los
ensayos de actividad – Se lavan las células con PBS y se
resuspenden en el tampón HEPES 100 mM a pH 7,5 con
inhibidor de proteasas. Después de sonicar las células
durante 1 min., se centrifugan a 4º C a 12000 rpm
durante 10 min. Se descarta el precipitado y se mide la
proteína del sobrenadante mediante el método Bradford.
Los homogeneizados se conservan a - 80º C.
2.7. Medida de la concentración de proteína – La
proteína total de los extractos celulares se cuantifica
según el método de Bradford (110), que se basa en un
desplazamiento del máximo de absorción (de 465 a 595
nm) del colorante azul de Coomasie en presencia de
proteína. Se utiliza una solución de colorante comercial
y la curva patrón se construye con albúmina.
2.10. Ensayo de actividad de PLA2 – Los
homogeneizados (100 µg) de las células U937 se
incuban durante 2 h a 37º C en el tampón HEPES 100
mM a pH 7,5 en presencia de 5 mM de EDTA y 100 µM
del sustrato fosfolipídico en un volumen final de 150 µl.
Se utilizan diferentes sustratos: micelas mixtas (68),
vesículas (53) y membranas (111). En algunos
experimentos el EDTA se reemplaza por 1,3 mM CaCl2.
Cuando se usan inhibidores, estos se preincuban 30 min.
antes de añadir el sustrato. La extracción de lípidos se
hizo por el método de Bligh & Dyer (112), y la
separación de estos se hace por cromatografía en capa
fina (TLC) usando como fase móvil hexano/dietil
éter/ácido acético (70:30:1); se raspan los fosfolípidos y
los ácidos grasos libres y se mide la radiactividad.
2.8. Inmunodetección (Western Blot) – Las células se
lavan con tampón fosfato salino (PBS) frío y se recogen
en un tampón de lisis frío (150 mM NaCl, 20 mM Tris
pH 7,4, Triton X-100 al 0,5 %, 1 mM PMSF, 100 µM
ortovanadato sódico y una mezcla de inhibidores de
proteasas 1X). Tras una incubación en hielo durante 30
min., el lisado celular se centrifuga a 4º C a 12000 rpm
durante 10 min. Se descarta el precipitado y se mide la
proteína del sobrenadante mediante el método Bradford.
Las muestras se mezclan con el tampón de Laemmli [60
mM Tris, 10 % glicerol (v/v), 2 % SDS (p/v), 0,002 %
2.11. Preparación de los sustratos para medir actividad
PLA2 – Micelas mixtas: 100.000 cpm de L-α-
11
2.14. Marcaje nuclear con DAPI – Se plaquea un millón
de células en medio con suero al 2 % y se estimulan a
37º C con los agonistas durante los tiempos deseados, se
lavan dos veces con PBS frío y se fijan con 0,5 ml de
paraformaldehído al 4 % durante 15 min. Después se
lavan con PBS, se incuban con 1 µg/ml de DAPI en PBS
durante 25 min. a temperatura ambiente y en oscuridad.
Tras varios lavados con PBS, las células se resuspenden
en 10 µl de Vectashield. Se coloca la muestra en el porta
y se analiza la fluorescencia con un microscopio
invertido Nikon TE-2000U con un filtro de luz
ultravioleta.
dipalmitoil [2-palmitoil-9,10-3H(N)] glicerofosfocolina
se combinan con el mismo compuesto sin marcar para
tener una concentración final de 100 µM en un volumen
final de 150 µl. Se evaporan con N2. Se añade Triton X100, cuya concentración final debe ser 400 µM y se usa
como tampón HEPES 100 mM a pH 7,5. Se agitan y se
calientan 1 min. a 40º C, después se ponen en un baño
de ultrasonidos durante 5 min.
Vesículas: 100.000 cpm de L-α-dipalmitoil [2-palmitoil9,10-3H(N)] glicerofosfocolina se combinan con el
mismo compuesto sin marcar para tener una
concentración final de 100 µM en un volumen final de
150 µl. Se evaporan con N2. Se utiliza como tampón
HEPES 100 mM pH 7,5 y se sonica durante un minuto.
2.15. Detección de la externalización de la PS en las
membranas de las células apoptóticas – Un millón de
células se mantienen con suero al 2 % y se estimulan a
37º C con los agonistas durante los tiempos deseados, se
lavan dos veces con PBS frío y se resuspenden en 100 µl
de tampón binding con 2 µl de Anexina V-FITC según
indica la ficha del producto. Se mantienen 10 min.
incubando en oscuridad y a temperatura ambiente,
después se diluyen en 400 µl de tampón binding y las
muestras se analizan por citometría de flujo usando el
Coulter-Epics XL-MLC.
Membranas: Las células U937 a una densidad de 1,5 x
106 cel/ml se marcan con 0,75 µCi/ml de [3H]AA
durante 18 h. Las membranas celulares totales se
preparan por centrifugación como describieron Diez et
al. (111). Las células se lavan 3 veces con PBS, se
resuspenden a 4º C en 10 mM Tris pH 8 que contenga
0,02 mM de EGTA e inhibidores de proteasas, se
sonican durante 1 min. y se centrifugan 10 min. a 12.000
rpm. El sobrenadante se centrifuga a 30.000 rpm durante
1 h; el pellet obtenido de esta última centrifugación se
lava con PBS que contenga 1 mM de EGTA y se
resuspende en PBS. Se cuenta la radiactividad de las
membranas y se guardan a – 80º C hasta su uso.
2.16. Incorporación de colina dentro de PC – Durante
los tiempos deseados 0,5 x 106 células en medio con
suero se mantienen con los agonistas, durante la última
hora de incubación se añaden 2 µCi/ml de [3H]colina.
Las células se lavan con medio sin suero y se extraen los
lípidos con un Bligh & Dyer (112), los lípidos se
separan por TLC usando como fase móvil
cloroformo/metanol/ácido acético/H2O (50:40:6:0,6 en
volumen). Se raspan las manchas que corresponden a
PC y se mide la radiactividad añadiendo líquido de
centelleo.
2.12. Ensayo de proliferación celular – Para medir la
proliferación celular se usa el kit CellTiter96 Aqueous
One Solution (Promega): las células (10.000
células/pocillo) se plaquean en placas de 96 pocillos en
condiciones normales de cultivo y se tratan con
diferentes concentraciones de BEL. Después de 24 h, el
producto que se ha formado, el formazan, se ensaya
midiendo su absorbancia a 492 nm en un lector de
placas.
2.17. Incorporación de AA en PL – Se planquean 0,5 x
106 de células en presencia de suero y se estimulan con
los agonistas durante los tiempos deseados, después se
dejan en reposo en medio libre de suero durante 1 h y se
exponen a 0,5 µCi/ml [3H]AA (1 µM). A los tiempos
predeterminados se recogen los sobrenadantes y sobre el
sedimento celular se añade 0,1 % de Triton X-100. Los
lípidos totales se extraen con un Bligh & Dyer (112) y
se separan por TLC usando como fase móvil
hexano/dietil éter/ácido acético (70:30:1). Para separar
las distintas clases de fosfolípidos se hace una
extracción con n-butanol frío y se separan por TLC
usando como fase móvil cloroformo/metanol/ácido
acético/agua (50:40:6:0.6). Se raspan las manchas
2.13. Análisis del ciclo celular – Se plaquea un millón
de células en presencia de suero al 2 % y se estimulan
con BEL durante los tiempos indicados, se lavan dos
veces con PBS frío y se resuspenden en etanol frío al 70
%, manteniéndose a 4º C durante 18 h. Pasado este
tiempo, se centrifugan a 4º C a 3000 rpm durante 5 min.,
y se resuspenden en el tampón de marcaje (PBS, 300
µg/ml de Ribonucleasa A y 20 µg/ml de PrI). Las
células se incuban durante 1 h a temperatura ambiente y
en oscuridad antes de ser analizadas en el citómetro de
flujo Coulter Epics XL-MCL.
12
solución 0,25 % de tripsina/EDTA durante 5 min. Este
paso adicional ayuda a despegar las células U937 sin
digerir, de los macrófagos. Los macrófagos se raspan de
los pocillos usando un raspador, se lavan dos veces con
PBS, y se analizan con el citómetro de flujo Coulter
EpicsXL-MCL citofluorómetro. La fluorescencia verde
de las EGFP se analiza en FL1 (505-545 nm), mientras
que la fluorescencia roja del PrI o de la Cy3-Anexina V
se analiza en FL2 (555-600 nm). Para cuantificar la
fagocitosis, la fluorescencia roja se analiza sólo en las
poblaciones celulares con una gran fluorescencia verde
(células positivas a EGFP, es decir, macrófagos). Los
macrófagos que contienen EGFP sólo son positivos a la
fluorescencia roja si han digerido células U937
marcadas con PrI. La fagocitosis se confirma con un
microscopio confocal usando el sistema de escaneado
con laser Radiance 2100 de Bio-Rad acoplado a un
microscopio invertido de Nikon con una cámara
termostatizada. Se usa un objetivo de 60X, con una
apertura numérica de 1,4 y aceite de inmersión. La
fluorescencia verde se monitoriza con un láser de argón
excitando a 488 nm usando una combinación de
HQ500LP y de HQ560SP. La fluorescencia roja se
monitoriza secuencialmente con un láser de HeNe
excitando a 543 nm usando un HQ590/570.
adecuadas y se mide la radiactividad después de añadir
líquido de centelleo.
2.18. Producción de transfectantes estables que expresan
la iPLA2-VIA – El vector pcDNA3.1 que contiene la
iPLA2 Grupo VIA fue amablemente cedido por la Dr.
Suzanne Jackowski (St. Jude Children’s Research
Hospital, Memphis, TN). Aproximadamente 2 µg por
106 células se transfectan por electroporación a 270 V
(975 µF) usando un Gene Pulser II electroporador (Biorad). Para seleccionar las células transfectadas, se
incuban en medio con 1 mg/ml de geneticina. Para
obtener las células transfectantes estables que expresan
la iPLA2 Grupo VIA, las células se clonan por dilución
límite en medio con 300 µg/ml de geneticina. A las dos
semanas, los pocillos que contienen una sola colonia se
seleccionan y la expresión de iPLA2 se analiza por
inmunodetección y por medida de la actividad iPLA2.
Los clones se mantienen en medio con 300 µg/ml de
geneticina.
2.19. Medida de lisofosfolípidos – Se marcan 0,5 x 106
células durante dos días con 0,5 µCi/ml de [3H]colina o
[14C]etanolamina. La extracción de los lípidos se hace
con n-butanol frío y su separación con una TLC usando
como fase móvil cloroformo/metanol/ácido acético/agua
(50:40:6:0.6). Se raspan las manchas que corresponden a
lisoPC o lisoPE y se introducen en viales de centelleo
para medir su radiactividad (113).
2.21. Medida del remodelado fosfolípidico con [3H]AA
– Para estos experimentos, un millón de células se
marcan con un pulso de [3H]AA (0,5 µCi/ml, 1 µM)
durante 30 min. a 37º C. Las células se lavan tres veces
con medio que contenga 0,5 mg/ml de albúmina para
eliminar la marca que no se ha incorporado. Después,
las células se mantienen en un medio libre de suero y se
incuban a 37º C durante los tiempos indicados. Los
lípidos se extraen y se separan como hemos indicado
más arriba.
