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EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE
GALACTOOLIGOSACÁRIDOS A PARTIR
DE MATERIAS PRIMAS LÁCTEAS CON
- GALACTOSIDASA INMOVILIZADA
FELIPE ANDRÉS GUÍO VILLARREAL
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Bogotá D.C., Colombia
2014
EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE
GALACTOOLIGOSACÁRIDOS A PARTIR
DE MATERIAS PRIMAS LÁCTEAS CON
- GALACTOSIDASA INMOVILIZADA
FELIPE ANDRÉS GUÍO VILLARREAL
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ingeniería Química
Director (a):
D. Sc., M. Sc., I. Q., Juan Carlos Serrato Bermúdez
Codirector (a):
M. Sc., Q. F., I. Q., Óscar Fernando Sánchez Medina
Línea de Investigación:
Bioprocesos
Grupo de Investigación:
Procesos Químicos y Bioquímicos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Bogotá D.C., Colombia
2014
Never regard study as a duty, but as the
enviable opportunity to learn to know the
liberating influence of beauty in the realm of
the spirit for your own personal joy and to the
profit of the community to which your later
work belongs
Albert Einstein
Agradecimientos
Quiero agradecer a Dios por la oportunidad y las enseñanzas de la Maestría. A mis
padres y mi familia por su incondicional apoyo. A los profesores Juan Carlos Serrato B. y
Óscar F. Sánchez M, por su confianza y orientación a lo largo de todo el proyecto. A
Diana Morales por su sincero apoyo, ánimo y sabios consejos para la vida personal y
profesional. A mis amigos y compañeros del posgrado Juan Pablo Aristizábal, Mónica
Casas, Andrés Altamar, Félix Sáenz, Iván Sánchez, Raúl Rodríguez, Jairo Durán,
Fernando Córdoba, Sandra Rodríguez, Luis Miguel Serrano y Liliana Ardila por su valiosa
ayuda. Al personal administrativo del Laboratorio de Ingeniería Química
Resumen y Abstract
IX
Resumen
Galacto-oligosacáridos (GOS) son prebióticos que se utilizan en las formulaciones de
alimentos funcionales. Estos compuestos se producen durante la hidrólisis de lactosa por
galactosidasa. En este estudio se evaluó la producción de GOS usando lactosa y
lactosuero deshidratado (lactosuero) con la enzima Lactozym 6500 L libre e inmovilizada.
La síntesis se realizó a 30, 40 y 50 ° C, pH 5.5, 6.0 y 6.5, concentración de lactosa 300,
400 y 500 g L-1, y relación en peso enzima / lactosa de 1.00, 1.25 y 1.50. La galactosidasa se inmovilizó por atrapamiento en alginato de calcio y unión covalente en
sílica gel 60. Ambas enzimas inmovilizadas se caracterizaron con o-nitrofenol--Dgalactopiranósido (ONPG), antes de la producción de GOS para determinar la retención
de la actividad. El rendimiento de producción de GOS obtenidos para la enzima libre fue
de 32,7% y 24,5% con lactosa y lactosuero, respectivamente. La inmovilización sobre
sílica gel tratada mostró una retención de actividad enzimática del 41,8%, en
comparación con la técnica de atrapamiento con sólo el 18,4%
Palabras
clave:
Galacto-oligosacáridos,
inmovilización de enzimas
.
-galactosidasa,
prebióticos,
Resumen y Abstract
XI
Abstract
Galacto-oligosaccharides (GOS) are prebiotics used in functional food formulations.
GOS are produced during lactose hydrolysis by -galactosidase. In this study GOS
production was evaluated using lactose or dry whey with Lactozym 6500 L free and
immobilized. The synthesis was performed at 30, 40 and 50°C, pH 5.5, 6.0 and 6.5, and
enzyme:lactose weigth ratio: 1.00, 1.25 and 1.50. -galactosidase was immobilized by
entrapment in calcium alginate and covalent union in silica gel 60. Both immobilized
enzymes were characterized with ONPG before GOS production to determine activity
retention. The obtained GOS yield for free enzyme was 32.7% and 24.5% using lactose
and dry whey, respectively. Immobilization on silica gel 60 showed enzyme activity
retention of 41.8%, compared with entrapment technique with only 18.4%.
Keywords:
Galactooligosaccharides,
immobilization.
-galactosidase,
prebiotics,
enzyme
Contenido
XIII
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Abstract........................................................................................................................... XI
Contenido ..................................................................................................................... XIII
Lista de figuras ............................................................................................................. XV
Lista de tablas ............................................................................................................. XIX
Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................... XXI
Introducción .................................................................................................................... 1
1.
Marco Teórico ........................................................................................................... 3
1.1
Galactooligosacáridos (GOS) .......................................................................... 3
1.2
- Galactosidasa .............................................................................................. 7
1.3
Inmovilización de Enzimas ............................................................................. 11
2.
Materiales y metodología ....................................................................................... 17
2.1
Materiales ...................................................................................................... 17
2.2
Metodología ................................................................................................... 18
2.2.1
Actividad hidrolítica con ONPG ........................................................... 18
2.2.2
Producción de GOS con Enzima Libre ................................................ 20
2.2.3
Producción de GOS con Enzima Inmovilizada .................................... 21
2.2.4
Inmovilización por atrapamiento en Alginato de Calcio ........................ 22
2.2.5
Inmovilización por atrapamiento en Alginato de Calcio con material
zeolítico. 22
2.2.6
Inmovilización por Unión Covalente con Sílica. ................................... 23
2.2.7
Inmovilización por Unión Covalente con Sílica Tratada. ...................... 23
2.2.8
Análisis HPLC ..................................................................................... 24
2.2.9
Modelo cinético y determinación de parámetros.................................. 24
3.
Resultados y Análisis ............................................................................................ 27
3.1
Identificación y cuantificación de GOS ........................................................... 27
3.2
Actividad hidrolítica ........................................................................................ 29
3.3
Producción de GOS utilizando -galactosidasa libre ...................................... 31
3.3.1
Sustrato: Lactosa ................................................................................ 31
3.3.2
Sustrato: Lactosuero ........................................................................... 38
XIV
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.4
3.5
Actividad hidrolítica con enzima inmovilizada .................................................46
Producción de GOS con enzima inmovilizada en alginato de calcio ...............50
3.5.1
Sustrato: Lactosa .................................................................................50
3.5.2
Sustrato: Lactosuero ............................................................................54
3.6
Producción de GOS con enzima inmovilizada en alginato de calcio con
material zeolítico .......................................................................................................58
3.6.1
Sustrato: Lactosa .................................................................................58
3.6.2
Sustrato: Lactosuero ............................................................................63
3.7
Producción de GOS con enzima inmovilizada en sílica ..................................67
3.7.1
Sustrato: Lactosa .................................................................................67
3.7.2
Sustrato: Lactosuero ............................................................................72
3.8
Producción de GOS con enzima inmovilizada en sílica tratada ......................76
3.8.1
Sustrato: Lactosa .................................................................................77
3.8.2
Sustrato: Lactosuero ............................................................................81
3.9
Modelamiento Cinético ...................................................................................86
4.
Conclusiones y recomendaciones ........................................................................91
4.1
Conclusiones ..................................................................................................91
4.2
Recomendaciones..........................................................................................92
A.
Anexo: Determinación de actividad hidrolítica con ONPG ..................................95
B. Anexo: Cuantificación e identificación de azúcares por HPLC ...........................97
C. Anexo: Hoja de datos de producto: Lactozym® 6500 L (Novozymes) ..............103
Bibliografía ...................................................................................................................105
Contenido
XV
Lista de Figuras
Pág.
Figura 1-1 Fórmula estructural de los galactooligosacáridos. (Gal: galactosa, Glu: Glucosa, p: grado de
oligomerización > 1). Adaptado de [Martínez-Villaluenga et al., 2008b]) ...........................................................4
Figura 1-2. Estructura 3D de -galactosidasa obtenida a partir de Kluyveromyces lactis (Tomado de:
[Pereira-Rodriguez et al., 2012]) ........................................................................................................................7
Figura 1-3. Mecanismos de reacción para la transgalactosilación e hidrólisis de lactosa por galactosidasa
(Enzima) (Adaptado de [Zhou, Q Z K et al., 2001b]) ..........................................................................................8
Figura 1-4. Reacciones para la producción de GOS a partir de lactosa con -galactosidasa. Adaptado de
[Yang, S-T et al., 2001a] ....................................................................................................................................9
Figura 1-5. Clasificación de la inmovilización de enzimas ó células respecto al tipo de unión con el soporte.
