Download transforma\das de Catharanthus roseus

DOCTORADO EN CIENCIAS Y
BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS
Estudio de la enzima Fosfolipasa C en raíces
transforma\das de Catharanthus roseus
César de los Santos Briones
Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.
CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA DE YUCATAN, A.C.
UNIDAD DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL
"ESTUDIO DE LA ENZIMA FOSFOLIPASA C EN RAÍCES
TRANSFORIVIADAS DE Cafharanfhus roseus"
TESIS QUE PRESENTA
Q.B.B. CÉSAR DE LOS SANTOS BRIONES
PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGIA DE PLANTAS
MERIDA, YUCATAN, MEXICO
1998
A YERENl por todo lo que hemos compartido en la vida y por lo que sigue. .
A toda mi familia: a mis padres y hermanos, a la familia Minero-García, por
su fe en mí y por ser todos una familia.
RECONOCIIvllENTOS
Este trabajo se realizó en la Unidad de Biología Experimental del Centro de
lnvestigación Científica de Yucatán AC. bajo la dirección de la Dra. Teresa
Hernández Sotomayor y el Dr. Víctor M. Loyola Vargas
Este trabajo fue financiado por la Fogany lnternational Research
Collaboration Award (R03TW00263), el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(3016-N9306), la ln{ernati.onal Foundati.on for Science (C/2236-1) y una beca del
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (88202) para César de los Santos
Briones.
AGRADECIMIENTOS
De manera especial:
A la Dra Teresa Hernández Sotomayor, al Dr Víctor M Loyola Vargas,
Dra. Rosario Muñoz Clares, al Dr. José Luis Boyer, al Dr. Vi.ctor Baizabal, a la
Renata Rivera y al Dr. Jorge Santamaria por sus excelentes sugerencias y la
revisión crítica con la que enriquecieron el presente escrito
A la Dra Rosario Muñoz Clares, al Dr. José Luis Boyer, al Dr Víctor M
Loyola Vargas y a la Dra Teresa Hernández Sotomayor por formar par(e de mi
comité tutorial en donde se djscutió parte importante de este trabajo.
A la Dra Teresa Hernández Sotomayor por su apoyo incondicional, su
interés por mi formación académica y por la paciencia otorgada durante mi. estancia
en su laboratorio.
AI Dr. Víctor M
Loyola Vargas por la dirección y asesoría otorgada al
presente trabajo
AI QFB Armando Muñoz Sánchez por su total colaboración durante la
realizacjón experimental de este trabajo y por todos los momentos vividos.
A las autoridades del Centro de lnvestigación Científica de Yucatán A C. en
especial a la Unidad de Biología Experimental por permitirme hacer uso de sus
instalaciones.
AI Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologi.a, a la Fogarty lnternational
Research Collaboration Award y a la ln{ernational Foundation for Science por el
apoyo económico brindado durante la realización de este proyecto.
ABREVIATURAS
Pl-PLC .-Fosfolipasa C específica para fosfatidi.linositol
PLC .-Fosfolipasa C
PI .-Fosfatidilinositol
PI-3-P -Fosfatidilinositol 3, monofosfato
P14-P ó PIP.-Fosfatidilinositol 4, monofosfato
PI-3,4-P2 .- Fosfatidilinositol 3, 4, bisfosfato
P14,5-P2 ó PIP2 .-Fosfatidmnositol 4, 5, bisfosfato
[3H]-PIP2.-Fosfatidi.linositol 4,5, bjsfosfato tritiado.
Pl-3,4,5-P3 .- Fosfatidi.li.nositol 3, 4, 5, trisfosfato
l-1,4,5-P3 Ó IP3 ,-lnosítol 1, 4, 5, trisfosfato
DAG.-1,2-Diacilglicerol
PKC.-Proteína cinasa C
GPCR - Receptor acoplado a protei.nas G
EGF -Factordel crecimiénto epjdérmico
.
PDGF.-Factor del crecimiento derivado de las plaquetas
FGF.-Factor del crecimiento de los fibroblastos
PTK Protei.na tirosina cinasa
lGF.-Factor del crecimiento de la insulina
TIIvl.-Triosa isomerasa
PH.-Homología a Pleckstrina
SH2.-Homología a Src 2
SH3 -Homología a Src 3
Src.-Sarcoma de rous
lo.§ .-Concentración media inhi.bitoria
EgF£:E:,,,á:g:::::.d::sj:n.:t:t,rnaoaecté{,.cáoc,dotetraacét,co_N,N,N,,N,.
DTT.-Ditiotreitol
PMSF.-Fenil-metil-sulfonil-fluoruro
BSA.- Albúmina sérica de bovino
BCA.-Ácido bicinconínico
TCA.- Ácido tricloroacético
SDS - Dodecilsufato de sodio
PAGE.- Electroforesis en gel de poliacrilamida
FPLC -Cromatografía líquida rápida de proteínas
RESUMEN
La fosfolipasa C (PLC), que hidroliza fosfolípidos de inositol para
formar diacilglicerol y fosfatos de i.nositol, se encuentra presente en células de
mamíferos así como en plantas y varios microorganismos [Shukla, 1982]. Esta
familia de isoenzimas se convierte en un elemento importante al i.ni.ciar un
mecanismo de transducción de señales en respuesta a estímulos específicos.
Actualmente, en mamíferos se conocen 10 isoenzimas de PLC y se clasifican en 3
subfamilias, P, y, y Ó; de éstas, cuatro son de tipo P, dos son de tipo y, y cuatro son
de tipo Ó [Rhee y Choi,1992; Lee y Rhee,1995; Rhee y Bae,1997]. Las isoenzi.mas
de tipo Ó son la forma más simple, y son las más pequeñas (Mr 85,000) en
comparación con las de tipo P y y (Mr 140,000-150,000) El descubrimiento de
proteinas homólogas a las isoenzimas de la familia 8, ampliamente distribui'das en
plantas [Shi eí a/,1995|, levaduras [Flick y Torner,1993], y moho de fango [Drayer
y Van Haastert,1992], sugiere qLie esta familia ha evolucionado en lc)s eucariontes
Diferentes estudios han establecido que la PLC tiene una función específica
dependiendo del sistema del que se trate Actualmente, sabemos que la PLC existe
en plantas y que su actividad es detectable. Sin embargo, no existen evidencias
que sugieran una función fisiológica para la PLC en células vegetales
En el presente trabajo se identificó y caracterizó una aptividad de la
fosfolipasa C presente en extractos solubles y extractos membranales de raíces
transformadas de Caíharanínus roseus. Durante una curva de crecimiento, en su
pico máximo de actMdad, la actividad específica de la PLC en los extractos
membranales (65 nmol/min/mg de proteína) fue superior que la actividad específica
de la PLC en los extractos solubles (5 nmol/min/mg de proteína). Estos valores
corresporidieron al día 8° y 4° de la curva de crecimiento respectivamente La
actividad de PLC presente en extractos membranales se activó a concentraciones
micromolares de calcio con una concentración media efectiva de 50 HM e hidrolizó
preferencialmente al PIP y PIP2. La PLC prese\nte en extractos solubles tambien se
activó a concentraciones micromolares de calcio, aunque ésta tuvo una
concentración media efectjva de 3.5 LiM, a su vez, ésta catalizó la hidrólisis del Pl y
PIP Se estudió el efecto de tres diferentes detergentes. Tritón X-100, deoxicolato y
octilglucósido EI Tritón X-100 inhibió la actividad de PLC en ambos extractos. En el
extracto soluble, el deoxicolato tuvo un efecto estimulatorio a bajas concentraciones
(0 02-0 04%, p/v) pero un efecto inhibitorio a concentraciones altas (0.15-0 2%,
p/v) El octilglucósido tuvo un efecto estimulatorio sobre la actividad de la PLC en
el extracto membranal a una concentración
partir de 015%, Se establecjeron diferentes
enzima en ambos extractos que incluyen
cromatografía de afinidad, y cromatografi.a
de 0 04% y en el extracto soluble a
estrategias para la purificación de la
cromatografía de mtercambio iónico,
de exclusión por tamaño. La enzima
asociada a la membrana fue solubilizada utilizando Kcl 2 M y fue purificada
parcialmente por cromatografia de afinidad. Se obtuvieron 5 veces cle purificación
partiendo del eluato desalado de ambas fracciones y teniendo como mezcla final
algunas bandas mayoritarias del rango de 55 a 75 kDa Estas estrategias podrán
servir como antecedente para trabajos futuros relacionados con la purificación de la
fosfolipasa C en plantas.
ABSTRACT
The phospholipase C (PLC) isozymes, which cleave i.nositol
phospholipids to diacylglycerol and inositol phosphates, are present in most
mammalian cells as well as in plants and various mjcroorganisms [Shukla,1982].
PLC isozymes play a crucial role in initiating the signal {ransduction cascade in
response to specific stimulus. To date, 10 mammalian PLC isozymes have been
identified and divided into three types known as P, y, and 6 (four PLC-P, two PLC-y,
and four PLC-Ó) [Rhee and Choi,1992; Lee and Rhee,1995]. The 6-type isozymes
are smaller (Mr 85,000) than the PLC-O and PLC-y (Mr 140,000-150,000) isoforms.
To date, Ó-type isozymes have been identified in lower eukaryotes such as yeast
[Flick and Torner, 1993], slíme molds [Drayer and van Haastert, 1992], and plants
[Shi ef a/.,1995], suggesting that this family has been evolved among eukaryotes.
The role of PLC in several systems including invertebrates, microorganisms, and
mammalians has been studied. At present, PLC activiv has been identified in
plants; however, its functional role has not yet been established
This
study
shows
the
identification
and
characterization
of
a
phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phospholipase C (PIP2-PLC) in cytosol and
membrane extracts from transformed roots of Cafharanífius roseus
During a
growth curve, the maximal specific activity of the enzyme in plasma membranes (65
nmol/min/mg protein) was higher than the maximal in cytosol (5nmol/min/mg
protein). These values did correspond at 8" and 4" days of culture, respectively.
Both activities were calcium-dependent. PLC activity from membrane extracts was
activated by micromolar concentrations of calcium; with a half effective
concentration of 50 HM and hydrolyzed preferentially PIP and PIP2.
PLC acti.vity
from cytosolic extracts also was activated by micromolar concentrations of calcium,
however it had 3.5 uM as half effective concentration; it catalized the hydrolysis of Pl
and PIP. The effects of three detergents on both activities were also studied. Triton
X-100, deoxicholate and octylglucoside. Triton X-100 had an inhibitory effect on
both PLC activiti.es. ln soluble extracts, deoxicholate had a stimulatory effect at low
concentrations (0.02-0.04%, w/v) but i.nhibited at higher concentrations (0.15-0.2%,
w/v) Octylglucoside had a stimulatory effect on membrane associated activity at
0.04% and on soluble activity at 0.15%. Several strategies to puri.ficate the enzyme
Ín
both extracts were followed.
lon exchange chromatography, affínity
chromatography and gel filtration chromatography were included for the purification
of the enzyme. The membrane-associated activity was solubilized using 2 M KCI ; it
was pamally purified by means of affinjty chromatography. We obtained 5 fold
purification since the desalting step, and a final preparation with several proteins of
molecular weigh(s ranging from 55 to 75 as de{ermi.ned by SDS~polyacrylamide gel
electrophoresis. We hope that the purification s(rategies used in this study will be
useful for future purification of plant phospholipase C
CONTENIDO
RECONOCIMIENTOS
ABREVIATURAS
RESUMEN
ABSTRACT
lntroducción
Capítulo 1. Antecedentes
1
Si.stema fosfoinosítidos-calcio
Receptores de la superficie celular
3
3
Receptores acoplados a protei.nas G
4
Receptores con actividad de tirosi.na cinasa
Proteínas G
La fosfolipasa C en células animales
lsoenzimas
Ca racteri.sticas estru ctu ra les
5
6
7
7
8
9
Domini.o X y dominio Y
Dominios SH2 y SH3
Dominios PH
Dominios EF-Hand y C2
Mecanismos de regulación
Activación por receptores con actMdad de tirosina cinasa
Activación por receptores acoplados a proteínas G
Actlvación de la PLC-ó
Localización de las isoenzimas de la PLC
Caracterización de las isoenzimas de la PLC
Función de la PLC en diferentes slstemas
Fosfoinosítidos en plantas
PLC en plantas
Modelo de estudio. Caíharaníhus roseus (L.) G. Don.
10
10
11
11
11
12
13
14
15
15
16
18
19
23
25
Hipótesis
Objetivos Generales y Particulares
Capítulo 2. -Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphoiipase c activity during 25
capítuio 3. tE:r#:::To9nphpaasr:i:if ::"i:'af:gf::ipr:::"S tTnns::irc::dt:::=f¿rmadas de 43
Catharanth us rcseus
Capítulo 4. DISCUSION GENERAL
Capitulo 5. CONCLUSIONES
Capítulo 6. PERSPECTIVAS
lNTRODUCCIÓN
Todos los organismos vÍvos reaccionan a señales de su medio
ambiente para poder sobrevivh y adaptarse a sus condici.ones de vida En los
organismos multi.celulares es necesaria la comunicación intercelular, un conti.nuo
flujo de información entre las células que lo integran, tanto para coordjnar y regular
el desarrollo, la organización y el metabolismo del gran número de células que
conforman los diversos tejidos y Órganos, como para controlar el crecimiento y la
díferenciación y responder a las señales químícas en el medio ambiente. Esta
comunicación puede lograrse a través de un contacto directo célula-célula, a través
de la unión de "moléculas señal" a la membrana plasmática de las células, o (en el
caso de células animales) a través de la formación de uniones "gap" cuando se
trata de células vecinas [Loewenstein, 1987] Sin embargo, cuando se trata de
células distantes, éstas se comunican a través de la secreción de mensajeros
qui'micos Los mensajeros secretados pueden ser moléculas solubles (hormonas,
neurotransmisores, éstas se unen a receptores que se localizan en la superficie de
las células
blanco) o
moléculas
hidrofóbicas (tales como
las
hormonas
esteroideales, que son capaces de traspasar la bicapa lípídica de la membrana
plasmática y unirse a proteínas específicas dentro de la célula) [Evans,1988]
Muchas de las señales extracelulares son transmitidas a través de la
membrana plasmática por una variedad de mecanismos que usan moléculas como
segundos mensajeros. Esto es, algunas moléculas extracelulares, entre las que se
incluyen las hormonas, los factores del crecimiento, Ios neurotransmisores y otros
agonistas, se unen a receptores específicos que se localizan en la superficie
externa de la célula. La unión agonista-receptor Ínicia la producción de segundos
mensajeros Estos segundos mensajeros, una vez formados, inducen reacciones
intracelulares que regulan una serie de procesos, tales como el metabolismo, la
secreción, el crecimiento celular, etc La comparación entre eucariontes Ínferiores y
superiores de los componentes Ínvolucrados en los procesos de transducción de
señales demuestra que muchos de estos mecanismos han sido conservados
durante la evolución.
En
plantas y animales las señales extracelulares controlan el
crecimiento de muchos tejidos, gobiernan la síntesis y secreción de las proteínas y
regulan la composición de los fluídos del organismo Las células de éste detectan lo
que está sucediendo en el ambiente extracelular, mantienen su homeostasis y los
traducen en respuestas fisiológicas. Algunas señales inducen una modificación en
la actividad de una o más enzimas presentes en las células Este tipo de reacción
permite a la célula responder rápidamente (en cuestión de minutos o segundos)
Los mecanismos de transducción en las células animales han sido
ampliamente estudiados Un ejemplo clásico es la generación de AMP ci.clico por la
adenilato ciclasa. Otro mecanismo es aquel que utiliza la hidrólisis de fosfolípidos
de inositol por acción de la fosfolipasa C para producir dos segundos mensajeros,
el inositol 1, 4, 5-trisfosfato y el díacilglicerol [Bemdge,1990, Taylor eí a/ .1990]
El descubrimiento del sistema de transducción de la cascada de los
fosfoinosítidos llevó consigo un gran progreso en el entendimiento de cómo las
1
señales €ran percibidas por las células y convertidas en respuestas intracelulares
Este avance condujo, naturalmente, a preguntarse si algún tipo de sistemas de
señales sim.ilares estaban presentes en otros eucar`iontes. Algunos estudios han
sugeridolaexistenciadeunsistemasimilaraldelavíadelosfosfoinosítidosenlas
células vegetales [Sandelius y Sommarin, 1990] Aunque se ha demostrado la
capacidad de liberación de calcio por el IP3 de membranas de cé" vegetales
[SchumakerySze,1987|,estosestudiosnohansidoconcluyentesdebidoalhecho
de que existen reservas muy bajas de fosfatidil.inosftd 4, 5-bisfosfato (PIP2) y de
•inositol 1, 4, 5-tr.isfosfato (lp3). Un segundo inconveniente radica en el lento
progreso de la caracterización funcional de los receptores para señales químicas
tales como` las fitohormonas Algunos estudios preliminares con reguladores de
crecimiento han mostrado efectos sobre las actividades enzimáticas de la vía de los
fosfoinosítidos y cambios en la reserva de diferentes metabolitos [Murthy et a/.,
1989, Connet y Hanke,1987, Ettlinger y Lehle,1988]
En este trabajo se presenta la caracterización y purificación parcial de
la fosfolipasa C a parim de raices transformadas de Catharanfhus roseus.
CAPITUL0 1
Antecedentes
SISTEMA FOSFOINOsiTIDOS-CALCIO
Los fosfoinosi'tidos son fosfolípidos que contienen un grupo inositol o
inositol fosfato como grupo polar. El fosfatidilinositol es el más simple de los
fosfoinosítidos. Los principales fosfoinosítidos con grupos fosfato en el anillo de
inosjtol son el fosfatidjlinositol 4-monofosfato (PIP) y el fosfatidilinositol
4,5-bisfosfato (PIP2) (Fig.1).
;ít:du::na.díí:g:!i:ás,:=gfgi£,:3i:ngors::íá;:fi!g:s%s::ctí:sf:3!,ií:s:f:::;#','B:4:=:_'i:i;i33?gij:s:toí
inositol 1,3,4,5-tetrakisfosfato; F = inositol 1,3,4-trisfosfato: G = inositol l ,4-bisfosfato;
La hidrólisis de fosfolípidos de inositol por acción de la fostolípasa C
(PLC) involucra un mecanismo de transducción de señales ubícuo que media
respuestas celulares producidas por cambios en el medjo ambiente externo.
En células animales, las jsoenzimas de la PLC son actjvadas por
proteínas G, receptores con actividad de tirosina cinasa (Jones y Carpenter,1992),
3
o por algún otro mecanismo aún desconocido, promoviendo la hidrólisis del PIP:
localizado en la parte interna de la membrana plasmática y convirtiendo a éste en
una molécula soluble en agua (inositol 1, 4, 5-trisfosfato o lp3) y en un componente
que por su naturaleza lipídica permanece asociado a la membrana (dtacilglicerol o
DAG) Ambos compuestos per se actúan como segundos mensajeros. afectando
numerosas reacciones celulares [Rhee eí a/ ,1991| La principal fiinción del lp3 es
movilizar calcio de almacenes internos no mitocondriales y quizá también estimular
indirectamente la entrada de calcio a la célula con la ayuda de otro metabolito
fosforilado, el inositol 1, 3, 4, 5-tetrakisfosfato
El lp3 se une a receptores
específicos localizados en organelos internos y estimula a los canales de calcio
provocando la liberación y un aumento transitorio del calcio citosólico EI DAG, por
su pane, puede activar a una clase de proteínas cinasas conocidas como proteínas
cinasas C (PKC). Estas proteínas cinasas son dependientes de diacilglicéridos y
calcio originando fosforilaciones de un amplio rango de proteínas.
RECEPTORES DE LA SUPERFICIE CELULAR
Los receptores de la superficie celular son proteínas que actúan como
transductores de una señal. Éstos unen un ligando con alta afinidad y convierten un
evento extracelular en una o más señales intracelulares que alteran la fisiología de
la célula Los receptores son clasificados en diferentes familias basadas en sus
similitudes estructurales y modos de transducción receptores acoplados a canales
iónicos, receptores acoplados a proteínas G, receptores con actividad enzimática
intrínseca y receptores que carecen de actividad catalítica intrínseca pero que se
asocian directamente con proteínas tirosina cinasas citosólicas (Fig. 2).
F¿g9%ia 2. Diferentes tipos de receptores celulares. qomado de Lodish et ai„
4
Los receptores acoplados a canales iónicos contienen actividad
intri.nseca que permite el paso de iones a través de la membrana celular cuando
son activados por la unión de un ligando [Schofield eí a/., 1987; Grenningloh eí a/.,
1987, Langosch eía/.,1988]
Los receptores acoplados a proteínas G modulan la actividad de
proteínas dentro de la célula después de la unión con su ligando. Estos receptores
poseen una estructura que contiene siete dominios transmembranales.
lntracelularmente, el receptor se acopla a una protei.na intermediaria para regular
una enzima [Strader ef a/. , 1994].
Los receptores con actividad enzimática intrínseca contienen un
dominio transmembranal. Estos receptores operan directamente como enzimas a
través de un dominio localizado intracelularmente con actividad de guanilato
ciclasa, tirosina cinasa o tirosina fosfatasa. Los receptores para varios factores del
crecimiento son proteínas cinasas que son activados por un ligando En muchos
casos, la unión del ligando produce dimerización y activación de la región catalítica
de cinasa [Fantl eí a/„ 1993].
Los receptores para muchas citocinas, interferones y factores del
crecimiento se incluyen en una familia de receptores cuyos dominios intracelulares
carecen de actividad enzimática intrínseca Sin embargo, a pesar de las diferencias
estructurales existentes entre estos receptores y los que poseen actividad catalítica
intrínseca, el mecanismo de activación parece ser similar. La unión del ligando
induce djmerización u oligomerización y esto permite el reclutamiento y activación
de proteínas tirosina cinasas citoplásmicas que se asocian con el dominio
intracelular de los receptores [Kishimoto eí a/.,1994, Mui y Miyajima,1994, Heldin,
1995].
