Download 14-Las enzimas como herramientas analíticas-B

Las enzimas como herramientas
analíticas
Dr. José Luis Cárdenas López
Las enzimas como herramientas analíticas
• Enzimas endógenas
• Enzimas exógenas
• Desarrollo de biosensores
Enzimas exógenas usadas para monitorear calidad de pescado
Enzima
Medición
Referencia
5’-Nucleotidasa, nucleosido
K-value
(Lou, 1998)
Etanol en pescado
(Gill, 1990)
fosforliasa, xantina oxidasa
Alcohol dehidrogenasa
enlatado
Diamina oxidasa, peroxidasa
Histamina
(Lopez-Sabater et al., 1993)
ELISA
Identificación de
(Carrera, 1996)
especies
Glutamato dehidrogenasa
Amoniaco
(Huss, 1995)
Octopina dehidrogenasa, piruvato
Frescura de Scallops
(Shin et al., 1998)
ATPasa
(Cheun et al., 1996)
Putrescina oxidasa
Poliaminas
(Chemnitius et al., 1992)
Trimetillamine dehidrogenasa
Trimetilamina
(Wong and Gill, 1987)
Ureasa
Urea
(Sheppard et al., 1996)
Xantina oxidasa
Hipoxantina
(Shen et al., 1996)
oxidasa
Purina nucleosido fosforilasa, xantina
oxidasa
Relacionadas con degradación de nucleótidos
Análisis
Hx
Hx, Ino
Principio
· enzimas (xantina
oxidasa, XO)
inmovilizadas en una
· simple de usar tira de
ensayo
· ensayo en tira, con
enzimas inmovilizadas
Ventajas
· rápido
· simple de usar fuera
del laboratorio
Desventajas
· semicuantitativo
· solamente puede
medir Hx (estados
finales del deterioro)
Referencia
Jahns et al. (1976)
· rápido
· simple de usar fuera
del laboratorio
· semicuantitativo
Ehira et al.(1986)
· baja reproducibilidad
· limitado a Hx e Ino
(estados finales del
deterioro)
IMP, Ino, Hx
· enzima cubierta con
electrodo de oxígeno
· rápido
· exacto
· más complicado y
Karube et al.(1984)
consume más tiempo
que la tecnología de la
prueba mediante tira
Indice-K
· ensayo de enzima
acoplado "KV-101
Medidor de Frescura"
· rápido
· resultados
comparables a HPLC
· deben adquirirse
enzimas y reactivos
· ¿costo?
· disponible
comercialmente de
Orienta Electric, Niiza
Saitama 352, Japón
Indice-K
· enzima cubierta con
electrodo de oxígeno
"Microfresh"
· rápido
· resultados
comparables a HPLC
· ¿costo?
· disponible
comercialmente de
Pegasus Instruments,
Agincourt, ON, Canadá
Etanol
• El etanol ha sido usado por muchos años como un indicador objetivo para la
calidad de los productos pesqueros
• Puede ser obtenido a partir de carbohidratos por fermentación anaeróbica
(glucólisis), y/o deaminación y decarboxilación de aminoácidos como la alanina, es
un metabolito común a una gran variedad de bacterias
• Ha sido usado para medir objetivamente la calidad de una variedad de pescados,
incluyendo atún enlatado
• El medio más simple y confiable para medir etanol en el tejido de pescado es el
uso del equipo para la prueba de enzima comercial, disponible de Boehringer
Mannheim (Alemania) o de Diagnostic Chemicals (Charlottetown, P.E.I, Canadá)
• La ventaja de emplear etanol como indicador de deterioro es su estabilidad al
calor (a pesar de ser volátil) y puede ser usado para evaluar la calidad de
productos pesqueros enlatados
Las aminas biogénicas: histamina, putrescina y