Adaptado de [Klein et al., 1983] .......................................................................................................................12
Figura 2-1. Reacción de ONPG con -Galactosidasa ......................................................................................19
Figura 3-1. Evolución de los cromatogramas de HPLC durante la producción de GOS con enzima libre
(Temperatura = 40°C, pH= 6.5 y R: 1.00) ........................................................................................................27
Figura 3-2. Comportamiento de la actividad hidrolítica con ONPG respecto al pH @ 40°C (A) y la
temperatura @ pH = 6.0 (B), para enzima libre ............................................................................................... 29
Figura 3-3. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.00 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosa ...........32
Figura 3-4. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.25 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosa ...........33
Figura 3-5. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.50 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosa ...........34
Figura 3-6. Efectos principales de la temperatura, pH y la relación enzima/lactosa inicial R, sobre YGOS
(Enzima Libre – Sustrato: Lactosa) ..................................................................................................................35
Figura 3-7. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima libre y lactosa como
sustrato a pH 5.5 (A), 6.0 (B) y 6.5 (C) .............................................................................................................37
Figura 3-8. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS con enzima libre y lactosa, respecto
a la conversión de lactosa a diferentes relaciones de enzima/lactosa inicial (pH=6.0 y 40°C) ........................37
Figura 3-9. Efectos principales de la temperatura, pH y la relación enzima/lactosa inicial R, sobre Y GOS
(Enzima Libre – Sustrato: Lactosuero) .............................................................................................................39
Figura 3-10. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.00 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosuero .......40
XVI
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Figura 3-11. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.25 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosuero ...... 41
Figura 3-12. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.50 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosuero ...... 42
Figura 3-13. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima libre y lactosuero como
sustrato a pH 5.5 (A), 6.0 (B) y 6.5 (C)............................................................................................................. 44
Figura 3-14. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS con enzima libre y Lactosuero,
respecto a la conversión de lactosa a diferentes relaciones de enzima/lactosa inicial (pH=6.0 y 40°C) .......... 44
Figura 3-15. Comportamiento de la actividad hidrolítica con ONPG respecto al pH, para enzima inmovilizada
en (A) alginato de calcio, (B) alginato de calcio con material zeolítico, (C) Sílica y (D) Sílica tratada.............. 47
Figura 3-16. Comportamiento de la actividad hidrolítica con ONPG respecto a la temperatura, para enzima
inmovilizada en (A) alginato de calcio, (B) alginato de calcio con material zeolítico, (C) Sílica y (D) Sílica
tratada. ............................................................................................................................................................. 48
Figura 3-17. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en alginato de calcio – Sustrato: lactosa) ...................................................................... 50
Figura 3-18. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
-1
alginato de calcio y lactosa como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C) . 51
Figura 3-19. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y 50°C.
-1
-1
-1
(A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosa y
enzima inmovilizada en alginato de calcio ....................................................................................................... 52
Figura 3-20. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de lactosa,
con enzima inmovilizada en alginato de calcio y lactosa (pH=6.0 y 50°C) ....................................................... 53
Figura 3-21. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el YGOS
(Enzima inmovilizada en alginato de calcio – Sustrato: lactosuero) ................................................................. 54
Figura 3-22. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
-1
alginato de calcio y lactosuero como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C)
......................................................................................................................................................................... 55
Figura 3-23. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y 50°C.
-1
-1
-1
(A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosuero y
enzima inmovilizada en alginato de calcio ....................................................................................................... 56
Figura 3-24. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de lactosa,
con enzima inmovilizada en alginato de calcio y lactosuero (pH=6.0 y 50°C) ................................................. 57
Figura 3-25. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico – Sustrato: lactosa) ................................... 58
Figura 3-26. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
alginato de calcio con material zeolítico y lactosa como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L
-1
(B) y 500 g L (C) ............................................................................................................................................ 59
Figura 3-27. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y 50°C.
-1
-1
-1
(A) Lact. inicial = 333 g L , (B) Lact. inicial = 400 g L y (C) Lact. inicial = 500 g L . Sustrato Lactosa y
enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico ..................................................................... 60
Figura 3-28. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de lactosa,
con enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico y lactosa (pH=6.0 y 50°C) .................... 62
Contenido
XVII
Figura 3-29. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico – Sustrato: lactosuero) .............................. 63
Figura 3-30. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
alginato de calcio con material zeolítico y lactosuero como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g
-1
-1
L (B) y 500 g L (C) .......................................................................................................................................64
Figura 3-31. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y 50°C.
-1
-1
-1
(A) Lact. inicial = 333 g L , (B) Lact. inicial = 400 g L y (C) Lact. inicial = 500 g L . Sustrato Lactosuero y
enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico .....................................................................66
Figura 3-32. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de lactosa,
con enzima inm. en alginato de calcio con material zeolítico y lactosuero (pH=6.0 y 50°C) ........................... 66
Figura 3-33. Esquema de la inmovilización de la -galactosidasa en sílica gel ...............................................67
Figura 3-34. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en sílica– Sustrato: lactosa) .......................................................................................... 68
Figura 3-35. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en sílica y
-1
-1
-1
lactosa como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C) ................................ 69
Figura 3-36. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y 40°C.
-1
-1
-1
(A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosa y enzima
inmovilizada en sílica .......................................................................................................................................70
Figura 3-37. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de lactosa,
con enzima inmovilizada en sílica y lactosa (pH=6.0 y 40°C) .........................................................................71
Figura 3-38. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en sílica – Sustrato: lactosuero) ....................................................................................72
Figura 3-39. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en sílica y
-1
-1
-1
lactosuero como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C) ........................... 73
Figura 3-40. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y 40°C.
-1
-1
-1
(A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosuero y
enzima inmovilizada en sílica ........................................................................................................................... 74
Figura 3-41. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de lactosa,
con enzima inmovilizada en sílica y lactosuero (pH=6.0 y 40°C) ....................................................................75
Figura 3-42. Esquema de la inmovilización de la -galactosidasa en sílica gel tratada ...................................76
Figura 3-43. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en sílica tratada – Sustrato: lactosa) .............................................................................77
Figura 3-44. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en sílica
-1
-1
-1
tratada y lactosa como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C) .................78
Figura 3-45. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y 40°C.
-1
-1
-1
(A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosa y enzima
inmovilizada en sílica tratada ........................................................................................................................... 78
Figura 3-46. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de lactosa,
con enzima inmovilizada en sílica tratada y lactosa (pH=6.0 y 40°C) ............................................................. 80
Figura 3-47. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en sílica tratada – Sustrato: lactosuero) ........................................................................81
XVIII
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Figura 3-48. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en sílica
-1
-1
-1
tratada y lactosuero como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C) ............ 82
Figura 3-49. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y 40°C.
-1
-1
-1
(A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosuero y
enzima inmovilizada en sílica tratada............................................................................................................... 83
Figura 3-50. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de lactosa,
con enzima inmovilizada en sílica tratada y lactosuero (pH=6.0 y 40°C) ........................................................ 84
Figura 3-51. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa (azul), glucosa (rojo), galactosa (verde) y GOS
(negro), obtenidos con el modelo cinético de reacciones elementales para: a) R=1.00, b) = 1.25 y c)=1.50 a
pH=6.0 y Temperatura = 40°C. Sustrato Lactosa y enzima libre. Línea continua: modelo y Puntos: datos
experimentales. ................................................................................................................................................ 86
Figura 3-52. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa (azul), glucosa (rojo), galactosa (verde) y GOS
-1
(negro), obtenidos con el modelo cinético de reacciones elementales para: a) Lact. Inicial=500gL , b) = Lact.
-1
-1
Inicial=400gL y c)= Lact. Inicial=333gL a pH=6.0 y Temperatura = 40°C. Sustrato Lactosa y enzima
inmovilizada en sílica tratada. Línea continua: modelo y Puntos: datos experimentales. ................................ 88
Figura A-1. Curva de calibración de absorbancia para diferentes concentraciones de ONPG. ....................... 95
Contenido
XIX
Lista de Tablas
Pág.
