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Functions, catalytic mechanism and regulation of Echinococcus granulosus Thioredoxin-Glutathione Reductase Funciones, mecanismo catalítico y regulación de la Tiorredoxina-Glutatión Reductasa de Echinococcus granulosus Lic. Mariana Bonilla Tesis de doctorado en Ciencias Biológicas PEDECIBA Orientador: Dr. Gustavo Salinas - Co-orientadora: Dra. Ana Denicola Cátedra de Inmunología, Facultad de Química y Facultad de Ciencias Universidad de la República Diciembre de 2011 A Mateo RESUMEN Varios procesos celulares esenciales dependen de la homeostasis del estado redox intracelular. En la mayoría de los organismos dos sistemas redox enzimáticos basados en tioles, el sistema de la tiorredoxina (Trx) y el sistema del glutatión (GSSG, forma oxidada; GSH, forma reducida), desempeñan un papel central en mantener un suministro adecuado de equivalentes de reducción a procesos celulares claves y a las defensas antioxidantes. Los platelmintos parásitos, que constituyen un importante problema de salud en los países en desarrollo, tienen un arreglo único y simplificado de estas rutas. En contraste con sus hospedadores y con sus contrapartes de vida libre, estos organismos carecen de tiorredoxina reductasa (TR) y glutatión reductasa (GR) convencionales. En su lugar, poseen sistemas TrxGSH ligados: una sola enzima, conocida como tiorredoxina-glutatión reductasa (TGR), es responsable de la reducción de Trx y GSSG. Esta enzima es una fusión natural de un dominio glutarredoxina (Grx) a dominios TR que poseen un centro redox C-terminal que contiene selenocisteína (Sec). Se ha probado que la TGR es esencial para estos parásitos y se la ha validado como un nuevo blanco de drogas para las infecciones causadas por platelmintos. En esta tesis hemos profundizado en la caracterización de los sistemas Trx-GSH ligados en Echinococcus granulosus (un platelminto parásito y agente causal de la echinococcosis quística), centrándonos en las funciones, mecanismo catalítico y regulación de la TGR de E. granulosus (EgTGR). Uno de los hallazgos principales de este trabajo fue la demostración de que la EgTGR posee actividad deglutationilasa independiente de GSH (puede catalizar la reducción de disulfuros mixtos glutatión-péptido usando un dador de electrones distinto del GSH), lo cual confiere una ventaja a este singular arreglo redox. Además, establecemos claramente un rol esencial del residuo de Sec en todas las actividades de la enzima, y determinamos que mientras que la actividad TR de la EgTGR sólo depende de sus dominios TR, sus actividades deglutationilasa y GR son mediadas por su dominio Grx a través de un mecanismo monotiólico, en el cual el intermediario glutationilado de la enzima es resuelto por el centro redox C-terminal de los dominios TR. Otros autores han descrito un fenómeno inusual y aún no bien comprendido de la TGR: el GSSG dispara un comportamiento histerético (inhibición temporal) en la actividad GR de la TGR, que es más pronunciado a altas concentraciones de GSSG y bajas concentraciones de TGR, y es reducido por el GSH de modo dependiente de la concentración. Encontramos que las EgTrxs también reducen la histéresis y probamos que, como para la actividad GR, la actividad deglutationilasa de la TGR se encuentra inhibida a altas concentraciones de GSSG. Basados en las correlaciones entre la glutationilación/deglutationilación de residuos de