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Las enzimas como
herramientas analíticas
Dr. José Luis Cárdenas López
Las enzimas como herramientas
analíticas
• Enzimas endógenas
• Enzimas exógenas
• Desarrollo de biosensores
Biosensores
José Luis Cárdenas López
2014
Biosensores
…medir frescura en pescado
• Los metodos convencionales para medir
frescura son tardados y difíciles de llevar a
cabo en la industria de manera rutinaria
• “Biosensores” instrumentos analíticos
compuestos de un elemento biológico de
reconocimiento (enzima, anticuerpo,
receptor, microbio) acoplado a un
transductor químico o físico
Componentes de un biosensor
enzima (a) convierte el sustrato en producto, el transductor (b)
lo convierte en una señal eléctrica. Se amplifica la respuesta (c),
se procesa (d) y se despliega (e).
• El elemento biológico está inmovilizado en
o cerca de la superficie del transductor
• El transductor convierte el evento
bioquímico en una señal eléctrica que se
puede conectar a una computadora o
sistema automático
• Dada la especificidad y sensibilidad de los
sistemas biológicos y la capacidad de
cómputo de los microprocesadores,
prometen revolucionar los metodos de
análisis
Tipos de biosensores
• Electroquímicos (electrodos)
• Masas (cristales o dispositivos de onda
acústica)
• Ópticos (optrodos)
• Térmicos (termosistores o sensores de
calor)
• Inmunosensores
• Los más usados: los electrodos
Potenciométrico
e
(a) membrana semi-permeable que rodea el
biocatalizador,
esta encerrada (b) y proxima a la membrana de
vidrio activado(c)
de un electrodo de pH (d)
el potencial electrico(e)
Se genera entre el electrodo interno de
Ag/AgCl (f) en un bano de HCl diluido
(g) y la referencia externa (h).
h
d
f
g
a
c
b
Tres tipos de electrodos selectivos
a iones
• Electrodos de vidrio para cationes (electrodos normales de pH):
el elemento sensible es una membrana delgada hidratada de vidrio
que genera un potencial eléctrico debido a la competencia
concentración-dependiente entre los cationes por los sitios de
enlace específicos. La selectividad de la membrana se determina
por la composición del vidrio
• Electrodos de vidrio para pH cubiertos de membranas
permeables a gases selectivas para CO2, NH3 or H2S. La difusión
del gas a través de las membranas causan un cambio en pH de una
solución sensible entre la membrana y el electrodo
• Electrodos de estado sólido donde el la membrana de gases se
reemplaza por una membrana específica para iones conductores
hecha de sulfuro de plata y haluros de plata. El electrodo de yodo
es útil para la determinacion de I- en la rx de peroxidasa y también
responde a iones cianuro
Amperométrico
Se aplica un potencial entre el cátodo de platino y el ánodo de plata. Se
genera una corriente (I) que se acarrea entre los electrodos por una solución
saturada de KCl. El electrodo está separado de la enzima (glucosa oxidasa,
GOD) por una membrana delgada, permeable solo al oxígeno
• Muchas enzimas producen o consumen
especies cargadas que pueden ser
monitoreadas por potenciómetros,
amperómetros, medidores de
conductividad
• Los electrodos amperométricos se basan
en la detección de Oxígeno o H2O2
acoplados a un sistema de oxidasas o un
microorganismo aerobiousado en la
industria de bebidas
Masas o cristales
• Cristales Piezo-eléctricos (cuarzo) vibran
bajo la influencia de un campo eléctrico.
La frecuencia de oscilación depende de su
grosor y cortes, teniendo cada cristal una
frecuencia resonante característica
• Esta cambia al adsorber o desorber otras
moléculas en su superficie
• Se puede detectar esas diferencias con un
transductor
Biosensor de formaldehido
• Usando formaldehído dehidrogenasa
inmobilizada cubriendo un cristal de
cuarzo
• Sensible a formaldehído gaseoso
Térmicos
La muestra (a) pasa a través de una caja aislada (b) al intercambiador
de calor (c) dentro de una caja de aluminio (d). Fluye a un termosistor
(e) y a un bioreactor empacado (f, 1ml volumen), que contiene el
biocatalizador, donde ocurre la rx. El cambio en T es determinado por el
termosistor (g) y la solución sale (h). Un dispositivo electronico
determina la diferencia en resistencia entre los termosistores (l)
Los termistores, detectan cambios en temperatura, funcionan cambiando su
resistencia eléctrica con la temperatura en la relación
Por lo tanto,
R1 y R2 resistencias de los termosistores a temp absolutasT1 and T2
respectivamente y B es una constante para el termosistor.
Reactante
Enzima
Salida de calor
-∆
∆H (kJ mol-1)
Colesterol
Colesterol oxidasa
53
Esteres
Quimiotripsina
4 - 16
Glucosa
Glucosa oxidasa
80
Peróxido de
Hidrógeno
Catalasa
100
Penicilina G
Penicilinasa
67
Péptidos
Tripsina
10 - 30
Almidón
Amilasa
8
Sacarosa
Invertasa
20
Urea
Ureasa
61
Ácido Úrico
Uricasa
49
Biosensores
Amperométricos para
enzimas flavo-oxidasas
(a) Primera generación.
Electrodo utilizando el
H2O2 producido en la rx
(E0 = +0.68 V).
(b) Segunda generación
electrodo utilizando un
mediador (ferrocene)para
transferir los electrones
por la rx. (E0 = +0.19 V).