Receptores acoplados a proteínas G
Las proteínas que penenecen a la superfamilia de receptores
acoplados a proteínas G comparten dos propiedades. Primero, la unión del ligando
al receptor induce la activación de una proteína heterotrimérica que une nucleótidos
de guanina (o proteína G) Estos receptores se acoplan, por medio de las proteínas
G, a proteínas efectoras (tales como la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C, la
fosfodiesterasa dependiente de GMP cíclico, y algunos canales iónicos). Segundo,
las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes clonados que codifican
para receptores acoplados a proteínas G predicen una estructura común que
consiste de siete ci héljces hidrofóbicas transmembranales [Henderson eí a/., 1990].
En la estructura de estos receptores, la secuencia ami.no-terminal es extracelular, la
secuencia carboxilo-terminal es citoplásmica y las a hélices están acomodadas en
la membrana en sentido contrario a las manecillas de un reloj. Los receptores
acoplados a proteínas G pueden ser divididos en diferentes grupos basándose en
sus ligandos naturales, sus homologías de secuencia de aminoácidos y en sus
similitudes estructurales.
5
En células de mamíferos, existe un grupo homogéneo de receptores
acoplados a proteínas G que son activados por ligandos peptídicos pequeños Este
grupo consiste de receptores para péptidos que se encuentran relacionados con el
intestino y el cerebro (tales como la secretina y el péptido intestinal vasoactivo), y
receptores para hormonas reguladoras de calcio (tales como la calcitonina y la
hormona paratiroidea) [Segre y Goldring,1993]. Estos receptores muestran un alto
grado de similitud en las regiones transmembranales hidrofóbicas, pero no son
homólogos a otros receptores acoplados a proteínas G. También contienen una
región
amino terminal
larga (130 aminoácidos) con
residuos de cisteína
conservados.
Los receptores acoplados a proteínas G, en células mamíferas, unen
diversos ligandos glicoproteínas (tales como las hormonas estimulantes de folículo
y de la tiroides), moléculas orgánicas pequeñas (tales como la adrenalina y la
acetHcolina),
compuestos hidrofóbicos (tales como los canabinoides),
y el
cromóforo retinal
La región extracelular amino terminal varía grandemente en
longitud
Los receptores comparten un número limitado de secuencias de
aminoácidos conservadas, principalmente en la región transmembranal [Probst ef
a/,1992] En este grupo diverso de receptores, se ha propuesto que la tercera
horquilla citoplásmica entre la quinta y sexta región transmembranal, una región
con menos identidad de secuencia, es la regiórt involucrada en la interacción del
receptor con proteínas G específicas [Savarese y Fraser,1992].
Receptores con actividad de proteina tirosina cinasa
Los receptores con actividad de tirosina cinasa contienen un dominio
extracelular amino terminal de unión al ligando, un dominio transmembranal y un
dominio intracelular con actividad de proteína tirosina cmasa Los receptores que
pertenecen a esta familia pueden ser divididos en cuatro subclases basándose en
su similitud de secuencia y características estructurales [Ullrich y Schlessinger,
1990]. el receptor para el factor del crecimiento epidérmico (EGF), el receptor para
la insulina, el receptor para el factor del crecimiento derivado de las plaquetas
(PDGF) y el receptor para el factor del crecimiento de los fibroblastos (FGF) Los
receptores para el EGF y para la insulina compaften secuencias homólogas
repetidas de cisteína en sus dominios extracelulares Los dominios extracelulares
de los receptores para el PDGF tienen una estructura parecida a la de las
inmunoglobulinas (cinco repeticiones) Los miembros de los receptores para el FGF
contienen tres repeticiones de secuencias similares a la de las inmunoglobulinas
La unión del ligando al dominio extracelular ocasiona la dimerización del receptor,
ia cual activa el dominio intracelular con actividad de tirosina cinasa promoviendo la
autofosforilación [Schlessinger y Ullrich,1992] EI ligando EGF (monomérico) y el
ligando PDGF (dimérico) median la dimerización de sus receptores [Heldin et a,I ,
1989, Greenfield et al , 1989| Cada uno de los ligandos da origen a una o mas
respuestas dependiendo del sistema y ambiente celular de que se trate La
activación de los receptores con actividad de proteína tirosina cinasa induce a las
células a proliferar y diferenciarse en el caso de los receptores para factores del
crecimiento, o a activar vías metabólicas en el caso del receptor para la insulina
|Schlessinger.1993|
6
El dominio con actividad de proteína tirosina cinasa es la región más
conservada Ésta contiene la secuencia consenso para unión de ATP, como se
encuentra en la subunidad catalítica de !as proteínas cinasas dependientes de AMP
cíclico Los dominios de cinasa de los receptores para el PDGF y para el FGF
contienen una secuencia insertada de residuos de aminoácidos hidrofílicos, que
dividen al dominio de cinasa por la mitad. Esta secuencia insertada probablemente
no está involucrada en la actividad de cinasa, pero se cree que tiene una función en
las interacciones del receptor con sus substratos [Kazlauskas y Cooper,1989].
La autofosforilación del receptor tiene una importante función en la
activación de la enzima y en la interacción con sus substratos [Koch eí a/.,1991]
Los receptores activados transducen las señales extracelulares no solamente por
fosforilación, sino también por interacciones directas de proteína-proteína. Muchos
substratos proteicos de los receptores para factores del crecimiento con actividad
de tií.osina cinasas contienen dominios de homología a src (SH2), una región
descubjerta orlginalmente en las tirosinas cinasas citoplásmícas relacionadas a
c-Src. Los dominios SH2 se unen a residuos de tirosina autofosforilados en el
receptor En los receptores para el PDGF y el EGF, los sitios de fosforilación se
encuentran en las regiones no catalíticas de los dominios citoplásmicos. Entre las
proteínas que pueden ser substrato para estas proteínas cinasas están la
fosfolipasa C-yl y la fosfotirosina fosfatasa Syp [Anderson eí a/.,1990; Margolis eí
a/.,1990a, b: Moran eí a/.,1990; Kazlauskas eí a/.,1993].
PROTEINAS G
Las proteínas G son una superfamilja compleja y diversa de proteínas
altamente homólogas que unen e hidrolizan GTP. Entre éstas se incluyen proteínas
involucradas en la síntesis de proteínas y dos clases de proteínas que transducen
señales: las proteínas G heterotriméricas de tamaño grande y proteínas
monoméricas de tamaño pequeño. Las proteínas G heterotriméricas consisten de
subunidades a, P y y. La activación, ocasionada por la unión de GTP, produce la
disociación de la proteína G formando un complejo dimérico de subunidades f}y y
una subunidad G libre unida a GTP. Las proteínas G funcionan como interruptores
moleculares que alternan entre la forma activa (unida a GTP) y la forma inactjva
(unida a GDP). La interconversión entre el estado activo y el inactivo ocurre por la
hidíólisis de GTP y del estado inactívo al estado activo por intercambio del
nucleótido (Boume eí a/.,1991 ].
LA FOSFOLIPASA C EN CÉLULAS ANIMALES
La fosfolipasa C (PLC) es una familia de isoenzimas que catalizan la
hidrólisis del fosfatidilinosito]4, 5-bisfosfato (PIP2) Iocalizado en la membrana
celular
generando
dos
componentes,
uno
hidrofóbico
y
otro
hidrofílico,
denominados
1,
2-diacilglicerol
(DAG)
e
inositol-1,
4,
5-trisfosfato
(lp3)
:,eesnpeencti::,Tneaná:(:|gá3f)jnAc%Rosd::T.puá:t::afi::ío::g::mcoeiig,T:Sme:en:t:j:r:su:
producen estos mensajeros secundarios son el de estimular la liberación de calcio
(lp3) [Berridge,1993] y el de activar a la proteína cinasa C (DAG) [Dekker eí a/.,
7
1995]. Esta vía bifurcada ejerce control sobre una gran variedad de respuestas
celulares incluyendo el crecimiento celular, Ia proliferación, la contracción, la
excitación y la secreción. La actividad de la PLC es ubícua en las células
animales, vegetales y en los mic")rganismos [Shukla, 1982; Jones y Carpenter,
19921.
¡ni,j:e£:,g::a:i:?g3s;a#::oi:i:eár:::s::,éési::::eÁÍ®:fg::eía:jLÍ:;niig?ti,:,g::tina#1Ía*s:pdi#roTá3r
lsoenzimas
En células animales, la PLC existe en múltiples isoformas y se han
purificado a homogeneidad varias de ellas; también se han clonado ADNcs de una
gran variedad de tejidos y especies y se han identificado aproximadamente 10
isoenzimas de PLC [Rhee eí a/., 1989; Rhee y Choi,1992; Waldo eí a/.,1994; Lee
y Rhee, 1995; Rhee y Bae, 1997]. Todas las enzímas de PLC identificadas hasta
ahora son polipéptidos monoméricos. En base al tamaño y la comparación de las
secuencias de aminoácidos deducidas, las PLCs puedan ser dMdidas en tres
familias: PLC-P (de aprox. 150 kDa). PLct (de aprox. 145 kDa), y PLCó (de
aprox. 85 kDa). Cada familia posee varios miembros, estos se designan añadiendo
números arábigos después de la letra griega, p. ej. PLC-Pl y PLC-P2 [Rhee y
Choi, 1992; Lee y Rhe, 1995]. El cuadro 1 proporciona una clasificación de las
fosfoli pasas C identificadas.
%adLrsárg£:#gdc:€ndebsñ:feanteens¡gu¡dgFMe:g;£*3oaEjncoácakg::ftge+aá+saosr.zóg2a,:
NOMBFtE
TAMAÑO (kDa)
OFtlGEN D-cla]
150-154
Cerebro do rsta y bovino [Katan y Parker.1987; Katan eí 8/.,
Familia p
81
1988)
É¡2
134
P3
'ap A
ADNc HL60 de humano [Krftz oÍ a/., 1990]
ADNcfibroblaBtosdehumano(Kritzeí8/.,1990]
125
GencmadeDmsapAÁza(Bloomquisteía/.,1988]
CkmmadeDmsopAffi[ShomdgeoÍa/..1991)
CenbroderataybcMno(Suheía/..19881))
HL60, pulrnón, bazo |Emori eí a/., 1989; Banno oÍ a/., 1990;
Htxrmaeía/..1990;OhtaoÍa/.,1988]
Cenbro do rata y bo\Áno [Homma eí a/., 1988; Suh oÍ a/.,
1988a]
Cenbrodebovino[Meldrumeta/.,1989;Meldmmefa/.,1991]
ADNcdefibroblstc6deliumano[KritzoÍa/.,1990|
ADNcdecerebrodonata(L®yRhee, 1996)
Ca racten'sticas estructu rales
La estructura de las tcs familias de PLC comprende dominios
comunes a todas ellas (domjnio PH de homologi.a a la plcx3kstrina, dominios
EbeFE#unnd=d=o_=#o~Xx=d=ov#XT.±o*=¥.5o^T¡=±_C.2_SLy_3F*.,_oe.=xtr=~S¡=.ELg:E=,::u#S#
beta(umregióncarboxmterminaldegn]nlongitud)ygamma(d®dominiosSH2,
un dominio SH3 y un dominio PH adicional) (Fig. 4).
F-=-!-.-::.=.-.l-.-!i-±,=_-i--__i-i---i-=F==
.=,
:r:g:u,??o#ñe?pEgFe:#!iécn2g;en5ñá(,£n:o,:sdHá;;mfxTát:es:taá:oaTá:ei#Tin%e::,ng!:;aasfocso::',::
Dominio X y dominio Y. La secuencia de aminoácidos de todas las
isoenzimas de PLC intracelulares contiene dos regiones altamente consewadas,
llamadas dominio X y dominio Y (de aproximadamente 170 y 260 aminoácidos,
respectivamente) las cuales están separadas por péptidos de secuencia y longM
variable. La conservación de los dominios X y Y en todas las isoenzimas de PLC
desdeOmsopMhastahumanosapoyalaideadequealgunafunciónesencial,tal
como la catálisis, está ascx2iada cx)n estas regiones [Rhee ef a/,1989]. De acuerdo
a Essen eí a/. (1996), quienes han cristalizado una versión truncada de la PLCól
derata,laregiónXesunamitaddeloqueellosllaman"barril"(triosafosfato
isomerasa) distorsionado pero cerrado". La o.tra miúd del barm TIM es la región Y.
Algunos estudios de mutación y de delección en las PLCJyl y PLCJy2
han mostrado que la expresión de cualquiera de las dos regiones solas producen
unaproteínainactiva.CuandolasregionesXyYdecualquieradelasdosenzimas
se unen, la proteína expresada retiene su actividad catalítica [Bristol e( a/., 1988;
Emori eí a/,1989]. Otros estudios de proteólisis con la PLC-8 indican que los
dominios X y Y permanecen físicamente asociados después de la ruptura con
tripsina entre estos dos dominios [Cifuentes ef a/., 1993; EllB ef a/., 1993]. Sin
embargo. estos estudios reportaron resultados diferentes sobre el efecto de la
proteólisis con tripsina sobre la actividad de PLC-8. Un {ercer estudio sugiere que
los dominios X y Y se asocian fisicamente de una manem que se protege esta
regióndelaproteólisisyproporcionaunsitiocatalítico[Femaldefa/,,1994].
Dominios SH2 y SH3. Mientras que las isoenzimas PLC-P y PLCó
contienen una secuencia coha de 50 a 70 aminoácidos que separan la región X de
la región Y, las isoenzimas PLctl y PLCJy2 contienen una larga secuencia de
aproximadamente 400 residuos y se distinguen por la presencia de secuencias
similares a las regiones de proteínas sm [Rhee et a/., 1989]. Estas isoenzimas
10
contienen dos dominios SH2 (src homology) y un dominio SH3 localizados entre
lasregionesXyY[Stahlefa/.,1988;Siiheía/.,1988b].LosdominiosSH2ySH3
son pequeños módulos de estructiiras proteicas que comprenden aprox. 100 y 50
aminoácidos, respectivamente, y gobieman interaccíones proteína-proteína. Los
dominios SH2 y SH3 de la PLCT no son necesarios para la actividad enzimática,
ya que la enzima netiene la actividad cuando ki negión SH2/SH3 es eliminada
[Bristol ef a/., 1988; Emori eí a/., 1989]. Sin embargo, los dominios SH2 de la
PLC+1 están involucrados en la asociación de la PLCJyl con sitios específicos
fosforilados en tirosina presente en proteínas [Anderson et a/., 1990; Margolis ef
aí.,1990a, b; Mohammadi ef a/.,1991; Rotin ef a/.,1992; Soler eí a/., 1993]. Se
piensa que esta interacción es un prerrequisito para la fósforilacíón de la PLCJyl
en residuos de tirosina por tirosina cinasas activadas. El dominio SH3 se cree que
funciona facilitando la asociación de la PLC+1 con proteínas de citoesqueleto
parlicularmente con aquellas que contienen secuencias de aminoácidos ricas en
prolina [Bar-Sagi eí a/.,1993; Gout eí a/.,1993].
Dominios PH. En todas las isoenzimas PLC de mamíferos se ha
encontrado una negíón de aprox. 100 aminoácidos homóloga a una región de la
pleckstrína (una proteína sustrato de la proteína cinasa C en plaquetas)
denominada dominio PH (por Pleckstrin homology). En los tres tipos de PLC, el
dominio PH se ha encontrado en la región amino-{eminal, precediendo a los
dominios EF-hand [Parker ef a/., 1994; Essen eí a/., 1996]. Las isoenzimas de tipo
PLCT contienen un dominio PH adicional entre los dominios X y Y que es dividido
por los dominios SH. En 1992, Rebecchi eí a/. repoilaron que la región
amino-terminal, que contiene el dominio PH de la PLC-81, es necesaria para
unirse con alta afinidad al PIP2 en vesículas bicapa en ausencia de calcio.
También consideraron la posjbilidad de que ese sitio de alta afinidad podría servir
como anclaje de la enzima en la superficie de la membrana durante la hidrólisis
p"3esiva del sustra{o catalizada por un sitio activo separado [Cifuentes ef a/.,
1993]. Posteriomente, Harlan ef a/., (1994) reportaron que los dominios PH se
unen al PIP2 y sugieren que esta región puede ser importante para la localización
de proteínas en la membrana a través de in{eracciones con el PIP2. Estas
observaciones sugieren que los dominjos PH pueden tener una función
biológicamente significativa en la localización de proteínas por fcBfolípidos de
membrana.
Dominios EF-hand y C2. La estructura tridimensional de la PLci}1
de rata, que carece del dominío PH, i.eveló que ésta consiste de 4 dominicN3
EF-hand (similares a aquellos presentes en la calmodulina) que preceden al
dominio X y de un dominio C2 (éste es un dominio de P-intercalaciones que tiene
una estriictura similar al primer dominio C2 de la proteína sinaptotagmina 1) cerca
de su carboxilo teminal [Essen ef a/., 1996]. Se sugirió que esta última región
intewiene en la unión clependiente de Ca2+ a las vesículas lipídicas.
Mecanismos de regulación
En células animales, se han identificado dos fomas de receptores
localizados en la superficie celular que activan a la PLC los cuales funcionan a
través de diferentes mecanismos moleculares.
11
Activación por receptores con actividad de tirosina cinasa. Existen
receptores con actividad de tirosina cinasa que activan a la PLC, tales como el
receótor para el EGF, el receptor para el PDGF, el receptor para el FGF y el
recep`or para el factor del crecimiento de
los ___L:^__^
hepatocitos
Estos receptores
cruzan
_ __
,.. A^minir`
rii.nnlácimir.r)
Con
una sola vez ia membrana plasmática y contiénen un dominio citoplásmico con
actMdad de tirosina cinasa [Nismbe eí a/,1990: Goldsschmit-Clermont eí a/.,
1991]. Estos recepto" promueven la hidrólisis de los fosfoinositidos a través de
£ _isoenzimas
'=____1_ -_---+-r
'„C;\,C)'''\J"````.1--''''____
mecanismos
_
que involucran
la fosforilación en t.irosina de •las
de la
famh PLC-y. El mecan.ismo de activación involucra la unión ligando-receptor,
misma que ocasiona dimerización del receptor; a su vez, este complejo conduce a
la activación de la actividad intrínseca de proteína tirosina cinasa del receptor por lo
que fosforila a numerosas proteínas en residuos de tiros`ina incluyendo la región
intracelular del receptor mismo así como a la PLCJyl [Eriksson eí a/.,1995] Los
residuos fosforilados en tirosina del receptor forman s.itios específicos de unión
para proteínas que cont.ienen regiones de aproximadamente 100 aminoácidos
(dominios SH2) como es el caso de la PLCJy.
Existen algunos reportes que sugieren una asociación física entre la
PLclyl y la tirosina cinasa activada del receptor [Margolis ef a/.,1990a, b; Rotin eí
a/ ,1992, Mohammadi ef a/.,1991|. Estos experimentos de asociación concluyeron
que la actividad de tirosina cinasa del receptor para el EGF era esencial para la
asociación de las dos proteínas. S'in embargo, Hernández-Sotomayor y Carpenter
(1993), en experimentos realizados /.n v/.Íro obtuvieron resultados que sugieren que
el receptor para el EGF purificado puede aumentar la actividad de la PLC-yl
independientemente de la fosforilación en residuos de tirosina, y que ésta
asociación no requiere del receptor autofosforilado, es independiente de ATP, y la
PLC-yl no fosforilada en residuos de tirosina responde al receptor para el EGF.
Otros ensayos /.n
v/.Íno de hidrólisis de
PIP2 han
proporcionado
evidencia directa de que la fosforilación en tirosina de la PLC-yl aumenta su
actividad enzimática (Nishibe ef a/„ 1990; Wahl ef at 1992). La activación de la
PLC-yl es atribuída a la fosforilación en tres residuos de tirosina (771, 783 y 1254),
dos de los cuales se encuentran localizados entre los dominios X y Y [Kim eí a/.,
1990b; Kim eí a/„ 1991]. La fosforilación de la PLC-yl por el receptor para el EGF
aumenta la act.ividad enzimática aproximadamente de 3 a 4 veces (Nismbe ef a/.,
1990; Wahl ef a/.,1992) Asimismo, se produce un gran cambio en la Ks (hay una
disminución de 7.5 veces), esto significa que se aumenta la asociación de la
PLC-yl con las micelas que contienen el PIP2. A bajas concentraciones de fracción
mol de PIP2 (0.07) la enzima fosforilada exhibe una velocidad de reacción 4 veces
más alta y una Km más baja. Sin embargo, a concentraciones altas de fracción mol
de sustrato (0.33), Ia velocidad máxima (Vmax) de reacción para ambas formas de
PLC-yl fueron equivalentes (Wahl eí a/.,1992;).
