Download Apoyo 2 - Unizar

Biosensores
“Instrumentos analíticos que transforman
procesos biológicos en señales eléctricas u
ópticas y permiten su cuantificación”
La nariz como biosensor
muestra
Aparato
medidor
Detector biológico
Transductor
Célula nerviosa
Membrana
olfatoria
Cerebro
Biosensores
Analito
(sustrato)
Elemento biológico
de detección
Procesador de la señal
Señal
Transductor
Elemento detector que responde al sustrato que se está midiendo es biológico en su naturaleza
Capa delgada de material biológico activo en contacto con transductor eléctrico
Transductor convierte cambio observado (físico/químico) en señal cuantificable
Señal electrónica con magnitud proporcional a concentración de un compuesto específico
Especificidad y sensibilidad de sistemas biológicos con poder informático de microprocesador
Ann NY Acad Sci, 1962
Nature, 1967
El analito o sustrato
cualquier sustancia consumida o producida en un proceso biológico
paracetamol
etanol
ácido láctico
aspirina
azucares
urea
TNT
fosfato
ácido glutámico
colesterol
creatina
penicilinas
aminoácidos
El componente biológico
Interacción con el sustrato altamente específica
Evitando interferencias de otras sustancias
Catalización de la reacción (más común)
Unión selectiva al sustrato
Otros componentes que contienen enzimas como:
Microorganismos (levaduras y bacterias)
Material tisular (plátano o hígado)
Anticuerpos
Ácidos nucleicos
El componente biológico
VENTAJAS
Alta especificidad
Discriminación
Detección en mezclas complejas
Estructura
Concentraciones
Sin tratamiento previo
Métodos de inmovilización
Componente biológico siempre en contacto íntimo
con el transductor
Unión covalente o no covalente
Membrana delgada recubriendo superficie de detección
Distancia entre lugar de reacción y lugar donde ocurre la
transducción eléctrica
Adsorción a la superficie (más simple)
Microencapsulación (membranas)
Atrapamiento (matriz de gel, pasta o polímero)
Unión covalente (enlaces químicos entre componente
biológico y transductor)
Entrecruzamiento (agente bifuncional)
Factores de rendimiento
Selectividad
Característica más importante
Discriminación entre sustratos
Función del componente biológico
Sensibilidad
Normalmente rango sub-milimolar (10-3 M)
Casos especiales fentomoles (10-15 M)
Precisión
Alrededor de ± 5 %
Factores de rendimiento
Naturaleza de la solución
pH
Temperatura
Fuerza iónica
Tiempo
Tiempo de respuesta más largo que sensores
químicos (30 seg)
Tiempo de recuperación (pocos minutos)
Vida útil por inestabilidad del material
biológico (días a meses)
BIOSENSORES
•
Utilizan la especificidad de los procesos biológicos:
–
–
–
–
Enzimas
x
Sustratos
Anticuerpos
x
Antígenos
Lectinas
x
Carbohidratos
Complementariedad de ácidos nucleicos.
•
Ventajas:
–
–
–
–
•
Reutilización
Menor manipulación
Menor tiempo de ensayo
Repetitividad
Tipos y usos mas comercializados:
1.
2.
Tiras colorimétricas
Electroquímicos:
•
•
3.
Potenciométricos: Glucosa, Lactato, Glicerol,
Alcohol, Lactosa, L-aminoácidos, Colesterol
Amperométricos: Glucosa, Sacarosa, Alcohol
Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.
Propiedades de un buen Biosensor
BIOSENSORES
1.
2.
3.
4.
5.
Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas.
Consultas y Urgencias Hospitalarias:
–
Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales
–
Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento
–
Menor riesgo de deterioro de la muestra
Diagnóstico Doméstico:
•
Ensayos de Embarazos
•
Control de Glucosa en diabéticos
Aplicaciones in vivo:
–
Páncreas artificial
–
Corrección de niveles de metabolitos
–
Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad
Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales:
–
Alimentación
–
Cosmética
–
Control de Fermentaciones
–
Controles de Calidad
–
Detección de Explosivos
–
Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas
–
Control de polución.