2.20. Ensayo de fagocitosis – La fagocitosis de las
células apoptóticas por macrófagos se determina con un
citómetro de flujo. Como células fagocíticas se emplean
los macrófagos P388D1-EGFP. Un millón de células
P388D1 se plaquean en placas de 24 pocillos en medio
con 5 % de suero. Como células diana se usan las
células U937 apoptóticas. La muerte celular apoptótica
en estas células se induce tratándolas con 500 µM H2O2
durante 20 h (44). Después las células U937 se marcan
con 20 µg/ml de PrI durante 20 min. En algunos
experimentos, las células apoptóticas se marcan con
Cy3-anexina durante 5 min. Después de lavar dos veces
las células U937 con PBS se añaden a los macrófagos
P388D1 que están en una monocapa en un volumen
final de 1,5 ml de RPMI sin suero. Las placas se
centrifugan a 300 x g (1200 rpm) durante 3 min. para
poner las células diana en contacto directo con los
macrófagos. La proporción de células diana frente a
macrófagos es 3:1. La reacción de fagocitosis se lleva a
cabo durante 2 h en un incubador humidificado de CO2
a 37º C, después los macrófagos se tripsinizan con una
3. RESULTADOS
3.1. Papel de la iPLA2 en la acumulación de ácidos
grasos libres en las células U937 tratadas con H2O2
3.1.1. Fosfolipasas A2 presentes en las células U937
3.1.2. Movilización de AA en las células U937 tratadas
con H2O2
3.1.3. Estudios de inhibición de PLA2
3.1.4. Estudios de la regulación de la actividad de la
iPLA2
13
3.5.3. Efecto de los inhibidores de ciclooxigenasa y
lipoxigenasa sobre la apoptosis de las células U937
3.2. El BEL provoca la muerte celular a través de la
PAP-1 y no de la iPLA2
3.2.1. Efectos del BEL sobre el crecimiento celular
3.2.2. Efectos del BEL sobre el ciclo celular y el DNA
4. DISCUSION
3.2.3. Marcaje con Anexina V-FITC en las células
tratadas con BEL
4.1. Papel de la iPLA2 en la acumulación de ácidos
grasos libres en las células U937 tratadas con H2O2
3.2.4. Efecto del BEL sobre la proteolisis de caspasas
Las células fagocíticas en respuesta a diferentes
agonistas producen especies reactivas de oxígeno entre
las que destacan el anión superóxido y el H2O2 (171).
El daño oxidativo que producen estos metabolitos se
asocia a la movilización de AA en las células del
sistema vascular: células endoteliales, células del
músculo liso, plaquetas o fagocitos. Aunque la
producción de estas especies juega un papel importante
en la señalización celular y en la defensa inmune, una
producción incontrolada puede ser un factor grave en los
desórdenes vasculares (171). Conocer las interacciones
entre las especies reactivas de oxígeno y los metabolitos
de AA es importante para el estudio de estos desórdenes.
3.2.5. Efectos del BEL sobre otros tipos celulares
3.2.6. Efecto de la inhibición de la iPLA2 sobre el
marcaje con anexina V-FITC y sobre la actividad iPLA2
3.2.7. Papel de PAP-1
3.3. Papel de la iPLA2 en la liberación de AA,
incorporación de ácidos grasos en los fosfolípidos y
apoptosis en las células U937 expuestas al H2O2
3.3.1. Liberación de AA en las células sobreexpresadas
con la iPLA2 y tratadas con H2O2
En este trabajo se emplea el H2O2 para provocar una
situación de estrés oxidativo y estudiar los mecanismos
de movilización de AA en células fagocíticas como son
las células U937. Los datos del capítulo 1 sugieren que
en las células U937 la movilización de ácidos grasos
provocada por el H2O2 no depende de la cPLA2α y si
de la iPLA2. Estos resultados se obtienen después de
emplear distintas técnicas como inhibidores químicos y
oligonucleótidos antisentido. Debido a que la
movilización de AA en respuesta al H2O2 no necesita
calcio, es consistente la participación de la iPLA2
(enzima independiente de calcio) (87). Otro dato que
confirma la participación de la iPLA2 en este proceso es
que las células U937 tratadas con H2O2 liberan otros
ácidos grasos además del AA (87), es decir no muestran
preferencia por el ácido graso que hidroliza;
característica que distingue a la enzima iPLA2 de la
cPLA2.
3.3.2. Papel de la iPLA2 en la incorporación de AA en
los PL
3.3.3. Papel de la iPLA2 en la apoptosis inducida por
H2O2
3.4. Papel de la iPLA2-VIA en la fagocitosis por
macrófagos de las células U937 tratadas con H2O2
3.4.1. Fagocitosis de las células apoptóticas U937 por
los macrófagos P388D1
3.4.2. La lisoPC es el metabolito responsable de facilitar
la fagocitosis
La figura 3B mide la movilización de AA debida al
H2O2 en función del tiempo, demostrando que hay una
respuesta lineal a tiempos cortos y una saturación
después de 2 h de tratamiento con el oxidante. Esta
cinética contrasta con la respuesta de las células a la Con
A (estímulo que libera AA debido a la acción de la
cPLA2) que satura la respuesta a la hora del tratamiento,
característica de una respuesta celular regulada.
3.5. El bloqueo de la incorporación de AA en los
fosfolípidos provoca la apoptosis de las células U937
3.5.1. Efecto del AA sobre la apoptosis en las células
U937
3.5.2. Inhibidores de la esterificación de AA inducen
apoptosis en las células U937
14
por apoptosis en células U937 tratadas con BEL. El
marcaje con Anexina-V FITC confirma que el BEL
aumenta la exposición de la PS al exterior a la superficie
celular.
Si se mide la actividad de la iPLA2, tanto en las células
tratadas con H2O2 como en las no tratadas, no hay
diferencia en la actividad. Estos ensayos se hacen con
tres condiciones experimentales diferentes variando el
tipo de sustrato: vesículas, micelas mixtas y membranas
naturales. El resultado con los tres sustratos fue que la
actividad intrínseca de la iPLA2 no cambia después de
la exposición de las células a H2O2. El mecanismo que
libera AA en las células U937 tratadas con H2O2 no
implica la activación de la iPLA2.
El BEL es capaz de activar la caspasa-3 y la caspasa-9;
esta activación se confirmó usando el inhibidor de
caspasas Z-VAD-FMK y con la ruptura del sustrato para
caspasa-3 PARP. Debido a la implicación de la caspasa9 se puede pensar que la apoptosis provocada por BEL
ocurre a través de la mitocondria.
Cuando en este ensayo se usan membranas de células
tratadas con H2O2, la actividad iPLA2 es más alta que
la de las membranas de las células sin estimular, lo que
demuestra que el tratamiento de las células con H2O2
facilita la interacción de la iPLA2 sobre la membrana
fosfolipídica. Se ha visto que las membranas de las
células tratadas con H2O2 tienen cantidades altas de
peróxidos lipídicos en comparación con las membranas
sin tratar, dato que sugiere que en las células tratadas
con H2O2 la hidrólisis lipídica ocurre más deprisa. Lo
que se desconoce es cómo esta acumulación de
peróxidos lipídicos puede facilitar la catálisis, aunque si
se sabe que existen distintos factores que alteran el
empaquetamiento lipídico de la membrana aumentando
la liberación de ácidos grasos tanto in vivo como in vitro
(172).
Ninguno de los efectos provocados por el BEL, se
reproduce tratando las células con MAFP o con un
oligonucleótido antisentido específico para la iPLA2;
descartándose la participación de la iPLA2 en la
apoptosis inducida por BEL. Trabajos anteriores en las
células U937 tratadas con ligando de fas apuntan a la
iPLA2 como la enzima responsable de la liberación de
ácidos grasos y por lo tanto, responsable de la
destrucción de la membrana fosfolipídica durante la
apoptosis (71,72), pero los datos de este capítulo
sugieren que la apoptosis a través de la mitocondria
puede ocurrir sin la actividad iPLA2.
La apoptosis provocada por el BEL disminuye en
presencia de propranolol (inhibidor de PAP-1) (33);
parece que los efectos del BEL van encaminados a
inhibir PAP-1. PAP-1 desfosforila el ácido fosfatídico
para producir DAG, esta reacción es necesaria para
mantener la biosíntesis de PC en las células. Si se inhibe
PAP-1 deberían disminuir los niveles celulares de PC, la
figura 16 demuestra que esto ocurre en las células
tratadas con BEL.
Con estos resultados se puede sugerir un modelo de
movilización de ácidos grasos, en este modelo el
oxidante induce la oxidación lipídica provocando la
acumulación de peróxidos lipídicos en la membrana.
Estos peróxidos lipídicos desestabilizan la membrana y
hacen que sea más susceptible para ser atacada por la
iPLA2, aumentando la liberación de ácidos grasos. Un
aspecto importante de este modelo es que la liberación
de ácidos grasos ocurre sin la activación de la cPLA2α.
Esta falta de activación probablemente indique que la
liberación de ácidos grasos sea un proceso no regulado.
La alteración de la homeostasis de PC causa la
disminución del crecimiento celular y provoca la muerte
celular por apoptosis (146). En la línea celular MT-58
con una mutación de la CT, la disminución de la síntesis
de PC provoca la apoptosis de la célula (173). Si se usan
análogos sintéticos de lisoPC que funcionan como
inhibidores de la síntesis de PC, en células como los
fibroblastos se produce apoptosis (174). La ausencia de
actividad PAP-1 podría explicar la apoptosis inducida
por BEL debido a la disminución de la síntesis de
lípidos.
4.2. El BEL provoca la muerte celular a través de la
PAP-1 y no de la iPLA2
En este capítulo se ha demostrado que el BEL, un
inhibidor de la iPLA2, produce la muerte celular por
apoptosis en una gran variedad de tipos celulares. La
tinción del núcleo con DAPI en células tratadas con
BEL provoca la condensación de la cromatina, un signo
evidente de apoptosis. Experimentos de citometría
usando como marcador PrI demuestran la muerte celular
Durante el proceso de apoptosis inducida por BEL la
ceramida se puede ver afectada debido a que en las
células la disminución de la síntesis de DAG y de PC
afecta a la síntesis de esfingomielina a través de la ruta
de la esfingomielina sintasa; la ceramida se acumularía
15
receptor, esto no ocurre con la inhibición de la iPLA2
por BEL (26,31,83,178,179).
dentro de la célula. No hay un consenso acerca del
mecanismo por el cuál la ceramida provoca apoptosis,
aunque se sabe que aumenta durante la fase inicial de
ésta (175,176). Las ceramidas naturales son capaces de
aumentar la permeabilidad de la membrana externa de la
mitocondria y provocar la liberación al citosol del
citocromo c y de otras pequeñas proteínas (177).
También se comprobó la participación de la iPLA2 en la
hidrólisis de los PL inducida por un oxidante, en células
estromales del útero (59) y más recientemente en
astrocitos (180). En células cómo macrófagos alveolares
(120) y células vasculares del músculo liso (121), la
movilización de AA producida por oxidantes se produce
por la falta de incorporación de ácidos grasos en los PL.
Durante este capítulo con distintos experimentos se ha
visto que el BEL provoca apoptosis en las células U937
a través de la enzima PAP-1 y no de la iPLA2. Este
aspecto debe tenerse en cuenta cuando se use la droga
para estudiar los distintos papeles de la iPLA2 en la
apoptosis y en otras respuestas celulares. El BEL, si se
utiliza durante tiempos largos, puede servir como
control positivo pero no para conocer el papel de la
iPLA2 durante la apoptosis. Serán otros inhibidores y
otras técnicas alternativas que inhiban la iPLA2 las que
se usen en estos estudios. Los efectos del BEL sobre el
metabolismo lipídico se detectan a la hora de exposición
con la droga, en este tiempo tanto la síntesis de PC
como de TAG están alteradas, además la célula sufre
una serie de alteraciones morfológicas y distintos
sucesos bioquímicos como la despolarización
mitocondrial y la liberación y activación de efectores de
muerte celular.
Como la iPLA2 participa en las reacciones de
desacilación y reacilación del AA en células
inmunoinflamatorias (5,6), parece interesante estudiar
los efectos del H2O2 en la incorporación de AA en
células como las U937. Para conocer el papel de la
iPLA2 en la incorporación se empezó estudiando el
efecto del timerosal, un compuesto organometálico que
bloquea la reacilación del AA y disminuye la
desacilación vía iPLA2 (151,152). Este compuesto
aumenta la liberación de AA que provoca el H2O2. La
causa de este aumento puede deberse a que el H2O2
inhiba la reacilación del AA y en este caso el timerosal
tendría un efecto sinérgico, como demuestran en sus
estudios Sporn et al. (120), y Cane et al. (121), o bien a
que el H2O2 estimule la desacilación mediada por las
PLA2 y en este caso el efecto del timerosal será aditivo.
