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FOSFATASA ACALINA
SIGNIFICADO CLÍNICO
La fosfatasa alcalina está presente en prácticamente todos los
tejidos del cuerpo, y particularmente se produce en niveles altos en
el epitelio intestinal, túbulos renales, hueso, hígado y placenta.
Aunque la función precisa de la enzima metabólica todavía no se
entiende, parece que la enzima está asociada con el transporte de
lípidos en el intestino y con el proceso en el hueso. La forma
presente en el suero de los adultos normales, probablemente se
origina principalmente en el hígado, con un máximo de la mitad
del total de la actividad que viene del esqueleto. Las
contribuciones respectivas de estas dos formas a la actividad total
son marcadamente dependientes de la edad. Las mediciones
séricas de ALP son de particular interés en la investigación de dos
grupos de condiciones: la enfermedad hepatobiliar y la enfermedad
ósea asociada con el aumento de la actividad osteoblástica.
Durante muchos años, se creía que la ALP que llegaba al hígado
desde otros tejidos (especialmente hueso) se excretaba en la bilis y
la actividad elevada de la enzima hallada en el suero en la
enfermedad hepatobiliar era el resultado de un fallo para excretar
la enzima a través de la bilis. Sin embargo, ahora se sabe que la
respuesta del hígado a cualquier forma de obstrucción del árbol
biliar es sintetizar más ALP. La obstrucción intrahepática del flujo
biliar también eleva la ALP en el suero, pero por lo general, en
menor medida. Las enfermedades hepáticas que afectan
principalmente a las células del parénquima, tales como la
hepatitis infecciosa, típicamente también muestran sólo niveles
séricos moderadamente elevados o incluso normales de ALP.
Entre las enfermedades óseas, los niveles más altos de actividad de
la ALP en suero se encuentran en la enfermedad de Paget. Sólo se
observan elevaciones moderadas en la osteomalacia, los niveles
disminuyen lentamente en respuesta terapéutica a la vitamina D. El
hiperparatiroidismo primario y el secundario se asocian con
elevaciones leves a moderadas de la actividad de la ALP en el
suero. Niveles de enzimas muy elevados está presente en los
pacientes con cáncer óseo osteogénicos. Se pueden encontrar
elevaciones transitorias durante la curación de fracturas óseas.
El crecimiento óseo fisiológico eleva la ALP en el suero, tomando
en cuenta por el hecho de que el suero de los niños en crecimiento
la actividad enzimática se encuentra de unos 1,5 a 2,5 veces más
de lo que está en el suero normal de los adultos. Un aumento de
hasta dos o tres veces de lo normal puede ser observado en las
mujeres en el tercer trimestre del embarazo, aunque el intervalo es
muy amplio y en algunos casos los niveles no exceden el límite
superior del intervalo de referencia. La enzima adicional es de
origen placentario. Los métodos de determinación de la actividad
de la ALP tiene una larga historia y numerosos métodos han tenido
un uso más o menos amplio.
El más popular de los sustratos cromogénicos para la fosfatasa
alcalina es el 4-nitrofenil fosfato. Este éster es incoloro, pero el
producto de reacción es de color amarillo en el pH de la reacción;
por tanto, la reacción enzimática se puede controlar continuamente
mediante la observación de la velocidad de formación del ion
nitrofenóxido 4. Mejorando las condiciones de la reacción, esta es
la base de los métodos actuales recomendados y estándares de
ensayo de la ALP. Se han introducido un gran número de kit
comerciales de procedimientos manual, automatizados, que
utilizan estos tampones y sustratos cromogénicos. El
procedimiento estándar para el ensayo de ALP propuesto por
DGKC utiliza tampón DEA a pH 9,8 y 4-NPP como sustrato.
PRINCIPIO DEL METODO: Cinético - DGKC
La enzima de la fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1, ortofosfóricomonoéster fosfohidrolasa) hidroliza el 4-NPP para liberar 4nitrofenol, bajo condiciones alcalinas. El 4-nitrofenol formado se
detecta espectrofotométricamente a 405 nm para dar una medida
de la actividad de la fosfatasa alcalina en la muestra. El presente
procedimiento se ha realizado de acuerdo a DGKC
COMPONENTES DEL KIT
Solamente para uso diagnóstico in vitro
Reactivo(líquido):
R1
4 x 40 mL
R2
1 x 40 mL
COMPOSICIÓN DE LA PRUEBA:
tampón DEA pH 9.81 M, MgCl2 0,5 nM, 4- Nitrofenilfosfato 10
mM.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Y ESTABILIDAD
SUERO DE INICIO (Procedimiento Monoreactivo):
Añadir 10 mL de reactivo R2 a una botella de reactivo R1.
ESTABILIDAD DE LA SOLUCION DE TRABAJO:
60 días a 2.8°C, protegido de fuentes de luz.
Ref: 400 1702L
REACTIVO DE INICIO (Procedimiento bireactivo):
utilizar los reactivos separados listos para usar.
ESTABILIDAD: Hasta la fecha de vencimiento en las
etiquetas a 2-8 ° C;
ESTABILIDAD DESDE LA PRIMERA APERTURA DEL
FRASCO:
Utilizar preferiblemente, hasta 60 días a 2-8°C.
Los componentes del kit son estables hasta la fecha de
vencimiento si se almacenan en las condiciones indicadas,
protegidas de fuentes de luz directa y si no está contaminada
durante la manipulación. Guarde los reactivos y la solución
de trabajo sin mezclar, desde la primera apertura, bien
cerrados.