TIPOS DE BIOSENSORES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS
– Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los
electrones involucrados en procesos redox
– Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones
– Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados
con cambios en el ambiente iónico de las soluciones
BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS
BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS
BIOSENSORES ÓPTICOS
– De onda envanescente
– Resonancia de plasma superficial
BIOSENSORES CELULARES
INMUNOSENSORES
UNIDADES FUNCIONALES
DE UN BIOSENSOR
Material biológico + Analito
Analito unido
Respuesta biológica
Respuesta Electrónica
Respuesta
electrónica
=
(Máxima respuesta electrónica posible) x (Concentración del analito)
(Constante de semisaturación) + (Concentración del analito)
Cinéticas de reacción en biosensores
Biosensores Electroquímicos
Amperométricos
electrodo de oxígeno
Biosensores Electroquímicos
Amperométricos
electrodo de oxígeno
Reacciones redox catalizadas por enzimas
Voltaje constante entre dos electrodos
Corriente debida a la reacción de los electrodos
Electrodo de Oxígeno
En este principio se basa el
primer y más sencillo
biosensor
Determinación de glucosa
Electrodo de oxígeno de
Clark
Electrodo de Oxígeno
(A) Disco de resina epoxy
(B) Cátodo de platino en el centro de un saliente.
(C) Ánodo de plata en forma circular
(D) Anillo de goma que sostiene un papel
espaciador empapado en un electrolito y una
membrana de polytetrafluoroethylene que separa
los electrodos de la mezcla de reacción.
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
La glucosa se determina por la disminución de la
concentración de oxígeno molecular disuelto
cuando la glucosa oxidasa cataliza la reacción redox
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
Electrodo de oxígeno
O2 + 2 H2 O + 2 e2 H2 O2 + 2 e-
H2 O2 + 2 OH2 OH-
Entre el cátodo central de
platino y el ánodo circundante
de plata se aplica un potencial de
0.6 voltios.
El circuito se cierra con solución
saturada de KCl.
Cát odo ( Pt )
Puent e de KCl
4 e- +
0 ,6 - 0 ,7 v
4 Ag
4 Ag + + 4 Cl-
Anodo ( Ag)
4 Ag + + 4 e-
4 AgCl
El oxígeno molecular disuelto se
reduce en el cátodo de platino.
Se liberan electrones y se
produce corriente eléctrica que
se puede medir.
DETERMINACIÓN DE SACAROSA
Glucosa
Sacarosa
O2
Glucosa
Fructosa
D-gluconolactona
H2O2
respuesta
glucosa
sacarosa
tiempo
flujo
Electrodo
Invertasa Glucosa-oxidasa
DETERMINACION DE
LA FRESCURA DEL PESCADO
DETERMINACION DE
LA FRESCURA DEL PESCADO
Tras la muerte, los nucleótidos del pescado sufren una serie de
reacciones de degradación progresiva:
ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico
La acumulación de inosina e hipoxantina respecto de los nucleótidos es un
indicador del tiempo que hace que el pez murió y de sus condiciones de
conservación, por tanto, de su frescura.
DETERMINACION DE
LA FRESCURA DEL PESCADO
BIOSENSOR:
xantina-oxidasa y nucleósido-fosforilasa inmovilizadas sobre
una membrana de triacilcelulosa de un electrodo de oxígeno
K < 20
20 > K < 40
K > 40
El pescado puede ser comido crudo
El pescado debe ser cocinado
Pescado no apto para el consumo
Los nucleótidos se podrían determinar utilizando el mismo electrodo y
muestra, pero añadiendo nucleotidasa y adenosín-deaminasa
DETERMINACION DE
LA FRESCURA DEL PESCADO
ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico
Ensayo simple para determinar de forma segura y fiable la
frescura del pescado, que tiene gran importancia para la
industria.
La determinación de frescura en las inspecciones sería
completamente subjetiva.
Biosensores Electroquímicos
Amperométricos
Ventaja:
Fáciles de fabricar.
Desventajas:
Reacción dependiente de concentración de oxígeno.
Ambientes anaerobios.
Otros procesos redox. Oxidación/reducción de
vitamina C. Interferencia.
Sustitución del oxígeno por otras sustancias.
La reacción mediada por el biosensor está
compuesta por tres procesos redox
sustrato
+
enzima (oxidada)
enzima (reducida)
+
mediador (oxidado)
reacción enzimática
reacción enzimática
reacción electrodo
mediador (reducido)
producto
+
enzima (reducida)
enzima (oxidada)
+
mediador (reducido)
mediador (oxidado)
+
e-
Mecanismos redox para diferentes configuraciones
de biosensores amperométricos
Mediadores redox en
biosensores
amperométricos
Oxidasas más especfíicas para el
reactivo a oxidar
Rápidas velocidades de transferencia
de electrones
Capacidad para ser regenerados
fácilmente
Retenibles en membrana biocatalítica
No reaccionar con otras moléculas,
incluyendo oxígeno molecular
Mediadores redox en
biosensores
amperométricos
Tetracianoquinodimetano
aceptor parcial de electrones
Ferroceno, tetratiofulvaleno y
N-metil fenazinio donantes
parciales de electrones
Hidroquinona y ferrocianuro
mediadores solubles
Biosensor que detecta concentración
de glucosa en sangre.