cisteína (Cys) y la histéresis, en el hecho de que la histéresis está drásticamente reducida en una mutante que carece de la Cys de resolución en el centro redox del dominio Grx, y en la participación de la enzima en su propia reactivación, proponemos que la glutationilación/deglutationilación de la Cys resolutiva del centro redox del dominio Grx es un proceso crucial en el fenómeno observado, regulando la actividad del dominio Grx. Es importante señalar, a su vez, que demostramos que la actividad TR de la TGR se preserva a altas concentraciones de GSSG y que las EgTrxs pueden llevar a cabo la reducción de GSSG y la deglutationilación bajo estas condiciones. Por tanto, existen vías de rescate tanto para la reducción de GSSG como para la deglutationilación a través de los dominios TR de la TGR y las Trxs. Finalmente, otro hallazgo central de este trabajo fue la demostración de que existen sistemas Trx-GSH ligados funcionales en los compartimentos citosólico y mitocondrial en este parásito. Globalmente, estos resultados sugieren que la TGR es no sólo una enzima esencial en el metabolismo de estos parásitos, sino también un dispositivo enzimático muy sofisticado sujeto a, e involucrado en, la regulación metabólica. ABSTRACT Essential cellular processes depend on the homeostasis of the intracellular redox state. In most organisms two major thiol-based redox enzymatic systems, the thioredoxin (Trx) system and the glutathione (GSSG, oxidized form; GSH, reduced form) system, serve a central role in maintaining an adequate supply of reducing equivalents to key cellular processes and antioxidant defenses. Platyhelminth parasites, which constitute a major health problem in developing countries, have a unique and simplified array of these routes. In contrast to their hosts and to their free-living counterparts, these parasites lack conventional thioredoxin reductase (TR) and glutathione reductase (GR). Instead, they have linked Trx-GSH systems: a single enzyme, known as thioredoxin-glutathione reductase (TGR), is responsible for Trx and GSSG reduction. This enzyme is a natural fusion of a glutaredoxin (Grx) domain to TR domains having a Cterminal redox center that contains selenocysteine (Sec). TGR has been shown to be essential for these parasites and it has been validated as a novel drug target for platyhelminth infections. This thesis has provided insights on the characterization of the linked Trx-GSH systems in Echinococcus granulosus (a platyhelminth parasite and the causative agent of cystic echinococcosis), focusing on the functions, catalytic mechanism and regulation of E. granulosus TGR (EgTGR). A major finding of this work was the demonstration that EgTGR possesses GSH-independent deglutathionylase activity (it can catalyze the reduction of glutathione-peptide mixed disulfides using an electron donor different from GSH), which confers an advantage to this peculiar redox array. Furthermore, we clearly establish an essential role for the Sec residue at the C-terminal redox center in all enzyme activities, and determine that while the TR activity of EgTGR only depends on its TR domains, its deglutathionylase and GR activities are mediated by its Grx domain by a monothiolic mechanism, in which the glutathionylated enzyme intermediate is resolved by the C-terminal redox center of the TR domains. Other authors have described an unusual and yet not completely understood phenomenon