Esto último es lo que se ha observado en los
experimentos descritos en el capítulo 4.3.
4.3. Papel de la iPLA2 en la liberación de AA,
incorporación de ácidos grasos en los fosfolípidos y
apoptosis en las células U937 expuestas al H2O2
Analizando los efectos del H2O2 sobre la capacidad de
las células de incorporar AA, se ha encontrado que los
oxidantes no bloquean la esterificación del AA dentro de
los PL sino que la aumentan. Una posible explicación es
que la rápida hidrólisis de los PL por la iPLA2 en
presencia de H2O2 provoca la acumulación de aceptores
lisoPL intracelulares que causan un incremento en la
incorporación de AA dentro de los PL. Señalar que el
H2O2 no afecta a las actividades de las enzimas de
reacilación del AA, la acil-CoA sintetasa de ácidos
grasos de cadena larga y la aciltransferasa dependiente
de CoA (120).
Para conocer que ocurre en las células U937 en
situaciones de estrés oxidativo se ha usado como
oxidante H2O2. Se han descrito mecanismos
moleculares para explicar la movilización de ácidos
grasos producida por el H2O2 en las células U937, en el
capítulo 1 se encontró que la enzima que participa en
este proceso es la iPLA2-VIA. Probablemente debido al
aumento de peróxidos lipídicos en la membrana
producidos por el H2O2, la iPLA2 tendrá mayor
accesibilidad sobre su sustrato incrementándose la
liberación de ácidos grasos (87). Este papel de la iPLA2
es bastante sorprendente desde el punto de vista
bioquímico, ya que en condiciones de activación (a
través de receptor o a través de cascadas de señalización
intracelulares) se sabe que es la cPLA2 y no la iPLA2 la
fosfolipasa necesaria para la movilización de AA en
células fagocíticas. En los fagocitos si se inhibe la
cPLA2α se bloquea la movilización de AA a través de
Aunque se produzca un aumento en la incorporación de
ácidos grasos dentro de los PL, el resultado neto de la
acción del H2O2 es un aumento de la movilización del
AA debido a los fuertes efectos del H2O2 sobre la
iPLA2. La importancia bioquímica del AA en las células
tratadas con H2O2 radica en que no todo el AA liberado
de los PL por la iPLA2 está disponible para su
metabolismo, una parte del AA libre será reincorporado
dentro de los PL limitando de esta forma la cantidad de
16
AA. Al contrario, en células especializadas en el
metabolismo del AA como fagocitos, la disminución
(36,48) o el incremento (como en este trabajo) de los
niveles de lisoPC intracelulares modificaran de forma
significativa la incorporación de AA. La regulación de
la incorporación de AA a través de lisoPC debe ser
característica de algunos tipos de células. En algunos
tipos de células existirán otros factores, además de la
disponibilidad de lisoPL, que limiten la incorporación
de AA.
AA libre disponible para las futuras reacciones
metabólicas.
El control de los niveles intracelulares de aceptores
lisoPL necesarios para la incorporación de AA dentro de
los PL es una de las funciones de la iPLA2 en las células
fagocíticas. Este papel se ha demostrado en estudios en
los que la actividad de la iPLA2 disminuye en las
células, bien vía farmacológica o bien por
oligonucleótidos antisentido (5,6,36,48). En este
capítulo se ha empleado una tercera vía, diferente a las
ya empleadas, la sobreexpresión de la iPLA2. Esta
nueva estrategia ha sido útil para confirmar papeles ya
descritos de esta enzima y estudiar otros nuevos. Se ha
encontrado que las células que sobreexpresan la iPLA2
tienen mayor capacidad para incorporar AA en los PL
que las células control. Además, las células que
sobrexpresan la enzima movilizan mayor cantidad de
AA libre en respuesta a H2O2. Estos resultados destacan
el papel clave de la iPLA2 en la mediación de la
hidrólisis fosfolipídica durante el estrés oxidativo
causado por el H2O2 y el importante papel de la enzima
en la regulación de los niveles intracelulares de lisoPC.
Además del papel en las reacciones de
desacilación/reacilación de ácidos grasos de los PL y en
la liberación de ácidos grasos, parece que durante el
daño oxidativo la iPLA2 tiene un nuevo papel. En las
células U937 sobreexpresadas con la iPLA2 el
porcentaje de apoptosis inducida por H2O2 es mayor
que el porcentaje en las células control, también
aumenta la destrucción de la membrana fosfolípidica y
la liberación de ácidos grasos al medio extracelular.
Estos datos parecen confirman que durante la apoptosis
hay una hidrólisis de PL mediada por la iPLA2.
Si se tratan las células con MAFP, en condiciones en
que la iPLA2 está completamente inhibida sigue
produciéndose apoptosis inducida por H2O2; lo que
indica que la actividad de la iPLA2 no es necesaria para
que tenga lugar la apoptosis. En el capítulo 2 se ha visto
que en un gran número de células el BEL induce
apoptosis a través de una ruta mediada por la caspasa-3
sin que participe la iPLA2 (29). Un estudio de Atsumi
(72) demuestra que el MAFP no impide que haya
apoptosis en células tratadas con ligando de fas o con
TNFα más cicloheximida, aunque el MAFP si que
disminuye la apoptosis a tiempos cortos. En las células
MCF7 transfectadas con caspasa-3 (73) el tratamiento
con araquidonil trifluorometil cetona (inhibidor de la
iPLA2) no disminuye la apoptosis causada por la luz
UV (22,24).
En las células de los islotes pancreáticos después de la
inhibición de la iPLA2 con BEL se mantienen los
niveles de lisoPC (30) permitiendo la incorporación de
AA. En las células COS cuando se sobrexpresa de forma
transitoria la iPLA2 aumentan los niveles de lisoPC pero
no aumenta la incorporación del AA dentro de los PL;
en estas células los niveles de lisoPC no limitan la
incorporación de AA (52). Como la sobreexpresión fue
transitoria, es posible que se haya alterado el
metabolismo fosfolipídico (8). Parece que las células
COS tienen una capacidad limitada para incorporar AA
dentro de los PL, no se necesitan los lisoPL obtenidos
con la sobreexpresión.
Con los resultados en COS (52), en los islotes
pancreáticos (30,43) y en las células U937 (capítulo 3),
se piensa que el tipo de enzima PLA2 que participa en
los mecanismos de producción de lisoPL y en la
remodelación de los ácidos grasos depende del tipo
celular. Unos niveles mínimos de lisoPL intracelulares
parece que son necesarios para mantener la
incorporación de AA dentro de los PL. En células con
una capacidad limitada para incorporar AA o en células
con niveles excesivamente altos de lisoPL, el
incremento en los niveles intracelulares de lisoPC por la
sobreexpresión de la iPLA2 (43,52) o la disminución de
dichos niveles por el uso de inhibidores farmacológicos
(30), tendrá poco o ningún efecto en la incorporación de
Con los estudios mencionados se llega a la conclusión
de que en ciertas condiciones la iPLA2 participa en la
fase temprana de la apoptosis, aunque se puede
prescindir de la enzima para que se desarrolle el proceso
apoptótico. Más que un papel destructivo, la iPLA2
tiene un papel durante la hidrólisis fosfolipídica que
causa el H2O2; esta hidrólisis podría servir para
producir señales accesorias que se dan durante el
proceso apoptótico (181,182).
17
fagocitosis. El epítopo reconocido fue la cabeza polar de
lisoPC (fosfocolina) (93). Como la unión de IgM se
inhibe usando BEL, se piensa que la lisoPC es generada
por una iPLA2, aunque no se determinó la identidad
molecular esta enzima (93).
4.4. Papel de la iPLA2-VIA en la fagocitosis por
macrófagos de las células U937 tratadas con H2O2
Hay evidencias de que las células fagocíticas eliminan
las células apoptóticas, un proceso crítico de la
homeostasis de los tejidos que comienza por la
manifestación de señales de atracción sobre la superficie
de las células muertas. Estas señales van a servir como
marcadores para que los fagocitos puedan identificar y
engullir a las células muertas gracias a otro tipo de
señales, las señales eat me. Se han identificado
diferentes tipos de señales eat me: moléculas que
traslocan a la superficie (como PS o anexina I)
(129,131,133,183,184), moléculas de la superficie que
sufren modificaciones (como ICAM-3 o CD31)
(185,186) y señales indirectas generadas por la
interacción de componentes del suero con la superficie
de las células apoptóticas (93).
En células U937 apoptóticas debido al tratamiento con
H2O2, como no se expresa la isoforma iPLA2 de grupo
VIB, parece que es la isoforma iPLA2 de grupo VIA la
encargada de la producción de lisoPC. Los estudios de
fagocitosis se hicieron en ausencia total de suero
eliminando la posibilidad de que algún componente del
suero participe en el reconocimiento de las células
apoptóticas por los macrófagos. Como la fagocitosis de
las células muertas se inhibe por preincubación de los
macrófagos con lisoPC parece probable que los
macrófagos pueden reconocer directamente a la lisoPC.
La capacidad de la lisoPC para actuar como un señal eat
me directa (este estudio) o indirecta (93) depende del
tipo celular y del estímulo usado.
En este estudio se ha encontrado que la enzima iPLA2VIA es necesaria en las células U937 tratadas con el
H2O2 (células apoptóticas) para ser reconocidas y
fagocitadas por los macrófagos. Tanto la disminución
como el aumento de los niveles de la iPLA2-VIA en las
células apoptóticas demuestran la correlación entre la
actividad de la iPLA2-VIA y el grado de fagocitosis de
las células apoptóticas por los macrófagos, por eso se
piensa que un producto metabólico de la iPLA2-VIA
participa en este proceso. Se ha identificado este
metabolito, es la lisoPC que actúa como una señal eat
me para los fagocitos. Se ha descartado la posibilidad de
que otra PLA2 presente en las células U937, como la
cPLA2α, tenga algún efecto; además distintos trabajos
sugieren que durante la apoptosis en las células U937
inducida por ligando de fas o TNFα, la cPLA2α está
inactiva (71,72,182).
Se puede especular sobre el mecanismo por el que la
lisoPC, producida por el ataque de la iPLA2-VIA sobre
la membrana fosfolipídica, consigue exponerse a la
superficie celular y como los fagocitos reconocen a los
lípidos. Este punto ya se ha discutido (187), y es
probable que la pérdida de asimetría de la bicapa sea el
principal mecanismo que provoque la exposición de la
lisoPC. Esta pérdida de asimetría es un evento temprano
de la apoptosis y provoca la exposición externa de los
aminofosfolípidos cargados negativamente como la PS.
La exposición de PS sería una primera señal eat me para
los fagocitos. Se cree que un receptor de la superficie de
los fagocitos reconoce a la PS que actuarían en la
fagocitosis de las células muertas (129,131,133,183),
este receptor se ha clonado recientemente y cuando se
bloquea se suprime la fagocitosis de la célula apoptótica
(129,131,133,183). Estudios más recientes han
cuestionado el hecho de que el receptor de PS participe
en la identificación de las células apoptóticas (188,189),
Mitchell et al. (189) han demuestrado que células
deficientes en dicho receptor son capaces de reconocer y
fagocitar a las células apoptóticas. Un artículo reciente
de Kenis et al. (190) señala que además de la PS son
necesarias otras señales eat me para que ocurra la
fagocitosis de las células apoptóticas.
Pero el papel de la lisoPC como señal eat me durante la
apoptosis depende de las condiciones de actividad de la
iPLA2-VIA. Este papel no se aprecia en las células
Jurkat ni en las células U937 cuando se usa como
inductor de apoptosis TNFα, en estos casos la hidrólisis
fosfolípidica es menor que si las células U937 se tratan
con H2O2 (44,87). Así que parece que el papel de la
lisoPC como señal eat me es importante durante la
apoptosis sólo cuando la iPLA2-VIA participa en la
degradación fosfolípidica. Estudios de Kim et al. (93)
apoyan estos datos, ellos han demostrado que las células
apoptóticas generan un epítopo de superficie que es
reconocido por anticuerpos naturales IgM que provocan
una activación complementaria que produce la
Es posible que los receptores de los macrófagos que
específicamente reconocen la lisoPC de la superficie de
las células muertas actúen en la fagocitosis de dichas
células o bien actúen indirectamente para promover su
unión y reclutar otros receptores de señalización que
18
estas mismas condiciones, la cantidad de AA sin
esterificar también aumenta.
participen en la fagocitosis. Uno de estos receptores
podría ser un receptor acoplado a proteína G que está
presente en los macrófagos y en otras células, el receptor
G2A, que se uniría a la lisoPC con alta afinidad (191).