Construido y vendido para el control
de los enfermos diabéticos.
Área de detección dispositivo con electrodo de un solo uso
Deposición sobre una tira de plástico. Consta de electrodo de referencia
Ag/AgCl y electrodo de carbono con glucosa oxidasa y mediador de
ferroceno
Ambos electrodos cubiertos con tejido hidrofílico. Paso de moléculas de
diferente tamaño, difusión homogenea, evita evaporación desigual
Duración 6 meses
Detección 2-25 mM en una gota de sangre
Resultado en 30 segundos
Miniaturización
Posible por la capacidad
del pirrol para
polimerizar mediante
oxidaciones
electroquímicas en
condiciones
suficientemente suaves
como para atrapar
enzimas y mediadores
sin desnaturalizarlos
Microelectrodo glucosa/lactato
Se puede recubrir la superficie de pequeños electrodos polimerizando
pirroles junto con biocatalizadores y mediadores, utilizando métodos de
microfabricación de microprocesadores, e incluso disponiendo varios
sensores en los mismos
Biosensores Electroquímicos
Potenciométricos
Determinan cambios en la concentración de
iones concretos
Biosensores Electroquímicos
Potenciométricos
Usan electrodos selectivos para ciertos iones
Electrodos ion-selectivos. pHmetro
Baratos
Determinación de varios analitos
Mayor velocidad
Muy poca muestra
Necesidad de compensación de la temperatura
Biosensores Potenciométricos
Biosensor Potenciométrico
Biosensores Electroquímicos
Conductimétricos
Detectan cambios en conductividad eléctrica
causados por alteraciones en la
concentración de iones
Biosensores Electroquímicos
Conductimétricos
En muchos procesos biológicos se producen cambios
en concentraciones iónicas
Estos cambios pueden ser usados por biosensores
que detecten cambios en la conductividad eléctrica
Sensor de Urea
NH2CONH2 +3H2O
Ureasa
2HN 4 + + HCO3- + OHUreasa inmovilizada
Cirugía renal y diálisis
Reacción provoca gran
cambio en concentración
iónica
Sensor de Urea
Un campo alternante entre
dos electrodos permite la
determinación de los
cambios en conductividad,
evitando procesos
electroquímicos no
deseados
Electrodos dispuestos para
ocupar mínimo espacio
0.1 y 10 mM de urea
Sensor de Urea
NH2CONH2 +3H2O
Ureasa
2HN 4 + + HCO3- + OHOtros ejemplos:
amidasas,
decarboxilasas,
esterasas,
fosfatasas y
nucleasas.
Biosensores Termométricos
“Sensores bioquímicos y TELISA”
La producción de calor es una propiedad general de
muchas reacciones enzimáticas
Base de los biosensores calorimétricos o térmicos
Biosensor
termométrico
Biosensor
termométrico
Los cambios ambientales no
afectan a los cambios de
temperatura detectados
Reacción confinada en
dispositivos termoaislados (a)
Precisa un aislamiento
correcto
La corriente del analito pasa a
través de un intercambiador
de calor (b)
Biosensor
termométrico
La reacción tiene lugar en un
pequeño reactor (c)
La diferencia en temperatura del
analito que entra y el producto
que sale es determinada por los
termistores interconectados (d)
Diferencia habitual de una
fracción de grado centígrado
Diferencias de hasta 0.0001ºC
Reacciones usadas en biosensores
termométricos
Biosensores Termométricos
Poco éxito comercial en comparación con otros
biosensores
Ventajas:
Se puede acoplar fácilmente varias reacciones
en un único reactor
Producir reacciones que actúan sobre los
productos de la reacción principal
Coinmovilizando otras enzimas
Introduciendo más reactivos en la corriente a
analizar
Biosensores Termométricos
Detector de Lactato
La sensibilidad a lactato se incrementa por
coinmovilización de lactato deshidrogenasa con
lactato oxidasa
Reciclaje de productos de la primera reacción
del sustrato
lactato oxidasa
lactato + O2 -----------------------> piruvato + H2O
lactato deshidrogenasa
piruvato + NADH + H+ --------------------------> lactato + NAD+
Biosensores Termométricos
Más ventajas:
Puede utilizarse células viables
Uso de células viables inmovilizadas en un
reactor, no sólo para producir bioconversiones,
sino para controlar la presencia de un sustrato
metabolizable en la corriente a analizar
Análisis de la presencia de materiales tóxicos en
una muestra, ya que afecta la tasa metabólica de
las células inmovilizadas sobre un determinado
sustrato
Biosensores Termométricos
Más ventajas:
Puede acoplarse a un inmunoensayo enzimático
ELISA termométrico o TELISA