(c) Tercera generación
usando directamente los
electrones producidos en
la rx (E0 = +0.10 V)
Ópticos
• Cambios en la absorción de luz entre
reactantes y productos de la reacción o bien
medir la producción de luz por un proceso de
luminiscencia
• Tiras de papel
• El mas común es un kit para diabetes. Incluyen
tiras con peroxidasa y un cromógeno ( otoluidina o 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). El H2O2
producido por la oxidación aeróbica de la
glucosa oxidará el cromógeno a una coloración
intensa
•
peroxidasa
cromogeno(2H) + H2O2 colorante + 2H2O
Medidor de glucosa
luciérnagas
Luciferasa de luciérnagas
• EC 1.13.12.7 para detectar presencia de
bacterias en alimentos o muestras clínicas
• ATP liberado al lisar las bacterias reacciona con
la D-luciferina y el O2 y produce luz amarilla
luciferasa
ATP + D-luciferin + O2 oxyluciferin + AMP + pyrophosphate + CO2 + light (562
nm)
• La luz se detecta con un espectrofotómetro
• La luciferasa de las luciérnagas es cara
(inmobilizar)
ELISA
Principios de ELISA
• (i) Anticuerpos inmobilizados en un tubo, Una
mezcla de conjugados antígeno-enzima mas
una concentración no conocida de antígeno se
ponen en el tubo y se dejan equilibrar.
• (ii) Después de un período el antígeno y el
conjugado antígeno-enzima se distribuirán entre
los estados unidos y no unidos dependiendo de
sus concentraciones.
• (iii) Se lava el material no unido. La cantidad de
conjugado antígeno-enzima se puede
determinar por la velocidad de la Rx enzimatica
subsecuente
Inmunosensores
• (a) el biosensor reemplaza el método de
detección colorimétrico
• (b) detección directa del antígeno unido a
la superficie recubierta de anticuerpos del
biosensor
Aplicaciones
•
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•
Análisis proximal
Etiquetado nutricional
Determinación de pesticidas
Toxinas y antinutrientes
Cambios en el procesamiento
Contaminación microbiana
Inactivación de enzimas
Demanda biológica de oxígeno
Glucosa y lactato, Yellow
springs
•
•
•
•
Detección electroquímica
Muy rápido (<1 min) y preciso
Volumen de muestra muy pequeño
Hospitales
Otro biosensor exitoso
En productos marinos…
• El elemento biológico mas empleado: las
enzimas
• El uso de enzimas directamente tiene
inherentes algunos problemas, cofactores,
inestabilidad, etc. lo que hace a los
biosensores una alternativa viable
• Los primeros se experimentaron en los
80’s por Watanabe, en la determinación
de frescura (para Hx) xantina oxidasa
inmovilizada en una sonda de oxígeno
Biosensor de frescura
• La enzima se inmovilizó en una membrana
preparada de triacetato de celulosa
• El Hx se oxida a acido úrico y H2O2 por la
enzima inmovilizada, la respuesta y corriente de
oxigeno se disminuye debido al consumo de
oxígeno
• Una relación lineal se obtiene entre la [Hx] y la
disminución de oxígeno en un rango específico.
• Se puede usar 100 veces el sensor y se puede
tener 30 días a 5oC
“Freshometer”
Frescómetro
Otros biosensores para frescura
• Método para frescura, electrodo de xantina
oxidasa, inmovilizada en membrana de seda
con alambre de cobre y disco de platino
• Sensible a Hx, medir frescura (Shen, 1996)
• Otro para Hx /(Hx+IMP+HXR), electrodo
amperométrico usando xantina oxidasa
inmovilizada, detectando H2O2 y urea, durante la
oxidación de Hx, inyectando nucleósido
fosforilasa y fosfato se obtiene HXR y
nucleosidasa para IMP, obteniendo valores de K
comparables a los instrumentales (Luong, 1992)
• Para bases volátiles, un electrodo
selectivo para iones de amoniaco que
también puede ser usado para TMA
(Pivarnik, 1998)
• Biosensor de poliaminas, usando
putrescina oxidasa inmovilizada en
electrodos de H2O2 , detecta consumo de
oxígeno y correlaciona con
concentraciones de histamina, cadaverina
y putrescina a ciertos niveles. Estable por
2 meses a 5oC, 60 ensayos
Otros biosensores
• Octopina en escalopas, se forma de la Arg y el
ac pirúvico, se acumula 1% en 5 días de
enhielado de la escalopa. Sensor de octopina
basado en octopina deshidrogenasa y piruvato
oxidasa. El ac pirúvico se oxida por la pox a
acetil fosfato, se mide el consumo de hidrógeno
y esto correlaciona con el contenido de octopina
(indicador de frescura en escalopas) (Shin,
1998)
• Urea en músculo de elamobranquios
(Sheppard, 1996)
Detección amperométrica de urea
• Glicerol y triglicéridos. Un biosensor
amperométrico usando glicerol
deshidrogenasa (GDH) y lipasa, la
oxidación del glicerol produce NADH, el
cual se mide con un electrodo de Ag
/AgCl, la GDH se inmoviliza en un
electrodo de carbono (Laurinavicius, 1996)
Disponibilidad comercial
• A pesar de estar bien estudiados en las
ultimas dos decadas, no han sido
totalmente aceptados todavía en la
industria
• Las técnicas de HPLC para calcular los
índices K siguen siendo el estandar
• Los medidores de glucosa para los
diabéticos son los biosensores mas
exitosos hasta el momento
• KV101 “Frescómetro” Japón, se usa para
Macarela, Sardina y Herring
• “Microfresh”
• Sigma (USA) produce uno para
estimación de etanol