Un trabajo más reciente en las células Jurkat no
demuestra la unión de la lisoPC al G2A (192), aunque
estas células sí migran cuando se expresa G2A en
respuesta a lisoPC (193,194); el G2A sería capaz de
responder frente a lisoPC gracias a un mecanismo
indirecto en el que la lisoPC modifica un receptor u otro
proceso que regula alternativamente al receptor G2A.
En el capítulo 3 se comprobó que como en la mayoría de
las células fagocíticas, las células U937 son capaces de
incorporan AA dentro de los PL celulares. El porcentaje
de apoptosis en las células U937 sobreexpresadas con la
iPLA2-VIA es mínimo debido a la capacidad de las
células para incorporar AA y mantener bajos los niveles
del ácido. En presencia de H2O2, el AA libre se
acumula ya que el oxidante activa la desacilación
mediada por la PLA2 y este paso domina sobre el paso
de reacilación de ácidos grasos (44,87).
Aún se desconocen los mecanismos de regulación de la
actividad iPLA2-VIA durante la apoptosis inducida por
H2O2. Se sabe que la iPLA2-VIA controla los niveles
basales de lisoPC (5,6,158); que en las células sin
activar, la inhibición de la actividad iPLA2 disminuye
los niveles de lisoPC (5,6,158) y que la ruptura de la
iPLA2-VIA por la caspasa-3 durante la apoptosis no
provoca cambios en actividad de la enzima (71,72).
Teniendo en cuenta esto se puede pensar que ciertas
señales apoptóticas podrían provocar que la membrana
sea más susceptible al ataque de la iPLA2-VIA (87), o
que una supuesta proteína reguladora de iPLA2-VIA
pueda ser modificada in vivo, lo que provocaría un
incremento de la hidrólisis fosfolipídica y la
acumulación de lisoPC.
La reacilación del AA en las U937 también puede
explicar por qué el AA exógeno a concentraciones
micromolares no es capaz de producir apoptosis. En el
capítulo 5 se inhibe la reacilación de AA inhibiendo la
acil-CoA sintetasa de ácidos grasos de cadena larga
usando dos inhibidores, el timerosal y la triacsina C. A
dosis no tóxicas para las células los dos compuestos
disminuyen la incorporación de AA en los PL. Si en
presencia de los inhibidores se tratan las células con AA
exógeno, éstas sufren muerte por apoptosis.
Otro mecanismo para manipular los niveles de AA en
las células es tratarlas con el IHP que inhibe la CoA-IT,
es decir, bloquea la remodelación fosfolipídica del AA
(la transferencia directa de AA de la PC a la PE), el AA
se va a acumular en la PC que es el sustrato preferido de
la iPLA2-VIA (36,48,53); además aumenta la hidrólisis
basal de los PL aumentando el AA libre. El bloqueo de
la CoA-IT disminuye los niveles de lisoPC, y provoca
que la reacilación del AA se reduzca (108).
4.5. El bloqueo de la incorporación de AA en los
fosfolípidos provoca la apoptosis de las células U937
Usando diferentes estrategias que aumentan los niveles
de AA en las U937 se ha demostrado que el AA es
inductor de apoptosis. Pequeñas cantidades de AA y de
otros ácidos grasos en células sin activar se están
continuamente generando durante el ciclo de
desacilación/reacilación de los PL de membrana. En el
paso de desacilación participan las PLA2 y en el caso de
los fagocitos la enzima que mantiene esta actividad
basal es la iPLA2-VIA (36,158,161). Se ha demostrado
en otros capítulos que la transfección estable en las
células U937 con el plásmido que contiene la iPLA2VIA provoca importantes alteraciones en el
metabolismo del AA.
El IHP, igual que el timerosal y la triacsina C, promueve
la muerte celular en presencia de AA exógeno. El
porcentaje de apoptosis que provoca el IHP por sí
mismo, es decir, sin AA exógeno, es mínimo
probablemente porque en estas condiciones existen otras
rutas metabólicas alternativas para disminuir los niveles
de ácidos grasos sin esterificar. El tratamiento con IHP
aumenta la acilación del AA en el TAG si se compara
con las células sin tratar, parece que una parte
importante del AA libre producido después de la
inhibición de la CoA-IT es desviado a la ruta de novo
para la biosíntesis del TAG, ruta que rara vez se usa en
condiciones normales en las líneas celulares fagocíticas
(46,48,147).
Cuando las células transfectadas con la iPLA2-VIA se
exponen al H2O2 los valores de apoptosis son más altos
que en las células control sin transfectar, concretamente
la población celular que sufre apoptosis es el doble. En
La concentración de AA que es capaz de inducir
apoptosis al combinarse con drogas que inhiben la
19
de calcio en el que no participa la cPLA2 y sí la iPLA2VIA.
incorporación de ácidos grasos y la remodelación, es del
orden micromolar (10 µM). Esta concentración
probablemente se alcanza localmente in vivo durante un
proceso inflamatorio y de ahí su importancia
fisiopatológica. Si se usa otro ácido graso, como el ácido
palmítico, éste no es capaz de producir apoptosis por sí
mismo ni cuando se combina con timerosal, triacsina C
o IHP (195) lo que indica que el efecto proapoptótico
descrito en este estudio para el AA no es un efecto
detergente.
5.2. El BEL provoca la muerte celular de las células
U937 a través de la PAP-1 y no de la iPLA2.
5.3. La iPLA2-VIA tiene un papel importante en la
incorporación del AA en los PL de las células U937 sin
tratar o tratadas con H2O2.
5.4. La iPLA2-VIA participa en la hidrólisis
fosfolipídica que ocurre durante la apoptosis provocada
por el H2O2 pero no es necesaria para que ocurra el
proceso apoptótico.
Ninguno de los inhibidores de COX y LO son capaces
de inhibir la apoptosis provocada por el AA más
timerosal, demostrando que los efectos descritos
anteriormente se deben al AA y no a sus metabolitos
oxidados.
5.5. La formación de lisoPC gracias a la iPLA2-VIA en
las células U937 tratadas con H2O2 para inducir
apoptosis, contribuye directamente al eficiente
reconocimiento por los macrófagos y su posterior
fagocitosis.
Aún es necesario definir los pasos moleculares que
envuelven la apoptosis inducida por AA, destacar que el
AA a concentraciones micromolares altera a efectores
celulares y a rutas de señalización, entre ellas la
producción de ceramidas que producen apoptosis (196199). Sería interesante pensar en los mecanismos
enzimáticos que producen AA libre en las células, como
posibles candidatos para el diseño de drogas con
potencial antitumoral (200,201).
5.6. Los niveles de AA libre dentro de las células
podrían ser una importante señal celular para la
apoptosis, y las alteraciones de los mecanismos que
controlan la reacilación del AA y también la
disponibilidad de AA libre, podrían ser decisivos en la
supervivencia de la célula.
5. CONCLUSIONES
Esta tesis doctoral ha sido realizada gracias a la concesión de una
beca de Formación de Personal Investigador del Ministerio de
Ciencia y Tecnología. El trabajo realizado ha dado lugar a las
publicaciones científicas indicadas en las referencias 29, 44, 195,
202-205.
5.1. En las células U937 tratadas con H2O2 ocurre una
movilización de AA por un mecanismo independiente
REFERENCES
1.
Six, D. A. and E. A. Dennis. 2000. The expanding superfamily of phospholipase A2 enzymes: classification and
characterization. Biochim.Biophys.Acta 1488:1-19.
2.
Balsinde, J., M. V. Winstead, and E. A. Dennis. 2002. Phospholipase A2 regulation of arachidonic acid mobilization.
FEBS Lett. 531:2-6.
3.
Kudo, I. and M. Murakami. 2002. Phospholipase A2 enzymes. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69:3-58.
4.
Chiba, H., H. Michibata, K. Wakimoto, M. Seishima, S. Kawasaki, K. Okubo, H. Mitsui, H. Torii, and Y. Imai. 2004.
Cloning of a gene for a novel epithelium-specific cytosolic phospholipase A2, cPLA2delta, induced in psoriatic skin.
J.Biol.Chem. 279:12890-12897.
20
5.
Balsinde, J. and E. A. Dennis. 1997. Function and inhibition of intracellular calcium-independent phospholipase A2.
J.Biol.Chem. 272:16069-16072.
6.
Winstead, M. V., J. Balsinde, and E. A. Dennis. 2000. Calcium-independent phospholipase A2: structure and function.
Biochim.Biophys.Acta 1488:28-39.
7.
Balsinde, J., R. Perez, Y. Saez, and MA. Balboa. 2004. Arachidonate Remodeling and Inflammation. AN. Fonteh and
RL. Wykle, eds. Birkhäuser Verlag Basel, pp. 61-72.
8.
Barbour, S., S. Al-Damarki, and A. Manguikian. 2004. Arachidonate Remodeling and Inflammation. AN. Fonteh and RL.
Wykle, eds. Birkhäuser Verlag Basel, pp. 13-36.
9.
Tanaka, H., R. Takeya, and H. Sumimoto. 2000. A novel intracellular membrane-bound calcium-independent
phospholipase A2. Biochem.Biophys.Res.Commun. 272:320-326.
10.
Mancuso, D. J., C. M. Jenkins, and R. W. Gross. 2000. The genomic organization, complete mRNA sequence, cloning,
and expression of a novel human intracellular membrane-associated calcium-independent phospholipase A2.
J.Biol.Chem. 275:9937-9945.
11.
Tanaka, H., R. Minakami, H. Kanaya, and H. Sumimoto. 2004. Catalytic residues of group VIB calcium-independent
phospholipase A2 (iPLA2gamma). Biochem.Biophys.Res.Commun. 320:1284-1290.
12.
Mancuso, D. J., C. M. Jenkins, H. F. Sims, J. M. Cohen, J. Yang, and R. W. Gross. 2004. Complex transcriptional and
translational regulation of iPLAgamma resulting in multiple gene products containing dual competing sites for
mitochondrial or peroxisomal localization. Eur.J.Biochem. 271:4709-4724.
13.
Murakami, M., S. Masuda, K. Ueda-Semmyo, E. Yoda, H. Kuwata, Y. Takanezawa, J. Aoki, H. Arai, H. Sumimoto, Y.
Ishikawa, T. Ishii, Y. Nakatani, and I. Kudo. 2005. Group VIB Ca2+-independent phospholipase A2gamma promotes
cellular membrane hydrolysis and prostaglandin production in a manner distinct from other intracellular phospholipases
A2. J.Biol.Chem. 280:14028-14041.
14.
Jenkins, C. M., D. J. Mancuso, W. Yan, H. F. Sims, B. Gibson, and R. W. Gross. 2004. Identification, cloning,
expression, and purification of three novel human calcium-independent phospholipase A2 family members possessing
triacylglycerol lipase and acylglycerol transacylase activities. J.Biol.Chem. 279:48968-48975.
15.
Tang, J., R. W. Kriz, N. Wolfman, M. Shaffer, J. Seehra, and S. S. Jones. 1997. A novel cytosolic calcium-independent
phospholipase A2 contains eight ankyrin motifs. J.Biol.Chem. 272:8567-8575.
16.
Balboa, M. A., J. Balsinde, S. S. Jones, and E. A. Dennis. 1997. Identity between the Ca2+-independent phospholipase
A2 enzymes from P388D1 macrophages and Chinese hamster ovary cells. J.Biol.Chem. 272:8576-8580.
17.
Larsson, P. K., H. E. Claesson, and B. P. Kennedy. 1998. Multiple splice variants of the human calcium-independent
phospholipase A2 and their effect on enzyme activity. J.Biol.Chem. 273:207-214.
18.