Mezcla antígeno no marcado (analito) y antígeno marcado
enzimáticamente en concentraciones conocidas junto con un
reactor en el que se ha depositado una capa de inmunoadsorbente
Aumento en cantidad de antígeno no marcado desplaza al antígeno
marcado de la unión a la capa del reactor por competición
La cantidad de antígeno marcado que queda en el reactor se puede
determinar por adición a la corriente que pasa por él del sustrato de
la enzima que marca el antígeno y midiendo la cantidad de calor en
la reacción enzimática
Biosensores Piezoeléctricos
“Narices bioelectrónicas”
Biosensor de
fibra óptica
para lactato
• Detecta cambios en la en
la concentración de
oxígeno determinando la
reducción de la
fluorescencia de un
fluorocromo (quenching)
Biosensor de célula óptica para
albúmina sérica
• Detecta la absorción de luz a
630 nm que pasa a través de la
célula detectora.
• Se evalúa el cambio de
amarillo a azul verdoso del verde
de bromocresol cuando se une a
la albúmina sérica a pH 3.8
• Respuesta lineal a la albúmina
en un intervalo de 5 a 35 mg/cm3
Biosensores Ópticos
1) Detección de Vapores:
• Ensayo sólido colorimétrico que detecta vapor de
alcohol utilizando alcohol-oxidasa, peroxidasa y 2,6diclorindofenol sólidos dispersados sobre placas de TLC
(cromatografía en capa fina) de celulosa microcristalina
transparente.
2) Tiras colorimétricas de un solo uso:
• Los más utilizados: análisis de sangre y orina.
• Control de la glucemia en diabéticos
- Glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano y un
cromógeno que cambia el color al ser oxidado
Cromógeno (2H) + H2O2----(peroxidasa)--->colorante + 2H2O
Biosensores Ópticos
3) Reacciones luminiscentes:
• Utilización de luciferasa
• Detecta la presencia de microorganismos en orina al
liberar ATP en su destrucción
Luciferina + ATP----(luciferasa)---> oxiluciferina + CO2 + AMP + ppi + luz
Biosensores Ópticos
Onda evanescente
• Se basa en un fenómeno conocido como
reflexión interna total de fluorescencia,
que consiste en la absorción y emisión de
fotones.
Biosensores Ópticos
Onda evanescente
• En este sensor una radiación que viaja a través
de una guía de ondas por reflexión interna
total crea un campo electromagnético
denominado campo evanescente, que puede
penetrar una determinada distancia desde la
superficie dependiendo del ángulo de
incidencia en la interfase y la longitud de
onda de la radiación de excitación.
Biosensores Ópticos
Onda evanescente
• Cualquier interacción molecular que se
produzca en este campo (como la unión
de un analito a un receptor inmovilizado
en la superficie de la guía de ondas)
produce cambios en las características de la
luz que se propaga por la guía de ondas
que pueden medirse y relacionarse con la
concentración de analito.
Biosensores Ópticos
Onda evanescente
• Es necesario utilizar marcaje con
moléculas con propiedades fluorescentes.
• Permite una detección directa, rápida y
selectiva del analito.
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“Un haz de luz será reflejado en su totalidad cuando incida
sobre una superficie transparente presente entre dos medios,
cuando proceda del medio con mayor índice de refracción y
cuando el ángulo de incidencia sea mayor que un valor critico”
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“En el punto donde se produce la reflexión, se induce un campo
electromagnético que penetra en el medio que tiene menor
índice de refracción”
“Este campo es denominado onda evanescente y decae
exponencialmente con la distancia de penetración,
desapareciendo tras unos pocos nanómetros”
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“La onda evanescente decae exponencialmente con la distancia
de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros”
“La profundidad a la que penetra depende del índice de
refracción, de la longitud de onda de la luz utilizada y puede ser
controlada con el ángulo de incidencia.
Biosensores ópticos de onda evanescente
Menor índice de refracción >
Mayor índice de refracción >
“La onda evanescente puede interaccionar a su vez con el
medio, provocando un campo electromagnético que puede
volver al medio con mayor índice de refracción, dando lugar a
cambios en la luz que continúa a lo largo de la guía de ondas.”