Existe una amplia variedad de proteínas tirosina cinasas (PTKs) que
no son receptores, tales como los miembros de las familias SÍc, Syk, y Jaknyk;
éstas cinasas son activadas por receptores que no poseen actividad de proteína
tirosina cinasa. Las PTKs activadas fosforilan algunos de los componentes a los
cuales se puede unir la PLCT a través de sus dominios SH2, y, por consiguiente,
12
es fosforilada en los mismos residuos de tirosina por la PTK AsÍ, en respuesta a la
unión de ciertos receptores de la superficie celular, las PTKs también fosforilan y
activan a las isoenzimas de la PLC-y [Noh ef a/ ,1995, Lee y Rhee,1995]
Activación por receptores acoplados a proteínas G. Los miembros
de
la
familia
de
PLC-P
son
regulados
por
proteínas
G
heterotriméricas
(subunidades G y Pv cuya contribución relativa depende de la PLC-P Ínvolucrada)
[Smrcka eí a/,1991; Boyer eí a/.,1992, Lee eí a/,1992; Wu eí a/,1992a, b] Las
proteínas G heterotriméricas (compuestas por subunidades c[, P, y y) transmiten
señales intracelulares de una familia de receptores que se encuentran acoplados a
estas proteínas G (GPCR). Esta fami`Iia de receptores incluye a receptores
adrenérgicos y fotorreceptores, entre otros. Los GPCR son proteínas que cruzan
siete veces la membrana, es deci.r, contienen siete hélices transmembranales con
tres horquillas citoplásmicas y un carboxilo-terminal intracelular [Kobílka ef a/.,
1987] La unión del li.gando causa un cambio conformacional en la estructura del
receptor, el cual activa a una proteína G heterotrimérica asociada La proteína G
activada se disocia formando una subunidad a y un complejo de subunidades Py
Ambos, la subuni.dad a y el complejo f}y, son capaces de acti.var enzi.mas efectoras
intracelulares [Sternweis, 1994], incluyéndose enlre éstas a una PLC específica
para fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato La activación de isoenzimas de la familia de la
PLC-P por proteínas G heterotriméricas incluye a la subfamilia GGq de las proteínas
GG [Smrcka ef a/,1991] La subfamilia Gq de las subunidades a incluye cuatro
productos díferentes: Gaq, Gctii, Gaw y GGi6
Se ha reportado que éstas (Gciq,
Gcm Gc" y Gcti6) acti.van a la PLC-P1 [Wu eí a/.,1992a] y que Gcw6 (y quizás Gaii)
son activadores eficientes de la PLC-P2 [Lee eí a/„ 1992] Ninguno de los miembros
de las otras subfamilias de las proteínas Ga activan directamente a la PLC y la
subfamilia Gq únicamente activa a la PLC-P y no a los miembros de las familías -Ó
Ó -y de la PLC [Wu eí a/„ 1992b]
La PLC-P2 recombinante es activada por dímeros Py, la PLC-Pl
recombinante puede o no ser afectada por Py [Katz ef a/.,1992] o puede ser mucho
menos sensible que la PLC-P2 [Boyer eí a/., 1992; Camps ef a/., 1992a]. Se
requíeren bajas concentraciones, nanomolares y posiblemente picomolares, de
subunidades G para estimular a la PLC [Taylor ef a/., 1991, Smrcka et a/„ 1991]; la
concentración necesaria para el caso de los dímeros Py es del rango mi.cromolar
[Boyer eí a/ ,1992, Camps eí a/ ,1992a,1992b]
La familia de PLC-P se distingue de las otras PLCs por la presencia de
una secuencia de gran longitud en la región carboxilo-terminal de la molécula
después del dominio Y de la enzima En esta región, Wu eí a/ , (1993a) encontraron
una secuencia requerida para la activación de PLC-Pl por Gciq Ellos subdividieron
la región C-terminal en dos secuencias. la caja P, que abarca los residuos Thr9°3 y
Ginl03° y que es esencial para la asociación de PLC-f)1 con la fracción paniculada y
subsecuente activación por Gaq, y la caja G, que es la región localizada entre los
residuos Lys"" y Leu''" y que es requerida para la interacción de PLC-Pl con Gciq
Las secuencias que se encuentran después de la caja G en la PLC-Pl y en la
PLC-P2 son homólogas por lo que se sugiere que ésta es la regíón de la enzima
13
requerida para la act.ivación por las subunidades Ga en ambas .isoformas. Cabe
hacer notar que la caja P es una secuencia de 128 aminoácidos compuesta de un
gran número de residuos cargados, especialmente residuos básicos y
generalmente lisinas. La asociación con la fracción pahiculada podrñ ocurrir a
través de los fosfolípidos o algunas proteínas asociadas a la membrana que se
encuentran cargadas negativamente.
Posteriormente
Wu
ef
a/.,
(1993b)
encontraron
un
segmento
am.ino-terminal de la PLC-P2 con una secuencia de aminoác.idos que se extiende
hasta el final del dominio Y y que es requerida para la activación por Gpy También
encontraron otra región carboxilo-terminal con el segmento que contiene la
secuencia de aminoácidos requerida para la activación por Gci. Además, sugirieron
que Gc" y las subunidades Py pueden modular simultáneamente la actividad de
PLC-f)2.
En 1996, Kuang eí a/. identificaron la región de PLC-P2 que interactúa
con Gpy La secuencia que se extiende desde el residuo Leu" hasta el residuo
Val6" parece tener una muy alta afinidad por Gpy en la región que abarca desde :1
inicio del dominio X hasta el final del dominio Y La proximidad de esta secuencia
con el centro catalítico sugiere que puede estar involucrada en la activación de la
PLC-P2
Activación de la PLC-Ó. Actualmente el mecanismo por el cual las
distintas isoenzimas de la PLC-6 se regulan no se conoce con exactitud. Sin
embargo, recientemente se reportó la activación de la PLC-Ól por una nueva clase
de proteínas que unen GTP, llamadas Gh [Feng eí a/.,1996] La proteína Gh está
formada por una subunidad a (de aprox 75m kDa) y una subunidad P (de aprox
50 kDa) [lm y Graham,1990] La subunidad Ghci, una proteína multifuncional que
también tiene actividad de transglutaminasa, activa y forma un complejo con la
PLC-Ól purificada [Nakaoka eí a/.,1994: Das eí a/.,1993|, esto ocurre en células
estimuladas via receptor ctradrenérgico (cii-AR) Se ha sugerido que GhG acopla
directamente cii-AR a la PLC-Ó1. Aun no se sabe si otras isoenz.imas de la PLC-Ó
tambiénsonactivadasporGhct,osiotrosreceptoresseacoplanaGhcLycómoestá
relacionada la actividad de transglutaminasa de Gha con su func.ión activadora de la
PLC-ól
En
base
a
la
información
estructural
obtenida
después
de
la
cristalización de la PLC-81 [Essen eí a/.,1996|, se propuso un mecanismo catalítico
consistente en dos pasos "atar y fiiar" El domim PH de b PLC-W ata la enzi" a
la membrana debido a la unión específica al PIP2 y el dominio C2 fija al dominio
catalitico con una orientacm favorable hacia la membrana El dominio EF-Hand
sirve como un enlace flexible entre el dominio PH y el resto de la enzima El ion
Cap sería requerido para que el dominio C2 pueda funcionar. Además, en la
catálisis pafticipan directamente otro ion de Ca2+, localizado en el sitio activo, y los
am.inoácidos His3u e His356
14
Localización de las isoenzimas de PLC.
lnicialmente la mayori.a de las PLCs fueron purificadas de fracciones
citosólicas [Ryu ef a/,1987a, b; Bennet y Crooke,1987; Rebecchi y Rosen,1987;
Fukui eí a/.,1988; Homma ef a/.,1988, Meldrum e! a/.,1989, Waldo eí a/.,1994].
También se ha caracterizado actividad de PLC que se encuentra asociada a la
membrana [Banno ef a/.,1988; Bano y Nozawa,1987; Lee eí a/„ 1987, Baldassare
ef a/,, 1989]. La actividad asociada a la membrana puede ser solubilizada con
concentraciones altas de sales, indicando que existen interacciones iónicas que
retienen a la PLC asociada a la membrana. Una de las actividades asociadas a la
membrana (PLC-P1) está distribuída igualmente entre el comparti.miento citosólico
y el compartimiento membranal [Lee eí a/., 1987]. El análisis de la hidropatía y
secuencia de aminoácidos de la PLC-Pl no revela la presencía de regiones
transmembranales. En contraste, la PLC-yl se encuentra predominan{emente en
citosol [Lee eí a/., 1987]
El tratamiento con el EGF en células A431 (las cuales están
enriquecidas con receptores para el EGF) produce la fosforilación de la PLC-yl en
residuos de tirosina (771, 783, y 1254) [Margolis eí a/„ 1989, Wahl eí a/., 1990]
Este tratamiento ocasiona una redistribución de PLC-yl
(un proceso de
translocación) por lo que aumenta la asociación de la enzima con la fracción
particulada de la célula [Kim ef a/„ 1990a, Todderud eí a/ ,1990].
Por otro lado, existen evidencias de que la PLC se localiza en el
núcleo de células animales [Martelli eí a/ ,1992; Kuricki ef a/ ,1992; Divecha ef a/„
1993a, Divecha eí a/,1993b, Mazzoni eí a/„ 1992] En células Swiss3T3 se
observó que la PLC-Pl se localiza en el núcleo y que ésta se regula por lGF-1
[Manelli ef a/, 1992]. Además, Asano ef a/ (1994) también han mostrado
evidencias de la existencia de una nueva PLC en el núcleo. EHos purificaron una
PLC nuclear de peso molecular aparente de 85 kDa de hepatoma de ascitos de
rata La PLC se detectó únicamente en el núcleo de hígado en regeneración
La existencia de múltiples isoformas de PLC fue descrita en estudios
hechos en diferentes teiidos en{re los que se incluyen el corazón, el cerebro, las
plaquetas, el hígado, y riñón [Hirasawa eí a/.,1982a, b; Chau y Tai, 1982; Low y
Weglicki,1983]
En resumen, las PLCs de tipo P (PLC-P1, -P2, -P3, y -P4) están
presentes en la fracción particulada y en el núcleo, mientras que las PLCs de tipo y
y ó son detectadas principalmente en la fracción citosólica [Lee eí a/ ,1987, Katan y
Parker,1987; Ryu ef a/ ,1987b; Jhon ef a/ ,1993, Lee eí a/ ,1993; Homma et a/ ,
1988; Fukui eí a/ ,1988; Rebecchi y Rosen,1987; Martelli eí a/.,1992; Divecha ef
a/.,1993a, b; Mazzoni eía/,,1992].
Caracterización de las isoenzimas de PLC
Las primeras isoenzimas de PLC purificadas a homogeneidad de
cerebro de bovino (de 150,145, y 85 kDa) fueron, más tarde, nombradas PLC-P1,
15
PLC-yl y PLC-Ót respectivamente. Estas isoenzimas fueron caracterizadas y
además se obtuvieron una serie de anticuerpos policlonales y monoclonales para
las tres isoenzimas [Ryu ef a/.,1987a, Suh eí a/ ,1988b] La caracterización incluyó
la evaluación de la inmunorreactiv.idad hacia cada una de las formas de PLC en su
estado nat.ivo y desnaturalizado Cada anticuerpo reaccionó únicamente con la
enzima contra la cual fue preparado Las tres isoenzimas fueron específicas para
fosfatidilinositol [Pl], fosfatidilinositol 4-monofosfato (Pl-4-P), y fosfatidilinosM
4,5-bisfosfato (P145-P2), y no hidrolizaron fosfatidilinositol 3-monofosfato (PIT3-P),
fosfatidilinositol
3,4-bisfosfato
(PI-3,4-P2)
o
fosfatidilinositol
3,4,5-tnsfosfato
(Pl-3,4,5-P3)
Se estudiaron las actMdades catalíticas de las tres isoenzimas
utilizando vesículas unilamelares pequeñas preparadas con Pl, P14P o P14,5-P2
como sustrato Sus actividades catalíticas fueron dependientes de la concentración
de calcio Con Pl como substrato, la velocidad de hidrólisis aumentó hasta alcanzar
una máxima a 6 mM de Ca2+ y posteriormente disminuyó Sin embargo, cuando la
concentración de calcio estuvo en el rango micromolar, el P14J' y el P14,5|P2
fueron mejores substratos para las tres isoenzimas. Con estos dos substratos, la
velocidad de h.idrólisis aumentó hasta alcanzar una máxima a 100 LtM de Ca2+,
concentraciones superiores a 1 mM Ca2+ fueron inhibitorias Cuando el substrato
fue PI-4-P, las tres isoenzimas tuvieron similares actividades específicas a su pH
Óptimo, el cual fue 4.8 para la PLC-P1, 5 0 para la PLC-yl , y 5 5 para la PLC" Sin
embargo, a pH neutro el orden de actividad específica fue PLC-Ó1 > PLC-yl >
PLC-P1. En contraste, el orden de actMdad específica para la hidrólisis de P14,5-P2
fue PLC-P1 > PLC-W > PLC-yl, signif.icando que la enzima de 150 kDa es la más
especifica para Pl-4,5-P2 El efecto de iones metálicos sobre la hidrólisis de P14P
mostró que la PLC-Pl y la PLC-yl no son afectadas por 50 iiM de Mg2+, Mn2+, Ca2+,
o Ni2+
Sin embargo, el Hg2+, Zn2+, y Cu2+, inhibieron a ambas PLCs
La PLC-yl
exhibe una alta sensibilidad a estos iones comparada con la PLC-P1, por ej el valor
de inhibición lo5 para Hg2+ fue 0 2 LiM para PLcyl y 1 LiM para PLC-PI
inhibió selectivamente a la PLC-yl
con un valor lo5 de 5 HM.
EI Cd2+
Para las tres
isoformas, en presencia de 3 mM de Ca2+ y 1 mM de EGTA, la velocidad de
hidrólisis de Pl aumentó bastante cuando la concentración de deoxicolato fue de
075" mg/ml (0.075-01 % p/v). No se observó algún efecto cuando la
concentración de deoxicolato fue de 0.5 mg/ml (0 05% p/v) [Ryu eí a/ ,1987a]
Morris ef a/. (1990) purificaron una PLC de 150 kD a paftir de la
fracción citosólica de eritrocitos de pavo. La actividad específica de la enzima
purificada fue de 6.7" 0 Limol/min/mg de proteína con PIP2 o PIP como substrato
Esta actividad fue dependiente de la presencia de Ca2+, con una activación media
máxima de aproximadamente 70 nM de Ca2+ con ambos substratos Esta PLC
mostró un pH Óptimo ácido (pH 40) y una estimulación a concentraciones
superiores de 005% (p/v) de colato de sodio como detergente. La PLC de
eritrocitos de pavo no reaccionó con la mezcla de anticuerpos monoclonales
preparados contra las isoenzimas purificadas por Ryu ef a/ (1987a)
Función de la PLC en diferentes sistemas
La función de la PLC se ha estudiado en diferentes sistemas y se ha
demostrado que la actividad de la PLC se encuentra involucrada en diferentes
16
procesos. S" ef a/. (1989) reportaron que la microinyección de PLC-yl y PLC-Pl
a células de fibroblasto indujo la síntesis de ADN. Sin embargo, en células de
mamíferos, Ia actividad de la PLC no fue esencial para la induccíón de la síntesis
de ADN [Hill ef a/., 1990] Por otro lado, debido a que la PLCLyl es un substrato
dírecto
genera
relatívo
alto en
de muchos receptores para factores del crecimiento, se piensa que ésta
señales para la proliferación celular Se ha observado que el contenido
de PLC-yl en carcinomas mamarios primarios es considerablemente más
comparación con el de tejidos de seno normal [Arteaga eí a/„ 1991],
Además, una PLC de tipo -y fue purificada de melanoma humano [Perella ef a/,
1991], esto implicó que la proliferación celular en células cancerígenas pudiera
estar influenciada por los niveles superiores de la PLC-y Recientemente, se reportó
que la PLC-yl es requerida para la proliferación célular en embriones de ratones
así como la importancía que la enzima tiene para el crecimiento y desarrollo del
embrión [Ji ef a/.,1997].
En Orosoph//a, el gene norpA (No receptor potential A) codifica para
una proteína con similitud a la PLC-P de retina de bovino [Ferreira eí a/,, 1993].
Cuando se hicieron mutaciones al gene norpA, no se encontró respuesta a la
estimulación por la luz, no se detectó actividad de PLC y se produjo ceguera Se
sugiere que esta PLC está involucrada en el proceso de fototransducción
[Bloomquist eí a/,,1988, Schneuwly eí a/., 1991] También se ha sugerido que la
deficiencia de PLC-P2 ocasiona disfunciones plaquetarias en humanos[Lee eí a/ ,
1996].
En Xenopus existe una PLC con un 64°/o de identidad a la PLC-P3 de
mamíferos [Ma eí a/., 1993] Cuando se inyectó a oocitos con oligonucleótidos
antisentido de PLC se redujeron significativamente las corrientes de Cl-
Sacharomyces cerev/s/ae y D/.cíyc)síe//um contienen una PLC con
secuencia similar a la de la PLC-ó [Yoko-o eí a/., 1993, Drayer y Van Haastert,
1992] En levaduras, la ruptura del gene PLcl produjo defectos en el crecimiento,
aunque la severidad dependió de la cepa utilizada [Yoko-o eí a/,1993] En otros
estudios, tambien en levaduras, la elíminación de cíerta secuencia de la PLC dió
como resultado células viables, las cuales, sin embargo, retardaron su crecimiento
celular cuando se cultivaron en condiciones no óptimas [Flick y Thorner,1993,
Payne y Fítzgerald-Hayes,1993] En O/cíyosíe//um, algunas observaciones previas
sugirieron que la regulación de la PLC era importante para la quimiotaxis y la
diferenciación [Bominaar eí a/, 1991; Bominaar y Van Haastert, 1994]
Sin
embargo, la eliminación de una región de secuencia del gene OdpLC dió como
resultado la pérdida de actividad de PLC en las células y no se observó alguna
alteración en el crecimiento y desarí.ollo [Drayer eí a/., 1994]
Existen algunas bacterias que secretan a una PLC al medio de cultivo.
entre éstas se pueden citar a Bac///us cereus [lkezawa y Taguchi,1981, Volwerk eí
a/.,1989], Bac/.//us Íhur/ng/'ens/s [lkezawa y Taguchi,1981] Síaphy/ococcus auneus
[Low,1981] y C/osír/d/um novy/ [Taguchi e lkezawa,1978] Estas PLCs reconocen
la estructura del inositol fosfato presente en el Pl, pero no hidrolizan los derivativos
fosforilados del Pl, Pl-4-P y P14,5-P2. Las PLCs de bacterias son monómeros de
17
aprox 35 kDa de masa molecular específicas para la hidrólisis de Pl. Se ha
reportado que las Pl-PLC de bacterias muestran efectos cuando se incuban con
preparaciones membranales o células sensibles a la insulina [Mato eí a/., 1987;
Saltiel y Cuatrecasas,1986; Saltiel ef a/.,1986]. Marques eí a/. (1989) compararon
la producción de Pl-PLC en cepas de S, aureus aisladas de pacientes con
síndromes tóxicos y de pc)rtadores saludables. Ninguna de las cepas a.isladas de
portadores saludables produieron Pl-PLC, 10 de las 32 cepas patogénicas si
produjeron Pl-PLC Además, hubo una significativa asociación entre la producción
de Pl-PLC y el desarrollo del síndrome de deficiencia respiratoria aguda o de la
coagulación intravascular diseminada, como complicaciones de la infección con el
estafilococo.`Esta correlación sugirió una función de la PI-PLC en la patogénesis de
enfermedades particulares de S. aureus Por otro lado, en L/síer/a monocytogenes
se identificó una proteína que es codificada por el gene plcA, y que es homóloga a
la PLC de Bac/.//us cereus, y de 8 fhumg/.ens/.s. La expres.ión del gene plcA
correlaciona con la aparición de actividad de PLC en las células. La actividad de
PLC se encontró unicamente en las especies patogénicas del género L/.síer/.a.
Cuando el gene sufre una ruptura, la actividad se pierde y la virulenc.ia disminuye
Esto sugiere que la PLC de L
monocy{ogenes puede estar involucrada en el
proceso de v.irulencia [Mengaud ef a/ ,1991]
En plantas, no se ha establecido alguna función fisiológica para la
PLC. Legendre ef a/. (1993) han planteado la hipótesis de que la activación de la
PLC puede constitw una vía por la cual un inductor activa la combustión oxidativa
en células en suspensión de soya.
FOSF0lNOsiTIDOS EN PLANTAS
En teiidos vegetales se ha demostrado la presencia de PIP2
Crain, i993],-se h'a detectádo actividad de PLC [Coté y Crain, igg3, Huang
1995], y se ha clonado ADNc que codifican para PLCs [Hirayama ef a/.,1995;
a/ ,1995, Yamamoto eí a/ ,1995, mrayama eí a/ ,1997].
Desde el primer reporte de la existencia de fosfoinosítidos en plantas
[Boss y Massel, 1985] han aparecido otras publicaciones indicando que estos
compuestos están presentes tanto en plantas completas como en cultivo de células
o teiidos [Helsper eí a/ ,1986a, b, lwine ef a/.,1989; Coté e{ a/.,1990, Rincón y
Boss,1990] Sin embargo, la distribución de estos IÍpidos es diferente de la que se
encuentra en células animales. Por ejemplo, el Índice de PIP a PIP2 es 0.51 en
músculo de coneio [Akhtar y Abdel-Latif,1980]. En contraste, el Índice de PIP PIP2
en células vegetales es de entre 10:1 y 201 y el contenido de PIP2 representa del
0% al 0 5% de los fosfolípidos de inositol totales [Dr®bak eí a/,1988; Heim y
Wagner,1989, Boss,1989]. Se ha estimado que, en células animales, unicamente
del 10% al 20% de las reservas de PIP2 se recambian en respiiesta a un estímulo
Si el origen de los segundos mensajeros en plantas es PIP2, la velocidad del
recambio debe ser bastante alta ya que las reservas son relativamente pequeñas.