Tabla 1-1. Lista de oligosacáridos identificados durante la obtención de GOS (Gal: Galactosa, Glu: Glucosa)
(Adaptado de [Mahoney, 1998]) .........................................................................................................................4
Tabla 1-2. Fuentes de -galactosidasa [Panesar et al., 2010] ...........................................................................7
Tabla 1-3. Factores estudiados en la producción GOS a partir de lactosa con diferentes fuentes microbianas
de -galactosidasa ...........................................................................................................................................10
Tabla 1-4. Comparación entre los métodos de inmovilización. Adaptado de [Arroyo, 1998]............................ 13
Tabla 2-1. Análisis de composición del Lactosuero en polvo ...........................................................................17
Tabla 3-1. Actividad hidrolítica con ONPG para -galactosidasa obtenida de diferentes microorganismos ....30
Tabla 3-2. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa libre en la prodición de GOS a partir de lactosa .........................................36
Tabla 3-3. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa libre en la producción de GOS con lactosuero ...........................................43
Tabla 3-4. Rendimiento y concentración de GOS a partir de lactosa y lactosuero ..........................................44
Tabla 3-5. Producción de GOS reportada a partir de lactosa y lactosuero usando -Galactosidasa libre ......45
Tabla 3-6. Actividad hidrolítica con ONPG de los diferentes biocatalizadores preparados .............................. 46
Tabla 3-7. Relación enzima inmovilizada/lactosa inicial usadas en la evaluación de la producción de GOS con
cada biocatalizador. .........................................................................................................................................49
Tabla 3-8. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizad en alginato de calcio en la producción de GOS con lactosa ....52
Tabla 3-9. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en alginato de calcio en la producción de GOS con lactosuero
.........................................................................................................................................................................56
Tabla 3-10. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en alg. de calcio con material zeolítico en la producción de
GOS con lactosa ..............................................................................................................................................61
Tabla 3-11. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en sílica en la producción de GOS con lactosa ......................68
Tabla 3-12. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizad en sílica en la producción de GOS con lactosuero ..................74
Tabla 3-13. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en sílica tratada en la producción de GOS con lactosa .........79
Tabla 3-14. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en sílica tratada en la producción de GOS con lactosuero ....83
Tabla 3-15. Rendimiento y concentración de GOS a partir de lactosa y lactosuero, usando -galactosidasa
inmovilizada en varios soportes .......................................................................................................................84
Tabla 3-16. Producción de GOS reportada a partir de lactosa y lactosuero usando -Galactosidasa
inmovilizada .....................................................................................................................................................85
XX
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Tabla 3-17. Parámetros del modelo cinético de reacciones elementales, para la producción GOS con enzima
libre a pH=6.0 y T=4.0...................................................................................................................................... 87
Tabla 3-18. Comparación del ajuste de datos experimentales para los casos de producción de GOS
evaluados con enzima libre a pH=6.0 y 40°C .................................................................................................. 87
Tabla 3-19. Parámetros del modelo cinético de reacciones elementales, para la producción GOS con enzima
inmovilizada en sílica tratada a pH=6.0 y T=4.0 .............................................................................................. 88
Tabla 3-20. Comparación del ajuste de datos experimentales para los casos de producción de GOS
evaluados con enzima inmovilizada en sílica tratada a pH=6.0 y 40°C ........................................................... 89
Contenido
XXI
Lista de Símbolos y Abreviaturas
Símbolos
Símbolo
Término
Ci
Concentración del compuesto i
R
Relación peso enzima a peso lactosa inicial
Si
t
T
Selectividad del compuesto i
tiempo
Temperatura
Uh
Actividad hidrolítica
Xi
Yi
Conversión del compuesto i
Rendimiento del compuesto i
Subíndices
Subíndice
Término
Lac
GOS
Glu
Gal
0
f
Lactosa
Galactooligosacáridos
Glucosa
Galactosa
Inicial
Final
Abreviaturas
Abreviatura Término
GOS
ONPG
ONP
Galactooligosacáridos
o-nitrofenol--D-galactopiranósido
o-nitrofenolpiranósido
Unidad
𝑔
𝐿
𝑔𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
𝑔𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎
%
min
°C
𝜇𝑚𝑜𝑙𝑂𝑁𝑃
min 𝑚𝐿
%
%
Definición
Ec. 2.2
Ec. 2.5
Ec. 2.1
Ec. 2.4
Ec. 2.3
Introducción
Los alimentos funcionales se definen como alimentos o ingredientes alimenticios que
proporcionan un beneficio en la salud mayor al valor nutritivo esperado de los alimentos.
Los galactooligosacáridos (GOS) son oligosacáridos de galactosa que contienen una
unidad de glucosa y son producidos a partir de lactosa. Estos presentan propiedades
como edulcorantes y prebióticos que los hace atractivos en el uso de alimentos
funcionales. [Sako et al., 1999; Tomomatsu, 1994; Van Loo et al., 1999].
El desarrollo comercial de los GOS, corresponde a los múltiples beneficios que ofrece a
la salud humana e inclusive su uso se ha extendido como suplemento en nutrición
animal. Una de las propiedades más conocidas, es el hecho de promover el crecimiento
de bifidobacterias (efecto prebiótico), las cuales disminuyen el riesgo de enfermedades
gastrointestinales atribuidas a enterobacterias. Adicionalmente, los GOS favorecen la
absorción de algunos minerales como el calcio y actúan también como edulcorantes para
pacientes diabéticos y obesos debido a su bajo poder calorífico. [Sako et al., 1999;
Torres et al., 2010; Yang, S-T et al., 2001a]
Para la obtención de GOS han sido utilizados varios métodos, como la extracción y
purificación de estos a partir de fuentes naturales al estar presentes en algunas plantas o
el uso de células libres e inmovilizadas en un medio de reacción. No obstante, los bajos
rendimientos y costos en la recuperación del producto, han incrementado el interés en la
producción de GOS a través de catálisis enzimática de glicosiltransferasas sobre lactosa
en altas concentraciones, siendo la -galactosidasa la enzima empleada en la mayoría
de los casos [Park, A-R et al., 2010; Yang, S-T et al., 2001a].
El estudio de los factores involucrados en la reacción de producción de GOS como el
origen de la enzima, la concentración de sustrato, la temperatura de reacción, los
2
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de
materias primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
parámetros cinéticos, así como otros factores que influyen e incrementen los
rendimientos de la enzima, han despertado el interés de varias investigaciones, pero aún
se hace necesario ampliar el conocimiento de este tipo de variables, con el fin de tener
una mayor aproximación a procesos de escalado.
En vista del limitado conocimiento que se ha desarrollado sobre los procesos necesarios
para la producción de los GOS utilizando enzimas inmovilizadas y las ventajas que el uso
de este tipo de catalizadores ofrece, como la posibilidad de utilizar varias veces el mismo
biocatalizador, controlar mejor el tiempo de reacción y por consiguiente la selectividad
hacia un producto deseado, o facilitar la separación de productos; es necesario
desarrollar estudios que permitan subsanar esta carencia. Esto a su vez permitiría
generar un producto de mayor valor agregado comparado con la lactosa - que ha
demostrado tener beneficios sobre la salud de los consumidores y plantear una solución
al problema ambiental generado por un residuo como el lactosuero.
En esta investigación se evaluó la producción de GOS mediante -galactosidasa libre e
inmovilizada en 4 soportes diferentes, a partir de lactosa y lactosuero (lactosuero).
Inicialmente, se estandarizó la técnica analítica para la cuantificación de los compuestos
involucrados durante la reacción de producción de GOS. Seguidamente, se determinó la
actividad hidrolítica de la enzima libre e inmovilizada en cada soporte, utilizando ONPG
como sustrato a diferentes condiciones de temperatura y pH. Estas condiciones fueron la
base para la evaluación de la producción de GOS a través de diseños de experimentos,
en cada uno de los esquemas de producción estudiados. Durante la evaluación de la
producción de GOS se determinó el biocatalizador con mejor actividad enzimática y
productividad de prebióticos, así como las mejores condiciones de reacción y la cinética
involucrada en la síntesis con enzima libre o inmovilizada para los dos sustratos
analizados. Los resultados aquí presentados, buscan dar las bases para un reactor de
producción de galactooligosacáridos por lotes o continuo, a partir de materias primas
lácteas (lactosa y lactosuero).
1. Marco Teórico
1.1
Galactooligosacáridos (GOS)
Los oligosacáridos son compuestos que contienen en su estructura entre tres y diez
unidades de monosacáridos, aunque por las características similares que poseen
algunos disacáridos respecto a compuestos de mayor tamaño, se incluyen unos
disacáridos como la lactulosa entre los oligosacáridos conocidos [Crittenden et al., 1996;
Rastall, 2010].