cadaverina
NH2
N
H2N-(CH2)n-NH2
n=4: Putrescine; n=5: Cadaverina
N
H
u
u
u
u
Histamina
Formada por la decarboxilación de
histidina catalizada por las enzimas de
los microorganismos
Estimula la contracción y relajación del
músculo liso
Estimula neuronas sensoras y motoras
Controla la secreción de ácidos
gástricos
u
u
Formada por la biodegradación de los
aminoácidos ornitina y lisina por la
acción de bacterias de putrefacción
Sobresaturan las enzimas degradantes de
la histamina, realzando el efecto tóxico
de la histamina
amina oxidasa de cobre (AO) Polímero Redox Activo
u
u
u
Fuentes biológicas : bacterias, hongos, plantas,
animales
Funciones biológicas: involucradas enc crecimiento
celular, proliferación and diferenciación
Cofactores:
O
a
b
N
N
H
N
O
N
N
&
HO
(PVI13-dmeOs)
Cu(II)
N
Os2+/ 3+
O
Topa quinona (TPQ)
N
Cobre
Reacción: R-CH2-NH2 + H2O + O2 → R-CHO + NH3 + H2O2
N
Cl N
Mecanismo de trabajo para los electrodos
(monoenzimática)
H
N
N
H2
C C
H2
NH2
Histamine
Electrode
AOox
NH3
H2O
H
N
AOred
N
C CHO
H2
Imidazoleacetaldehyde
2e-
Eappl.= +200 mV
vs. Ag/AgCl
Mecanismo de trabajo para los electrodos
(BIenzimática)
Electrode
H
N
H2
N
C C
H2O
H2
H2N
Histamine
NH3
H
N
N
AOox
(TOPA -native)
H2O2
(Fe3+-
H2O
AOred
(TOPA -inactive)
HRPred
native)
HRPox
(Fe4+ =
2e-
2 Os2+
2 Os3+
O, P+ inactive)
O2
OHC C
H2
Imidazoleacetaldehyde
Electrode type C
Electrode type D
No Os2+/3+
2e-
Eappl.= -50 mV
vs. Ag/AgCl
Muestras de pescado- (turbot)
30
g histamine/kg fish
fish kept at -20°C
fish kept at 25°C
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
Days
•Contenido de histamina de pescado turbot en dos diferentes temperaturas (-20 y 25°C)
analizado por el método de electródo bi-enzimático
Oxidación del producto de la rx de histamina
H2O
+
O2
H
N
AOred
H2
C C
H2
NH2
Histamine
N
NH3
+ H2O2
H
N
Electrode
AOox
N
C CHO
H2
Imidazoleacetaldehyde
H
N
N
C COOH
H2
Imidazoleacetic acid
2e-
Eappl.= +200 mV
vs. Ag/AgCl
+
NH3
NH2
AO
+ O2 + H2O
O
NH2
Putrescine
+ H2O2 + NH4+
- H2O
Putrescina y cadaverina forman
compuestos cíclicos - ¡no se pueden
oxidar más!
N
1-Pyrroline
+
NH3
NH2
Cadaverine
AO
+ O2 + H2O
O
+ H2O2 + NH4+
NH2
- H2O
N
1-Piperideine
ELISA para
identificar
especies
Octopina deshidrogenasa para
medir frescura en escalopas
Ureasa
(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3
• Usada para medir amoníaco
• Amoníaco criterio de calidad microbiana
(tardía) de PM
• En A. clínicos la actividad de ureasa puede ser
indicadora de muchas condiciones patológicas
(piedras en vías urinarias, úlceras y males del
hígado)
Ureasa
• Hay muchos métodos para inmovilizar ureasa
y estimar la urea en muestras de pescado
• Paper usando conjugado de fulereno-ureasa
del 2013 en un electrodo potenciométrico
– óptico[Kovacs, 2003], amperométric [Rajesh ,
2005; Tiwari, 2009;Kuralai 2006 ], térmico[Fulton,
1980; Xie, 1996] conductométrico[Castillo-Ortega,
2002], and potenciométrico [Ahuja, 2008, 2011;
Chen 2009]
Lo cotidiano
• Enzimas comerciales para medir algún
atributo
• Precio $$ y disponibilidad