En plantas superiores existen evidencias para sugerir que una función
primordial
de
los
fosfoinosítidos
puede
18
ser
la
de
regular
la
estructura
del
citoesqueleto [Tan y Boss,1992; Dr®bak,1993; Gross y Boss,1993; Staiger ef a/.,
1993, Yang eí a/., 1993]. En células vegetales se han detectado cambios en los
niveles de fosfolípidos de inositol en respuesta a estímulos específicos [Drobak,
1992], aunque los mecanismos de regulación de las enzimas involucradas en el
metabolismo de estos IÍpidos no se conocen. También, se ha observado que el lp3
causa liberaci.Ón de calcio de las vacuolas [Allen ef a/., 1995]. Kim ef a/. (1996),
presentaron evidencias de que el lp3 estimula la liberación de calcio, el cual luego
cierra los canales de K+ en las células puMnares. EIlos midieron la producción de
IP3 en protoplastos de tejidos flexores y extensores (que estimularon con varias
señales de luz) usando un ensayo radioreceptor en el cual el IP3 no radiactivo en la
célula compite con el IP3 radiactivo por la unión al receptor específico de lp3 aislado
de glándulas adrenales de bovino.
PLC en plantas
En los últimos años han aparecjdo reportes de actividad de PLC en
varios si.stemas vegetales; estos estudios han sugeri.do la exístencia en células
vegetales de un sistema si.milar al de la vía de los fosfoinosítidos descrita en células
animales [Sandelius y Sommarin,1990].
En células vegetales se han identificado dos tipos de PLC específicas
para fosfolípidos de inositol. enzimas solubles y enzimas asociadas a membrana
[Mc Murray e lrvine,1988, Melin eí a/.,1987; Pfaffman ef a/,1987; Tate ef a/.,
1989; Kamada y Muto,1992; Yotsushima eí a/.,1992; Yotsusmma eí a/,1993] La
información que va a ser descrita a continuación puede ser resumida en el cuadro
2.
La actividad de una PLC en plántulas de trjgo fue caracterizada por
Melin ef a/ (1987) La fracci.ón de membrana plasmática estuvo enriquecida de
fosfolipasa C con actividad para PIP y PIP2. Esta actividad fue mayor en brotes que
en raíces. Además, la actividad específica de la enzima en la membrana plasmática
de brotes culti.vados en oscuridad fue superior que aquellos cultivados en luz En
contraste, Ia actividad enzimática en membrana plasmática de rai.ces no fue
sensible al régimen de luz. Aunque se encontró actividad de PLC en la fracción
citosóIÍca, unicamente la enzima en membrana plasmática mostró especificidad de
substrato para PIP y PIP2 Esta enzíma fue dependiente de calcio, se activó a
concentraciones menores de 10 LiM y se inhibió a concentraciones mayores de 10
HM A concentraciones bajas de calcio se hidrolizó preferencialmente PIP2. En
contraste a las PLCs de animales, la PLC de plántulas de trigo no se activó por
GTP o análogos no hidrolizables de GTP En frijol y soya, se detectó activídad de
una PLC específica para Pl en membrana plasmática y en la fracción soluble. El
85-90% de la acti.vidad total se detectó en la fracción soluble, mientras que el 15%
estuvo en la fraccion asociada a la membrana; ambas se activaron con 0 5 mM de
calcio y a un pH Óptimo de 66 [Pfaffman ef a/.,1987]. La activi.dad de PLC,
utilizando Pl como substrato, se ha observado en fracciones citosólicas de apio,
coliflor, narciso [Irvine ef a/ ,1980]. En los tubos polínicos de iMm /ong/.#ort/m se
observaron dos actividades de PLC en la fracción particulada y una actividad de
PLC en la fracción citosólica [Helsper ef a/ ,1986a, b,1987]. La actividad de esta
19
PI-PLC aumenta durante la elongación del tubo polínico y es estimulada con 1 mM
de calcio [Helsper ef a/.,1987] En apio, se ha identificado una enzima asociada a
la membrana y una enzima soluble. Mientras que la enzima soluble hidroliza
unicamente PIP, la enzima asociada a la membrana hidroliza también PIP2 a pH
neutro y en una manera dependiente de calcio., además, la actividad aumenta
también en presencia de deoxicolato (01%, p/v)[Mc Murray e lrvine, 1988| En
algas verdes (DL/na//.e//a sa//na) Ia existencia de una PLC estuvo enriquecida en la
fracción correspondiente a la membrana plasmática y fue estimulada por calcio y
GTP [Einspahr eí a/,, 1989]. En membranas plasmáticas de raíces de avena, la
actividad de fosfolipasa C, utilizando PIP2 como substrato, fue de 13 2 nmol/min/mg
deproteínayalcanzaunmáximoaconcentracionesde10LiMdecalcio[Tateeía/,
1989]
La
purificación
de
una
fosfolipasa
C`
soluble
específica
pa,ra
fosfatidilinositol se realizó a panir de células de arroz cultivadas en suspension
[Yotsushima ef a/., 1992] El peso molecular aparente de la enzima se estimó en 50
kDa, tuvo un punto isoleléctrico de 6.3, un pH óptimo de 5 2 y una alta especificidad
para fosfatidilinositol Los valores de Vmax y Km fueron 5 Limol/min/mg de proteina y
0.3 mM, respectivamente La fosfolipasa C de membrana plasmática de raíces de
trigofuepurificada(parcialmente)25vecesatravesdecromatografíadeadsorción
ycromatografíadeintercamb.ioiónico.LaenzimacatalizólahidrólisisdePIPyPIP2
.iviuauc;. especificas
t;cit.;`~`,,„`,._
, .,10 ^Hmol/min/mg
_ . , ____ nin „ de
con actividades
de ._
5y
proteína,
respectivamente.
El
a c=
c hara PIP.
1 a enzima fue
imo
de
la
actividad
fue
entre
6-7
parar PIP
PIP2 La enzima t
pH Óptimo cie ia activioau iut= c;uiic v-,
-,.,..,y _6-6_ 5 _para
.
_ ____ ..-- :^.^-rni^r^m^iarf>c; /1n uM\ rMelin ef a/„
199
dependiente de calcio a concentraciones micromolares (10 LiM) [Melin ef a/.,19(
Yotsushima
TÜISU>UIHia eít;.a/c7..
(1993)
\ i-vv/
purificaron
r-.„ --_
una fosfolipasa
.
. . C a_ paftm
_ J_ ^de
r\ __-^^l/r-in/mr,
membranas\,
arroz, los valores de Vmax y Km para fosfatidilinositol fueron de 2 9 Limol/min/mg y
mM,
mM, respec(lvarllc:lllt=.
respectivamente Ll
El r+c;ou
peso
molecular
„,v.~v-._.
_r__
_
de
enzima se rle
estimó
en
_
_ .
iiaparente
¿_1:_^
..,- lai-i]rti`;irlz.rl
65 V
kDa, el punto isoeléctrico fue 51,
dependiente de calcio
pH Óptimo para la actividad de 65 y fue
En las raices de plántulas de avena se reportó la existencia de al
menos cuatro variantes de fosfolipasa C, dos citosólicas y dos asociadas a la
membrana [Huang ef a/ ,1995] Las dos PLCs c.itosólicas y las dos PLCs asociadas
a la membrana pueden ser separadas en base a su afinidad por la heparina La
PLC citosólica y la PLC asociada a la membrana que se unen a la h?parina
presentan un peso molecular aparente de 50-70 kDa, son activadas a
concentraciones micromolares de calcio y son específicas para fosfoinosítidos
fosforilados
20
Cuadro 2, Evidencias de PLC en plantas
PLANTA
CARACTERISTICAS
REFERENCIA
ACTIVIDAD DETECTADA EN
FFUCCION MEMBRANAL
FRACCION SOLUBLE
TR'GO
Hidrólisis
(brote y
raíces)
activación con Ca2+ < 10 L.M,
de
PIP
y
PIP2:
"drólisis de Pl,
Melín eí a/..1987
inhibición con Ca2+ > 10 HM,pHóptimode5,5-6conPIP2,y5,5-75conPIP
FRIJOL y
Hidrólisis
SOYA
actividad total), concentración
actividad total).
(ta'lo)
Óptima de Ca2+ 0 5 mM, pH
Óptima de Ca2+ 05 mM; pH
Óptlmo 6.6_
Óptmo 6 6_
de Pl
(15% de la
Lillum
Hidrólisis de
Longiflorum
actividad total); concentración
Óptima de Ca2. 1 mM, pH
(polen)
APIO (tallo)
Pl
(35°/o de la
Hidrólisis
de
Pl
(85%
de
la
concentración
"drólisis de Pl (65% de la
Óptlmo 6.5
actividad total), concentración
óptima de Ca2+ 1 mM, pH
Óptlmo 6 5
Hidrólisis de PIP2; activación
Hidrólisis
con 01% de deoxicolato,ConcentraciónÓptimadeCa2+1mM
con 01% de doexicolato
TR'GO
Hidrólisis
(p'ántu'as)
activación cx)n 0025% dedeoxícolato;concentraciónÓDtimadeCa2+10uM
de
PIP
y
Hidrólisis
(raíces)
concentración óptima de Ca2+10L,M.
PIP
y
PIP;
actwación
PIP2,
AVENA
de
de
Pfaffmann eí a/.
1987
Helsper eí a/
1986a
MCMurray e lrvine,
1988
Pical eí a/.,1992
PIP2,
Tate ef a/.1989
PURIFICADA A PARTIR DE
FRACCION MEMBRANAL
ARROZ
FRACCION SOLUBLE
PM aparente de 50 kDa; pl
6 3, pH Óptimo 5 2; específica
(celulas en
suspensión)
Yotsushima eí a/
1992
Para Pl, Vmax 5 Limol/min/mgproteína,Km03mM311vecesdepurmcación,activi-dadespecíficadelaenzimapui.a33umol/min/mgproteí-ria,concentraciónÓptimadeca2+100uM
TR'GO
Específica para PIP y PIP2,
(raíces)
25 veces de purtficación.actividadespeci'ficadelaenzimapura5Limol/min/mgproteína(paraPIP)y10LLmol/mln/mgprotel'na(paraPIP2).pHÓptlmo6-7(PIP)y6-65(PIF'2),concentraciónÓptimadeCa2+10HMy1mM(enpresenciadeMgc124mM)
Melm eí a/ ,1992
AFtROZ
P M aparerite 42 kDa, pl 51.
Yotsushima eí a/ .
(células en
suspensión)
pH Óptimo 6 5, 220 veces de
1993
purificación, especi'fica paraPl.Vmai29Limol/min/mgproteína.Km12mM,
21
activacion Por ca2. y sr2+ imwactividadespecíficadelaenzimapura1.9umol/min/mgproteína
formas
separadas
en
(raíces)
base a su afinidad por heparina; P.M aparente de 42 kDa,81vecesdepurificación,
base a su afinLdad por heparina, PM. aparente de 50-70kDa;561vecesdepurifica-
act¡vidad
ción; actividad específica delaenzimapura14.6
de
en
formas
Dos
específica
separadas
Dos
AVENA
laenzimapura806
nmol/min/mg
proteína
(con
pip2), concentración Óptima
Huang eía ' , 1995
nmol/min/mg
proteína
(con
pip2).
concentración
Óptlma
de Ca2+ 1 mM
i de Ca2+ 1 mM`
Actualmente, se ha reportado la clonación de tres genes en plantas de
Arab/dops/s ma//.ana El gen A{PLC7S codifica para una PLC específica para
fosfatidilinositol y es inducido baio condiciones de estrés salino y deshidratación
[Hirayama ef a/,1995], éste gen codifica para una proteína de 561 aminoácidos
con una masa molecular calculada de 64 kDa. Este producto incluye en su
estructura los dominios EF-hand (en su región amino terminal), X, Y, y es similar a
aqueHas isoformas de la familia Ó, además hidroliza PIP2 y su actividad fue
dependiente de calcio
La clonación y secuenciación de un gene (AfpLct) que exhibe un alto
grado de similitud de secuencia
por Yamamoto eí a/ (1995)
aminoácidos, y contiene en su
reside la actividad catalítica La
jóvenes
Las
plantas
con los genes de PLC-Ó de animales fue realizada
Este gen codifica para una proteína de 533
estructura las dos regiones conservadas en donde
expresión de este gene no se detectó en plántulas
expresaron
este
gene
cuando
se transfirieron
desde
condiciones cultivadas con períodos cortos de luz (8 h de luz/16 h de oscuridad)
hasta condiciones cultivadas en períodos largos de luz (16 h de luz/8 h de
oscuridad)
Recientemente, se reponó el tercer gene de Arabidops/.s Íha//.ana
(AfpLC2) [Hirayama ef a/ ,1997]. El producto proteico de este gene exhibe bastante
similitud de estructura con la de AtpLCIS Ambos son similares a las isoformas de
la familia Ó Aunque AtpLC2 posee las regiones X y Y, éste no presentó en su
estructura amino terminal el dominio EF-hand ni el domino PH
Las plantas
cultivadas en cond.iciones normales expresan constitutivamente el gen AíPLC2 en
casi todos los órganos excepto en las síliques, implicando que AtpLC2 no está
involucrada en el desarrollo de la semilla. Los niveles de ARNm de AtpLC2 fueron
altos bajo condiciones normales de cultivo y los niveles de ARNm de plantas que
habían sido expuestas a deshidratación no sufrieron cambio alguno Debido a que
el gene AíPLCIS es inducible con estrés salino y de deshidratación, Hirayama eí a/.
(1997) indicaron que la expresión de AtpLC7S y A{PLC2 es regulada de diferente
manera bajo las mismas condiciones de estrés, y que la función de éstas Pl-PLCs
en las respuestas de estrés pueden ser diferentes
22
También en plantas de soya se caracterizó un gen (PLC7) que
codifica para una proteína que incluye los dominios catalíticos conservados de las
PLC de típo 6. El gen PLcl codifica para una proteína de 600 aminoácidos y posee
una masa molecular de 68.8 kDa Esta proteína contiene en su estructura (entre las
regiones X y Y) un sitio de unión a Ca2+ de tipo EF-hand; la región amino terminal
está truncada. Debido a estas características, Shi et al„ (1995) sugirieron que esta
isoenzima es un miembro de una famma nueva de Pl-PLCs. La localización de esta
protei'na, expresada en plantas de tabaco, indicó que se encuentra tanto en la
membrana plasmática como en el citosol
La identidad de esta enzima fue
confirmada por estudios de complementación funcional en levaduras y por pruebas
de actividad /.n v/.Íro [Shi eí a/., 1995]
MODELO DE ESTUDIO: Calharanfhus noseus (L.) G. Don.
C. roseus es una angiosperma dicotiledónea, perteneciente a la familia
Apocynaceae, originaria de Madagascar y díspersada por cultivo a todo el mundo,
es un arbusto pequeño y erguido, de 30 a 60 cm de altura, perenne y común en las
regiones tropicales [Taylor y Farnsworth, 1975]. C roseus es una de las plantas
medicinales más ampliamente estudiadas [Moreno eí a/ ,1995]. Estos estudios se
han enfocado en el aislamiento y semi-síntesis de sus alcaloides. Se han aislado
más de 200 alcaloides de diferentes panes de la planta, muchos de ellos con
actividad farmacéutica importante [Cordell,1980; Mersey y Cutler,1986]. De éstos,
los más imponantes
son la vinblastina y la vincristina con propiedades
antileucémicas, el alcaloide antihipertensivo ajmalicina, y la serpentina que produce
efectos sedantes. Los bajos rendímientos de estos alcaloides en la planta, además
de su alto costo comercial, ha impulsado la investigación hacia nuevos métodos
alternativos para la producción de estos alcaloides tales como la sintesis o
semi-síntesis [Kutney eí a/ ,1988] y el cultivo de células y tejidos [Miura y Hirata,
1986] En las últimas dos décadas, se ha obtenido una considerable cantidad de
información relacionada con el crecimiento y producción de metabolitos
secundanos a partir de cultivos celulares y de tejidos de C. noseus Nan der Heijden
ef a/ ,1989; Ganapathi y Gargi,1990, Moreno eí a/„ 1995].
Actualmente, la Unidad de Biología Experimental del Centro de
lnvestigación Científica de Yucatán
cuenta con varios modelos experimentales
para la obtención de alcaloides a partir de cultivos de C. roseus. Uno de éstos es la
línea J1, la cual previamente ha sido caracterizada en cuanto a crecimiento y
producción de alcaloides Esta línea de raíces fue obtenida mediante la infección de
hojas con Agrobacfer/.um rh/zogenes [Ciau-Uitz eí a/., 1994]. Adicionalmente, las
raíces transformadas ofrecen ventajas con respecto al cultivo de plantas. Entre
éstas se incluyen la estabilidad genética y bioquímica, el no requerimiento de
fitohormonas exógenas y la alta tasa de crecimiento.
En
C.
noseL/s
se
han
aislado
y
caracterizado
varias
enzimas
involucradas en la biosíntesis de los alcaloides indólicos [Moreno eí a/., 1995], sin
embargo aún no se conocen los mecanismos de regulación correspondientes. Por
otro lado, C roseus ha comenzado a ser un modelo para estudios de fisiología
vegetal. La elucidación de los mecanismos de transducción de señales que
23
pudieran estar involucrados o relacionados con la activación o expresión de
enzimas de la biosíntesis de los alcaloides, permitiría la manipulación de
diferentes factores que puedan conducir al incremento de la producción
alcaloides en cultivos de C. roseus.
24
HIPÓTESIS
Exi.sten estudios que han sugerido la exi.stencia en células vegetales
de un sistema similar al de la vía de los fosfoinosítidos descrita en céw animales
También se ha identificado la actvidad de PLC con características diferentes a las
de animales, por lo que es posible la existencia de múltiples isoformas de PLC en
plantas que pudieran ser similares a aquellas de otros sistemas Asimismo, al igual
que en células ani.males, cada una de las PLCs de plantas tendría mecanismos de
ac{ivación y regulación djferentes. Este trabajo sería un avance para el
entendimiento de la función fisiológi.ca de esta enzima en los mecanismos de
transducción de señales en plantas.
OBJETIVOS GENERALES
Caracterizar a la PLC durante el proceso de crecimiento en raíces
transformadas de C. noseus.
Purificar a la fosfolipasa C de raíces transformadas de C. roseus.
OBJETIVOS PARTICULARES
Medir los niveles de actividad de la PLC /.n v/Íro, utilizando [3H]-PIP2
como sustrato en raíces transformadas de C. roseus.
Determinar el efecto del Ca2+ sobre la PLC de rai.ces transformadas de
C. roseus.
Determinar
la
especificidad
del
sustrato
de
la
PLC
de
rai.ces
transformadas de C roseus.
Determinar el efecto de diferentes detergentes sobre la PLC de raíces
transformadas de C. noseus.
Desarrollar un protocolo que permita la separación y purificación de la
PLC de raíces transformadas de C. roseus utilizando técnicas de cromatografía
convencjonales y de FPLC.
25
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CAPITULO 11
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-Phospholipase C activity
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César De Los Santos~Briones, J. Armando Muñoz-Sánchez,
José Chín-Vera,
Victor M. Loyola-Vargas and S. M. Teresa Hernández-Sotomayor. Publicado en J.
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lp3,
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inositol 1,4,5,trisphosphate, PIP, phosphatidylinositol 4-monophosphate; Pl,
phosphatidylinositol;
C.
n)seus,
Cafharan!hus roseus,.
EGTA,
[ethyl - enebis
(oxyethylenenitrilo)] tetraacetic acid; DAG, diacylglycerol; TCA, trichloroacetic acid;
SDS, sodium dodecyl sulfate
ABSTRACT
A phosphati.dylinositol 4,5-bisphosphate phospholi.pase C (PLC) activjty
was identified in different tissues from Caíharaníhus nDseus. The §pecific activity of
the enzyme was 10 times higher in a membrane fraction than in cytosol. During a
culture cycle, in two different root lines, PLC-activity in the cytosol reached a
maximum that preceded the higher activity in the membranes. Both ac{ivities,
soluble
and
membrane,
are
calcium-dependent
for
full
activity.
The
membrane~bound activity catalyses efficiently phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate
(PIP2)
and
phosphatidylinositol
4-monophosphate
(PIP)
hydrolysis
while
phosphatidylinositol (PI) is a poor substrate. The soluble activity preferentially
hydrolyzes Pl over PIP and PIP2. Both activities are completely inhi.bited by Triton
X-100, whereas they respond differentially to n-octyl P-D-glucopyranisde.
lNTRODUCTION
Phospholipase C has a key role in the signal-transduction pathway in
animal cells. PLC catalyses the hydrolysis of phosphatidyli.nositol 4,5-bisphosphate,
generating two potential intracellular second messengers: diacylglycerol and inositol
1,4,5 trisphosphate
ln
mammalian cells,
approximately eight distinct PLC
isoenzymes have been purified, cloned and sequenced (Rhee ef a/., 1989).
Activation of PLC and stimulation of PIP2 hydrolysis in animal cells occurs through
agonists that bind to either G-protein-coupled receptors or tyrosine kinase receptors
(for review see Jones and Carpenter,1992; Lee and Rhee,1995).
Purification and biochemical characterization of PLCs have been
carried out mostly with materials of animal orjgin However, the function of the
43
enzyme /.n vÍvo remains unelucidated, ln Drosoph//a, analys.is of the norpA gene has
revealed that .n encodes a putative PLC (Bloomquist e{ a/ , 1988). Mutations in this
gene render the fly blind (Pak ef a/., 1970), suggesting that PLC is an essential
component of the phototransduction pathway in Orosoph/./a. In Saccharomyces
cerev/s/'ae, disruption of the PLcl gene results in slow growth or lethal.ity for ceHs,
indicating that PLcl is impohant for ceH growh (Yoko -o eí a/. , 1993).
Several repons on plant PLC have emerged in the last few years (for
review see Gross and Boss, 1993) lt appears that all the enzymes hitherto
investigated, faH in one of two main groups PLC type 1 is predominantly soluble, has
a clear preference for Pl over PIP and PIP2, and requires millimolar concentrations
of
Ca2+
for fun
activity
(MCMurray
and
lrvine,
1988.