Ma, Z., X. Wang, W. Nowatzke, S. Ramanadham, and J. Turk. 1999. Human pancreatic islets express mRNA species
encoding two distinct catalytically active isoforms of group VI phospholipase A2 (iPLA2) that arise from an exonskipping mechanism of alternative splicing of the transcript from the iPLA2 gene on chromosome 22q13.1. J.Biol.Chem.
274:9607-9616.
19.
Ackermann, E. J. and E. A. Dennis. 1995. Mammalian calcium-independent phospholipase A2. Biochim.Biophys.Acta
1259:125-136.
21
20.
Ma, Z. and J. Turk. 2001. The molecular biology of the group VIA Ca2+-independent phospholipase A2. Prog .Nucleic
Acid Res. Mol. Biol 67:1-33.
21.
Lio, Y. C. and E. A. Dennis. 1998. Interfacial activation, lysophospholipase and transacylase activity of group VI Ca2+independent phospholipase A2. Biochim. Biophys. Acta 1392:320-332.
22.
Ackermann, E. J., K. Conde-Frieboes, and E. A. Dennis. 1995. Inhibition of macrophage Ca(2+)-independent
phospholipase A2 by bromoenol lactone and trifluoromethyl ketones. J.Biol.Chem. 270:445-450.
23.
Lio, Y. C., L. J. Reynolds, J. Balsinde, and E. A. Dennis. 1996. Irreversible inhibition of Ca(2+)-independent
phospholipase A2 by methyl arachidonyl fluorophosphonate. Biochim. Biophys. Acta 1302: 55-60.
24.
Conde-Frieboes, K., L. J. Reynolds, Y. C. Lio, M. R. Hale, H. H. Wasserman, and E. A. Dennis. 1995. J. Am. Chem.
Soc. 118:5519-5525.
25.
Hazen, S. L., L. A. Zupan, R. H. Weiss, D. P. Getman, and R. W. Gross. 1991. Suicide inhibition of canine myocardial
cytosolic calcium-independent phospholipase A2. Mechanism-based discrimination between calcium-dependent and independent phospholipases A2. J.Biol.Chem. 266:7227-7232.
26.
Balsinde, J. and E. A. Dennis. 1996. Distinct roles in signal transduction for each of the phospholipase A2 enzymes
present in P388D1 macrophages. J. Biol. Chem. 271: 6758-6765.
27.
Daniels, S. B., E. Cooney, M. J. Sofia, P. K. Chakravarty, and J. A. Katzenellenbogen. 1983. Haloenol lactones. Potent
enzyme-activated irreversible inhibitors for alpha-chymotrypsin. J.Biol.Chem. 258:15046-15053.
28.
Balsinde, J. and E. A. Dennis. 1996. Bromoenol lactone inhibits magnesium-dependent phosphatidate phosphohydrolase
and blocks triacylglycerol biosynthesis in mouse P388D1 macrophages. J. Biol. Chem. 271: 31937-31941.
29.
Fuentes, L., R. Perez, M. L. Nieto, J. Balsinde, and M. A. Balboa. 2003. Bromoenol lactone promotes cell death by a
mechanism involving phosphatidate phosphohydrolase-1 rather than calcium-independent phospholipase A2. J. Biol.
Chem. 278:44683-44690.
30.
Ramanadham, S., F. F. Hsu, A. Bohrer, Z. Ma, and J. Turk. 1999. Studies of the role of group VI phospholipase A2 in
fatty acid incorporation, phospholipid remodeling, lysophosphatidylcholine generation, and secretagogue-induced
arachidonic acid release in pancreatic islets and insulinoma cells. J.Biol.Chem. 274:13915-13927.
31.
Hsu, F. F., Z. Ma, M. Wohltmann, A. Bohrer, W. Nowatzke, S. Ramanadham, and J. Turk. 2000. Electrospray
ionization/mass spectrometric analyses of human promonocytic U937 cell glycerolipids and evidence that differentiation
is associated with membrane lipid composition changes that facilitate phospholipase A2 activation. J.Biol.Chem.
275:16579-16589.
32.
Beltramo, M., E. Di Tomaso, and D. Piomelli. 1997. Inhibition of anandamide hydrolysis in rat brain tissue by (E)-6(bromomethylene) tetrahydro-3-(1-naphthalenyl)-2H-pyran-2-one. FEBS Lett. 403:263-267.
33.
Balboa, M. A., J. Balsinde, and E. A. Dennis. 1998. Involvement of phosphatidate phosphohydrolase in arachidonic acid
mobilization in human amnionic WISH cells. J.Biol.Chem. 273:7684-7690.
34.
Jenkins, C. M., X. Han, D. J. Mancuso, and R. W. Gross. 2002. Identification of calcium-independent phospholipase A2
(iPLA2) beta, and not iPLA2gamma, as the mediator of arginine vasopressin-induced arachidonic acid release in A-10
smooth muscle cells. Enantioselective mechanism-based discrimination of mammalian iPLA2s. J.Biol.Chem. 277:3280732814.
22
35.
Cummings, B. S., J. McHowat, and R. G. Schnellmann. 2002. Role of an endoplasmic reticulum Ca(2+)-independent
phospholipase A(2) in oxidant-induced renal cell death. Am.J.Physiol Renal Physiol 283:F492-F498.
36.
Balsinde, J., M. A. Balboa, and E. A. Dennis. 1997. Antisense inhibition of group VI Ca2+-independent phospholipase
A2 blocks phospholipid fatty acid remodeling in murine P388D1 macrophages. J.Biol.Chem. 272:29317-29321.
37.
Carnevale, K. A. and M. K. Cathcart. 2001. Calcium-independent phospholipase A(2) is required for human monocyte
chemotaxis to monocyte chemoattractant protein 1. J.Immunol. 167:3414-3421.
38.
Akiba, S., S. Mizunaga, K. Kume, M. Hayama, and T. Sato. 1999. Involvement of group VI Ca2+-independent
phospholipase A2 in protein kinase C-dependent arachidonic acid liberation in zymosan-stimulated macrophage-like
P388D1 cells. J.Biol.Chem. 274:19906-19912.
39.
Smani, T., S. I. Zakharov, E. Leno, P. Csutora, E. S. Trepakova, and V. M. Bolotina. 2003. Ca2+-independent
phospholipase A2 is a novel determinant of store-operated Ca2+ entry. J.Biol.Chem. 278:11909-11915.
40.
Su, X., D. J. Mancuso, P. E. Bickel, C. M. Jenkins, and R. W. Gross. 2004. Small interfering RNA knockdown of
calcium-independent phospholipases A2 beta or gamma inhibits the hormone-induced differentiation of 3T3-L1
preadipocytes. J.Biol.Chem. 279:21740-21748.
41.
Shinzawa, K. and Y. Tsujimoto. 2003. PLA2 activity is required for nuclear shrinkage in caspase-independent cell death.
J.Cell Biol. 163:1219-1230.
42.
Murakami, M., S. Shimbara, T. Kambe, H. Kuwata, M. V. Winstead, J. A. Tischfield, and I. Kudo. 1998. The functions
of five distinct mammalian phospholipase A2S in regulating arachidonic acid release. Type IIa and type V secretory
phospholipase A2S are functionally redundant and act in concert with cytosolic phospholipase A2. J.Biol.Chem.
273:14411-14423.
43.
Ma, Z., S. Ramanadham, M. Wohltmann, A. Bohrer, F. F. Hsu, and J. Turk. 2001. Studies of insulin secretory responses
and of arachidonic acid incorporation into phospholipids of stably transfected insulinoma cells that overexpress group
VIA phospholipase A2 (iPLA2beta ) indicate a signaling rather than a housekeeping role for iPLA2beta. J.Biol.Chem.
276:13198-13208.
44.
Perez, R., R. Melero, M. A. Balboa, and J. Balsinde. 2004. Role of group VIA calcium-independent phospholipase A2 in
arachidonic acid release, phospholipid fatty acid incorporation, and apoptosis in U937 cells responding to hydrogen
peroxide. J.Biol.Chem. 279:40385-40391.
45.
Bao, S., D. J. Miller, Z. Ma, M. Wohltmann, G. Eng, S. Ramanadham, K. Moley, and J. Turk. 2004. Male mice that do
not express group VIA phospholipase A2 produce spermatozoa with impaired motility and have greatly reduced fertility.
J.Biol.Chem. 279:38194-38200.
46.
Chilton, F. H., A. N. Fonteh, M. E. Surette, M. Triggiani, and J. D. Winkler. 1996. Control of arachidonate levels within
inflammatory cells. Biochim.Biophys.Acta 1299:1-15.
47.
Balsinde, J., B. Fernandez, and J. A. Solis-Herruzo. 1994. Increased incorporation of arachidonic acid into phospholipids
in zymosan-stimulated mouse peritoneal macrophages. Eur.J.Biochem. 221:1013-1018.
48.
Balsinde, J., I. D. Bianco, E. J. Ackermann, K. Conde-Frieboes, and E. A. Dennis. 1995. Inhibition of calciumindependent phospholipase A2 prevents arachidonic acid incorporation and phospholipid remodeling in P388D1
macrophages. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92:8527-8531.
49.
Daniele, J. J., G. D. Fidelio, and I. D. Bianco. 1999. Calcium dependency of arachidonic acid incorporation into cellular
23
phospholipids of different cell types. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 57:341-350.
50.
Alzola, E., A. Perez-Etxebarria, E. Kabre, D. J. Fogarty, M. Metioui, N. Chaib, J. M. Macarulla, C. Matute, J. P. Dehaye,
and A. Marino. 1998. Activation by P2X7 agonists of two phospholipases A2 (PLA2) in ductal cells of rat submandibular
gland. Coupling of the calcium-independent PLA2 with kallikrein secretion. J.Biol.Chem. 273:30208-30217.
51.
Birbes, H., S. Drevet, J. F. Pageaux, M. Lagarde, and C. Laugier. 2000. Involvement of calcium-independent
phospholipase A2 in uterine stromal cell phospholipid remodelling. Eur. J. Biochem. 267:7118-7127.
52.
Chiu, C. H. and S. Jackowski. 2001. Role of calcium-independent phospholipases (iPLA(2)) in phosphatidylcholine
metabolism. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287:600-606.
53.
Balsinde, J. 2002. Roles of various phospholipases A2 in providing lysophospholipid acceptors for fatty acid
phospholipid incorporation and remodelling. Biochem.J. 364:695-702.
54.
Boilard, E. and M. E. Surette. 2001. Anti-CD3 and concanavalin A-induced human T cell proliferation is associated with
an increased rate of arachidonate-phospholipid remodeling. Lack of involvement of group IV and group VI
phospholipase A2 in remodeling and increased susceptibility of proliferating T cells to CoA-independent transacyclase
inhibitor-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 276: 17568-17575.
55.
Hirabayashi, T., T. Murayama, and T. Shimizu. 2004. Regulatory mechanism and physiological role of cytosolic
phospholipase A2. Biol. Pharm. Bull. 27:1168-1173.
56.
Akiba, S. and T. Sato. 2004. Cellular function of calcium-independent phospholipase A2. Biol. Pharm. Bull. 27:11741178.
57.
Steer, S. A., K. C. Wirsig, M. H. Creer, D. A. Ford, and J. McHowat. 2002. Regulation of membrane-associated iPLA2
activity by a novel PKC isoform in ventricular myocytes. Am. J. Physiol Cell Physiol 283:C1621-C1626.
58.
Yellaturu, C. R. and G. N. Rao. 2003. A requirement for calcium-independent phospholipase A2 in thrombin-induced
arachidonic acid release and growth in vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 278:43831-43837.
59.
Birbes, H., E. Gothie, J. F. Pageaux, M. Lagarde, and C. Laugier. 2000. Hydrogen peroxide activation of Ca(2+)independent phospholipase A(2) in uterine stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276:613-618.
60.
Martinez, J. and J. J. Moreno. 2001. Role of Ca2+-independent phospholipase A2 on arachidonic acid release induced by
reactive oxygen species. Arch. Biochem. Biophys. 392:257-262.
61.
