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CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA ENZIMÁTICO PARA LA
PRODUCCIÓN DE ALQUILGLICÓSIDOS A ALTA TEMPERATURA
INTRODUCCIÓN
RESULTADOS
Los alquilglicósidos son un grupo de surfactantes no iónicos que
presentan una buena estabilidad química en un amplio intervalo de
pH, presentan una importante actividad antimicrobiana y son
biodegradables. Algunos de ellos se han empleado como
intermediarios en la síntesis enzimática de sus ésteres, aumentando
su espectro de acción. Por su parte, los heptilglicósidos se pueden
sintetizar
enzimáticamente
mediante
una
reacción
de
transglicosidación en medio orgánico bifásico. En este caso la
partición de los componentes del sistema, el contenido de agua, la
solubilidad del alcohol en la fase acuosa y la del agua en el heptanol,
juegan un importante papel en el rendimiento. Para el caso de la
lactosa García y col.,* demostraron que en un sistema con bajo
contenido de agua y alta temperatura (90°C), la transglicosidación
domina a la hidrólisis. No obstante, se plantea que la reacción está
limitada por un fenómeno de inhibición por producto.
La reacción de interés se muestra en la figura siguiente:
O
Lactosa
OH
+
β-Glicosidasa
OH
Heptanol
O
OH
+
O
HT
Heptilgalactósido
Gal + Glu
Enzima + Glucosa
Oscurecimiento no enzimático
Fig. 1. Esquema de las principales reacciones que tienen lugar en el sistema
heptanol:agua (93:7% v/v) a 90°C. Lac, lactosa; Glu, glucosa; Gal, galactosa;
E-Gal; complejo enzima-galactosa.
METODOLOGÍA
CENTRO
Concentración [mM]
Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo es aportar elementos
que permitan entender el comportamiento del sistema con bajo
contenido de agua y emplear este conocimiento para identificar las
causas que limitan el progreso de la reacción.
35
60
30
55
12
50
45
10
40
8
35
30
6
25
20
4
15
2
0
Fase orgánica
Adicionar estándar
interno
10
5
0
1
2
3
Determinar proteína
soluble (Lowry)
Reconstituir la muestra
en la fase móvil
CH3OH: H2O (75:25)
Concentración [mM]
Extraer carbohidratos y
enzima con un vol.
equivalente de buffer
45
25
40
35
20
30
15
25
20
10
15
10
5
0
Analizar carbohidratos
por HPLC-ELSD
(Columna aminada)
55
Filtrar a través de una
membrana con diámetro
de poro de 0.45 µm
5
0
1
2
3
4
0
300
400
nm
Fig. 3. Evaluación del color generado en función del
contenido de agua.
En la figura 2 se observa un patrón similar en la rapidez de síntesis
del heptilgalactósido para el centro y el fondo del reactor en un
intervalo de tiempo de una hora. Sin embargo, el agua coalesce
hacia el fondo del reactor favoreciendo la hidrólisis de la lactosa
sobre la transglicosidación al presentarse una región “enriquecida”
en agua. Como consecuencia de la coalescencia
y por ende la
ausencia de enzima, la reacción en el centro del reactor se detiene.
Debido a la conjunción de una alta concentración de glucosa así
como de enzima, aunado a la alta temperatura, se observó un
progresivo oscurecimiento no enzimático en el fondo del reactor
(Fig. 3).
CONCLUSIONES
() Glucosa
() β-Glicosidasa
FONDO
55
Evaporar el heptanol a
presión reducida
200
() Lactosa
60
35
Extracción pigmento
Barrido espectral UV-VIS
0.5
0.00
()Heptilgalactósido
4
tiempo (horas)
30
Fondo del reactor
1.5
1.0
Heptanol
Fase dispersa
Glu
Gal
(fondo)
E-Gal
Oligosacáridos
H2O
En este tipo de estudios a condiciones extremas (sistema
heptanol:agua (93:7) a 90°C), resulta muy díficil mantener una
buena reproducibilidad. Por ejemplo, es complicado determinar la
concentración inicial de agua o lactosa agregados.
Tomar muestras de
1mL del fondo y centro
reactor
2.0
A
Heptilgalactósido
Lac
5% agua
6% agua
7% agua
2.5
Heptanol
O
Glucosa
3.00
Heptilgalactósido
E-Gal
Glu
Concentración de Proteína [µg/mL]
O
O
Lac
Concentración de Proteína [µg/mL]
OH
OH
Fase orgánica
(centro)
Heptanol
()Heptilgalactósido
() Lactosa
() Glucosa
() β-Glicosidasa
tiempo (horas)
!   Se demostró que el sistema heptanol:agua (93:7% v/v) es un
sistema metaestable que tiende a la separación de las fases y por lo
tanto a la partición de los componentes del sistema hacia la fase
acuosa dispersa. Esto explica que la transglicosidación de la lactosa en
la fase orgánica se detenga en un intervalo corto de tiempo, poniendo
en entredicho la inhibición por producto previamente reportada*.
!   En la fase orgánica preferentemente se lleva a cabo la reacción de
transglicosidación de la lactosa (heptilgalactósido:glucosa, 1:1).
!   La formación de oligosacáridos en la fase acuosa dispersa indica que
los carbohidratos compiten para aceptar el complejo enzima-galactosa
con el heptanol que se encuentra en menor concentración debido a su
baja solubilidad en el agua.
!   Los productos de Maillard debido a la alta temperatura podrían ser la
causa de la disminución de la concentración esperada de glucosa y
enzima en el fondo del reactor.
*García,
G.M., López-Munguía, C.A., and Bárzana, G.E. 2000. “Alcoholisis and
reverse hydrolysis reactions in organic one-phase system with a
hyperthermophilic β-glycosidase” Biotechnol. Bioeng. (69), 627-632.
Fig. 2. Progreso de la reacción en el centro y fondo del reactor.
Cuantificar
alquilglicósidos por
HPLC-ELSD
(Columna C18)
Carmina Montiel Pacheco, Sandra Pérez Munguía, Eduardo Bárzana García
Departamento de Alimentos y Biotecnología, Facultad de Química
Universidad Nacional Autónoma de México