Los sitios donde se han realizado los mayores avances sobre esta clase de compuestos
han sido los países de la Comunidad Europea, Corea del Sur y Japón, lugares donde el
uso de endulzantes artificiales es prohibido en alimentos, llevando a que se encuentren
nuevos compuestos con estas características y encontrándose en los oligosacáridos una
alternativa prometedora. Por esta razón, en 1991 el Gobierno de Japón estableció una
legislación para los alimentos de uso específico en la salud (FOSHU – Food for Specified
Health Use), en la que se clasificaron los oligosacáridos según el monosacárido que se
polimeriza en la estructura original [Crittenden et al., 1996]. De esta manera se dio una
primera clasificación para estos compuestos en fructo-, galacto-, soya y palatinosa
oligosacáridos. En 1996, la lista de FOSHU que clasificaba las sustancias este tipo, se
extendió a otros compuestos quedando incluidos en ella los provenientes de otros
azúcares como lactulosa, lactosucrosa, xilo- e isomalto-oligosacáridos. En la actualidad
hay 12 clases de oligosacáridos grado alimenticio que son producidos a lo largo del
mundo [Crittenden et al., 1996; Roberfroid, 2007; Van Loo et al., 1999].
Este tipo de compuestos se encuentran de manera natural en alimentos comunes como
frutas, vegetales, leche y miel. En la mayoría de los casos, tanto en estado natural como
en productos para el consumo humano, los oligosacáridos no son compuestos puros, por
el contrario, son una mezcla de varios compuestos de este tipo con diferentes grados de
oligomerización [Crittenden et al., 1996; Rastall, 2010].
4
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Figura 1-1 Fórmula estructural de los galactooligosacáridos. (Gal: galactosa, Glu: Glucosa, p: grado de
oligomerización > 1). Adaptado de [Martínez-Villaluenga et al., 2008b])
Los oligosacáridos basados en la galactosa se denominan galactooligosacáridos (GOS) y
son producidos a partir de lactosa. En la Figura 1-1 se muestra su fórmula química
general como D-Galactosa – D-(Galactosa)p – D-Glucosa, siendo p el grado de
oligomerización que varía entre 1 y 3. Los tipos de enlace que puede presentarse entre
las unidades de galactosa-glucosa en los GOS son -(1-3), -(1-4) y -(1-6) (Tabla 1-1),
siendo predominante el enlace-(1-4) [Mahoney, 1998; Sako et al., 1999; Yang, S-T et
al., 2001b; Zarate et al., 1990] . Igualmente, algunos disacáridos, como alolactosa y
galactobiosa están también presentes en la mezcla de productos de GOS que resultan
del complejo de reacciones involucradas durante la síntesis de estos compuestos
(Figura1-5) [Yang, S-T et al., 2001b].
Tabla 1-1. Lista de oligosacáridos identificados durante la obtención de GOS (Gal: Galactosa, Glu: Glucosa)
(Adaptado de [Mahoney, 1998])
Compuesto GOS
Disacáridos
Trisacáridos
Tetrasacáridos
Pentasacárido
Estructura Química
β-D-Gal (1→6)-D-Glu
β-D-Gal (1→6)-D-Gal
β-D-Gal (1→3)-D-Glu
β-D-Gal (1→3)-D-Gal
β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→6)-D-Glu
β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→4)-D-Glu
β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→6)-D-Gal
β-D-Gal (1→3)-β-D-Gal (1→4)-D-Glu
β-D-Gal (1→4)-β-D-Gal (1→4)-D-Glu
β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→4)-D-Glu
β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→3)-β-D-Gal (1→4)-D-Glu
β-D-Gal (1→3)-β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→4)-D-Glu
β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal (1→6)-β-D-Gal(1→4)-D-Glu
Marco Teórico
5
Los galactooligosacáridos (GOS) son componentes naturales de diversos alimentos
comunes como la cebolla, el ajo, el plátano y la soya [Stahl et al., 1994; Yang, S-T et al.,
2001a]. Sin embargo, los niveles de GOS en estos alimentos son demasiados bajos para
que su ingesta ejerza un efecto significativo en el organismo humano. Por esta razón, su
presencia en suplementos dietéticos o inclusión en alimentos, es la mejor forma de
administración para el consumo humano [Thammarutwasik et al., 2009; Tomomatsu,
1994].
Dentro de las propiedades de los GOS se pueden nombrar su solubilidad en agua y su
sabor dulce, por lo general entre 0.3 y 0.6 veces el sabor dulce de la sacarosa. Esta
propiedad de los GOS y demás oligosacáridos, depende de la estructura y peso
molecular, así como el nivel de mono- y disacáridos presentes en la mezcla. Por su
característica respecto al sabor, son bastante usados en la producción de alimentos si se
desea tener un compuesto que reduzca el sabor dulce y se puedan resaltar otros sabores
en el producto final [Crittenden et al., 1996; Panesar et al., 2010; Sako et al., 1999]
Comparados con los mono- y disacáridos, el alto peso molecular de los GOS trae como
consecuencia un aumento en la viscosidad de las soluciones de estos compuestos,
llevando a que se obtengan productos con mayor consistencia y mejor sensación en la
boca cuando se consumen alimentos que en su formulación contengan este tipo de
compuestos. Por esta propiedad pueden ser ampliamente utilizados en la preparación de
bebidas lácteas, helados y galletas. Otra característica que tiene en los alimentos a los
que se adicionan, es su alta capacidad de retención de humedad, previniendo excesiva
sequedad y una baja actividad del agua, que es conveniente en un control adecuado de
la contaminación microbiana. También se ha observado que muchos de ellos son fuertes
inhibidores de la retrodegradación del almidón en alimentos [Crittenden et al., 1996;
Panesar et al., 2010; Park, A-R et al., 2010; Rastall, 2010; Sako et al., 1999].
Además de las propiedades fisicoquímicas descritas anteriormente, los GOS tienen gran
interés por sus propiedades fisiológicas. Los bajos contenidos de azúcares simples
presentes en ellos,
hacen que no sean utilizados por la flora de la boca para la
producción de ácidos o poliglucanos [Crittenden et al., 1996; Tomomatsu, 1994; Van Loo
et al., 1999]. Por esto, son usados como sustitutos de la sacarosa al ser bajos
6
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
promotores de caries dental, en bebidas, yogurt, gomas de mascar y en confitería. Del
mismo modo, los galactooligosacáridos no son digeridos por los humanos, haciéndolos
adecuados para su uso como endulzantes en alimentos de bajo contenido energético y
para el consumo de personas con diabetes [Tomomatsu, 1994]. La característica de no
ser asimilados por el organismo humano hace que tengan efectos similares a la fibra
dietaria, y previene así el estreñimiento [Crittenden et al., 1996; Rastall, 2010;
Tomomatsu, 1994; Yang, S-T et al., 2001b].
En estudios recientes se ha reportado la habilidad de los galactooligosacáridos para
promover el crecimiento de bifidobacterias en el colon, constituyéndolos como prebióticos
[Crittenden et al., 1996; Rastall, 2010; Thammarutwasik et al., 2009; Tomomatsu, 1994;
Torres et al., 2010; Yang, S-T et al., 2001b]. Un prebiótico se ha definido como un
“ingrediente fermentado selectivamente que permite cambios específicos tanto en la
composición y/o actividad de la microflora gastrointestinal, proporcionando beneficios en
el bienestar y salud del consumidor” [Roberfroid, 2007].
Por las propiedades que presentan, los GOS han tenido un desarrollo comercial
importante en países como Japón, Holanda y recientemente en Australia, para ser
empleados en las industrias de alimentos y farmacéutica [Crittenden et al., 1996; Gosling
et al., 2010; Yang, S-T et al., 2001a]. Como resultado de esto, durante el 2005 fueron
producidas únicamente en Japón seis mil toneladas de GOS [Taniguchi, 2005].
Por otro lado, en la industria quesera se producen cantidades importante de lactosuero,
que es un residuo causante de serios problemas ambientales por su alta carga biológica
y orgánica, y representa una pérdida económica para las empresas al desecharse la
lactosa presente en este. Aproximadamente el 47% del suero de leche o lactosuero
producido al año en todo el mundo se desecha [Novalin et al., 2005]. Por esto, la
conversión de la lactosa presente en este desecho en un producto con alto valor como
los GOS es de gran interés para la industria alimentaria [Gosling et al., 2010].
Marco Teórico
1.2
7
- Galactosidasa
La -galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una hidrolasa que actúa sobre galactósidos
hidrolizándolos a monosacáridos. Esta enzima fue una de las primeras en ser aislada y
purificada a partir de diferentes fuentes naturales como plantas, animales y
microorganismos [Rastall, 2010; Yang, S-T et al., 2001a]. En la Tabla 1-2 se presenta
algunas de las fuentes de -galactosidasa, encontradas en la naturaleza.