Maggi, L. B., Jr., J. M. Moran, A. L. Scarim, D. A. Ford, J. W. Yoon, J. McHowat, R. M. Buller, and J. A. Corbett. 2002.
Novel role for calcium-independent phospholipase A(2) in the macrophage antiviral response of inducible nitric-oxide
synthase expression. J.Biol.Chem. 277:38449-38455.
62.
Jenkins, C. M., M. J. Wolf, D. J. Mancuso, and R. W. Gross. 2001. Identification of the calmodulin-binding domain of
recombinant calcium-independent phospholipase A2beta. implications for structure and function. J.Biol.Chem. 276:71297135.
63.
Conricode, K. M., K. A. Brewer, and J. H. Exton. 1992. Activation of phospholipase D by protein kinase C. Evidence for
a phosphorylation-independent mechanism. J.Biol.Chem. 267:7199-7202.
64.
Wang, Z., S. Ramanadham, Z. A. Ma, S. Bao, D. J. Mancuso, R. W. Gross, and J. Turk. 2005. Group VIA phospholipase
A2 forms a signaling complex with the calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIbeta expressed in pancreatic islet
beta-cells. J.Biol.Chem. 280:6840-6849.
24
65.
Tay, H. K. and A. J. Melendez. 2004. Fcgamma RI-triggered generation of arachidonic acid and eicosanoids requires
iPLA2 but not cPLA2 in human monocytic cells. J.Biol.Chem. 279:22505-22513.
66.
Akiba, S., S. Ohno, M. Chiba, K. Kume, M. Hayama, and T. Sato. 2002. Protein kinase Calpha-dependent increase in
Ca2+-independent phospholipase A2 in membranes and arachidonic acid liberation in zymosan-stimulated macrophagelike P388D1 cells. Biochem.Pharmacol. 63:1969-1977.
67.
Mosavi, L. K., T. J. Cammett, D. C. Desrosiers, and Z. Y. Peng. 2004. The ankyrin repeat as molecular architecture for
protein recognition. Protein Sci. 13:1435-1448.
68.
Ackermann, E. J., E. S. Kempner, and E. A. Dennis. 1994. Ca(2+)-independent cytosolic phospholipase A2 from
macrophage-like P388D1 cells. Isolation and characterization. J.Biol.Chem. 269:9227-9233.
69.
Larsson Forsell, P. K., B. P. Kennedy, and H. E. Claesson. 1999. The human calcium-independent phospholipase A2
gene multiple enzymes with distinct properties from a single gene. Eur.J.Biochem. 262:575-585.
70.
Manguikian, A. D. and S. E. Barbour. 2004. Cell cycle dependence of group VIA calcium-independent phospholipase A2
activity. J.Biol.Chem. 279:52881-52892.
71.
Atsumi, G., M. Tajima, A. Hadano, Y. Nakatani, M. Murakami, and I. Kudo. 1998. Fas-induced arachidonic acid release
is mediated by Ca2+-independent phospholipase A2 but not cytosolic phospholipase A2, which undergoes proteolytic
inactivation. J.Biol.Chem. 273:13870-13877.
72.
Atsumi, G., M. Murakami, K. Kojima, A. Hadano, M. Tajima, and I. Kudo. 2000. Distinct roles of two intracellular
phospholipase A2s in fatty acid release in the cell death pathway. Proteolytic fragment of type IVA cytosolic
phospholipase A2alpha inhibits stimulus-induced arachidonate release, whereas that of type VI Ca2+-independent
phospholipase A2 augments spontaneous fatty acid release. J.Biol.Chem. 275:18248-18258.
73.
Lauber, K., E. Bohn, S. M. Krober, Y. J. Xiao, S. G. Blumenthal, R. K. Lindemann, P. Marini, C. Wiedig, A.
Zobywalski, S. Baksh, Y. Xu, I. B. Autenrieth, K. Schulze-Osthoff, C. Belka, G. Stuhler, and S. Wesselborg. 2003.
Apoptotic cells induce migration of phagocytes via caspase-3-mediated release of a lipid attraction signal. Cell 113:717730.
74.
Ramanadham, S., F. F. Hsu, S. Zhang, C. Jin, A. Bohrer, H. Song, S. Bao, Z. Ma, and J. Turk. 2004. Apoptosis of insulinsecreting cells induced by endoplasmic reticulum stress is amplified by overexpression of group VIA calciumindependent phospholipase A2 (iPLA2 beta) and suppressed by inhibition of iPLA2 beta. Biochemistry 43:918-930.
75.
Barbour, S. E., A. Kapur, and C. L. Deal. 1999. Regulation of phosphatidylcholine homeostasis by calcium-independent
phospholipase A2. Biochim.Biophys.Acta 1439:77-88.
76.
Baburina, I. and S. Jackowski. 1999. Cellular responses to excess phospholipid. J.Biol.Chem. 274:9400-9408.
77.
Roshak, A. K., E. A. Capper, C. Stevenson, C. Eichman, and L. A. Marshall. 2000. Human calcium-independent
phospholipase A2 mediates lymphocyte proliferation. J.Biol.Chem. 275:35692-35698.
78.
Uozumi, N., K. Kume, T. Nagase, N. Nakatani, S. Ishii, F. Tashiro, Y. Komagata, K. Maki, K. Ikuta, Y. Ouchi, J.
Miyazaki, and T. Shimizu. 1997. Role of cytosolic phospholipase A2 in allergic response and parturition. Nature
390:618-622.
79.
Bonventre, J. V., Z. Huang, M. R. Taheri, E. O'Leary, E. Li, M. A. Moskowitz, and A. Sapirstein. 1997. Reduced fertility
and postischaemic brain injury in mice deficient in cytosolic phospholipase A2. Nature 390:622-625.
25
80.
Diaz, B. L. and J. P. Arm. 2003. Phospholipase A(2). Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 69:87-97.
81.
Balsinde, J., M. A. Balboa, and E. A. Dennis. 2000. Identification of a third pathway for arachidonic acid mobilization
and prostaglandin production in activated P388D1 macrophage-like cells. J.Biol.Chem. 275:22544-22549.
82.
Han, W. K., A. Sapirstein, C. C. Hung, A. Alessandrini, and J. V. Bonventre. 2003. Cross-talk between cytosolic
phospholipase A2 alpha (cPLA2 alpha) and secretory phospholipase A2 (sPLA2) in hydrogen peroxide-induced
arachidonic acid release in murine mesangial cells: sPLA2 regulates cPLA2 alpha activity that is responsible for
arachidonic acid release. J.Biol.Chem. 278:24153-24163.
83.
Panini, S. R., L. Yang, A. E. Rusinol, M. S. Sinensky, J. V. Bonventre, and C. C. Leslie. 2001. Arachidonate metabolism
and the signaling pathway of induction of apoptosis by oxidized LDL/oxysterol. J.Lipid Res. 42:1678-1686.
84.
Marshall, J., E. Krump, T. Lindsay, G. Downey, D. A. Ford, P. Zhu, P. Walker, and B. Rubin. 2000. Involvement of
cytosolic phospholipase A2 and secretory phospholipase A2 in arachidonic acid release from human neutrophils.
J.Immunol. 164:2084-2091.
85.
Gross, R. W., A. E. Rudolph, J. Wang, C. D. Sommers, and M. J. Wolf. 1995. Nitric oxide activates the glucosedependent mobilization of arachidonic acid in a macrophage-like cell line (RAW 264.7) that is largely mediated by
calcium-independent phospholipase A2. J.Biol.Chem. 270:14855-14858.
86.
Larsson Forsell, P. K., G. Runarsson, M. Ibrahim, M. Bjorkholm, and H. E. Claesson. 1998. On the expression of
cytosolic calcium-independent phospholipase A2 (88kDa) in immature and mature myeloid cells and its role in
leukotriene synthesis in human granulocytes. FEBS Lett. 434:295-299.
87.
Balboa, M. A. and J. Balsinde. 2002. Involvement of calcium-independent phospholipase A2 in hydrogen peroxideinduced accumulation of free fatty acids in human U937 cells. J.Biol.Chem. 277:40384-40389.
88.
Murakami, M., T. Kambe, S. Shimbara, and I. Kudo. 1999. Functional coupling between various phospholipase A2s and
cyclooxygenases in immediate and delayed prostanoid biosynthetic pathways. J.Biol.Chem. 274:3103-3115.
89.
Akiba, S., M. Hayama, and T. Sato. 1998. Inhibition of Ca2+-independent phospholipase A2 by bromoenol lactone
attenuates prostaglandin generation induced by interleukin-1 beta and dibutyryl cAMP in rat mesangial cells. FEBS Lett.
437:225-228.
90.
Ramanadham, S., R. W. Gross, X. Han, and J. Turk. 1993. Inhibition of arachidonate release by secretagogue-stimulated
pancreatic islets suppresses both insulin secretion and the rise in beta-cell cytosolic calcium ion concentration.
Biochemistry 32:337-346.
91.
Ma, Z., S. Zhang, J. Turk, and S. Ramanadham. 2002. Stimulation of insulin secretion and associated nuclear
accumulation of iPLA(2)beta in INS-1 insulinoma cells. Am.J.Physiol Endocrinol.Metab 282:E820-E833.
92.
Lauber, K., S. G. Blumenthal, M. Waibel, and S. Wesselborg. 2004. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the
corpses. Mol.Cell 14:277-287.
93.
Kim, S. J., D. Gershov, X. Ma, N. Brot, and K. B. Elkon. 2002. I-PLA(2) activation during apoptosis promotes the
exposure of membrane lysophosphatidylcholine leading to binding by natural immunoglobulin M antibodies and
complement activation. J.Exp.Med. 196:655-665.
94.
Balboa, M. A., Y. Saez, and J. Balsinde. 2003. Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion
in U937 promonocytes. J.Immunol. 170:5276-5280.
26
95.
Isenovic, E. and M. C. LaPointe. 2000. Role of Ca(2+)-independent phospholipase A(2) in the regulation of inducible
nitric oxide synthase in cardiac myocytes. Hypertension 35:249-254.
96.
Walev, I., J. Klein, M. Husmann, A. Valeva, S. Strauch, H. Wirtz, O. Weichel, and S. Bhakdi. 2000. Potassium regulates
IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2. J.Immunol. 164:5120-5124.
97.
Moran, J. M., R. M. Buller, J. McHowat, J. Turk, M. Wohltmann, R. W. Gross, and J. A. Corbett. 2005. Genetic and
pharmacologic evidence that calcium-independent phospholipase A2beta regulates virus-induced inducible nitric-oxide
synthase expression by macrophages. J Biol Chem. 280:28162-28168.
98.
McHowat, J., S. Liu, and M. H. Creer. 1998. Selective hydrolysis of plasmalogen phospholipids by Ca2+-independent
PLA2 in hypoxic ventricular myocytes. Am.J.Physiol 274:C1727-C1737.
99.
Mancuso, D. J., D. R. Abendschein, C. M. Jenkins, X. Han, J. E. Saffitz, R. B. Schuessler, and R. W. Gross. 2003.
Cardiac ischemia activates calcium-independent phospholipase A2beta, precipitating ventricular tachyarrhythmias in
transgenic mice: rescue of the lethal electrophysiologic phenotype by mechanism-based inhibition. J.Biol.Chem.
278:22231-22236.
100.
Albert, A. P. and W. A. Large. 2003. Store-operated Ca2+-permeable non-selective cation channels in smooth muscle
cells. Cell Calcium 33:345-356.
101.
Wolf, M. J., J. Wang, J. Turk, and R. W. Gross. 1997. Depletion of intracellular calcium stores activates smooth muscle
cell calcium-independent phospholipase A2. A novel mechanism underlying arachidonic acid mobilization. J.Biol.Chem.
272:1522-1526.
102.
Nowatzke, W., S. Ramanadham, Z. Ma, F. F. Hsu, A. Bohrer, and J. Turk. 1998. Mass spectrometric evidence that agents
that cause loss of Ca2+ from intracellular compartments induce hydrolysis of arachidonic acid from pancreatic islet
membrane phospholipids by a mechanism that does not require a rise in cytosolic Ca2+ concentration. Endocrinology
139:4073-4085.