Inmunosensor de onda evanescente
Especialmente indicados para
inmunoensayos:
• No es necesario separar el resto
de los componentes de una muestra
clínica
• La onda solo penetra hasta el
complejo antígeno anticuerpo
• Se excitan fluorocromos unidos a
la superficie mediante la onda
evanescente, y la luz emitida por
ellos volverá a la fibra óptica
• La cantidad de muestra necesaria
es mínima
Biosensores Ópticos
Resonancia de plasmones superficiales
• Los plasmones son oscilaciones colectivas de los
electrones de conducción de un metal.
• La resonancia de plasmones superficiales es un
fenómeno óptico que ocurre cuando una luz
polarizada se dirige desde una capa de mayor
índice de refracción (un prisma) hacia una de
menor índice de refracción, que en este caso es
una capa metálica, de oro o de plata, que se sitúa
entre el prisma y la muestra.
Biosensores Ópticos
Resonancia de plasmones superficiales
• La luz que incide en la interfase entre el
metal y el prisma provoca la excitación de
un plasmón superficial para un
determinado ángulo de incidencia de dicha
luz, llamado ángulo de resonancia.
Biosensores Ópticos
Resonancia de plasmones superficiales
• El ángulo de resonancia depende
fuertemente del índice de refracción del
medio colindante a la lámina metálica, por
lo que las variaciones que se produzcan en
el mismo van a ser detectadas como
cambios del ángulo de resonancia y este
cambio es proporcional a la concentración.
Biosensores Ópticos
Resonancia de plasmones superficiales
• La unión de los analitos al elemento de
reconocimiento supone un cambio de
índice de refracción sobre la superficie del
metal y, como consecuencia, un
desplazamiento del ángulo de resonancia.
Biosensores Ópticos
Resonancia de plasmones superficiales
• Esto permite realizar medidas directas
en tiempo real, sin marcaje, así como el
análisis de muestras complejas sin
purificación previa.
Resonancia de plasma superficial
“Si la superficie del cristal está recubierta por una capa metálica
(oro, plata, paladio) los electrones de su superficie pueden
oscilar en resonancia con los fotones generando un onda de
plasma superficial y amplificando el campo evanescente en la
cara mas alejada del metal”
Resonancia de plasma superficial
“Si la capa de metal es lo suficientemente delgada como para
permitir al campo evanescente penetrar hasta la superficie
opuesta, el efecto será muy dependiente del medio adyacente al
metal”
Resonancia de plasma superficial
“Este fenómeno sucede sólo cuando la luz incide con un ángulo
específico, el cual depende de la frecuencia, el grosor de la capa
metálica y el índice de refracción del medio que se encuentra
inmediatamente sobre la superficie metálica”
Resonancia de plasma superficial
“La producción de esta resonancia de plasma superficial
absorbe parte de la energía de la luz reduciendo la intensidad de
la luz reflejada internamente”
Resonancia de plasma superficial
“Los cambios que suceden en el medio provocados por
interacciones biológicas pueden ser apreciados detectando los
cambios de intensidad de la luz reflejada o el ángulo de
resonancia”
Cambio en la absorción por efecto de
la resonancia de plasma superficial
“Detección de la
gonadotropina
coriónica humana
(hCG) mediante un
anticuerpo unido a
la superficie del
biosensor:
La unión causa un
cambio en el
ángulo de
resonancia”
Resonancia de plasma superficial
•
•
•
Permiten detectar partes por millón
Un análisis típico requiere 50µl de muestra y tarda 5 a 10 minutos
Puede utilizarse con DNA y RNA.
Biosensores celulares
• Las células microbianas, como biocatalizadores,
poseen ciertas ventajas sobre las enzimas
purificadas cuando se usan en biosensores:
• Baratos
• Vida media más larga
• Menos sensibles a inhibición, al pH y a
temperatura
• Capacidad autorregenerativa
Biosensores celulares
• Desventajas:
• Más lentos en respuesta
• Más lentos en velocidad de recuperación
• Menor selectividad
• Fácilmente disgregables
• Condiciones más suaves
Biosensores celulares
• Muy útiles cuando se requieren
varios pasos o la presencia de
coenzimas
• Células vivas o muertas
Biosensores celulares
Inmunosensores
Tipos de
inmunosensores
Nanobiosensores en el Campo de la Medicina
Nanobiosensores en urgencias
Nanobiosensores en la consulta