Tabla 1-2. Fuentes de -galactosidasa [Panesar et al., 2010]
Bacterias
Hongos
Levaduras
Plantas
Órganos de
animales
Bacillus megaterium
Clostridium acetobutylicum
Escherichia coli
Aspergillus foelidis
Bullera singularis
Lactobacillus acidophilus
Aspergillus niger
Kluyveromyces bulgaricus
Albaricoque
Lactobacillus bulgaricus
Aspergillus oryzae
Kluyveromyces fragilis
Almendra
Lactobacillus helviticus
Auerobasidium pullulans
Kluyveromyces lactis
Fruto de café
Intestinos
Lactobacillus lactis
Neurospora crassa
Kluyveromyces marxianus
Melocotón
Tejido de la piel
Lactobacillus thermophilus
Penicillum canescens
Saccharomyces anamensis
Semillas de Alfalfa
Pseudomonas fluorescens
Penicillum expansum
Saccharomyces fragilis
Streptococcus lactis
Streptomyces violaceus
Saccharomyces lactis
Cerebro
Streptococcus thermophilus
Thermus acquaticus
La estructura de la -galactosidasa de Kluyveromyces lactis fue analizada por [PereiraRodriguez et al., 2012], encontrando cuatro subunidades idénticas, cada una con 1025
aminoácidos y peso total de 475957 Da. En la Figura 1-3 se presenta la estructura 3D de
las cuatro subunidades de la enzima, resaltadas cada una en colores diferentes.
Figura 1-2. Estructura 3D de -galactosidasa obtenida a partir de Kluyveromyces lactis
(Tomado de: [Pereira-Rodriguez et al., 2012])
8
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
La β galactosidasa cataliza la transferencia de una unidad de galactosa presente en un
β-galactósido como la lactosa, a un aceptor que contiene un grupo hidroxilo [Zhou, Q Z K
et al., 2001b]. Esto sucede a través de un mecanismo general de reacción propuesto en
dos pasos: a) formación del complejo galactósido-enzima y liberación simultánea de
glucosa y b) el complejo galactósido-enzima es transferido a un aceptor nucleofílico que
contiene grupo hidroxilo. Cuando esta transferencia se realiza a agua, se produce
galactosa (Reacción de Hidrólisis – Figura 1-4). Por otro lado, si la transferencia es a otro
carbohidrato como la lactosa, se producen di-, tri- y/o galactooligosacáridos de mayor
grado de oligomerización (Reacción de Transgalactosilación – Figura 1-4) [Neri, D B, V.
et al., 2009; Zhou, Q Z K et al., 2001b].
GOS
Enzima
Sacárido
Aceptor
Gal
Gal
Sacárido
Aceptor
Sacárido
Aceptor
Reacción de Transgalactosilación
Enzima
+
Lactosa
Enzima
Lactosa
Enzima
Gal
Glu
Reacción de Hidrólisis
Gal
H2O
Figura 1-3. Mecanismos de reacción para la transgalactosilación e hidrólisis de lactosa por
galactosidasa (Enzima) (Adaptado de [Zhou, Q Z K et al., 2001b])
Durante las síntesis enzimáticas de GOS más de diez clases diferentes de
galactooligosacáridos han sido encontrados como consecuencia de este mecanismo de
reacción, siendo principalmente disacáridos (alolactosa y galactobiosa) y trisacáridos,
aunque tetrasacáridos, pentasacáridos e incluso oligosacáridos de mayor tamaño han
sido reportados [Mahoney, 1998; Zarate et al., 1990]. En la Figura 1-5 se presenta las
principales reacciones involucradas en la producción de GOS.
Marco Teórico
9
Gal - Glu
+
E +
(E-Gal)
Gal – Glu + (E-Gal)
Gal2 – Glu + (E-Gal)
Gal3 – Glu + (E-Gal)
Gal + (E-Gal)
Glu + (E-Gal)
H2O
E +
(E-Lac)
(E-Gal) + Glu
Gal
(E - Gal2 - Glu )
(E - Gal3 - Glu )
(E - Gal4 - Glu )
(E - GB)
(E - AL)
E + Gal2 – Glu
E + Gal3 – Glu
E + Gal4 – Glu
+ H2O
+ H 2O
+ H2O
E + GB + H2O
E + AL + H2O
Gal – Glu: lactosa. E: b-galactosidasa. Gal: galactosa. Glu: glucosa. GB: galactobiosa.
AL: alolactosa. Gal2 – Glu: trisacárido. Gal3 – Glu: tetrasacárido. Gal4 – Glu: pentasacárido
Figura 1-4. Reacciones para la producción de GOS a partir de lactosa con -galactosidasa.
Adaptado de [Yang, S-T et al., 2001a]
La transgalactosilación es un paso intermedio de una reacción más compleja porque, a
medida que avanza el tiempo, todos los azúcares formados pueden ser hidrolizados
hasta monosacáridos [Mahoney, 1998; Zarate et al., 1990; Zhou, Q Z K et al., 2001b]. Por
lo tanto, el conocimiento de la evolución en el tiempo de cada uno de los compuestos, se
requiere para estimar el punto de rendimiento máximo de GOS como productos
deseados en la reacción.
Después de observar el mecanismo de reacción se evidencia que uno de los factores
que influye en la formación de GOS, es la concentración inicial de lactosa. A medida que
esta disminuye y la concentración de agua en el sistema aumenta, la actividad de agua
aumenta y prevalece la reacción de hidrólisis. Mientras que la reacción de
transgalactosilación aumenta con una disminución de la concentración agua y altas
concentraciones de lactosa. Asimismo, se ha reportado un aumento en la actividad de
transgalactosilación de la enzima y por consiguiente una mayor producción de GOS, al
reducir la actividad de agua por adición de solventes orgánicos que disminuyan su
concentración en el medio de reacción [Goulas et al., 2007; Ladero et al., 2002]. Sin
embargo, la reacción en este tipo de condiciones lleva a una desactivación más rápida de
la -galactosidasa y una producción más lenta de GOS.
Aparte de la concentración de lactosa y la actividad del agua durante la reacción, otros
factores influyen en la producción de GOS como: la temperatura, el pH y la presencia de
inhibidores como galactosa y/o glucosa [Sanz-Valero, 2009; Torres et al., 2010; Yang, ST et al., 2001b; Zheng et al., 2006]. En la Tabla 1-3 se muestran algunos de los estudios
10
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
sobre la producción de galactooligosacáridos, realizados a diferentes condiciones de
reacción.
Dentro de los métodos de producción de GOS se han reportado varios estudios en los
que se utilizan enzimas de diferentes microorganismos para su producción, siendo estas
empleadas de forma libre. De la misma manera, un gran número de ensayos se ha
enfocado en encontrar las mejores condiciones de producción de galactooligosacáridos
con microorganismos libres en el medio de reacción [Yang, S-T et al., 2001a]. Contrario
a esto, un área que ha sido poco estudiada y que ofrece varias ventajas, es aquella en la
que se emplea la inmovilización de la enzima. Esta ruta aprovecha mejor los costosos y
complejos procesos de purificación de la enzima al brindar la posibilidad de utilizar el
mismo catalizador en varias oportunidades, ayudando también a reducir las etapas de
separación de productos posteriores a la unidad de reacción [Arroyo, 1998].
Tabla 1-3. Factores estudiados en la producción GOS a partir de lactosa con diferentes fuentes microbianas
de -galactosidasa
Condiciones de Reacción
Microorganismo fuente de
 - galactosidasa
Conc. Lactosa
-1
(g L )
T (°C)
pH
Inhibidores
-1
(g L )
Referencia
Aspergillus niger
200
45
4.5
-
[Kim et al., 1990]
Aspergillus oryzae
400
20-50
4.0 – 7.0
-
[Iwasaki et al., 1996]
50 - 500
30 - 60
3.5 – 5.5
30, 70 y 100
(Galactosa y Glucosa)
[Neri, D B, V. et al., 2009]
Bacillus circulans
65 - 200
40
5
18
(Galactosa y Glucosa)
[Boon, M. A. et al., 1999]
Bullera singuaris
100 - 300
45
4.8
-
[Shin et al., 1998]
Kluyveromyces lactis
200
45
7.0
-
[Foda et al., 2000]
[Splechtna et al., 2006]
Lactobacillus reuteri
46, 103 y 205
30
5.5 – 7.5
-
Penicillium simplicissimum
600
50
6.5
-
[Cruz et al., 1999]
Saccharopolyspora rectivirgula
600
70
7.0
-
[Nakao et al., 1994]
Marco Teórico
1.3
11
Inmovilización de Enzimas
La inmovilización de enzimas es definida como: “enzimas confinadas físicamente o
localizadas en una región definida del espacio, con retención de su actividad catalítica, y
que pueden usarse repetida y continuamente” [Chibata, 1978a]. En este sentido, diversos
métodos confiables y reproducibles para la preparación de este tipo de catalizadores han
sido estudiados y tienen ahora aplicación a nivel de laboratorio e industrial.