103.
Smani, T., S. I. Zakharov, P. Csutora, E. Leno, E. S. Trepakova, and V. M. Bolotina. 2004. A novel mechanism for the
store-operated calcium influx pathway. Nat.Cell Biol. 6:113-120.
104.
Seno, K., T. Okuno, K. Nishi, Y. Murakami, F. Watanabe, T. Matsuura, M. Wada, Y. Fujii, M. Yamada, T. Ogawa, T.
Okada, H. Hashizume, M. Kii, S. Hara, S. Hagishita, S. Nakamoto, K. Yamada, Y. Chikazawa, M. Ueno, I. Teshirogi, T.
Ono, and M. Ohtani. 2000. Pyrrolidine inhibitors of human cytosolic phospholipase A(2). J.Med.Chem. 43:1041-1044.
105.
Seno, K., T. Okuno, K. Nishi, Y. Murakami, K. Yamada, S. Nakamoto, and T. Ono. 2001. Pyrrolidine inhibitors of
human cytosolic phospholipase A2. Part 2: synthesis of potent and crystallized 4-triphenylmethylthio derivative
'pyrrophenone'. Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:587-590.
106.
Ono, T., K. Yamada, Y. Chikazawa, M. Ueno, S. Nakamoto, T. Okuno, and K. Seno. 2002. Characterization of a novel
inhibitor of cytosolic phospholipase A2alpha, pyrrophenone. Biochem. J. 363:727-735.
107.
Blank, M. L., Z. L. Smith, and F. Snyder. 1992. Contributing factors in the trafficking of [3H]arachidonate between
phospholipids. Biochim. Biophys. Acta 1124:262-272.
108.
Surette, M. E., A. N. Fonteh, C. Bernatchez, and F. H. Chilton. 1999. Perturbations in the control of cellular arachidonic
acid levels block cell growth and induce apoptosis in HL-60 cells. Carcinogenesis 20:757-763.
109.
Chomczynski, P. and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156-159.
27
110.
Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.
111.
Diez E, J. Balsinde, M. Aracil, and A. Schüller. 1987. Ethanol induces release of arachidonic acid but not synthesis of
eicosanoids in mouse peritoneal macrophages. Biochim. Biophys. Acta 921: 82-89.
112.
Bligh, E. G. and W. J. Dyer. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol
37:911-917.
113.
Balsinde J., B. Fernández, J. A. Solís-Herruzo, and E. Diez. 1992. Pathways for arachidonic acid mobilization in
zymosan-stimulated mouse peritoneal macrophages. Biochim. Biophys. Acta 1136: 75-82.
114.
Balboa, M. A., J. Balsinde, D. A. Dillon, G. M. Carman, and E. A. Dennis. (1999) Proinflammatory macrophageactivating properties of the novel phospholipid diacylglycerol pyrophosphate. J. Biol. Chem. 274: 522-526.
115.
Murakami, M. and I. Kudo. 2002. Phospholipase A2. J. Biochem. (Tokyo) 131: 285-292.
116.
Fitzpatrick, F. A. and R. Soberman. 2001. Regulated formation of eicosanoids. J. Clin. Invest 107: 1347-1351.
117.
Rao, G. N., M. S. Runge, and R. W. Alexander. 1995. Hydrogen peroxide activation of cytosolic phospholipase A2 in
vascular smooth muscle cells. Biochim. Biophys. Acta 1265: 67-72.
118.
Boyer, C. S., G. L. Bannenberg, E. P. Neve, A. Ryrfeldt, and P. Moldeus. 1995. Evidence for the activation of the signalresponsive phospholipase A2 by exogenous hydrogen peroxide. Biochem. Pharmacol. 50: 753-761.
119.
Samanta, S., M. S. Perkinton, M. Morgan, and R. J. Williams. 1998. Hydrogen peroxide enhances signal-responsive
arachidonic acid release from neurons: role of mitogen-activated protein kinase. J. Neurochem. 70: 2082-2090.
120.
Sporn, P. H., T. M. Marshall, and M. Peters-Golden. 1992. Hydrogen peroxide increases the availability of arachidonic
acid for oxidative metabolism by inhibiting acylation into phospholipids in the alveolar macrophage. Am. J. Respir. Cell
Mol. Biol. 7: 307-316.
121.
Cane, A., M. Breton, K. Koumanov, G. Bereziat, and O. Colard. 1998. Oxidant-induced arachidonic acid release and
impairment of fatty acid acylation in vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol 274: C1040-C1046.
122.
Balsinde, J., B. Fernández, and E. Diez. 1990. Regulation of arachidonic acid release in mouse peritoneal macrophages.
The role of extracellular calcium and protein kinase C. J. Immunol. 144: 4298-4304.
123.
Ghomashchi, F., A. Stewart, Y. Hefner, S. Ramanadham, J. Turk, C. C. Leslie, and M. H. Gelb. 2001. A pyrrolidinebased specific inhibitor of cytosolic phospholipase A(2)alpha blocks arachidonic acid release in a variety of mammalian
cells. Biochim. Biophys. Acta 1513: 160-166.
124.
Zupan, L. A., R. H. Weiss, S. L. Hazen, B. L. Parnas, K. W. Aston, P. J. Lennon, D. P. Getman, and R. W. Gross. 1993.
Structural determinants of haloenol lactone-mediated suicide inhibition of canine myocardial calcium-independent
phospholipase A2. J. Med. Chem. 36:95-100.
125.
Martin, A., A. Gomez-Munoz, P. A. Duffy, and D. N. Brindley. 1994. Signal-Activated Phospholipases. M. Liscovitch,
ed. Landes Co., Austin, TX, pp. 139-164.
126.
Brindley, D. N., D. English, C. Pilquil, K. Buri, and Z. C. Ling. 2002. Lipid phosphate phosphatases regulate signal
transduction through glycerolipids and sphingolipids. Biochim. Biophys. Acta 1582:33-44.
127.
Han, G. S., W. I. Wu, and G. M. Carman. 2006. The Saccharomyces cerevisiae lipin homolog Is a Mg2+-dependent
28
phosphatidate phosphatase enzyme. J. Biol. Chem. 281:9210-9218.
128.
Devitt, A., O. D. Moffatt, C. Raykundalia, J. D. Capra, D. L. Simmons, and C. D. Gregory. 1998. Human CD14 mediates
recognition and phagocytosis of apoptotic cells. Nature 392:505-509.
129.
Fadok, V. A., D. L. Bratton, D. M. Rose, A. Pearson, R. A. Ezekewitz, and P. M. Henson. 2000. A receptor for
phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells. Nature 405:85-90.
130.
Bratton, D. L., E. Dreyer, J. M. Kailey, V. A. Fadok, K. L. Clay, and P. M. Henson. 1992. The mechanism of
internalization of platelet-activating factor in activated human neutrophils. Enhanced transbilayer movement across the
plasma membrane. J. Immunol. 148:514-523.
131.
Fadok, V. A., A. de Cathelineau, D. L. Daleke, P. M. Henson, and D. L. Bratton. 2001. Loss of phospholipid asymmetry
and surface exposure of phosphatidylserine is required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and
fibroblasts. J. Biol. Chem. 276:1071-1077.
132.
Martin, S. J., C. P. Reutelingsperger, A. J. McGahon, J. A. Rader, R. C. van Schie, D. M. LaFace, and D. R. Green. 1995.
Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating
stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J.Exp.Med. 182:1545-1556.
133.
Hoffmann, P. R., A. M. deCathelineau, C. A. Ogden, Y. Leverrier, D. L. Bratton, D. L. Daleke, A. J. Ridley, V. A.
Fadok, and P. M. Henson. 2001. Phosphatidylserine (PS) induces PS receptor-mediated macropinocytosis and promotes
clearance of apoptotic cells. J.Cell Biol. 155:649-659.
134.
Ashkenazi, A. and V. M. Dixit. 1998. Death receptors: signaling and modulation. Science 281:1305-1308.
135.
Thornberry, N. A. and Y. Lazebnik. 1998. Caspases: enemies within. Science 281:1312-1316.
136.
Chen, M. and J. Wang. 2002. Initiator caspases in apoptosis signaling pathways. Apoptosis. 7:313-319.
137.
Earnshaw, W. C., L. M. Martins, and S. H. Kaufmann. 1999. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and
functions during apoptosis. Annu.Rev.Biochem. 68:383-424.
138.
Castedo, M., K. Ferri, T. Roumier, D. Metivier, N. Zamzami, and G. Kroemer. 2002. Quantitation of mitochondrial
alterations associated with apoptosis. J.Immunol.Methods 265:39-47.
139.
Li, P., D. Nijhawan, I. Budihardjo, S. M. Srinivasula, M. Ahmad, E. S. Alnemri, and X. Wang. 1997. Cytochrome c and
dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91:479-489.
140.
Ferri, K. F. and G. Kroemer. 2001. Organelle-specific initiation of cell death pathways. Nat.Cell Biol. 3:E255-E263.
141.
Sanchez, T. and J. J. Moreno. 2002. Calcium-independent phospholipase A2 through arachidonic acid mobilization is
involved in Caco-2 cell growth. J.Cell Physiol 193:293-298.
142.
Zou, H., Y. Li, X. Liu, and X. Wang. 1999. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome
that activates procaspase-9. J.Biol.Chem. 274:11549-11556.
143.
Soldani, C. and A. I. Scovassi. 2002. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 cleavage during apoptosis: an update. Apoptosis.
7:321-328.
144.
Zhu, H., H. O. Fearnhead, and G. M. Cohen. 1995. An ICE-like protease is a common mediator of apoptosis induced by
diverse stimuli in human monocytic THP.1 cells. FEBS Lett. 374:303-308.
29
145.
Balsinde, J., M. A. Balboa, P. A. Insel, and E. A. Dennis. 1999. Regulation and inhibition of phospholipase A2.
Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 39:175-189.
146.
Cui, Z. and M. Houweling. 2002. Phosphatidylcholine and cell death. Biochim.Biophys.Acta 1585:87-96.
147.
Balsinde, J. and E. A. Dennis. 1996. The incorporation of arachidonic acid into triacylglycerol in P388D1 macrophagelike cells. Eur.J.Biochem. 235:480-485.
148.
Horrobin, D. F. and C. N. Bennett. 1999. New gene targets related to schizophrenia and other psychiatric disorders:
enzymes, binding proteins and transport proteins involved in phospholipid and fatty acid metabolism. Prostaglandins
Leukot.Essent.Fatty Acids 60:141-167.
149.
Clark, J. D., N. Milona, and J. L. Knopf. 1990. Purification of a 110-kilodalton cytosolic phospholipase A2 from the
human monocytic cell line U937. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 87:7708-7712.
150.
Kramer, R. M., E. F. Roberts, J. Manetta, and J. E. Putnam. 1991. The Ca2(+)-sensitive cytosolic phospholipase A2 is a
100-kDa protein in human monoblast U937 cells. J.Biol.Chem. 266:5268-5272.
151.
Goppelt-Struebe, M., C. F. Koerner, G. Hausmann, D. Gemsa, and K. Resch. 1986. Control of prostanoid synthesis: role
of reincorporation of released precursor fatty acids. Prostaglandins 32:373-385.
152.
Kaever, V., M. Goppelt-Strube, and K. Resch. 1988. Enhancement of eicosanoid synthesis in mouse peritoneal
macrophages by the organic mercury compound thimerosal. Prostaglandins 35:885-902.
153.
Wagner, B. A., B. E. Britigan, K. J. Reszka, M. L. McCormick, and C. P. Burns. 2002. Hydrogen peroxide-induced
apoptosis of HL-60 human leukemia cells is mediated by the oxidants hypochlorous acid and chloramines.
Arch.Biochem.Biophys. 401:223-234.
154.
Wagner, B. A., G. R. Buettner, L. W. Oberley, C. J. Darby, and C. P. Burns. 2000. Myeloperoxidase is involved in
H2O2-induced apoptosis of HL-60 human leukemia cells. J.Biol.Chem. 275:22461-22469.
155.