Pfaffman
ef
a/.,
1987,
Yotsushima ef a/,1992); PLC type U is predominantly associated with plasma
membrane, shows a marked preference for PIP and PIP2 over Pl, and is fully
activated by low micromolar Ca2+ concentrations (Melin eí a/.,1987, Sandelius and
Sommann,1990; Yotsushima ef a/.,1993, Melin et a/ ,1992)
Recently, an Arab/.dops/s fha//.ana cDNA has been cloned that exhibits
a high degree of sequence homology to animal PLC-Ó type (Yamamoto eí a/ ,
1995). A soybean cDNA has also been cloned that shows strong homology to
D/'cfysfel/um
LJIuly>`C3IIUIIl
PLC
i-L`i am^
and ui`^„„„:„:
mammalian
` . PLC-Ó
_.=,
isoform (Shi r`eí a`
,1995)ic Also,
a gene
•,.
_L___L_i:__^^
`i`.hirh
inrliirf]A
bv
encoding a phosphatydilinositol-specific phospholipase C, which is induced b
rlehvdration
in Arab/dops/s
Íha//.ama
_ (Hirayama
__L
----- :-11\,
eí a/
dehydration and
and salt
salt stress
stresswas
wasidentified
iut3Hiiiic:u
„ .,c]„,uut,u
,..,,... _.._
`` ,___,
1995) The possible modes of activation of plant PLC(s) are relevant, especially if
exists any analogy to mammalian systems. Evidence in favor of involvement of
G-proteins in plant PLC activation has been reported (Einsparh and Thompson,
1990), as has inositol phospholipid breakdown induced by light and auxm (Morse eí
a`.,1987: Ettlinger and Lehle,1988). lt has also been suggested that a major role for
inositol phospholipids in higher plants may be to regulate cytoskeletal structure
(Gross and Boss,1993; Tan and Boss,1992, Drobak,1993, Straiger ef a/ ,1993)
However,
further
investigations
of
both
the
b`iochemical
and
molecular
characteristics of the plant PLC isoenzymes is required ln tms paper, data are
presented suggesting that PLC activiv can be regulated during the growth of
Caíharar)Íhus noseus transformed roots
MATERIALS AND METHODS
Cell culture. Hairy root line Jl of C roseus was obtained by infection
of leaves with Agrobacíer/um rn/zogenes (Ciau-Uitz et a/ ,1994) and maintained in
85 medium (Gamborg eí aL 1968) (1.54 g/1., Sigma), supplemented wm 30 g/L
sucrose, pH was adiusted to 5 7 prior to autoclaving of the medium with 01 molfl
KOH/HCI One hundred milliliters of medium were placed in a 250 mL Erlenmeyer
flask and autoclaved for 20 min at 15 psi. Flasks were inoculated with 0 5 g (fresh
mass) of hairy roots Roots were subcultured every 14 d. Cultures were grown in
darkness at 25°C on a rotary shaker at 100 rpm
Normal roots of C roseqs
Ínon-transformed) were obtained as described (Ciau-Uitz eí a/ ,1994) and grown in
the same conditions except that the medium was supplemented with 10 nmol/L of
naphtalene acetic acid Normal roots were subcultured every 28 d
44
Preparation of tissue and cell extracts. Roots were quickly frozen
with liquid nitrogen and homogenized with a politron in buffer A (1g of tissue in 2 5
ml; 50 mmol/L Nacl,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L Tris.Hcl pH 74, 250 mmol/L
sucrose,10°/o glycerol,1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride,10 mmol/L sodium
pyrophosphate and 0.2 mmol/L orthovanadate). Extracts were passed through a
gauze, and tissue debrjs was removed by centrifugation at 12,000 gn for 30 min at 4
°C The supernatant was further centrifuged at 100,000 gn for 45 min. The
supernatants (protejn: 3.5-5.0 mg/mL) were recovered as the soluble fraction. The
pellet was resuspended in the same buffer A (protein: 0.5-1 2 mg/mL), and was
used as a crude membrane fraction. Similar protein concentrations were founded in
all the tjssues studied. All steps duríng the extraction were performed at 4°C. The
cell extracts were quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -75°C. Protein
concentrations of samples were measured by BCA protein assay reagent using
bovine serum albumin as standard.
PLC as§ay. The hydrolysis of [3H]PIP2 was measured as described by
Hernández-Sotomayor and Carpenter (1993) and Nishibe eí a/., (1990) in a reaction
mixture (50 LtL) that contained 35 mmol/L NaH2P04 (pH 6.8), 70 mmol/L Kcl, 0.8
mmol/L EGTA, 0.8 mmol/L Cac12 (final Ca2+ concentration 25 Ltmol/L), 200 Limol/L
PIP2 (~20,000 cpm), 0.08 % deoxycholate The reaction was stopped with 100 LtL of
1 % (w/v) bovine serum albumin and 250 HL of 10 % (w/v) TCA. Precípitates were
removed by centrifugation (13,000 gn for 10 min) and the supernatants collected for
quantification of [3H]lp3 release by liquid scintíllation counting Aquasol.
ln some
experiments, lp3 the product of hydrolysis of PIP2 by PLC, was separated and
charactenzed on a Dowex AG IXs formate form column (1 mL) according to the
methods of Berridge eí a/., (1983).
Calcium dependence. A Cac12/EGTA mixture was used, and the free
calcjum
concentration
was
calculated
using
EQCAL
(Biosoft)
and
Chelator
(Shoenmakers) programs.
Data presentation. All experiments were repeated at least three times
using extracts prepared on separate occasions, and all gave similar results. Each
figure contains data from a single, representative experiment assayed in duplicate,
the errors varied by less than 10%.
Materials.
Mannheim.
[3H]PIP2
PIP2
,
ammonium
[3H]PIP,
[3H]Pl,
salt was
obtained
from
Boehringer
and Aquasol were obtained from
Du
pont-New England Nuclear BCA protein assay reagent was supplied by Pierce
Chemical Co. 85 medium, PIP and Pl were obtajned from Sigma. Dowex AG 1-Xs
formate form was obtained from Bio-Rad.
RESULTS
Change in PIP2-PLC activity during the growth cycle of different
roots lines. Cells in culture grow following a sigmoidal curve, and the metabolic
requirements throughout the growth cycle differ. There js substantial evidence that
enzymes are expressed differentially through this cycle The growth curve for line J1
45
transformed roots from Caíf}araníhus roseus is presented in Fig. 1. This curve
sriows a lag period of about 4-5 d, the exponential phase starts during the sixth d,
and then a linear phase continues over 14 d after this period, whereiipon the roots
enter a stationary phase
0
4
8
12
16
20
24
28
CULTURE DAYS
!|#,:c::;!:g:e;s:;s,a:n':pi:,P#L?Ct,,anoc.:,'#,,f,:.:;dno:r.Tíe,T!:a::?mt:??;:o:n,'sffiÑeR3)`oBri;'g'£i:;
was expressed tn absolute values of lp3 formation. Growth curve (.)
PIP2-PLC activity was detected in the Jl line The specific actMty in the
total extract (at day 6 of culture) was
20 nmol/min.mg, protein. When the total
extract was fractionated into soluble and membrane fractions by centrifugation, the
specific actMty in the membrane fraction was found to be 65 nmol/min.mg and in
the soluble fraction was 5 nmol/min.mg protein. The activity in both fractions was
then measured along the growth culture cycle The time-course of PIP2-PLC activity
along the growth culture peaked in the soluble fraction from day 2-4 and from day
6-8 for the membrane fraction This (day 8) is the period where the exponential
growth phase starts in
line J1 (Fig
1) PLC activity was measured in normal roots
46
which require naphtalene acetic acid for growth and compared with the transformed
root Jl line that does not require external growth factor regulators. As shown in Fig.
1, normal roots grow more slowly than transformed roots and follow a more linear
growth curve.
PIP2-PLC activity was also measured in the normal root line. The
absolute values of actívity differ from those observed in the Jl line (Fig.1). ln this
case, the soluble activity was higher at the beginning of the cycle before going to
basal levels during the remainder of the cycle. The paftern for the membrane
fraction was different. There was one main peak of activity between s and 10 d.
To determine whether the observation of PLC activity could be
extended to other tissues and cell lines from C. roseus (ranging from normal plants
to suspension cells), the capacity to hydrolyze PIP2 was evaluated ln several
cultures and dlfferent tissues of C. roseus plantlets. Because it was previously
noted that PLC activity changes according to culture age, we attempted to
measure in the different cultures when they initiated the exponential growing phase.
As shown in Fig. 2, PLC activity was detectable in all cultures, with a
higher specific activity present in the membrane fraction lt is interesting to observe
that
the specific activity
of the membrane
fraction from transformed tissues
(tumors) and undiferentiated
tíssues (callus) was higher than that from roots,
stems, or leaves, whereas, the specific activity of the soluble fraction from
transformed tissue was higher or similar to specific activity of leaves, stems and
roots or suspension culture cells.
:¿Fúbíép(dpá-sahcetáv¡b¢a!g)d#e:een;b:ápesir:St:;Sns|:#)Pá-apí:S,anct{¥;tsyu¥saswmiasrffr:ÍdeLn,
degree of differentiation. Suspension cells (from tumors obtained from A. Íumeíac/.ens
transformed stems); tumor (from stems transformed with A. ÍL/meíac/ens); light callus
(from roots); clark callus (from roots); leaf, stem and root from C mseus plant from 4
weeks of culture
47
Since the Jl line presented the most prominent peak in PLC activity,
we decided to use this line for further characterization of this enzyme
ldentification of hydrolysis products and substrate specificity.
The products of inositol phospholipid hydrolysis by the membrane-bound-PLC
activity were analyzed by anion-exchange chromatography. When [3H]PIP2 was the
substrate, the main product eluted was lp3. The majority of phospholipase activity
degrading the exogenous radiolabeled PIP2 is of a PLC nature since over 95 % of
[3H]inositol phosphates released were recovered as [3H]lp3 (data not shown).
The PLC activity of the membrane-bound and soluble fractions with
various inositol phospholipid substrates js shown in Table 1. ln the membrane
fraction, PIP2 and PIP were hydrolyzed ~ 20 times the rate of Pl hydrolysis, whereas
in the soluble fraction PIP and Pl were hydrolyzed at 10 and 4 times the rate of PIP2
hydrolysis, respectively.
Table 1. Substrate specificity of the Jl transformed roots. Soluble and membrane
g,#:r::{':':Estaraieasyed dur¡ng the 6th Culture day in the presence of 2oo Limoi/L of the
SOLUBLE
|
MEMBRANE
(nmoi min-i mg-1 )
PIP2
0_26
54
PIP
36
54
Pl
1
3
Calcium dependence of phospholipase C. To determine the effects
of varying Ca2+ concentratlons on PLC activity, a series of Ca2+-EGTA buffers at pH
6 8 were prepared, using two different computer programs, to yield the free Ca2+
concentrations shown in Fig. 3. The hydrolysis of PIP2 of both enzymes, soluble and
membrane, was activated by Ca2+. lnterestingly, the EC5o for the soluble fraction is
greater than for the membrane-bound enzyme. These data differ from previously
published data, in which it was reported that the soluble form requires a higher Ca2+
concentration for activation than the membrane form (Melin ef a/.,1987; Sandelius
and Sommarin,1990; Yotsushima eí a/„ 1993; Melin eí a/.,1992). Our data show
that there was an inhibitory effect at higher Ca2+ concentrations. Tms occurrence
has also been observed m other plant PLCs (MCMurray and lrvine,1988; Melin eí
a/.,1987; Hirayama ef a/.,1995).
48
0123456
LOG [ Ca2+ ], nM
:¡ag;3.etEí=:nte3fwc,#cbuaT+ccOo:%::{::ti¡oonnsov:n:'dp2u!,yndgrod¥S+¡_sÉGTThÁB#reor'¥,s',§niiep'jpí2
line. For cytosol (.), samples were from clay 4 and for membrane (.), samples were
from day 6.
Effect of detergents on soluble and membrane associated
phospholipase C activity. To determine the optimal detergent for PLC activity,
the effect of various detergents on both soluble and membrane-assocíated PLC
activity was tested using PIP2 as a substrate. When increasing concentrations of
detergents were added to the assay, three distinct responses were observed (Fíg.
4). The non-ionic detergent, Triton X-100, had a dramatlc inhibitory effect on both
PLC actMties. The ionic detergent deoxycholate had djfferent effects. ln the soluble
fraction, it had a stimulatory effect at low concentrations but inmbited the enzyme at
higher concentrations (0.15-0.2 %). ln the membrane fraction, deoxycholate had an
inhibitory effect but was less pronounced than in the soluble fraction. Non-ionjc
octylglucoside had very little effect on the membrane associated activity, but did
stimulate the soluble actMty.
49
A
8
0 00
05
10
15
20
25
| DETERGENT ] %
E¡egt.er4g.e:tg:C¿,:hf{he:erfi:nea|üco°nncesn?:=tE|:sanadsTnedTct¡83::::e°C:adt3gdptLocsat::¡#d
:n:::i;et;i!!sEr:ftiís:s:reárn::f;:s:r?ghe:nnt:ca::,:ie;ds#orv::,'y:'en,g::tgTeenpTP;af|:ehs:w3::rg;ta?t;Áací3)t3eoí
:ro°±/ymJ.nDTgqu¿:pyTaen%9,rdaen:E ,a#/dv),Cs€8:u°+ dreeos;ecchttí:(€ (oT,rl¿O/C) X-100 ( Á, v/v),
DISCUSSION
The wealth of information accumulated on the molecular mechanisms
by which animal cells perceive and transduce external signals starkly contrasts with
our relative ignorance of the initial events in plant-specific signaling cascades.
Research in a number of different eukaryotic systems has led to a general belief
that the selectivity of cellular signals required to provide cell-specific responses do
not necessarily caH for fundamentally new mechanistic elements to transduce the
initial signal to their final cellular response in each case
Extensive evidence,
including Ca2+ mobilization studies, suggests a central importance in plants of a
signal transduction pathway involving both calcium-and phosphatidylinositol-derived
second messengers, which may connect light and other environmental signals to
the regulation of genes. The presence and relevance of second messengers, such
as lp3, and their rapid production in response to phytohormonal or light stimuli, point
to a fundamental role of these compounds in plant signaling (Coté and Crain,1993)
50
Since it has been shown that PLC plays a key role in signaling
mechanisms in mammalian cells, the possibility remains that this is the case in
plant cells However, there are only a few repohs concerning the purification and
characterization of plant inositol phospholipid specific PLCs, but the cloning of a
putative Pl-PLC in higher plants has been reported (Yamamoto eí a/., 1995). To
date plant PLC has not been purified to homogenei.ty, and although calcium is
required for activity, there are no reports about the possible mechanisms for
activation of this enzyme.
ln this study, we detected 1) significant changes (3-10 fold) Ín the PLC
activíty during culture growth (PLC was more prominent during the initiation of the
exponential growing phase of the cultures, and was observed in two different root
lines); 2) detection of two different activities in cytosol and membrane fractions (both
activities have been reported in different plant cells and tíssues, but during the first
10 d of culture in the two root lines studied, there was a peak in the soluble activity
that preceded the activity in membranes).
lt has been reported in C roseus suspension cells that the amounts
and ratio of the different inositol phosphates depended on the stage of the growth
cycle, with the highest levels corresponding to the cell-division phase A role of the
phosphatidylinositol
cycle
in
the
proliferation
control
of plant cells was
then
proposed The activities of the phospholipid kinases of the Pl cycle also correlate
with the cell division phase of the growth cycle (Heim and Wagner,1989, Grabowski
eí a/ ,1991 ). However, to date, it has not been reported how a key enzyme such as
PLC changes during a growth cycle, particularly in a differentiated tissue.
ln mammalian cells, it has been shown that the subcellular localization
of the PLC isoenzymes is important. PLC-Pl is primarily membrane associated,
whereas PLC-yl and ól are primarily soluble. Translocation of the PLC-yl from
cytosol to membrane compartments has been observed in response to growth
factors (Todderud eí a/ ,1990, Kim eí a/„ 1989). However, the mechanísm by which
this translocation takes place is unknown. ln our model, we can not rule out the
possibility that translocation from the cytosol to the membrane may occur; there
could also be several isoforms at the beginning of the culture The mechanism by
which the PLC activity is membrane-associated is unclear from the available results.
lt could be that when soluble PLC translocates to the membrane it binds to PIP2
perhaps in a manner similar to that suggested for mammalian PLCÓ (Cifuentes eí
a/„ 1993). The PH domain (pleckstrin homology), which is found in a broad array of
signaling proteins including all animal PLC isozymes, has been suggested to be a
sequence that associates proteins with membranes in order to function (Musacchio
eí a/., 1993). Evidence for the interaction of PLCó-PH domains with PIP2 was
provided ln this enzyme, the amino-terminal region containing the PH domain was
necessary for binding to phospholipid vesicles containing PIP2 (Cifuentes ef a/ ,
1993). These results suggest that PIP2 might be important for localizing protetns
containing PH domains at the membrane surface. The soluble localization of PLC,
as well as for other PLC isozymes in animal cells, presents a logistic problem since
PIP2 is located in the membrane. ln C. roseus the specific activiv for PIP2 hydrolysis
is about 10-fold higher in membranes than in the cytosol for most of the tissues
51
studied (Fig. 2, Table 1) ln plants, it has been reported that membrane-bound PLC
preferentially hydrolyzes PIP2 and PIP over Pl (Melin ef a/„ 1987: Sandelius and
Sommarin,1990; Yotsusmma ef a/.,1993, Melin eí a/ ,1992; Huang eí a/.,1995).
With the discovery that so many of the components of the mammalian
phosphoinositide signaling system also are present and functioning in plant cells,
the obvious question is: what is the role of this system in plant cell signaling? The
central feature of this system is the production of the two messenger molecules lp3
and DAG Little attention has been paid to the role of DAG, principally due to the
difficulty in detecting protein kinase C activity in plants, but i( has been shown
extensively that lp3 is able to release Ca2+ from intracellular stores in plant cells
(Trewavas and Gilroy,1991). Little is known about the metabolism of lp3 /.n v/.vo, but
several studies using soluble plant extracts and membrane preparations as enzyme
sources suggest that, Í.n v/.Íro, the metabolism of lp3 (1, 4, 5) by plant enzymes
differs significantly from that of other eukaryotes (Memom eí a/., 1989, Dr¢bak eí
a/.,1991; lrvine eí a/„ 1992; Joseph eí a/,1989). Although we expect the IP3
release to be a very fast response, some of the kinases and phosphatases involved
in its metabolism may be regulated in a different way in plants (for reviews see
Dr®bak,1992; Cho ef a/ ,1993: Yang and Boss,1994; Yang eí a/.,1993).
ln the search for primary events initiated by phytohormones, both short
and long-term effects on plant grow^h have been studied A major difficulty ras been
to distinguish those primary hormonal responses of probable importance in growfth
regulation from those that are merely consequences of the primary alterations of
cellular physiology. Growth responses such as cell elongation, however, require the
completion of a series of metabolic steps to facilitate promotion and spatial control
of cell wall synthesis, as well as cell division. This suggests long-term responses,
with time intervals that may vary beween 1 h and several days. Calcium signals
emanating from the plasma membrane are known to be generated by a number of
mechanisms that use calcium channels that are receptor operated, voltage
dependent, or regulated by second messengers. The calcium fluxes induced can be
either transient or sustained. The proposed role of calcium as a common
denominator may also explain why previously stimulated cells can retain an
enhanced
responsiveness
that
outlasts
the
initiating
stimulus
Persistent
responsiveness may be caused by osciiiatory fluxes or repetitive spikes in éaicium
concentration, creating what has been termed a cellular memory. It is a possibility
that lp3 has a more relevant role than DAG as a second messenger in plant cells,
and also that lp3 levels can be maintained by the continuos activation c)f PLC.
Our work has identified phospholipase C activity capable of hydrolyzing
polyphosphoinositides in different tissues from different degrees of differentiation
and organization, at rates comparable to those of other animal and plant tissues
The enzyme has dependence on micromolar concentration of Ca2+ for its activity as
described for other PLCs lt efflciently catalyses PIP2 and PIP while Pl is a poor
substrale,
thereby displaying a different phosphoinositide substrate profile
compared with PLCs from other tissues.Our results agree with those obtained by
Huang eí a/,1995. who found two cytosolic and two membrane-associated
enzymes The partially purified enzymes were activated by micromolar calcium and
52
were specific for phosphorylated phosphoinositides. Thus, plants, in contrast to
animals, may have PLCs highly specific for phosphorylated phosphoinositides
With the data presented here, we are presently unable to answer the
main question about the mechanism by which external or intemal signals regulate
PLC. Guanine nucleotides failed to stimulate th.s enzyme (data not shown). The
possibility that G-proteins may be involved in the PLC regulation in our model
remains open ln mammalian cells /.n v/.vo or /.n v/'fno, tyrosine phosphorylation
increases the catalytic activity of PLC-yl , suggesting that PLC-yl catalytic activity is
regulated by tyrosine phosphorylation (Nishibe eí a/„ 1990) /n v/'Íro experiments
also showed that the association of EGF receptor can increase PLC-yl activity
independently of tyrosine phosphorylation (Hernández-Sotomayor and Carpenter,
1993). We found that the absence of phosphatase inhibitors in the buffer extract
reduced more than 50 % the activiv of the membrane-associated activity but did not
modify the soluble activity (data not shown). The fact that mammalian PLC can be
modulated by so many mechanisms opens the possibility that perhaps plant's PLC
may be regulated by a new mechanism not described before. Purification of PLC in
our model,
to homogeneity, will be essential for a full
understanding
of the
physiological rates and the regulation of the enzymes
ACKNOWLEDGMENTS.