La mayoría de métodos disponibles para la inmovilización de enzimas u otras proteínas
biológicamente activas, pueden agruparse dos categorías: métodos de inmovilización por
unión química o por retención física. En la primera se tienen dos subdivisiones: a) unión a
soportes y b) entrecruzamiento. Por su parte, en la categoría de inmovilización por
retención física se encuentra el método de c) atrapamiento y d) inclusión en membranas.
En la Figura 1-5 se muestra un resumen de los métodos de inmovilización enzimática de
acuerdo a la interacción con el soporte (Unión química o Retención física) [Arroyo, 1998;
Klein et al., 1983]. De igual forma, de la Tabla 1-4 se puede tener una base para la
selección del método de inmovilización, por medio de la comparación entre los diferentes
procedimientos respecto a aspectos como la preparación, actividad enzimática, costo del
proceso, entre otros.
En el método de adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante
interacciones iónicas, fuerzas de van de Waals y puentes de hidrógeno. Una variante
dentro de la técnica de adsorción consiste en emplear resinas de intercambio iónico, las
cuales contienen grupos funcionales y contraiones móviles. Estos contraiones se pueden
intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan
cambios en la matriz insoluble [Arroyo, 1998].
12
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Inmovilización de enzimas
Atrapamiento Físico
Unión Química
Atrapamiento
Unión Secundaria
Adsorción
Floculación
Unión Covalente
Unión a
Soportes
Entrecruzamiento
Microencapsulación
n
Inclusión en
membranas
Reactores de
membrana
Figura 1-5. Clasificación de la inmovilización de enzimas ó células respecto al tipo de unión con el soporte.
Adaptado de [Klein et al., 1983]
La metodología de unión covalente a soportes se basa en la activación de grupos
químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. Observando
los 20 diferentes aminoácidos que se pueden encontrar en la estructura de las enzimas,
los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son la lisina, la cisteína,
la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el
ácido aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no
se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir
en la unión covalente [Arroyo, 1998; Chibata, 1978a; Guisan, 2006a]. Esta unión
dependerá de la activación que tenga el soporte durante el proceso de inmovilización.
Los soportes generalmente utilizados pueden ser de tipo inorgánicos (naturales o
manufacturados), ó soportes orgánicos como polímeros naturales ó sintéticos. Se utilizan
como soportes polisacáridos (derivados de la celulosa), proteínas, polímeros sintéticos
como resinas de intercambio iónico y policloruro de vinilo, materiales inorgánicos (arcilla
y sal) y óxidos metálicos como la alúmina, la sílica gel, óxido de zirconio u óxido de titanio
[Arroyo, 1998; Guisan, 2006b]
La inmovilización por entrecruzamiento consiste en el uso de reactivos bifuncionales o
multifuncionales, como el glutaraldehído, toluendiisocianato o diamina diazotizada, que
originan uniones intermoleculares entre las varias unidades de enzima. El resultado de
estos enlaces intermoleculares irreversibles es estabilizar la enzima para que sea capaz
de resistir condiciones extremas de pH y temperatura [Guisan, 2006a].
Marco Teórico
13
Por otro lado, en el método por atrapamiento hay retención en las cavidades internas de
una matriz sólida porosa, constituida generalmente por prepolímeros entrecruzables ó
polímeros del tipo poliacrilamida. Empleando este método de inmovilización no se
requiere gran cantidad de enzima y ésta no sufre una alteración importante en su
estructura. Es el método más estudiado para la inmovilización de enzimas y las matrices
poliméricas más empleadas son: agar, alginato, carragenina, celulosa y sus derivados,
colágeno, gelatina, resinas epóxicas, poliacrilamida, poliéster, poliestireno y poliuretano
[Arroyo, 1998; Guisan, 2006b].
La inclusión en membranas se clasifica en microencapsulación y reactores de membrana
donde la enzima se rodea de membranas semipermeables que permiten el paso del
sustrato y producto ó los reactores emplean membranas permeables al producto final
[Guisan, 2006b].
En la selección del material se deben considerar algunos factores como: (1)
disponibilidad del material a bajo costo, (2) el proceso de inmovilización debe ser simple
y efectivo respecto a la retención de la actividad enzimática, (3) debe ser alta la
capacidad y la eficiencia de la enzima inmovilizada y (4) el diseño del reactor debe ser
simple. En el método de atrapamiento se utiliza principalmente polímeros orgánicos,
aunque existe el interrogante si son más convenientes los polímeros sintéticos [Arroyo,
1998; Chibata, 1978a; Klein et al., 1983].
Tabla 1-4. Comparación entre los métodos de inmovilización. Adaptado de [Arroyo, 1998]
Método
Parámetro
Inclusión en
membranas
Adsorción
química
Unión
covalente a
soportes
Atrapamiento
Entrecruzamiento
Preparación
Fuerza de Unión
Actividad Enzimática
Regeneración Soporte
Estabilidad
Validez
Resistencia Microbiana
Costo del Proceso
Intermedia
Débil
Media-Alta
Posible
Media
General
Si
Medio-Alto
Sencilla
Media
Media
Posible
Baja
General
No
Bajo
Difícil
Fuerte
Alta
Difícil
Alta
Limitada
Si
Alto
Difícil
Media
Baja
Imposible
Alta
General
Si
Medio
Intermedia
Débil-Media
Baja
Imposible
Alta
Limitada
Si
Medio
14
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Para el caso específico de la -galactosidasa, en los últimos 20 años su inmovilización
por diferentes métodos ha ganado bastante atención en la industria de alimentos por las
ventajas que esto presenta sobre los procesos en los que se utiliza [Grosová et al.,
2008]. Considerando el alto precio de la -galactosidasa respecto al bajo valor de la
lactosa que se utiliza como sustrato en la reacción, la opción de la adición directa de la
enzima puede no ser la mejor e incentive a proponer alternativas que conduzcan a
mayores rendimientos económicos y un mejor control de la reacción en el proceso. En
comparación con la enzima en solución, la -galactosidasa inmovilizada proporcionaría
ciertas ventajas en la producción de GOS como a) una alta reutilización de enzima; b) un
aumento en el rendimiento de la reacción y la estabilidad térmica de la enzima; c) la
posibilidad de realizar la reacción en una operación continua, con formación controlada
de productos y una alta productividad del reactor; y d) la no contaminación del producto
por la enzima y el tratamiento simplificado y eficiente del biocatalizador [Gosling et al.,
2010; Grosová et al., 2008; Yang, S-T et al., 2001a]. Sin embargo, el proceso de
inmovilización puede afectar seriamente propiedades de la enzima en la reacción como:
pH, temperatura y parámetros cinéticos, según sea el método de preparación realizado
[Ladero et al., 2000; Ladero et al., 2001]. Por otro lado, si una técnica adecuada es
aplicada, la inmovilización puede mejorar las propiedades de la -galactosidasa como la
estabilidad de la enzima a altos o bajos valores de pH y temperatura. [Zhou, Q Z K et al.,
2001b]
Diferentes técnicas se han reportado para la inmovilización de -galactosidasa, como
entrecruzamiento [Sheu et al., 1998; Shin et al., 1998]; unión covalente [Bódalo et al.,
1991; Di Serio et al., 2003; Hernaiz et al., 2000]; atrapamiento [Mammarella et al., 2005] y
la adsorción [Albayrack et al., 2002]. Igualmente, diferentes tipos de soportes han sido
utilizados relacionados con estos métodos, como grafito [Zhou, Q Z K et al., 2001a],
pellets de quitosano [Sheu et al., 1998] y vidrio poroso [Bódalo et al., 1991]. Sin embargo,
la mayoría de estos métodos fueron desarrollados teniendo como propósito la reacción
de hidrólisis de la lactosa en lugar de la formación de GOS. Para este último caso,
algunos soportes usados en la inmovilización de la enzima han sido pellets de quitosano
[Sheu et al., 1998; Shin et al., 1998], pellets de celulosa [Kmínková et al., 1988], pellets
de agarosa [Berger et al., 1995], matrices de polietilenimina [Albayrack et al., 2002] y
pellets de polisiloxano- alcohol polivinílico [Neri, D et al., 2009]. En ciertos casos se
Marco Teórico
15
observó que el uso de la enzima inmovilizada en estos soportes, resultaba en una
disminución del 20-30% en el rendimiento de la producción de GOS, por la influencia de
problemas de transferencia de masa presentes en el sistema reactivo [Grosová et al.,
2008; Sheu et al., 1998; Shin et al., 1998].