of TGR: GSSG triggers a hysteretic behavior (time-dependent inhibition) on the GR activity of TGR, which is more pronounced at high GSSG and low TGR concentrations, and relieved by GSH in a concentration-dependent manner. We found that EgTrxs also relieved hysteresis and demonstrate that, as for the GR activity, the deglutathionylase activity of TGR is inhibited at high GSSG concentrations. Based on the correlations between glutathionylation/deglutathionylation of cysteine (Cys) residues and hysteresis, on the fact that hysteresis is drastically reduced in a mutant lacking the resolving Cys at the Grx domain´s redox center, and on the involvement of the enzyme in its own reactivation, we propose that glutathionylation/deglutathionylation of the resolving Cys in the Grx domain’s redox center is a crucial proccess in the the observed phenomenon, regulating the activity of the Grx domain. Importantly, we demonstrate that TGR’s TR activity is preserved at high GSSG concentrations and that EgTrxs can support GSSG reduction and deglutathionylation under these conditions. Therefore, rescue pathways for both GSSG reduction and deglutathionylation are provided through the TR domains of TGR and Trxs. Finally, another central finding of this work was the demonstration that functional Trx-GSH systems exist in the cytosolic and mitochondrial compartments in this parasite. Overall, these results suggest that TGR is not only an essential enzyme in the parasites’ metabolism, but also a very sophisticated enzymatic device subject to, and involved in, metabolic regulation. LIST OF ABBREVIATIONS cEgTrx DTNB DTT EgTGR EgTGRWT, EgTGRGCUG EgTGRGC* EgTGRGCCG EgTGRC31S EgTGRC34S EgTGRGUCG EgTRGCUG, Grx-less EgTGR FhTGR GFP GLO GPx GR Grx GSH GSSG GST H2O2 HED iNOS mEgTrx Msr .NO NTDs .O2 ONOO PAMPS PCS PDI Prx Pr-S-S-G Pr-S-S-Pr p-S-S-G RNS ROS RR RSOH RSO2 RSO3 RSeOH RSeO2 RSeO3 Sec, U SECIS SmTGR SOD TcTGR TGR TR Trx cytosolic thioredoxin isoform from Echinococcus granulosus 5,5-dithiobis(2-dinitrobenzoic acid) dithiothreitol Echinococcus granulosus TGR wild-type Echinococcus granulosus TGR TGR mutant truncated at the Sec residue of the C-terminal redox center TGR mutant carrying a Sec596 to Cys mutation TGR mutant carrying a Cys31 to Ser mutation TGR mutant carrying a Cys31 to Ser mutation TGR mutant carrying a Cys595to Sec and a Sec596 to Cys mutation TGR mutant lacking the Grx domain Fasciola hepatica TGR green fluorescent protein glyoxalase glutathione peroxidase glutathione reductase glutaredoxin reduced glutathione oxidized glutathione glutathione S-tranferase hydrogen peroxide 2-hydroxyethyl disulfide inducible nitric oxide synthase mitochondrial thioredoxin isoform from Echinococcus granulosus methionine sulfoxide reductase nitric oxide radical neglected tropical diseases superoxide radical anion peroxynitrite anion pathogen associated molecular patterns phytochelatin synthase protein disulfide isomerase peroxiredoxin glutathione-protien mixed disulfide protein disulfide glutathione-peptide mixed disulfide reactive nitrogen species reactive oxygen species ribonucleotide reductase sulfenic acid sulfinic acid sulfonic acid selenenic acid seleninic acid selenonic acid selenocysteine selenocysteine insertion sequence Schistosoma mansoni TGR superoxide dismutase Taenia crassiceps TGR thioredoxin-glutathione reductase thioredoxin reductase thioredoxin TABLE OF CONTENTS 1. INTRODUCTION 1 1.1 PLATYHELMINTH PARASITES: MODEL ORGANISMS TO STUDY THE SYSTEMS INVOLVED IN REDOX HOMEOSTASIS 1.2 INFECTIONS BY PLATYHELMINTH PARASITES: AN ENORMOUS BURDEN TO DEVELOPING COUNTRIES 1.3 OXIDANT SPECIES AND ANTIOXIDANT DEFENSES IN PARASTIC PLATYHELMINTHS: A FIRST VIEW 1.4 THE THIOREDOXIN AND GLUTATHIONE SYSTEMS 1. 