The authors thank Dr. José Luis Boyer for critical advice, Dr. Graham
Carpenter for generous assjstance with reagents and advice, Dr. Roger Ashburner
for the revision of the English version of the manuscript, and Sue Carpenter for the
administí.ative
work to the FIRCA grant. Suppohed by Fogarty lnternational
Research Collaboration Award (R03TW00263), Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (3016-N9306), lnternational Foundation for Science (C/2236-1) and a
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologi'a Fellowship to De Los S -8. C (88202).
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57
CAPITULO 111
Purificación parcial de la Fosfolipasa C en raíces transformadas
de Catharanthus roseus
César
De
Los
Santos-Briones,
Victor
M.
Loyola-Vargas
y
S.M.Teresa
Hernández-Sotomayor.
lNTRODUCCION
En células animales se han identificado varias isoenzimas de la familia
de la fosfolipasa C; éstas difíeren entre sÍ con respecto a los mecanismos de
activación y regulación [Ree y Bae,1997]. Aunque sus substratos son lípidos de
membrana, las PLCs se localizan tanto en la fracción membranal como en la
fracción citosólica. Muchas de ellas fueron purifícadas en un principio de la fracción
soluble y posteriormente de la fracción particulada [Rhee eí a/.,1989].
La actMdad de fosfolipasa C también se ha detectado en otros
organismos como en bacterias [lkezawa y Taguchi,1981], levaduras r/oko-o eí a/.,
1993], moho de fango [Bominaar eí a/.,1994], algas verdes unicelulares [Einspahr
eí a/„ 1989], etc.
En plantas se ha detectado actividad de PLC en raíces, brotes, tallos,
inflorescencias y polen de varias angiospermas [lrvine eí a/., 1980; Helsper eí a/ ,
1985; MCMurray and lrvine,1988; Tate eí a/„ 1989; Melin eí a/.,1992; Yotsushima
ef a/.,1992,1993]. En base a sus características bioquímicas, las PLCs de plantas
se han clasificado en dos grupos [Dr¢bak, 1992]. Las PLCs solubles (tipo 1)
hidrolizan prefierencialmente Pl y requieren concentraciones milimolares de Ca2+;
las PLCs asociadas a membrana (tipo 11) hidrolizan preferencialmente al P14-P y al
PIP2 y se activan por concentraciones micromolares de Ca2+[Yotsushima ef a/.,
1993].
La mayoría de estos estudíos sostienen la hipótesis de que el
metabolismo de los fosfolípidos de inositol en plantas está involucrado en algún
mecanismo de transducción de señales. Sin embargo, se requieren de estudios
precisos y detallados para probar esta hipótesis. En lo que se refiere a la
purificación y caracterización de PLCs en plantas, existen algunos repones: no
obstante, ninguna se ha purificado a homogeneidad y, debido a esto es escaso el
conocimiento no sólo de los mecanismos en los que se involucra a la PLC sino
también de la posible función que ésta pudiera tener.
MATERIALES Y METODOS
Cultivo de tejidos vegetales. Como material biológico se utilizaron
cultivos de raíces de Caíharaníhus roseus obtenidas por transformación mediante
58
el uso de la bacteria Agrobacíen.um rh/.zogenes. De las diferentes líneas obtenidas
en el laboratorio se empleó la J1, la cual fue obtenida transformando raíces de
plántula y se caracteriza por su rápido crecimiento (tiempo de duplicación igual a 30
h) [Ciau-Uitz eí a/„ 1994]. La líneas Jl se cultivó en medio de cultivo 85 (a la mitad
de su fuerza iónica) suplementado con 30 g/L de sacarosa Las raíces de la línea
Jl fueron subcultivadas cada 14 días en matraces Erlenmeyer de 250 mL utilizando
0.5 g de tejido como inóculo inicial.
Extracto Proteico. Las raíces frescas se congelaron en nitrógeno
líquido, se trituraron hasta obtener un polvo fino y se homogenizaron con un politrón
en el amortiguador A (Nacl 50 mM, EGTA 1 mM, Tris-Hcl 50 mM pH 7.4, sacarosa
250 mM, glicerol 10% (v/v), PMSF 1 mM, P-mercaptoetanol 1 mM, pirofosfato de
sodio 10 mM y ortovanadato de sodio 0. 2 mM) 1 g de tejido en 2.5 mL de
amortiguador. El extracto se filtró a través de una gasa y los restos de tejido fueron
removidos por centrifugación a 12,000 X g durante 30 minutos a 4°C. EI
sobrenadante obtenido se centrifugó a 100,000 X g durante 45 minutos a 4°C. EI
sobrenadante fue recuperado como la fracción citosólica y el sedimento
resuspendido en el mismo amortiguador A se usÓ como la fracción membranal
cruda. Las concentraciones de proteína fueron medidas por el método del ácido
bicinconínico (BCA) utilizando albúmina de suero de bovino (BSA) como estándar
[Smith ef a/.,1985].
Medición de [a actividad de PLC. En nuestro modelo se midjeron los
niveles de actividad de la PLC /`n v/.Íro, utilizando [3H]-PIP2 como sustrato, en 2
distintos extractos celulares
fracciones citosólicas y fracciones membranales
crudas. La hidrólisis del [3H]-PIP2 se midió en una mezcla de reacclón (50 LiL) que
contenía NaH2P04 35 mM (pH 6.8), Kcl 70 mM, EGTA 0 s mM, Cac12 0.8 mM
(concentración final de Ca2+ 25 HM), PIP2 200 uM (~ 20,000 cpm), deoxicolato
0.08% (p/v). El tiempo de la reacción fue de 10 minutos y se detuvo con 100 LiL de
BSA 1% (p/v) + 250 LiL de TCA 10% (p/v). El precipitado fue removido por
centrifugación (12,000 X g durante 10 minutos) y el sobrenadante se colectó para la
cuantificación del [3H]-lp3 formado en líquido de centeHeo Aquasol.
Solubilización de la PLC membranal. Se tomaron las raíces frescas
del 6° día de cultivo La extracción proteica para obtener la fracción membranal
cruda se realizó de acuerdo al protocolo ya descrito, con la ligera modificación de
que el sedimento obtenido de la centrifugación a 100,000 X g, se resuspendió en el
amortiguador A con Kcl 2 M. El sedimento resuspendido se sonicó durante 90
segundos y se ultracentrifugó nuevamente a 100,000 X g durante 45 minutos a 4°C.
El sobrenadante se recuperó como la fracción membranal solubilizada.
Purificación de la PLC asociada a la membrana. Todos los
procedimientos de purificación se realizaron a 4°C haciendo uso de iin equipo de
FPLC® (Fast Protein Liquid Chromatography). Para la extracción de la proteína se
utilizaron 100 g en peso fresco de raíces. Se obtuvo la PLC membranal solubilizada
(2.3 mg de proteína/mL).
59
PROTOCOLO No. 1
prec,p,tóc.n:::::£::a:::3=:::::##;S::atEu'raed:ra:t:NT:,Tsbg:nhaás::':3':'zaa,::n::
un 40% de saturación. El precipitado se separó mediante centrifugación a 28,000 X
g durante 20 minutos Al sobrenadante se le adicionó el volumen necesario de una
solución saturada de (NH4)2S04 para que éste alcance un 60% de saturación. EI
precipitado se separó mediante centrifugación a 28,000 x g durante 20 minutos. La
pastilla se disoMó con amortiguador A y se le adicionó el volumen necesario de una
solución saturada para obtener una concentración final de (NH4)2S041 7 M.
obtemda en::g=ggg£=Í:aé#ní=:a:;;£:5±:£=#3,Íío, :: npareTta rác,xón38nz#t,::
Phenyl-Sepharose® CL4B (Pharmacia) previamente equilibrada con 100 mL de
amortiguador 8 (Tris 20 mM pH 7.4, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.6 mM, 2
Hg/mL de leupeptina) Con (NH4)2S041 7 M. La elución se hizo con un volumen de
100 mL de amortiguador 8 con un gradiente linear decreciente de 1.7 a 0 M de
(NH4)2S04. Se colectaron fracciones de 0.5 mL, se midió la actividad de PLC y la
absorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas.
PROTOCOLO No. 2
desaióutdiza::==::=:=:í=::::i:::!S:i:=i=)::eger;:ta°dem#.r25na('psh°:::':c:a;
previamente equilibrada con 5 volúmenes de amortiguador 8 a un flujo de 2
mL/min. La elución se llevó a cabo con 100 mL de amortiguador 8 Las fracciones
colectadas fueron de 5 mL La absorbancia se midió a 280 nm.
con,en,an,aggg:g::;1¡É::3!:¡3:::::i:::::col:sm:raacp::oen:3adc:áaa'a,ia6SxqTS
cm) HiLoad" Q Sepharose® HP (Pharmacia) previamente equilibrada con 100 mL
de amohiguador 8. La elución se hizo con un volumen de 200 mL con un gradiente
linear de 0 a 1 M de Nacl. Se colectaron fracciones de 3 mL Se midió la actMdad
de PLC y la absorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas.
depLCseag:%==:=£:=:::±:#:::¡::£=Í=±=áaEt2V%,uxm6eoncc#at:Ldooadfgns:::r:dea£
200 prep grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL de amortiguador
8 conteniendo Nacl 100 mM a un flujo de 2 mL/min. La elución se hizo con 320 mL
de amortiguador 8 con Nacl 100 mM. Las fracciones colectadas fueron de 3 mL
ap,,ffi,..aug:g:gg::tiiTg:=g::ggFdeLaHse;raar::i?neepshacr::e3cér'-d6aBd(g:a:::c:a3
equilibrada con 100 mL de amortiguador 8 con Nacl 100 mM. Se eluyó con 200 mL
de amortiguador 8 con un gradiente linear de NacI 100 a 900 mM. Las fracciones
colectadas fueron de 2 mL.
60
PROTOCOLO No. 3
sedesa,óut,g:hmd:tougnr:f:?,:i::tra:'Ósne:3#x®Eá%risthoarmeamcpar,a:a,:::l,:R,|,:a,g:
condiciones del protocolo No.2 anteriormente descrito.
Cromatografía de afinidad. Las fracciones con actividad de PLC se
aplicaron a una columna (1.6 x 17 cm) de Heparin-Sepharose® CLJ3B (Pharmacia)
equilibrada con 150 mL de amortiguadcm C (fosfato de potasio 20 mM pH 7.3,
EDTA 1 mM, DTT lmM, PMSF 0.6 mM, 2 ug/mL de leupeptina). Se eluyó con 250
mL de amortiguador C con un gradiente linear de Kcl 0 a 1.5 M. Las fracciones
colectadas fueron de 5 mL.
act¡v,daddegm-ast:9ar:iiícaód::::ac::,nu:nnage±reEe'mv::UcT::i2°':C}a88%Ume)CH°,nLtoean!3
Superdex® 200 prep grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL de
amortiguador 8 con Nacl 100 mM a un flujo de 2 mL/min. La elución se hizo con
320 mL de amortiguador C con Nacl 100 mM. Las fracciones colectadas fueron de
3mL.
Purificación de la PLC citosólica.
Todos los procedimientos de
purificación se llevaron a cabo a 4°C haciendo uso del equipo de FPLC® (Fast
Protein Liquid Chromatography). Para la extracción proteica se utilizaron 20 g en
peso fresco de raíces El sobrenadante obtenido después de la centrifugación a
100,000 X g (~ 12 mg de proteína/mL) se consideró como la fracción que contiene
la PLC citosólica.
PROTOCOLO No. 1
Precidt¥on con íNHbsoi, El o)mcto cjtosóllco s. ptüpb de
acuerdo al protocolo No. 1 descrito para la fracción membranal.
Cromatografía de interacción hidrofóbica La preparación enzimática
obtenida en el paso anterior se aplicó a una columna de interacción hidrofóbica en
condiciones similares a las descritas en el protocolo No. 1 para la fracción
membranal.
PROTOCOLO No. 2
PredpjtEmon cofi íNH}>SO,. El e)rb.ac±o cttosólkD se pTedptó d. Ea
misma forma como se describe en el protocolo No.1 para la fracción membranal.
La pastilla obtenida en la última centrifugación se resuspendió con amortiguador A.
Cromatoqrafía de filtración en gel. La preparación enzimática obtenida
en el paso anterior se desaló utilizando una columna (2.6 x 18 cm) de Sephadex®
G-25 (Pharmacia) siguiendo las indicacic)nes del protocolo No. 2 descrito para la
fracción membranal.
61
con,en,an,ag:::gtg:g,gÉ;::!:;3:::::i::::=col:sm:raacpcr:oen:;adc:sdaa`a,:a6Sxqi:
cm) HiLoad" Q Sepharose® HP (Pharmacia) de igual forma a la descrita en el
protocolo No. 2 para la fracción membranal.
ac,,v,dadde;ggg:?Í::i::::::;S:=:=%reE:#ucT3::2`:c;ag3:ume,cf,nLtá:t?
Superdex® 200 prep grade (Pharmacia) utilizando las condiciones descritas en el
protocolo No. 2 para la fracción membranal.
depLCseasg:;:g::::is=g::S:a6Laxs,f;a::?ndeesHqeu:a:,:Táeenpí::r:asea.ct:v[d€ag
(Pharmacia) de manera similar a la descrita en el protocolo No. 2 para la fracción
membranal.
Calibración de la columna HiLoad®
26/60 Superdex® 200 prep
grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL de amortiguador 8 que
contenla NacI 100 mM Se prepararon dos mezclas de marcadores de masa
molecular (primera. azul de dextrán-2000 kDa, apoferritina443 kDa, P-amilasa-200
kDa,
BSA-66
kDa.,
segunda.
tiroglobulina-669
kDa,
alcohol
deshidrogenasa-150kDa, anhidrasa carbónica-29 kDa, aprotininaú 5 kDa) en el
amortiguador de equilibrado Se aplicaron 3 mL de mezcla proteica Se hicieron dos
corridas, una para cada mezcla proteica. Se colectaron fracciones de 3 mL.
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de
sodio (SDS-PAGE) Se conservaron alícuotas correspondientes ya sea a las
fracciones eluídas de cada columna o a cada paso de purificación. Las proteínas de
cada alícuota se separaron en geles de poliacrilamida al 10% con SDS por
electroforesis, de acuerdo al método de Laemml.i (1970), a 50 mA o 30 V. Los geles
se tiñeron con una solución de nitrato de plata [Bloom eí a/„ 1987| o azul de
comassie.
RESULTADOS
Solubilización de la PLC membranal.
Se probaron concentraciones crecientes de Kcl para encontrar la
concentración en que la enz.ima se disocia de la membrana. Como control se utilizó
una fracción membíanal resuspendida en amortiguador sin Kcl y s.in ser sometida a
la segunda centrifuga.ión. En la figura 1 se observa que la actividad de la PLC
aumenta en forma proporcional a la concentración de Kcl alcanzando una
concentración Óptima de 2 M: esto sugiere que la enzima se disocia de la
membrana debido a la modificación de las interacciones iónicas cuando se
presentan concentraciones altas de sales.
62
SOBRENADANTE
PASTILLA
Figura 1. Solubilización de la PLC asociada a la membrana.
Precipitacion con sulfato de amonio.
Como primer paso de purificación se empleó la precipitación con
sulfato de amonio Para ello se llevaron a cabo experimentos de precipitación para
seleccionar el rango de las concentraciones adecuadas. En estos experimentos se
utilizó una solución saturada y se adicionó a alícuotas (5 ml) de extracto soluble o
membranal solubilizado hasta que éstas alcanzaron un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, 80%, o 90% de saturación. Los resultados indicaron lo siguiente: Con
respecto a la actividad enzimática total en ambos extractos (fig. 2 y 3, panel A) se
observó la disminucjón gradual de la actMdad de PLC en el sobrenadante hasta un
50% de saturacióm después de ésta concentración la actividad se pierde por
completo. Con respecto a la actMdad específica de la enzima, en el caso de la PLC
membranal solubilizada (fig. 2, panel 8), a un 10% de saturacjón se observó iin
incremento ligero tanto en el sobrenadante como en la pastilla, posiblemente
debido a un mecanismo de activación. Posteriormente, a 20%, 30%, y 40%, la
actividad enzimática en la pastilla se mantiene en valores similares a los del control;
pero al alcanzar un 50% de saturación se observó un incremento de 4 veces con
respecto al control y este patrón se mantiene hasta el 90% de saturación. En el
caso de la PLC soluble (fig 3, panel 8) la actividad específica aumenta ligeramente
en el sobrenadante a un 10% de saturación y posteriormente va disminuyendo
hasta perderse a un 50% de saturación; mientras que en la pastilla la actMdad
específica de la enzima va incrementando proporcionalmente hasta un 40% de
63
saturación en donde alcanza un valor similar al del control. Al alcanzar un 50% de
saturación la actividad específica de la enzima en la pastilla se incrementa 10
veces y a concentraciones superiores a esta la actívidad específica decrece
gradualmente Finalmente, en ambos casos (extracto soluble y extracto membranal
solubilizado) se decidió utilizar los rangos vistos entre un 40% y un 60% de
saturación para la precipitación con sulfato de amonio, ya que a un 40% de
saturación se sacrifica hasta un 50% de actividad específica en el sobrenadante
comparada con la del control pero que eliminará cierta cantidad de proteínas en
este rango de precipitación, y al 60% de saturación se observa un incremento en la
actividad especifica de al menos 4 veces comparada con la del control.
0
io
20
30
.0
50
60
70
10
90
PUIFATO DE AHONIO| %
0
10
20
.0
.0
50
60
70
00
90
|SllLFATO OE AHONIO] %
ia;giu:rsá,,:::a;:ie¡|i;d!a:::sei,;ue#;a.:::i:::TCN:óH:,,b2igÁa;f§?:d*£t:gi::t,á£::n:,::#3e:i::ii3a;
64
E#
l
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PULFAT0 DE AMONlo| %
811 ll_ J.ú
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lo
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PUIFATO DE AMONlo| %
;;#:dc:ód:ere,;`:p',?:cii!n::dé.;a!p,,L¡á#:!e:e?ipa:ac:fi¥,eqnsuo:3:e::a£rif:nie::y:,d?en,o,,igBo:oíot:#
obtenida de la precipitación.
Purificación de la PLC asociada a la membrana.
Para la purificación de la PLC membranal se inició con la solubilización
de ésta en el extracto crudo utilizando 2 M de Kcl. Para establecer la cantidad de
material usado para la purificación, se tomaron en cuenta los resultados del cuadro
de purificación reponado por Yotsushima eí a/. (1992) en donde parten de 22.8 g de
protei'na
protei.na
tuvieron
columnas
total con una actividad total de 242 Limol/min (110 nmol/min/mg de
como actividad específica); ellos iniciaron con columnas de 5 0 x 40 cm y
un rendimiento final de 0.8%
En nuestro caso, la disponibilidad de
de 1.0 cm x 30 cm y de 1.6 x 18 cm en el laboratorio, nos limitó a iniciar
la purificación partiendo de 100 gr de raices frescas y que corresponde a 122 gr de
protei'na total y 83 69 nmol/min de actividad total en el extracto citosólico, o 618 mg
y 33 68 nmol/min de actividad total en el extracto membranal. A pesar de las
cantidades mínimas de proteína y de activldad, en todos los casos se observó
actividad de PLC eluyendo después del lavado de la proteínas que no se unieron a
la matriz, sugiriendo un sobrecargado de la columna
65
PROTOCOLO No. 1. Se realizó una extracción completa partiendo de
20 gr de raíces frescas Este protocolo incluyó una columna de fenil-sefarosa,
aprovechando la concentración de sulfato de amonio como requisito de unión a la
matriz. Se cargó a la columna un volumen de 6 mL proveniente de la precipitación
al 40%-60% con sulfato de amonio que contiene 1.53 mg de proteína y 128 9
nmol/min
de
actividad
total.
El
perfil
de
unión
y
elución
de
la
columna
de
fenil-sefarosa del extracto membranal se presenta en la figura 4. Se observó que
existe unión y elución de algunas proteínas en la columna de fenil-sefarosa. Sin
embargo, al medm la actividad de PLC, ésta no se detectó durante el lavado de la
columna, ni durante la elución de la proteína pegada a la columna. Este
comportamiento podría deberse a que la PLC sÍ se une a la fenil-sefarosa aunque
posteriorme`nte es difi'cil eluirla ya que se aplicó extracto con actividad y ésta no se
detectó en ningún lugar de la elución.
100
150
200
250
VOLUMEN (mL)
:#:r:o4enpuenfflá,cdo¡u#::,¡Txdsbec#,agteopT:nmyp.rs:3L£rr:sc¿%,tca£_o45oTo%oL6Looíoedaems:,,fga::ddoer
de elución 0.5 mL/fracción
Nuevamente,
se
reintentó
purificar
a
la
enzima
siguiendo
este
protocolo Se obtuvo la fracción membranal solubmzada, ésta se precipitó con
sulfato de amonio en el rango de precipitación ya descrito; en esta ocasión, no se
logró disolver la pastilla con el amortiguador A Se intentó la disolución adicionando
Kcl 0 S M, también se intentó con sonicación Los resultados fueron negativos por
lo que se eliminaron estos dos pasos de purificación (precipitación con sulfato de
amonio y la cromatografía de interacción hidrofóbica) del protocolo de purificación
para la PLC membranal y se planteó otra estrategia Se pensó que estos resultados
fueron negativos debido a la agregación de la masa proteica en presencia de altas
concentraciones de sales tanto de sulfato de amonio como de Kcl.