Los principales inconvenientes de estos métodos son el uso de reactivos tóxicos no
permitidos en la industria de alimentos, su elevado costo de preparación y que no
admiten una aplicación a nivel industrial por su dificultad para ser escalados. Por tal
razón, durante el proceso de inmovilización factores como la naturaleza del soporte de
inmovilización, la naturaleza de los reactivos químicos empleados en los métodos y las
posibles aplicaciones relacionadas con el proceso de inmovilización, deben considerarse
para lograr una fácil regeneración del biocatalizador y unos costos de operación bajos
para el proceso industrial en el que se aplique la enzima inmovilizada. Por lo tanto, el
soporte y el método de inmovilización, son factores importantes que afectan el
desempeño de la enzima y las características del proceso en el que se utilice el
biocatalizador. Desde ese punto de vista, es interesante evaluar los efectos que tienen la
inmovilización de la -galactosidasa y el análisis cinético del uso de este biocatalizador,
con el fin de caracterizar la reacción de producción de GOS y una potencial aplicación a
nivel industrial.
Igualmente, surge la posibilidad de evaluar las condiciones de operación y el diseño del
sistema de reacción (Lotes o Continuo), que generen la mayor productividad de GOS
utilizando la transformación enzimática de lactosa presente en el lactosuero. Este
subproducto de la industria quesera tiene un gran potencial contaminante y se genera en
cantidades importantes (fabricar 1 kg de queso genera cerca de 9 kg de suero [Padín et
al., 2006]). Por tal razón, este tipo de sustancias como sustratos de la reacción,
presentan una alternativa valiosa para aprovechar adecuadamente este subproducto y
lograr un producto de alto valor agregado con diversas aplicaciones.
2. Materiales y metodología
A continuación se especifican los materiales y reactivos empleados durante la fase de
experimentación. Igualmente, se describen los procedimientos realizados para la
producción de GOS con enzima libre e inmovilizada.
2.1 Materiales
Los siguientes materiales se utilizaron durante las diferentes etapas experimentales:
a. Reactivos: Lactosa monohidrato (Merck), alginato de sodio - grado analítico
(Carlo Erba), cloruro de calcio anhidro - grado analítico (Merck), glutaraldehído en
solución acuosa al 25% p/v (Polysciences, Inc.), sílica gel 60 malla 220–450
(Sigma Aldrich),
tris(hidroximetil)aminometano (Tris) - grado reactivo (Sigma
Aldrich), o-nitrofenol--D-galactopiranosida (ONPG) para ensayos enzimáticos
(Sigma Aldrich), fosfato di ácido de potasio - grado analítico (J. T. Baker), fosfato
mono ácido de potasio (J. T. Baker) – grado analítico. Igualmente se empleó
como sustrato en las reacciones enzimáticas lacto suero en polvo (Colanta) , cuyo
análisis de composición realizado por el proveedor se presenta a continuación:
Tabla 2-1. Análisis de composición del Lactosuero en polvo
Composición
% Peso
Humedad (máx)
Acidez (como ácido láctico mín y máx)
Cenizas (máx)
Lactosa (máx)
Proteína (máx)
Grasa (máx)
Cloruro (máx)
4.0
1.0 - 1.3
6.0
80.0
11.0
0.5
0.08
El contenido de lactosa en este sustrato fue verificado en este trabajo por HPLC,
dando como resultado una concentración de lactosa de 76.38 ± 0.42 %w/w.
18
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
b. Enzima: la -galactosidasa utilizada durante toda la fase experimental fue
Lactozym Pure® 6500 L (Novozymes, Dinamarca), obtenida a partir de
Kluyveromyces lactis según datos del fabricante (Ver Anexo C).
c. Reactivos Grado HPLC: Glucosa (Carlo Erba), galactosa (Sigma Aldrich),
lactosa monohidrato (Sigma Aldrich).
2.2 Metodología
2.2.1 Actividad hidrolítica con ONPG
Inicialmente se caracterizó la actividad de hidrólisis de la enzima, mediante el protocolo
de prueba con ONPG (o-nitrofenol--D-galactopiranosida) [Iqbal et al., 2010; Ladero et
al., 2001; Nakagawa et al., 2007; Nguyen, TH. et al., 2007], con el fin de determinar las
mejores condiciones de pH y temperatura en las que la enzima tiene mayor actividad de
hidrólisis. La evaluación de la actividad, se realizó bajo las siguientes condiciones de
temperatura 20, 30, 40, 50 y 60± 1ºC; y 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.0 unidades de
pH. Los intervalos establecidos para cada variable surgieron de resultados reportados
[Yang, S-T et al., 2001a] para la actividad de la -galactosidasa obtenida a partir de
Kluyveromyces lactis y las condiciones recomendadas por el fabricante de la enzima
(Anexo C). Dicha evaluación, a las condiciones mencionadas, se efectuó para la enzima
libre e inmovilizada con los cuatro métodos analizados.
La mezcla de reacción para cada ensayo fue de 100 µL de enzima en dilución (1/100) o
0.05 g de biocatalizador (enzima inmovilizada) en buffer fosfato de potasio 0.1 M al pH de
cada ensayo, con 4.9 mL de ONPG 0.200 mM en la solución buffer de las mismas
características. La reacción se llevó a cabo en un baño térmico a la respectiva
temperatura del ensayo y después de tres minutos, se detuvo adicionando 1 mL de
carbonato de sodio (Na2CO3) al 4% (w/v) en agua destilada. [Iqbal et al., 2010;
Nakagawa et al., 2007; Nguyen, TH. et al., 2007; Splechtna et al., 2007]. En esta
medición se consideró como blanco, la mezcla de reactivos en las proporciones antes
mencionadas, exceptuando la presencia de -galactosidasa libre o inmovilizada.
Materiales y metodología
19
Finalmente, se hizo la medición de absorbancia para cada muestra a 420 nm, en un
espectrofotómetro UV-VIS SPECTRONIC® - Milton Roy Genesys 5. Los ensayos de
actividad hidrolítica con ONPG se realizaron por triplicado.
Para determinar la relación entre la concentración de ONPG y la absorbancia máxima del
ONP a 420 nm (Figura 2-1), se realizó una curva de calibración a diferentes
concentraciones de ONPG: 0.025, 0.050, 0.100, 0.150, 0.200 y 0.250 mM a temperatura
ambiente y pH 6.0. La absorbancia se registró después de reacción completa con la
enzima (t >20 min.). Los ensayos para esta curva de calibración se realizaron por
triplicado (Anexo A).
+ H2O
+
 - galactosidasa
ONPG
Galactosa
ONP
Figura 2-1. Reacción de ONPG con -Galactosidasa
La actividad hidrolítica se definió como el número de µmoles de ONP producidas en el
tiempo por volumen de enzima utilizada, como se presenta a continuación:
𝑼𝒉 =
𝝁𝒎𝒐𝒍 𝑶𝑵𝑷 𝒕𝒇 −𝝁𝒎𝒐𝒍 𝑶𝑵𝑷 𝒕𝟎
𝒗𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂 𝒎𝑳 ×𝒕 [𝒎𝒊𝒏]
Ecuación 2-1
La determinación de la actividad hidrolítica se hizo tanto para la enzima libre como para
cada uno de los biocatalizadores obtenidos con los cuatro métodos de inmovilización
estudiados. En estos últimos casos, se realizó la medición de actividad usando
directamente la enzima inmovilizada (Directa), así como al sobrenadante obtenido
durante el proceso de inmovilización (Indirecta). Esto con el fin de determinar el
porcentaje de retención de actividad en los soportes evaluados.
Posteriormente, con los perfiles obtenidos en esta prueba se establecieron condiciones
cercanas, para realizar las pruebas de actividad de transgalactosilación con lactosa y
lactosuero como sustrato. En este caso fue necesario considerar el efecto de la
concentración inicial de lactosa en la reacción como se describe en la siguiente sección.