Cao, Y., A. T. Pearman, G. A. Zimmerman, T. M. McIntyre, and S. M. Prescott. 2000. Intracellular unesterified
arachidonic acid signals apoptosis. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97:11280-11285.
156.
Grimsley, C. and K. S. Ravichandran. 2003. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me
signals. Trends Cell Biol 13:648-656.
157.
Nindl, G., N. R. Peterson, E. F. Hughes, L. R. Waite, and M. T. Johnson. 2004. Effect of hydrogen peroxide on
proliferation, apoptosis and interleukin-2 production of Jurkat T cells. Biomed.Sci.Instrum. 40:123-128.
158.
Balsinde, J. and M. A. Balboa. 2005. Cellular regulation and proposed biological functions of group VIA calciumindependent phospholipase A2 in activated cells. Cell Signal. 17:1052-1062.
159.
Lands, W. E. 2000. Stories about acyl chains. Biochim.Biophys.Acta 1483:1-14.
160.
Leslie, C. C. 2004. Regulation of arachidonic acid availability for eicosanoid production. Biochem.Cell Biol 82:1-17.
161.
Balsinde, J., S. E. Barbour, I. D. Bianco, and E. A. Dennis. 1994. Arachidonic acid mobilization in P388D1 macrophages
is controlled by two distinct Ca(2+)-dependent phospholipase A2 enzymes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 91:11060-11064.
162.
Yamashita, A., T. Sugiura, and K. Waku. 1997. Acyltransferases and transacylases involved in fatty acid remodeling of
phospholipids and metabolism of bioactive lipids in mammalian cells. J.Biochem.(Tokyo) 122:1-16.
30
163.
Taketo, M. M. and M. Sonoshita. 2002. Phospolipase A2 and apoptosis. Biochim.Biophys.Acta 1585:72-76.
164.
Doug, M., K. Guda, P. R. Nambiar, A. Rezaie, G. S. Belinsky, G. Lambeau, C. Giardina, and D. W. Rosenberg. 2003.
Inverse association between phospholipase A2 and COX-2 expression during mouse colon tumorigenesis. Carcinogenesis
24:307-315.
165.
Surette, M. E. and F. H. Chilton. 1998. The distribution and metabolism of arachidonate-containing phospholipids in
cellular nuclei. Biochem.J. 330 ( Pt 2):915-921.
166.
Joly, F., M. Breton, C. Wolf, E. Ninio, and O. Colard. 1992. Heterogeneity of arachidonate and paf-acether precursor
pools in mast cells. Biochim. Biophys. Acta 1125:305-312.
167.
Kaever, V., U. Firla, and K. Resch. 1988. Sulfhydryl reagents as model substances for eicosanoid research. Eicosanoids
1:49-57.
168.
Hartman, E. J., S. Omura, and M. Laposata. 1989. Triacsin C: a differential inhibitor of arachidonoyl-CoA synthetase and
nonspecific long chain acyl-CoA synthetase. Prostaglandins 37:655-671.
169.
Chilton, F. H., A. N. Fonteh, C. M. Sung, D. M. Hickey, T. J. Torphy, R. J. Mayer, L. A. Marshall, J. D. Heravi, and J. D.
Winkler. 1995. Inhibitors of CoA-independent transacylase block the movement of arachidonate into 1-ether-linked
phospholipids of human neutrophils. Biochemistry 34:5403-5410.
170.
Blank, M. L., Z. L. Smith, and F. Snyder. 1993. Arachidonate-containing triacylglycerols: biosynthesis and a lipolytic
mechanism for the release and transfer of arachidonate to phospholipids in HL-60 cells. Biochim. Biophys. Acta
1170:275-282.
171.
Lum, H. and K. A. Roebuck. 2001. Oxidant stress and endothelial cell dysfunction. Am.J.Physiol Cell Physiol 280:C719C741.
172.
Balsinde, J., M. A. Balboa, and E. A. Dennis. 1997. Inflammatory activation of arachidonic acid signaling in murine
P388D1 macrophages via sphingomyelin synthesis. J.Biol.Chem. 272:20373-20377.
173.
Cui, Z., M. Houweling, M. H. Chen, M. Record, H. Chap, D. E. Vance, and F. Terce. 1996. A genetic defect in
phosphatidylcholine biosynthesis triggers apoptosis in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 271:14668-14671.
174.
Gueguen, G., V. Granci, P. Rogalle, F. Briand-Mesange, M. Wilson, A. Klaebe, F. Terce, H. Chap, J. P. Salles, M. F.
Simon, and F. Gaits. 2002. A lysophosphatidic acid analogue is revealed as a potent inhibitor of phosphatidylcholine
synthesis, inducing apoptosis. Biochem. J. 368:447-459.
175.
Pettus, B. J., C. E. Chalfant, and Y. A. Hannun. 2002. Ceramide in apoptosis: an overview and current perspectives.
Biochim. Biophys. Acta 1585:114-125.
176.
van Blitterswijk, W. J., A. H. van der Luit, R. J. Veldman, M. Verheij, and J. Borst. 2003. Ceramide: second messenger
or modulator of membrane structure and dynamics? Biochem. J. 369:199-211.
177.
Siskind, L. J., R. N. Kolesnick, and M. Colombini. 2002. Ceramide channels increase the permeability of the
mitochondrial outer membrane to small proteins. J. Biol. Chem. 277:26796-26803.
178.
Degousee, N., F. Ghomashchi, E. Stefanski, A. Singer, B. P. Smart, N. Borregaard, R. Reithmeier, T. F. Lindsay, C.
Lichtenberger, W. Reinisch, G. Lambeau, J. Arm, J. Tischfield, M. H. Gelb, and B. B. Rubin. 2002. Groups IV, V, and X
phospholipases A2s in human neutrophils: role in eicosanoid production and gram-negative bacterial phospholipid
hydrolysis. J. Biol. Chem. 277:5061-5073.
31
179.
Bailleux, A., D. Wendum, F. Audubert, A. M. Jouniaux, K. Koumanov, G. Trugnan, and J. Masliah. 2004. Cytosolic
phospholipase A2-p11 interaction controls arachidonic acid release as a function of epithelial cell confluence. Biochem.J.
378:307-315.
180.
Sun, G. Y., J. Xu, M. D. Jensen, and A. Simonyi. 2004. Phospholipase A2 in the central nervous system: implications for
neurodegenerative diseases. J.Lipid Res. 45:205-213.
181.
Ravichandran, K. S. 2003. "Recruitment signals" from apoptotic cells: invitation to a quiet meal. Cell 113:817-820.
182.
Fadok, V. A. 2003. The sirens' call. Nat.Cell Biol. 5:697-699.
183.
Savill, J. and V. Fadok. 2000. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature 407:784-788.
184.
Arur, S., U. E. Uche, K. Rezaul, M. Fong, V. Scranton, A. E. Cowan, W. Mohler, and D. K. Han. 2003. Annexin I is an
endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment. Dev.Cell 4:587-598.
185.
Brown, S., I. Heinisch, E. Ross, K. Shaw, C. D. Buckley, and J. Savill. 2002. Apoptosis disables CD31-mediated cell
detachment from phagocytes promoting binding and engulfment. Nature 418:200-203.
186.
Moffatt, O. D., A. Devitt, E. D. Bell, D. L. Simmons, and C. D. Gregory. 1999. Macrophage recognition of ICAM-3 on
apoptotic leukocytes. J.Immunol. 162:6800-6810.
187.
Kronke, M. and S. Adam-Klages. 2002. Role of caspases in TNF-mediated regulation of cPLA(2). Febs Letters 531:1822.
188.
Bose, J., A. D. Gruber, L. Helming, S. Schiebe, I. Wegener, M. Hafner, M. Beales, F. Kontgen, and A. Lengeling. 2004.
The phosphatidylserine receptor has essential functions during embryogenesis but not in apoptotic cell removal. J.Biol.
3:15.
189.
Mitchell, J. E., M. Cvetanovic, N. Tibrewal, V. Patel, O. R. Colamonici, M. O. Li, R. A. Flavell, J. S. Levine, R. B.
Birge, and D. S. Ucker. 2006. The presumptive phosphatidylserine receptor is dispensable for innate anti-inflammatory
recognition and clearance of apoptotic cells. J. Biol. Chem. 281: 5718-5725.
190.
Kenis, H., H. van Genderen, N. M. Deckers, P. A. Lux, L. Hofstra, J. Narula, and C. P. Reutelingsperger. 2006. Annexin
A5 inhibits engulfment through internalization of PS-expressing cell membrane patches. Exp. Cell Res. 312: 719-726.
191.
Kabarowski, J. H., K. Zhu, L. Q. Le, O. N. Witte, and Y. Xu. 2001. Lysophosphatidylcholine as a ligand for the
immunoregulatory receptor G2A. Science 293: 702-705.
192.
Witte, O. N., J. H. Kabarowski, Y. Xu, L. Q. Le, and K. Zhu. 2005. Retraction. Science 307: 206.
193.
Yang, L. V., C. G. Radu, L. Wang, M. Riedinger, and O. N. Witte. 2005. Gi-independent macrophage chemotaxis to
lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood 105: 1127-1134.
194.
Wang, L., C. G. Radu, L. V. Yang, L. A. Bentolila, M. Riedinger, and O. N. Witte. 2005. Lysophosphatidylcholineinduced surface redistribution regulates signaling of the murine G protein-coupled receptor G2A. Mol.Biol. Cell 16:
2234-2247.
195.
Perez, R., X. Matabosch, A. Llebaria, M. A. Balboa, and J. Balsinde. 2006. Blockade of arachidonic acid incorporation
into phospholipids induces apoptosis in U937 promonocytic cells. J. Lipid Res. 47: 484-491.
196.
Chan, T. A., P. J. Morin, B. Vogelstein, and K. W. Kinzler. 1998. Mechanisms underlying nonsteroidal antiinflammatory
drug-mediated apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95: 681-686.
32
197.
Jayadev, S., C. M. Linardic, and Y. A. Hannun. 1994. Identification of arachidonic acid as a mediator of sphingomyelin
hydrolysis in response to tumor necrosis factor alpha. J. Biol. Chem. 269: 5757-5763.
198.
Jayadev, S., H. L. Hayter, N. Andrieu, C. J. Gamard, B. Liu, R. Balu, M. Hayakawa, F. Ito, and Y. A. Hannun. 1997.
Phospholipase A2 is necessary for tumor necrosis factor alpha-induced ceramide generation in L929 cells. J. Biol. Chem.
272: 17196-17203.
199.
Cai, Z., A. Bettaieb, N. E. Mahdani, L. G. Legres, R. Stancou, J. Masliah, and S. Chouaib. 1997. Alteration of the
sphingomyelin/ceramide pathway is associated with resistance of human breast carcinoma MCF7 cells to tumor necrosis
factor-alpha-mediated cytotoxicity. J. Biol. Chem. 272: 6918-6926.
200.
Monjazeb, A. M., C. E. Clay, K. P. High, and F. H. Chilton. 2002. Antineoplastic properties of arachidonic acid and its
metabolites. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 66: 5-12.
201.
Das, U. N. 1999. Essential fatty acids, lipid peroxidation and apoptosis. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 61:
157-163.
202.
Balboa, M. A., R. Pérez, and J. Balsinde. 2003. Amplification mechanisms mechanisms of inflammation: paracrine
stimulation of arachidonic acid mobilization by secreted phospholipase A2 is regulated by cytosolic phospholipase A2derived hydroperoxyeicosatetraenoic acid. J. Immunol. 171: 989-994.
203.
Balsinde, J., R. Pérez, and M. A. Balboa. 2006. Calcium-independent phospholipase A2 and apoptosis. Biochim. Biophys.
Acta 1761: 1344–1350.
204.
Pérez, R., M. A. Balboa, and J. Balsinde. 2006. Involvement of group VIA calcium-independent phospholipase A2 in
macrophage engulfment of hydrogen peroxide-treated U937 cells. J. Immunol. 176: 2555–2561.
205.
Balboa, M. A., R. Pérez, and J. Balsinde. 2008. Calcium-independent phospholipase A2 mediates proliferation of human
promonocytic U937 cells. FEBS J. 275: 1915–1924.
33