PROTOCOLO No. 2 Se obtuvo un extracto y la PLC asociada a la
membrana se disoció de la misma sometiéndola a concentraciones altas de cloruro
de potasio El extracto membranal soluble (9 5 mL) se aplicó a una columna de
66
G25 para desalar (figura 5) La actividad de PLC se detectó al inicio del volumen
vacío de la columna (27-30 mL) y se observó en los dos picos de absorbancia, EI
primer pico de absorbancia no contiene sales a diferencia del segundo pico en
donde se detecta conductividad debido a la presencia de sales. Estas últimas
fracciones no se tomaron ya que no estaban completamente desaladas La
muestra desalada (45 mL) se aplicó a una columna de intercambio iónico El perfil
de elución (figura 6) muestra un pico de actividad dentro del gradiente de elución
Las fracciones que tuvieron actividad de PLC (54 mL) se mezclaron y concentraron
por ultrafiltración con membranas DiafloYM30 (Amicon). El volumen concentrado
(6 mL) se aplicó a una columna de exclusión por tamaño Esta columna se incluyó
para eliminar proteínas de alto y bajo molecular esperando separar las proteínas
presentes dentro de un rango de 50-150 kDa de masa molecular.
.
---. ,
..'' ,
0030
-
0025
0020
0015
0010
.'/
0005
/
0000
-0 005
20
40
60
80
100
VOLUMEN (mL)
:Lg,uáae5seB;fEed£ál2:i,ópnhgret?cT:?d|o6om#%rea:#osh::uubá'ázoarddoeee,u:,nóan,Cg':mu,raaé3i.gnxl8
67
0
50
100
150
200
250
300
350
VOLUMEN (mL)
;:g:r:p6a.c:gg'Hd,:oeáá9LónQds'e#::oe®miTgRrapná|grems:Lacdeoe2no5n:LCoáuem::á`h.¡Suxaásrc:?
elución. 3 mL/fracción.
El perfil de elución de la columna de superdex 200 (figura 7) muestra
un volumen vacío de aproximadamente 100 mL y un pico con actividad de PLC.
Este pico corresponde a una masa molecular de 90 kDa de acuerdo a la curva de
calibración (figura 8) obtenida con proteínas de masa molecular conocida.
100
150
200
250
300
VOLUMEN (mL)
5,ugpué:d3pp2orid:ree;,::;o;ned3e2,6:[cdemveoTub:aenna!:ne,::FÓ::!u:nuaír`a2c:,orngocm)deH,Load®
68
10
15
20
25
V.„o
:#a.g.(gu6Wxa6doeccma;'bHr,aLC:g3®ogLepn:Fdaes;on2oP6o::énpasrg3em328::'á?utao|uc:::cideaeiTcrónn:
3 mL/fracción.
•./
/
_
-.`:``.``ii€:.l=`=',..,-..-ri`
0
50
100
150
200
250
300
350
400
VOLUMEN (mL)
i'8#:ingseppehT'io8:® e2#mnL dd% JaoiupmL:n Tee:::?orna.' 2e#L7fT:ccC.%':mna (16 X 17 cm) de
69
El pico (un volumen de 2.9 mL) obtenido de la columna de exclusión
por tamaño se aplicó a una columna de afinidad
columna (figura 9) no se detectó actividad de PLC
En el perfil de elución de esta
El cuadro de purificación de la PLC asociada a membrana (cuadro 1)
indica un incremento en la actividad total cuando el extracto eluye de la columna de
Sephadex G-25,
este fenómeno,
que también
ocurrió cuando se
realizó
la
precipitación con sulfato de amonio, se repite en este paso de purificación y por
consiguiente aparentemente aumentan las veces de purificación si se compara con
la actividad específica del extracto inicial Este resultado sugiere la existencia de
algún factor inhibitorio que se elimina ya sea durante la precipitación con sulfato de
amonio o bien, durante la elución a través de una columna de filtración en gel. Por
lo tanto, después del desalado existen 10 veces más de actividad total El último
paso de purificación alcanzado fue el de la cromatografía por exclusión de tamaño
por superdex 200 HP El gel de poliacrilamida al 10% (figura 10) revela en el carril
del pico de Superdex 200 HP la intensificación de 4 bandas de 73 kDa, 65 kDa, 59
kDa, y 55 kDa respectivamente Aunque hasta este paso existe cieno grado de
purificación, se requiere optimizar la purificación
En el carril correspondiente a la
proteína no unida a heparina se observan también las mismas bandas siendo las
de 65 y 59 kDa las que se observan menos
Cuadro 1
Cuadro de Purificación de la PLC membranal del 7° dia de una curva de
crecimiento
PASO DE
PURIFICACION
PROTEINA ACTIVIDAD
TOTAL
TOTAL
ACTIVIDAD
VECES DE
ESPECIFICA
PURIFICACION
RENDIMIENTO (%)
(mg)
(pkat)
(pkat/mg prot.)
Extractomembranal
279
2439
8744
1
100
Extractomembranalso'uble
26.02
2 200 7
84_57
096
90.2
930 87
106
8927
Desalado porG25
234
Seíarosa-Q
168
4 069 5
2 422 32
277
1667
Superdex 200HP
0.168
6339
3 773 1
431
259
No unida aSefarosa-heparina
0085
22.95
270
308
0.94
Sefarosa-heparina
0
0
0
0
0
21781
5
70
lvIW
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
FOSFORILASA 8 107 kDa
BSA 76 kDa
OVALBUMINA 52 kDa
ANHIDRASA CARBONICA 36.8 kDa
lNH. TRIP. SoyA 27.2 kDa
LISOZYIVIA 19 kDa
:;g:;:::,:í:°;°a3:d;e;i:8:i#;&CÍ_Í#Í,:¡egs;;dci?TTe::¥b:.a::nLi:,;iíír!e!1:£?Sefti:a;;t#s::a¡:'!;2::°Áir;ÍÍ:g:
8é3:Pi::éoespeh®ár:;:#a,t8,deiu,aatocá,:Tancaofuemsn:pde:d#a2r,no-sHeppigí:gé®9,proteínanou"aa
PROTOCOLO No. 3. En este caso se realizó una extracción a partir de
20 g de raíces del 7° día de cultivo; se inició con esta cantidad de material vegetal
para observar los perfiles de elución en cada uno de los pasos a seguir en la
purificación, a pesar de la cantidad de proteína se observó actividad de PLC en las
proteínas que no se unieron a la matriz de la columna, nuevamente sugiriendo un
sobrecargado de la columna Se obtuvo el extracto membranal solubilizado (5 mL)
y se aplicó a una columna de G-25 para desalar. La muestra desalada (27.5 mL) se
aplicó a una columna de afinidad, seguida de un volumen de 200 mL de
amortiguador C para eluir a la protei'na que no se unió a la matriz de heparina
Posteriormente se eluyó la proteína que sÍ se unió, con 250 ml de amortiguador C
utilizando un gradiente linear de Kcl de 0 a 1 5 M (estas condiciones fueron
tomadas del manual que acompaña a la Heparin-Sepharose® CL-6B comercial y se
modificaron del protocolo No. 2 para investigar alguna optimización de la elución)
El perfil de elución (figura 11) muestra un pÍco de actividad dentro del gradiente de
elución, aproximadamente a 0.6 M de Kcl.
71
E,g#:,n:áeppheaí:sg8£5uoc#ddeevL;u:Le:dmeeeTubcr,%nn:,5emnuífaacc:gLumnatt6xí7cm,de
El
poliacrilamida-SDS
pem
de
elución
al
10%
(figura
también
12),
en
se
cada
observó
carrh
se
en
un
aplicó
gel
la
de
proteina
previamente precipitada correspondiente a 0.5 mL de la fracción colectada durante
la elución de la columna de heparina A parü del carril correspondiente a los 310
mL de la elución, se observó un aumento en la intensidad de tinción de una banda
de 56 kDa, ésta permanece hasta los 360 mL de la elución También se observó la
separación de las proteinas de aMo peso molecular (al principio de la elución) con
respecto de las proteinas de bajo peso molecular (al final de la elución).
PICO DE ACTIVIDAD DE PLC
r,
ml ELuiDO
FRACCION
107 kDa
76 kDa
52 kDa
3e kDa
27 kDa
'9 koa
:±guYrdaeTc2o:::':sd,::i':,Cd:nd::a':oPuL:nT:gLreaFaaj]nv:St:p::r:sDe%-PAGEall0°/oteñiticon
72
Las fracciones que se obtuvieron de la elución de la columna de
heparina se mezclaron de acuerdo al cuadro 2. En este cuadro se aprecia la
cantidad de proteína aplicada y la cantidad de proteína eluída
Cuadro 2 Mezclas obtenidas de la elución de la columna de heparina
Fracción
Memb.solubilizada
de mL 30 a 60
corresponde a:
vol. total (mL)
Cantidad deprot.(mg)
extracto aplicado
4.1
4.2
prot. no unida
35
0.34
de mL 250 a 285
11
40
0.8
de mL 290 a 330
111
45
1.22
20
0.48
45
0.49
de mL 335 a 350 pico de act. PLC
de 355 mL a 395
V
Después de haber probado una columna de afinidad como primer
paso de purificación se planteó la estrategia de utilizar como segundo paso la
misma columna de afinídad Para esto, se realizó otro extracto bajo las mismas
condiciones que el anterior y se aplicó a una primera columna de afinidad sin alterar
ninguna condición El patrón de elución (figura 13) resultó ser bastante similar al de
la figura 11 `
0010
0005
0
100
200
300
400
500
0000
600
VOLUMEN (mL)
Figura 13 Perfil de elución de la PLC membranal en una la columna (16 x 17 cm) de
Heparin-Sepharose® 250 mL de volumen de elución, 5 mL/fracción.
73
Las fracciones en las que se detectó actividad de PLC (del mL 305 al
350) se combinaron y se concentraron por ultrafiltración con membranas
DiafloYM30 (Amicon). El volumen concentrado (7 mL) se desaló por filtración en
gel. El volumen final obtenido del desalado (19 5 mL) se aplicó a una segunda
columna de afinidad bajo las mismas condiciones que la anterior, salvo el gradiente
de elución que fue creciente de Kcl de 0 a 1 M. El perfil de elución del segundo
paso de purificación se aprecia en la figura 14. En este caso ya no detectamos
actividad de PLC en ningun punto de la elución. Sin embargo, el perfil de elución
fue similar al de la figura 13, aunque se esperaba en su totalidad la unión de la
proteína cargada, esto no sucedió ya que durante el lavado eluyó proteína que no
se unió (aunque en menor proporción) a la matriz. También se observó el primer
pico que elüyó en el primer paso de purificación y que supuestamente ya se había
separado del pico que contenía la actividad de la PLC.
0
100
200
300
400
500
Volumen (mL)
E'8#:inlseppheaí;s83. 25UoC# ddeevL£u:Le: dmeeeTubcr¡%nn:'5emnL/?rnaacc::irna (1 6 X 17 cm) de
Aunque no se detectó actividad de PLC, se realizó una corrida de la
proteína eluída (de este segundo paso de purificación) en un gel de
poliacrilamida-SDS al 7 5 % (figura 15) para observar la separación de bandas
durante la elución. En esta ocasión se observaron las bandas proteicas que
corresponderían al pico de acttvidad siendo éstas las que se observan en los
carriles de las fracciones 52 a 56.
La siguiente estrategia consistió en eliminar la segunda columna de
afinidad e incluir, en lugar de ésta, una columna de exclusión por tamaño
basándose en la la separación de 4 bandas proteicas presentes en los carriles 52 a
56 de la figura 15 AsÍ, nuevamente se repitió todo el proceso de extracción,
74
disociación de la membrana, desalado, elución por la columna de afinidad
obteniendo resultados idénticos a los ya señalados. Finalmente las fracciones que
contenían actívidad de PLC se aplicaron a la columna de exclusión por tamaño.
Figura 15. Perfil de elución de la PLC membranal visto en SDS-PAGE al 7.5% teñido con
nitrato de plata eluída de la segunda columna de Heparin-Sepharose®.
La figura 16 muestra la elución de proteínas en base a su peso
molecular en esta última columna Este perfil indicó la presencia de proteinas de
diferente peso molecular la aparición del pico de actividad de la PLC debería
apreciarse aproximadamente en el mL 190-205 de acuerdo a la figura 7, en donde
sÍ se aprecia el pico de actMdad; sin embargo, no detectamos actividad de PLC en
ninguna de las fracciones eluídas. Esta fue la última estrategia realizada.
75
0_0018
0.0016
.',
0.0006
"-`J,...`+:`.".„`.
0,0004
0 0002
0_0000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Volumen (mL)
5,ugpu::d:6£Esí,p?:pe;::Lóen82óampLL:eT:,T:r::ad,ee:"ucn,:n:oáu#Lirá:c:Óxn6ocm,deH,Load®
Purificación de la PLC citosólica.
PROTOCOLO No 1
precipitación con
una columna de
fenil-sefarosa del
igual forma que
Se obtuvo un extracto citosólico y se sometió a
sulfato de amonio (40-60% de saturación) Este protocolo incluyó
fenil-sefarosa
El perfil de unión y elución de la columna de
extracto citosólico se muestra en la figura 17 Se observó que, de
el extracto membranal, sÍ existe unión y elución de algunas
proteínas en la columna
ésta no se detectó ni en
en las fracciones eluídas
la elución
se propuso
de fenil-sefarosa, aunque, al medir la actMdad de PLC,
las fracciones correspondientes a la proteína no unida, m
Debido a que se obtuvieron resultados negativos durante
el protocolo no
2
Los resultados negativos pudieron
originarse por la fuerte interacción existente entre la enzima y la matriz
76
50
100
150
200
VOLUMEN (mL)
:#:F:ole7nupneam:oiuemen'::,i,ÓTgg'c#rdaec,3h:,ioyi-o!iec:hg::S:p:t6E?4g,To4ooL6foáoedaem3:,ifga:?ddoer
de elución. 0 5 mLMraccion.
PROTOCOLO No. 2. En esta ocasión para la extracción se emplearon
20 g de raíces del 4° día de cultivo. El extracto citosólico obtenido se sometió a
precipitación con sulfato de amonio La resuspension obtenída (5.5 mL) se aplicó a
una columna para desalar (figura 18) La actividad de PLC se detectó al inicio del
volumen vacío de la columna (27-30 mL) y abarcó 5 fracciones haciendo un total de
22 mL Se pudo apreciar que la proteína sale antes que la conductividad
confirmando el objetivo de desalar la muestra La muestra desalada (20 mL) se
aplicó a una columna de intercambio iónico. El perfil de elución de esta Última
columna (figura 19) muestra un pico de actividad dentro del gradiente de elución
Las fracciones que mostraron actividad de PLC (46 mL) se mezclaron y
concentraron con gel de Sephadex®G-25 ya que en ese momento no se disponi'a
del equipo de ultrafiltración (Amicon)
77
40
80
120
VOLUMEN (mL)
:Lg:rnaalc8.-,uP:::i2.6':c|isnc#,ldeerisae33acátá#:25P,rpe:;Priiaadc:ai??64oo-:EOÁáesá'La:ohidgeu:dm.:nd:
elución; 5 mL/fracción
0025
0020
+
0015
0010
1
...``_;'.i'`.f+
0_005
0_000
0
50
100
150
200
250
300
VOLUMEN (mL)
Figura 19 Perfil de elución del extracto citosólico desalado en una columna (1.6 x 10 cm)
8Í%Tnpa3Camd|£ff;:g#:M Q Sepharose® High Performance
200 mL de amortiguador de
El volLimen concentrado
(10 mL) se aplicó a una columna de exclusión por
tamaño. El perfil de elución de la columna superdex 200 (figura 20) mostró un
volumen vacio de 100 mL y un pico de actividad de PLC pero en una sola fracción
que
posiblemente se
debió
a
un
ensayo de
78
actMdad
erróneo
Este
pico
corresponde a una masa molecular de 156 kDa de acuerdo a la curva de
calibraci.Ón (figura 8) obteni'da con proteínas de masa molecular conocida. También
se observó un segundo pico de actividad correspondiendo a una masa molecular
de 61 kDa; este pico de actividad coincide con un pico de absorbancia a 280 nm.
:,ugpu::d:%!g#rdeepeg,ruacá:n3d2eo,:Ft:;:t,ousmó::ad:ne,uunc?Ó:?,3u#nLñr,a2c:,;n6ocm,deH,Load®
El volumen concentrado (2.2 mL) de las fracciones (del mL 195 al 201 )
que contienen el pico de actividad de PLC obtenido de la eluci.Ón en la columna de
exclusión por tamaño se aplicó a una columna de afinidad. En el perfil de elución de
esta columna (figura 21) no se detectó actividad de PLC. Esto probablemente fue
debido a la dilución de la proteína de interés durante la elución por la columna La
absorbancia negativa observada en las figuras 20 y 21 fue el resultado de un error
de calibración en el equipo de FPLC.
79
Ei
Eziil
-----,---.
0
50
100
150
200
250
300
VOLUMEN (mL)
L,g#:,n:éepph:r:,sed®e 2ed:CLOLn d:ev¿FumpeLncd:,teq:::ácna, 2enm#r:c::j:mm tt 6 x í 7 cmt de
El cuadro de purificación (cuadro 3) indicó que existen 3 veces de
purificación con la precipitación 40-60% con sulfato de amonio También se
observó que existen aprox 15 veces de purificación en la proteína que no se unió a
la Q-Sepharose® Esto se confirmó al observar el gel de poliacrilamida al 10%
(figura 22) en el carrn de la proteina que no se unió a Q-Sepharose® se intensifica
una banda de 65 kDa que también aparece en el carril del pico de Q-Sepharose®
Aunque en el carril que corresponde al eluato de la columna de superdex se
observa proteína, cuando se midió la actividad de la PIC para obtener el cuadro de
purificación, ya no se detectó alctividad alguna
Esto sugiere un proceso de
degradación y/o desactivación de la enzima durante su almacenamiento.
80
Cuadro 3. Cuadro de Purificación de la PLC citosólical del 4° dia de cultivo
PROTEINATOTAL ACTIVIDADTOTAL
PASO DEPURIFICAcloN
ACTIVIDADESPECIFICA
VECES DEPURIFICACION RENDIMIENTO (%)
(mg)
(pka')
(pkat/mgpl'Ot.)
Extracto citosól ico
4853
4077
8403
1
100
Precipitación con(NH4)2S0440-60°/o
919
2 472 43
2688
313
60_63
Desalado por G25
6.56
1 730.5
263.8
313
42.43
No iinida aSefarosa-Q
01
135
1 323.5
15.75
331
Sefarosa-Q
134
50.25
37.47
044
123
Superdex 200 HP
002
0
0
0
0
Sefarosa-heparina
0
0
0
0
0
FOSFORILASA 8 107 kDa
BSA 76 kDa
OVALBUMINA 52 kDa
ANHIDRASA CARBONICA 36.8 kDa
lNH. TRIP. SOYA 27.2kDa
LISOZYMA 19 kDa
Figura 22. Perfil de purificación visto en SDS-PAGE al 10% teñido con nitrato de plata WM,
Marcadores de pesos moleculares, 1, extracto total; 2, extracto membranal, 3, extracto
citosólico: 4, sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio al 40%, 5, pastilla de
la precipitación con sulfa`o de amonio al 40%;
6, sobrenadante de la prec.ipitación con
§§#3nd:oedp:TQg_Ts2:5bah;á6:::X;é®,#n:os:í,uLa:{:ea,:Q:Í%:p:í:`:oc::gbcéooné§:c:g:;d:e:aec¿:óTdoa:d:oe,:u:g66oooa{oéTíÍ
eluato de la columna de Heparin-Sepharose®. En todos los camles se aplicaron 10 iig de
proteína`
81
DISCUSION
En células vegetales se ha detectado actividad de PLC tanto en la
fracción soluble como en la fracción asociada a la membrana. Ambas poseen
características diferentes [Helsper eí a/ , 1985; lrvine eí a/ , 1980, MCMurray and
lrvine,1988: Melin eí a/ ,1992, Tate eí a/.,1989, Yotsushima eí a/.,1992,1993]. En
su reporte, Pfaffmann eí a/. (1987), examinaron la distribución subcelular de una
Pl-PLC de hipocótilos de soya y frijol. De la actividad total de los homogenados,
aproximadamente el 85% fue soluble y el 15% estuvo asociada a la membrana; y
de la actividad que estuvo asociada a la membrana la actividad más alta fue
recuperada `en la fracción correspondiente a la membrana plasmática. Nosotros
también hemos detectado actividad de PLC en fracciones solubles y en fracciones
asociadas a la membrana [De los Santos eí a/,1997] Para solubilizar la PLC
asociada a la membrana se intentaron vanos métodos y se obtuvieron los mejores
resultados con la adición de 2 M de cloruro de potasio al amortiguador de
extracción [Hernández-Sotomayor eí a/., 1997] Esto indica que esta isoforma
puede estar asociada a la membrana débilmente a través de interacciones iónicas.
Existen repones sobre la purificación de PLCs en plantas; sin
embargo, esta enzima aún no se ha purificado a homogeneidad Una PLC asociada
a la membrana plasmática fue purificada 25 veces a partir de raíces de trigo [Melin
ef
a/,
1992].
La
enzima
parcialmente
purificada
hidrolizó
PIP
y
PIP2
a
concentraciones micromolares de Ca2+.
Esta enzima no fue purificada a
homogeneidad debido a su labilidad En arroz, ambas PLC soluble y particulada
fueron purificadas a aparente homogeneidad Estas enzimas presentaron masas
moleculares aparentes en electroforesis de SDS-poliacrilamida de 55 y 42 kDa,
fueron purificadas 311 y 219 veces, y con actMdades específicas de 33
Limol/min/mg de proteína y 19 Limol/min/mg de proteína, respectivamente
[Yotsushima eí a/„ 1992,1993] Ambas enzimas fueron altamente específicas para
PI, aunque la actividad contra PIP2 pudo ser reconstituída por la adición de un
factor proteico perdido durante la purificación En raíces de avena, las dos formas
presentes tienen una masa molecular aparente de 50-70 kDa [Huang eí a/.,1995].