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD
Realice la prueba de acuerdo con las directrices del Manual
de "Buenas Prácticas de Laboratorio" (BPL)
El
reactivo
R1 contiene
dietanolamina (DEA)
Etiquetado de reactivo R1:
Xn R48/22-41
R48/22: Nocivo. Riesgo de efectos graves para la salud por
exposición prolongada si se ingiere;
R41: Riesgo de efectos graves para los ojos;
S20/21: Cuando se usa, no comer, beber o fumar;
S26: En caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente
con abundante agua y consultar al médico:
36/37/39: Usar ropa protectora adecuada, guantes y
protección ocular / facial;
S46: En caso de ingestión, acuda al médico inmediatamente
y muéstrele la etiqueta o el envase.
TOMA DE MUESTRAS Y MANIPULACIÓN
Suero,
plasma
(heparina
solamente)
Los sueros que se mantienen a temperaturas ambiente suelen
mostrar un ligero aumento en la actividad, real, la cual varía
de 1% durante un período de 6-h a 3 a 6% durante un
período de 1 a 4 días. Incluso en los sueros almacenados a la
temperatura del refrigerador, la actividad aumenta
lentamente. En los sueros congelados, la disminución de la
actividad, se recupera lentamente después de la
descongelación del suero. Una mejora similar de la
actividad, pero de mayor magnitud, se produce con las
preparaciones liofilizadas reconstituidas, tales como los
disponibles como sueros de control o calibradores. En el
material reconstituido se incrementa con el almacenamiento
al 4 y 20°C son aproximadamente de 10 y 30%
respectivamente. La actividad continúa durante varios días,
pero a un ritmo decreciente. La causa de este fenómeno no
se conoce pero se puede atribuir a la renaturalización de la
enzima parcialmente desnaturalizada o de la disociación, en
el calentamiento, de un complejo de fosfatos-lipoproteínas o
un multímero de la enzima que se formó en el proceso de
liofilización
PROCEDIMIENTO DE PRUEBA
INICIO DE LA PRUEBA
Longitud de onda:
405 nm
Paso de luz
1 cm
Temperatura:
37°C
Dispense en la cubeta la solución de trabajo
1 mL
Preincube a 37°C por 5 minutos
Añada la muestra
20 µL
Mezclar, realice la primera lectura de la absorbancia
después de 60 segundos, incube a 37°C. Realice otras
tres lecturas a intervalos de 60 segundos. Calcule el
∆Abs/min
REACTIVO AL INICIO
Longitud de onda:
405 nm
Paso de luz
1 cm
Temperatura:
37°C
R1
1 mL
Añada la muestra
25 µL
Preincube a 37°C por 5 minutos
R2
250 µL
Mezclar, realice la primera lectura de la absorbancia
después de 60 segundos, incube a 37°C. Realice otras
tres lecturas a intervalos de 60 segundos. Calcule el
∆Abs/min
4 x 50 mL
FACTOR DE CONVERSIÓN
Actividad de la ALP (U/L)x 0,0167=Actividad de la ALP
(ukat/L)
VALORES ESPERADOS
Hombres 270 U/L ( <4,50 ukat/L)
Mujeres 240 U/L ( <4,00 ukat/L)
Cada laboratorio debe establecer los rangos de referencia para su
propia población de pacientes.
CONTROL DE CALIDAD- CALIBRACIÓN
Se sugiere realizar un control de calidad interno.
Comprobar el cumplimiento de los datos obtenidos con los
previstos para validar los resultados
DESEMPEÑO DEL ANÁLISIS
LINEALIDAD
El método es lineal hasta 3000 U/L. Si el valor límite se excede,
se sugiere diluir la muestra de 1+9 con solución salina y repetir la
prueba, multiplicando el resultado por 10.
SENSIBILIDAD
El límite de detección es de 7 U/L.
INTERFERENCIAS
No se observó interferencia por la presencia de:
Hemoglobina
≤ 400 mg/dL.
Bilirrubina
≤ 27 mg/dL
Lípidos
≤ 1000 mg/dL
PRECISION
Intra-ensayo (n=10)
Muestra 1
Muestra 2
promedio(mg/dL)
175,70
426,70
SD (mg/dL)
0,95
2,41
CV%
0,50
0,60
Intra-ensayo (n=20)
Muestra 1
Muestra 2
promedio(mg/dL)
167,26
408,28
SD (mg/dL)
3,99
8,61
CV%
2,40
2,10
METODOS DE COMPARACION
Una comparación entre Hospitex y un producto comercialmente
disponible dio los siguientes resultados:
ALP Hospitex = x
ALP competencia = y
n = 112
Regresión lineal y =0.96x -2.17 U/l
Coeficiente de correlación r2 = 0.999
ELIMINACIÓN DE RESIDUOS
Este producto está hecho para ser utilizado en los laboratorios
profesionales. Por favor, consulte las normas locales para una
correcta eliminación de residuos.
S56: desechables de esta sustancia y su recipiente en un punto
peligroso o especial de recogida de residuos
S57: Utilícese un envase adecuado para evitar la contaminación
del medio ambiente
S61: Evítese su liberación en el medio ambiente, consulte las
instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad
REFERENCIAS
FABRICANTE
Hospitex Diagnostics S.R.L.
LEYENDA DE LOS SÍMBOLOS
solo para diagnostico in vitro
lote de fabricación
código
almacenaje a intervalo de temperatura
fecha de vencimiento
RESULTADOS DEL CÁLCULO
Realizar el cálculo en unidades por litro, multiplicando el
∆A / min por el factor como se indica
Actividad de ALP en U/L = ∆Abs/min x 2757
precaución, lea las instrucciones adjuntas
lea las instrucciones
ALP_00
Hospitex Diagnostics S. r.l. – Via Arno 23/25, 50019 OSMANNORO, SESTO DFIORENTINO (FI) – www.hospitex.it – email:[email protected]
Rev00.21/11/2011