5 LINKED THIOREDOXIN-GLUTATHIONE SYSTEMS IN PARASITIC PLATYHELMINTHS 1.6 THE PRIMARY STRUCTURE OF THIOREDOXIN -GLUTATHIONE REDUCTASE: TGR IS A SELENOENZYME 1. 7 WHY DO SELENOPROTEINS USE SELENOCYSTEINE INSTEAD OF CYSTEINE? 1.8 TGR IS AN ESSENTIAL ENZYME IN THE METABOLISM OF PLATYHELMINTH PARASITES 1.9 TGR AS A DRUG TARGET 1. 10 EXISTING EVIDENCE ON TGR FUNCTIONS AND MECHANISM 1. 11 OPEN QUESTIONS ON TGR FUNCTIONS AND MECHANISM 2. AIMS OF THIS THESIS GENERAL AIM SPECIFIC AIMS 1 1 3 7 7 10 10 15 17 19 22 25 25 25 RESULTS AND DISCUSSION 26 3. PAPER I 26 4. PAPER II 26 5. HYSTERESIS REVISITED 27 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 27 29 31 34 37 377 39 411 42 HYSTERETIC BEHAVIOR IN ENZYMES THE FIRST INDICATIONS OF HYSTERESIS IN EGTGR EGTGR HYSTERETIC BEHAVIOR OCCURS AT HIGH GSSG CONCENTRATIONS EGTGR HYSTERETIC BEHAVIOR IS OBSERVED AT LOW ENZYME CONCENTRATIONS GSH CAN ABOLISH EGTGR HYSTERETIC BEHAVIOR TRXS CAN ALSO ABOLISH HYSTERESIS IN EGTGR EGTGR HYSTERESIS PERSISTS AFTER GSSG REMOVAL THE TR ACTIVITY OF TGR IS NOT AFFECTED BY PRETREATMENT OF THE ENZYME WITH GSSG HYSTERESIS CORRELATES TO GLUTATHIONYLATION/DEGLUTATHIONYLATION OF CYSTEINE RESIDUES 5.10 FIRST DRAFT FOR A MECHANISM BEHIND HYSTERESIS 5.11 EGTGR HYSTERESIS IS DRASTICALLY ATTENUATED BY THE MUTATION OF THE RESOLVING CYSTEINE (CYS34) IN THE GRX DOMAIN’S REDOX CENTER 5.12 ADDITIONAL SURPRISES 5.13 WHAT CAN BE LEARNT FROM THE DEPENDENCE OF THE HYSTERETIC BEHAVIOR ON PH? 5.14 REFORMULATING OUR MODEL FOR HYSTERESIS IN EGTGR EXPERIMENTAL PROCEDURES 466 49 49 54 57 6. GENERAL DISCUSSION AND CONCLUSIONS 59 6.1 THE EXISTENCE OF FUNCTIONAL LINKED SYSTEMS IN MITOCHONDRIA AND CYTOSOL 6.2 FURTHER CHARACTERIZATION OF TGR FUNCTIONS AND MECHANISM 6.2 A. THE DEGLUTATHIONYLASE ACTIVITY OF TGR 6.2 B THE ROLE OF TGR DOMAINS AND OF THE SEC RESIDUE IN TGR FUNCTIONS 6.2 C THE MECHANISM FOR THE GRX DOMAIN DEPENDENT ACTIVITIES 6.3 TGR HYSTERESIS 6.3 A FURTHER CHARACTERIZATION AND INVESTIGATIONS ON THE MECHANISM 6.3 B WOULD HYSTERESIS EVER OCCUR IN VIVO? 6.3 C WOULD HYSTERESIS BE PHYSIOLOGICALLY RELEVANT? 6.3 D ALTERNATIVE PATHWAYS FOR GSSG REDUCTION AND DEGLUTATHIONYLATION 6.3 E WHAT WOULD THE PHYSIOLOGICAL CONSEQUENCES OF HYSTERESIS BE? 6. DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES (VERSIÓN EN ESPAÑOL) 44 59 60 60 63 65 68 68 70 71 72 73 77 6.1 LA EXISTENCIA DE SISTEMAS LIGADOS FUNCIONALES EN LA MITOCONDRIA Y EN EL CITOSOL 6.2 CARACTERIZACIÓN ADICIONAL DE LAS FUNCIONES Y MECANISMO DE LA TGR 6.2 A. LA ACTIVIDAD DEGLUTATIONILASA DE LA TGR 6.2 B EL ROL DE LOS DOMINIOS Y DEL RESIDUO DE SEC DE LA TGR EN SUS FUNCIONES 6.2 C EL MECANISMO PARA LAS ACTIVIDADES DEPENDIENTES DEL DOMINIO GRX 6.3 LA HISTÉRESIS DE LA TGR 6.3 A CARACTERIZACIÓN EN PROFUNDIDAD Y ESTUDIO DEL MECANISMO 6.3 B ¿OCURRIRÁ LA HISTÉRESIS IN VIVO BAJO ALGUNA CIRCUNSTANCIA? 6.3 C ¿TENDRÁ LA HISTÉRESIS RELEVANCIA FISIOLÓGICA? 6.3 D VÍAS ALTERNATIVAS PARA LA REDUCCIÓN DE GSSG Y LA DEGLUTATIONILACIÓN 6.3 E ¿CUÁLES SERÍAN LAS CONSECUENCIAS FISIOLÓGICAS DE LA HISTÉRESIS? 77 78 78 81 83 86 86 89 90 91 92 REFERENCES 96 ACKNOWLEDGMENTS/AGRADECIMENTOS 103