En este trabajo, hemos iniciado la purificación de la PLC de C. roseus
a partir de raíces transformadas utilizando diferentes tipos de cromatografía como
Sephadex G-25, Heparin-Sepharose®, Q-Sepharose®, y Superdex® 200 Aunque no
sabemos con certeza el peso molecular aparente de las PLCs existentes en C.
roseus, de acuerdo al análisis de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
pudmos apreciar bandas de peso molecular dentro de un rango de 55-75 kDa. De
acuerdo al peso molecular de las familias de PLCs en células animales, la PLC de
plantas corresponderi'a a las PLCs de tipo ó. Además, se han clonado genes de
PLC de Arab/dops/s Íha//ana [Hirayama eí a/.,1995,1997; Yamamoto eí a/„ 1995] y
soya [Shi ef a/.,1995] cuyos productos poseen pesos moleculares de 60-70 kDa,
similares a las enzimas parcialmente purificadas, y características estructurales
parecidas a las de tipo -ó de animales No obstante, no debemos excluir la
posibilidad de que en C. noseus exista alguna otra familia de PLC.
82
El incremento de la actividad total observado después de la adición del
sulfato de amonio (en la fracción soluble) y del desalado por filtración en gel G25
(en la fracción asociada a la membrana) sugiere la presencia en el homogenado
total de algún factor que pudiera estar afectando la actividad de la PLC cuando
ambos se encuentran presentes. Esta sugerencia seguirá presente hasta no
demostrar lo contrario para lo cual se requieren ensayos de reconstitución durante
el proceso de purificación. Por otro lado, aunque se mantuvo en mente iniciar la
purificación con cantidades altas de proteína, siempre se observó sobrecargado en
las columnas sugiriendo el empleo de columnas mas grandes. Teniendo estos
antecedentes se plantea como estrategia el empleo de la precipitación con sulfato
de amo"o tratando de optimizar los resultados presentados en este trabajo, el uso
de una columna de heparina en una columna de 2.6 x 60 cm para obtener mayor
capacidad de unión, incluir una columna de exclusión por tamaño preparativa y
como paso final una columna de exclusión por tamaño analítica.
En nuestro trabajo, la purificación no se logró debido a la pérdida de la
actividad de la enzima. Las causas probables son: a) La inactivación por proteólisis,
causa poco probable debido a la presencia de inhibidores de proteasas dentro de
los amortiguadores de elución en cada paso de purificación; b) La cantidad de
proteína presente en la última etapa de la purificación, originando la dilución de la
mezcla aplicada como resultado inevitable del proceso de elución de la columna,
originando la incapacidad para detectar la actividad; c) La desnaturalización de la
enzima por efecto de la dilución, ya que el hecho de que la enzima se encuentre
aislada en una solución altamente dilui.da puede originar desnaturalización; d) La
adsorción de la enzima a la superficie de la columna en la última etapa de la
purificación, puesto que la enzima es de naturaleza hidrofóbica puede interaccionar
con la superficie de la columna ayudada además con la alta dilución en que se
encuentra presente; e) La labilidad de la enzima, la pérdida de la actividad de la
enzima puede deberse a la presencia de pequeñas cantidades de contaminantes
en el amortiguador originando algún proceso reactivo; f) El aislamiento de cierto
activador durante alguna de las etapas del proceso de purificación, minimizando la
detección de la actividad.
Las veces de purificación de ambas PLC soluble y asociada a la
membrana (aprox. 6 y 5 veces respectivamente) no alcanzaron las expectativas
deseadas Sin embargo, se puede asumir cierta purificación parcial, útil para
realizar alguna caracterización adicional de la enzima. Conjuntamente, ya se cuenta
con el monta/e de al menos un protocolo de purificación repe`itivo para la obtención
de una preparación enzimática de PLC parcialmente pura Para el análisis cinético
de la PLC de C, roseus [Hernández-Sotomayor eí a/., en preparación] se utilizó una
preparación enzimática purificada parcialmente a partir del extracto membranal
(con una actividad específica de 107 nmol/min/mg de proteína) y empleando el
último de los protocolos aquí descritos Estas técnicas de purificación podrán ser
optimizadas para trabajos futuros sobre la PLC.
83
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86
CAPITULO 4
Discusión General
Los fosfolípidos forman parte de un mecanismo de transducción de
señales en las células animales. Existen estímulos que se perciben en la
membrana plasmática y activan a la PLC, Ia cual hidroliza PIP2 y produce lp3 y
DAG. EI DAG activa a una proteína cinasa C y el lp3 induce un aumento en la
concentración de calcio citosólico, Consecuentemente, se inician reacciones
enzimáticas reguladas por Ca2+ las cuales conducen a varias respuestas
fisiológicas (fosforilación de proteínas, secreción, transporte de iones, división
celular, etc.) El lp3 puede ser metabolizado por desfosforilaciones produciendo
inositol y Pi, o por fosforilación para formar otros inositol fosfatos.
Aunque en las células vegetales se ha demostradQ la .biosíntesis y el
metabolismo de los fosfolípídos de inositol [Boss y Massel, 1985; Sandelius y
Sommarin, 1986],
no se conoce su función fisiológica; sin embargo se ha
reportado que la degradación de los fosfolípidos de inositol puede ser inducida por
estímulos ambientales como choque osmótico [Einsparh eí a/„ 1988], luz [Morse eí
a/., 1989] fitorreguladores de crecimiento tales como auxinas [Eftlinger y Lehle,
1988] y citocininas [Connet y Hanke,1987]. También se ha detectado actividad de
fosfolipasa C en una variedad de tejidos vegetales (MCMurray e lrvine, 1988).
Todos estos repones proporcionan evidenclas que sugieren que los fosfoli'pidos de
inositol tienen una función importante en la transducción de señales en plantas.
En este trabajo, se detectó actMdad de una fosfolipasa C específica
para fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en diferentes teiidos de raíces de C. roseus.
Pfaffman ef a/„ (1987) han reportado que, de la actividad total de la PLC de los
homogenados de hipocótilos de soya, el 85% es soluble y el 15°/o está asociada a la
membrana. En células vegetales se han detectado dos tipos de PLC específica
para fosfolípidos de inositol: enzimas solubles y enzimas asociadas a la membrana
[Mc Murray e lrvine, 1988]. En base a estos repohes, se decidió fraccionar un
extracto total proteico para obtener extractos membranales y citosólicos crudos. La
actMdad de PLC se detectó en ambos extractos aunque la actividad específica de
la enzima fue 10 veces más alta en extractos membranales que en los extractos
citosólicos. En las dos líneas de raíces estudiadas, durante los primeros 10 días de
cultivo se observó un pico de actMdad de PLC de la fracción citosólica que precede
a aquella de fracciones membranales. Ambas actividades son detectadas al inicio
de la fase exponencial de la curva de crecimiento. Esta variación de la actividad con
respecto al ciclo de cultivo sugiere que el metabolismo de los fosfolípidos de inositol
puede estar involucrado en el proceso de proliferación celular. Estos resultados
correlacionan con la detección de actividades de proteínas cinasas del metabolismo
de los fosfoinosítidos durante el ciclo de cultivo de células en suspensión de C.
roseus [Heim y Wagner,1986,1987,1989].
Yotsushima
eí
a/.,
(1992,1993)
reportaron
la
purificación
a
homogeneidad aparente y la caracterización de una PLC soluble y una PLC
asociada a membrana a partir de células en suspensión de arroz. La comparación
de sus propiedades indica que son jsoenzimas diferentes. La masa molecular
87
aparente de las enzimas asociada a membrana y soluble fue 42 y 55 kDa,
respectivamente La PLC asociada a la membrana tuvo un pH Óptimo de 65
mientras que la soluble lo tuvo a 5.2 El ion Sr2+ activó a la PLC asociada a la
membrana y no lo hizo con la soluble. Melin ef a/ (1992) reportaron la purificación
parcial y caracterización de una PLC de membranas plasmáticas de trigo
enzima fue solubilizada con octilglucósido y
La
la purificaron 25 veces. La enzima
parcialmente purificada hidrolizó PIP2 y PIP. En este trabajo se llevó a cabo una
caracterización inicial de ambas actividades detectadas con el fin de realizar un
análisis y comparación de la conducta enzimática. Cabe hacer notar que esta
caracterización preliminar fue hecha en extractos crudos AsÍ bien, al determinar la
especificidad por el sustrato observamos que la PLC asociada a membrana
hidrolizó preferencialmente al PIP2 y al PIP mientras que la PLC de la fracción
citosólica hidrolizó preferencialmente al PIP y al Pl. Estos resultados preliminares
correlacionan con aquellas reportadas para las PLCs asociadas a membrana y
solubles respectivamente.
Las PLCs de plantas superiores requieren de Ca2+ para su activación
[lrvine eí a/,
1980]
Las actividades de PLC reportadas en plantas son
dependientes de Ca2+ a concentraciones micromolares (enzimas asociadas a
membrana) y a concentraciones milimolares (enzimas soluble) En contraste con la
dependencia de Ca2. de las enzimas solubles reportadas, la actividad de ambas
PLCs que detectamos en las raíces de la línea Jl de C. mseus tienen una
dependencia total a concentraciones micromolares de calcio y se presenta un
efecto inhibitorio a concentraciones superiores de calcio De acuerdo a algunos
investigad]res, los niveles basales de Ca2+ libre en la célula vegetal se encuentran
en un rango Je 100 a 300 nM [Dr®bak,1992, Felle,1988] Esto indica que ambas
PLCs se encuentran inactivas a niveles basales en la célula y que la actividad
enzimática es estimulada cuando las concentraciones de Ca2+ citosólico se eleva a
niveles micromolares en respuesta a algún estímulo a la célula por 1o que podrían
estar reguladas por la concentración de Ca2+ en el citosol Parece ser que las PLC
solubles contribuyen a la amplificación de señales en lugar de transducir señales
extracelulares dentro de la célula En células animales se ha reportado que los
fosfolípidos de inositol están localizados en la pane citosólica de la bicapa lipídica y
que el contenido de fosfatidilinositoles es mayor en las endomembranas que en la
membrana plasmática [Hokin, 1985]
En plantas superiores, Ias membranas
plasmáticas están ennquecidas de PIP y PIP2 mientras que los microsomas
contienen PI [Boss,1989] Estas observaciones mantienen la función hipotétióa de
las PLCs solubles. Sin embargo, también en células animales se ha reportado la
translocación de la PLC-yl desde el citosol hacia la membrana en respuesta a
factores del crecimiento aunque no se conoce la naturaleza de este mecanismo
[Todderud e( a/ ,1990, Kim ef a/ ,1989]. Por lo tanto, tampoco podemos excluir la
posibilidad de que cieha translocación pudiera estarse llevando a cabo
Al determinar los parámetros cinéticos aparentes
se observaron
cambios durante los primeros 10 días de cultivo, hasta llegar a ser similares Estos
datos no proporcionan información relevante que se puedan tomar en cuenta para
sacar conclusiones aunque sÍ nos dan una idea de que el comportamiento
88
enzimático en su máxima actividad es diferente uno del otro. Por ello,
indispensable la determinación de los parámetros cinéticos con la enzima pura.
es
La estimulación de la actividad de la PLC por deoxicolato y Tritón
X-100, en membranas plasmáticas de raíces de trigo, se observó a un 0.01% (p/v)
[Melin ef a/,1992] y a 0.02-0 025% (p/v) [Pical eí a/.,1992]; la inhibición de la
actividad enzimática se presentó cuando la concentraciones fueron superiores a
0 05%. En nuestro modelo el Tritón X-100 tuvo un efecto inhibitorio a panir de
0.02% (p/v) tanto en la PLC soluble como en la PLC membranal. El deoxicolato
activó unicamente a la PLC soluble a 0.02% (p/v) El octilglucósido activó a la PLC
asociada a membrana pero únicamente a 0 04°/o (p/v) mientras que la PLC soluble
se activó a concentraciones superiores (0.15-0.2°/o). El aumento de la actividad
enzimática en presencia de detergentes podría ser explicada en varias formas: a) el
complejo substrato lípido-detergente es un mejor substrato para la enzima que el
substrato lípido solo; y b) el detergente abre una barrera estructural y expone el sitio
activo de la enzima. La primera explicacjón no sería vállda si a concentraciones
altas de detergente se observa inhibición de la enzima. La segunda opción sería la
indicada si tomamos en cuenta el efecto diferencial de los tres detergentes sobre
una misma isoenzima. Además, la comparación de los datos reportados para la
PLC en plantas sugeriría que el efecto de cierto detergente podría deberse a la
combinación específica de la enzima con el detergente, o bien el sustrato lípido con
el detergente.
Aunque existen reportes en relación a la purificación y caracterización
de las PLCs especi.ficas para fosfolípidos de inositol en plantas, ésta no ha sido
purificada a homogeneidad. Huang ef a/ (1995) reportaron al menos cuatro
vanantes de Pl-PLCs en las raíces de plántulas de avena, dos citosólicas y dos
asociadas a la membrana. Las dos variantes citosólicas y las dos asociadas a la
membrana se separaron en base a su afinidad por la heparina. En nuestro modelo
no descartamos la existencia de isoformas con diferente afinidad por la heparina ya
que se detectó actividad de PLC en el perfil de lavado y elución de la proteína en la
columna de heparina. La purificación parcial de la fosfolipasa C de C. roseus que
hemos obtenido puede ser optimizada para lograr la homogeneidad. Ambas PLC
soluble y asociada a la membrana de C. roseus mostraron afinidad por heparina,
unión a Q-sepharose, y una buena elución por cromatografía de exclusión de
tamaño.
La existencia del ciclo de los fosfoinosítidos en células vegetales ha
sjdo establecida a partir de la determinación tanto de sus metabolitos como de sus
actividades enzi.máticas [Boss, 1989; Sandelius y Sommarin, 1990]. Desde hace
más de una década, se han realizado estudios preliminares con fitohormonas que
mostraron efectos sobre las actividades enzimáticas del ciclo de los fosfoinosi'tidos
y cambios en las reservas de sus metabolitos [Falkenau ef a/,1987; Connett y
Hanke,1987; Murthy eí a/..1989] Ettlinger y Lehle (1988) estudiaron la capacidad
del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) para reiniciar la división celular de células
en suspensión de Caíharaníhus roseus mantenidas en la fase Gi. La adición de
2,4-D causó una disiminución transiente de PIP y PIP2 acompañada de un aumento
en los niveles de lp2 e lp3, Estos efectos sugerían la estimulación de la PLC por
auxinas, por lo que Zbell y Walter-Back (1988) utilizaron el ácido ¡ndolacético (lAA)
89
en células en suspensión de Daucus carioía para observar los efectos que éste
produciría. La adición de lAA a las preparaciones microsomales redujo los niveles
de PIP`y PIP2 sugiriendo un efecto de la auxina sobre la acción catalizadora de la
PLC
Otros reportes relacionados con la existencia del metabolismo de los
fosfoinosítidos en plantas en respuesta a otras señales refieren a los efectos de la
luz sobre el control del movimiento de las hojas en Samanea saman [Morse et al.,
1989].
La luz blanca indujo un aumento del lp2 e lp3 así como diacilglicerol.
Actualmente, dadas las evidencias se deduce que la PLC en plantas, como en
células animales, puede estar involucrada en diferentes procesos; es por esto, que
se requiere atención y esfuerzo para demostrar una acción concertada de los
elementos involucrados en el metabolismo de los fosfoinosítidos en determinado
peoceso La purificación a homogeneidad de al menos una de las isoenzimas de la
PLC en C. noseus permitirá un estudio más profundo para conocer la función de
estas enzimas en la fisiología vegetal, en el desarrollo, y en la respuesta a cambios
ambientales.
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92
CAPITULO 5
Conclusiones
Debido a las ventajas que ofrece un cultivo de raíces transformadas y
a la disponibilidad de una línea celular de C. roseus previamente caracterizada en
la Unidad de Biología Experimental, Ia actividad de PLC fue caracterizada en la
línea celular J1. Los resultados obtenidos en el presente trabajo derivan las
siguientes conclusiones:
A) La acti.vidad de PLC específica para fosfatidilinositol bisfosfato está
presente en extractos solubles y en extractos membranales en diferentes cultivos
de tejidos de C roseus. Durante una curva de crecimiento de la línea J1, ambas
actividades alcanzaron un pico máximo durante el inicio de la fase exponencial
8) La actividad de PLC en ambos extractos, membranales y solubles,
fue dependiente de calcio a concentraciones micromolares.
C) La actividad de PLC presente en extractos membranales es
especi'fica para fosfoinosítidos monofosforilados y bisfosforilados, mientras que la
actividad de la
PLC
presente en extractos solubles es específica para
fosfoinosítidos no fosforilados y monofosforilados
D) El efecto que tienen los detergentes sobre la actividad de la PLC es
diferencial El octilglucósido fue el único detergente de los estudiados que tuvo un
efecto estimulatorio sobre la actividad de PLC presente en ambos extractos
E) El protocolo establecido para la purificación parcial de la PLC
presente en extractos solubles y en extractos membranales permite obtener 5-6
veces de purificación partiendo del eluato desalado de ambas fracciones Con este
protocolo se obtienen en la preparación final varias proteínas cuyas masas
moleculares están en el rango de 55 a 75 kDa determínados por SDS-PAGE
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CAPITULO 6
Perspectivas
Actualmente, es evidente que los constituyentes de
fosfoinosítidos, incluyendc) los fosfolípidos, inositoles fosfatos y
encuentran presentes en las plantas También es evidente que los
cuales opera esta vía apenas comienzan a ser elucidados, tratando
la vía de los
las enzimas, se
medios por los
de encontrar su
participación en mecanismos de transducción de señales a estímulos tales como
luz, fitohormónas, ataque a patógenos y estrés S.in embargo, hasta ahora no ha
emergido un esquema que defina claramente la posición de los elementos de esta
vía dentro de las células vegetales.
Aunque a lo largo de los años las investigaciones acerca del
metabolismo de los fosfoinosítidos han sido hechas basándose en los mecanismos
que existen en células animales, es necesario enfatizar que esta vía podría no
funcionar en idéntica forma en plantas De cualquier manera, se tiene la ceneza de
que esta vía en plantas pahicipa en varios procesos en los cuales se transfiere
información intercelular e intracelular. Existe una lista de acciones futuras a seguir`
1. PURIFICACIÓN A HOMOGENEIDAD DE LA PLC DE C roseus La
acción inmediata a seguir es la purificación a homogeneidad de cualquiera de las
PLCs presentes en las ralces transformadas de C roseus considerando los
antecedentes de este trabajo e incluyendo algún paso adicional. Uno de éstos
podría ser la purificación mediante una electroforesis en gel preparativo, una vez
identificada la banda proteica (con anticuerpos comerciales contra alguna PLC de
animales) se cofta del gel y la proteína se electroeluye y concentra. Otra alternativa
sería una cromatografía de afinidad utilizando una columna con una matriz que
contenga acoplado un anticuerpo dirigido contra alguna de las regiones comunes a
las PLCs de ammales, un anticuerpo dirigido contra la secuencia completa de
alguna PLC de animales o bien algún ligando específico para um a la PLC (p ej.
IP3). Para optimizar el grado de pureza, se puede realizar la combinación de ambas
estrategias ya mencionadas seguida de la cromatografia de afinidad y
posteriormente
preparativo.
2.
la
electroelución
PRODUCCIÓN
de
DE
la
proteína
separada
ANTICUERPOS.
La
mediante
obtención
el
gel
de
los
anticuerpos puede hacerse directamente a partir de la banda proteica cortada y
electroeluída del gel, e incluso sin electroeluirla del gel
Lo ideal es obtenerlos a
partir de una proteína con un alto grado de pureza Los anticuerpos obtenidos
serían útiles para realizar estudios de inmunolocalización /.n v/íro e /n v/.vo a nivel
celular o de tejido, o bien para determinar si existe expresión o activación de la
enzima a lo largo del ciclo de cultivo
3, ESTUDIOS CINÉTICOS. Con la enzima pura se podrían determinar
los parámetros cinéticos de la enzima. El análisis cinético se realizaría de acuerdo a
la cinética de dilución superficial descrita para las fosfolipasas y que incluye dos
94
reacciones: Ia primera es la asociación de la enzima con la superficie micelar y la
segunda es la catálisis interfacial de donde se obtienen los valores de Km y Vmax.
Estos valores podrían ser comparados con los parámetros cinéticos reponados
para algunas de las PLCs, o bien servir como referencia en futuros estudios
cinéticos con alguna PLC aislada de otra fuente vegetal.
4. SECUENCIACIÓN DE LA ENZIMA. La secuenciación de la enzima
permitiría conocer la homología qiie ésta presenta con las enzimas de células
animales y, como resultado, la clasificación dentro de la familia de PLCs Por otro
lado,
de la secuencia de aminoácidos se puede derivar el diseño de
oligonucleótidos para la obtención del gen, mismo que sería útil para expresar la
proteína ya sea en alguna bacteria o tejido vegetal mediante transformación
dependiendo de los fines a que se diriga la expresión.
5. EXPERIMENTOS DE RECONSTITUCIÓN. Con la enzima pura y
algunos de los elementos de transducción (receptores, proteínas G, mastoparan)
de células animales se podría saber si esta enzima sigue el mismo mecanismo de
acción que en animales Además, en estos experimentos se pueden incluir
fitorreguladores para conocer su efecto sobre esta vía de transducción de señales.
6. EXPERIMENTOS DE MUTACIÓN. La clonación del gen de la PLC
de plantas permitiría realizar experimentos de mutagénesis sitio dirigida, ya sea
para conocer la función que tiene la enzima en la célula vegetal, o bien para
conocer los sitios de interaccion con los elementos del mecanismo de transducción.
Esto se realizaría cambiando un aminoácido en particular o cierta secuencia de
aminoácidos que parezca es requerida para alguna función de la enzima.
95
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Ex-hacienda Xcumpich
Antigua carretera a Progreso Km. 7
Apartado Postal 87 C.P. 97310
Cordemex, Yucatán