20
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
2.2.2 Producción de GOS con Enzima Libre
Para la producción de GOS se utilizó como sustrato lactosa grado reactivo y lactosuero
deshidratado. La evaluación del efecto de la temperatura, pH y concentración de lactosa
sobre la actividad enzimática de la  - Galactosidasa para producir GOS, se realizó
mediante un diseño experimental de superficie de respuesta, efectuado de manera
factorial 33 con una repetición en el punto central. Las condiciones para las variables
analizadas fueron: 30, 40 y 50 ± 1ºC, 5.5, 6.0, y 6.5 ± 0.01 unidades de pH y relaciones
enzima/lactosa inicial de 1.00, 1.25, 1.50. Esta relación se define como se muestra a
continuación y se obtuvo variando la concentración de lactosa inicial en valores de 333,
400 y 500 g L-1:
𝑹=
𝑷𝒆𝒔𝒐 𝑬𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂 𝒈𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂
𝑷𝒆𝒔𝒐 𝑳𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂 𝒊𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒈𝑳𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂
× 𝟏𝟎𝟎
Ecuación 2-2
Como variable de respuesta del diseño experimental se definió el Rendimiento de la
reacción hacia la producción de GOS (YGOS), definido como se muestra a continuación:
𝒀𝑮𝑶𝑺
𝒕
=
𝑴𝑮𝑶𝑺−𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍
𝑴𝑳𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂
𝒕
× 𝟏𝟎𝟎
Ecuación 2-3
𝒕𝟎
Siendo Ci la concentración de GOS o lactosa según corresponda.
Adicional a esta variable se definió también la Conversión de lactosa (XLac) y la
Selectividad a galactooligosacáridos (SGOS), con el fin de observar el comportamiento de
la producción de GOS, respecto a los demás compuestos involucrados en la reacción.
𝑿𝑳𝒂𝒄 =
𝑺𝑮𝑶𝑺 =
𝒕𝟎 − 𝑴𝑳𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂 𝒕
× 𝟏𝟎𝟎
𝑴𝑳𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂 𝒕𝟎
𝑴𝑳𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂
𝑴𝑮𝑶𝑺
𝒕
𝑴𝑮𝑶𝑺 𝒕 + 𝑴𝑮𝒍𝒖 𝒕 + 𝑴𝑮𝒂𝒍 𝒕
× 𝟏𝟎𝟎
Ecuación 2-4
Ecuación 2-5
Los ensayos de producción de GOS se realizaron por duplicado empleando 100 mL de
solución de lactosa o lactosuero en buffer fosfato de potasio 0.1 M a los pH requeridos y
la temperatura de cada ensayo.
Materiales y metodología
21
La solución de lactosa o lactosuero se llevó a la temperatura requerida y se mantuvo en
agitación (150 r.pm.) y temperatura controlada (Heidolph Promax 1020) durante 20
minutos, antes de comenzar la reacción. Posteriormente, la -Galactosidasa fue
adicionada a la solución y se tomó 1 mL de muestra en diferentes tiempos: 0, 2.5, 5, 10,
20, 40 y 90 min para el seguimiento del consumo de lactosa y formación de GOS. Cada
muestra se dejó durante 10 min en agua en ebullición y a continuación, se sometió a
choque térmico en baño de hielo por 5 min, para detener la reacción enzimática.
Las muestras fueron filtradas por membranas de celulosa 0.45 m y se hizo una dilución
1:10 con cada una de ellas. Finalmente se almacenaron a 4±1°C para posterior
cuantificación de compuestos por cromatografía líquida.
2.2.3 Producción de GOS con Enzima Inmovilizada
Para el estudio de la producción de GOS pero bajo condiciones de inmovilización de la
enzima β-galactosidasa, se utilizaron dos tipos de inmovilización por atrapamiento y dos
tipos de inmovilización por unión covalente. Los procedimientos para obtener los
respectivos biocatalizadores se describen en las secciones posteriores.
La producción de GOS con cada enzima inmovilizada se evaluó mediante un diseño
experimental de superficie de respuesta, efectuado de manera factorial 33 con una
repetición en el punto central. Las condiciones para las variables analizadas fueron: 30,
40 y 50 ± 1ºC, 5.5, 6.0, y 6.5 ± 0.01 unidades de pH y concentración inicial de lactosa de
333, 400 y 500 g L-1. En la determinación de estas condiciones se tuvieron en cuenta los
resultados de la etapa anterior de producción y la evaluación de la actividad hidrolítica
con ONPG.
Los ensayos de producción de oligosacáridos se realizaron por duplicado empleando 100
mL de solución de lactosa o lactosuero en buffer fosfato de potasio 0.1 M a los pH
requeridos y la temperatura de cada ensayo.
22
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
La solución de lactosa o lactosuero se llevó a la temperatura requerida y se mantuvo en
agitación (150 r.pm.) y temperatura controlada (Heidolph Promax 1020) durante 20
minutos, antes de comenzar la reacción. Posteriormente, la -Galactosidasa inmovilizada
(0.5 g) fue adicionada a la solución, manteniendo la temperatura a 150 r.p.m. y se tomó 1
mL de muestra en diferentes tiempos: 0, 10, 30, 45, 90, 150 y 270 min. Cada muestra se
dejó durante 10 min en agua en ebullición y a continuación, se sometió a choque térmico
en baño de hielo por 5 min, para detener la reacción enzimática.
Las muestras fueran filtradas por membranas de celulosa 0.45 m y se hizo una dilución
1:10 con cada una de ellas. Finalmente se almacenaron a 4±1°C para posterior
cuantificación de compuestos por cromatografía líquida.
2.2.4 Inmovilización por atrapamiento en Alginato de Calcio
Para esta inmovilización se utilizaron 50 mL de solución del alginato de sodio al 2% (w/v)
en agua destilada, que se mezclaron con 500 L de enzima, dejando en agitación
magnética durante 1 hora. Esta mezcla se bombeó con una bomba peristáltica, sobre
una solución de cloruro de calcio 0.2 M, enfriada previamente. La velocidad de la bomba
fue graduada con el fin de obtener pellets de un tamaño adecuado (Diámetro promedio: 3
mm aprox.) [Guisan, 2006b; Sánchez et al., 2008].
Los pellets fueron almacenados por 12 horas en la solución de cloruro de calcio a 5ºC
hasta su posterior uso en los ensayos.
2.2.5 Inmovilización por atrapamiento en Alginato de Calcio con
material zeolítico.
En este procedimiento se utilizaron 50 mL de solución del alginato de calcio al 2% y 0.1 g
de material zeolítico, que se mezclaron con 500 L de enzima, dejando en agitación
magnética durante 1 hora. Este material se adicionó con el fin de aumentar el tamaño de
Materiales y metodología
23
poro [Serrato, 2004] en los pellets de alginato de calcio. Esta mezcla se bombeó con una
bomba peristáltica, sobre una solución de cloruro de calcio 0.2 M (previamente llevada a
5°C). Al igual que en el método anterior, la velocidad la bomba fue graduada con el fin de
obtener pellets del mismo tamaño (Diámetro promedio: 3 mm aprox.).
Los pellets fueron almacenados por 12 horas en la solución de cloruro de calcio a 5ºC
hasta su posterior uso en los ensayos.
2.2.6 Inmovilización por Unión Covalente con Sílica.
En la inmovilización de la enzima por este método se utilizaron 10 mL de una solución
buffer fosfato pH 7.0 al 0.1 M y 1 g de sílica gel lavada con agua desionizada, a esta
mezcla se agregó 500 L de enzima, dejando en agitación magnética durante 12 horas
[Chibata, 1978b; Guisan, 2006b; Mariotti et al., 2008]. Esta mezcla fue filtrada y
posteriormente lavada con solución buffer fosfato de potasio 0.1 M, pH 7.0. La enzima
inmovilizada filtrada se adicionó directamente a la mezcla de reacción.
2.2.7 Inmovilización por Unión Covalente con Sílica Tratada.
Para este tipo de inmovilización por unión covalente, se lavó 1 g de sílica gel con agua
desionizada y se puso en contacto con una solución de Tris 0.5 M en agua destilada (10
mL) durante 4 horas. Posteriormente se filtró la sílica y se mezcló con 10 mL de solución
de glutaraldehído al 10% v/v en buffer fosfato de potasio (pH 7.0, 0.1 M), en agitación
magnética durante 4 horas. [Chibata, 1978b; Guisan, 2006b; Mariotti et al., 2008; Sheu et
al., 1998]. La sílica tratada fue filtrada y lavada varias veces con la misma solución buffer.
Para realizar la inmovilización de la enzima se agregó la sílica a 10 mL de buffer fostato
de potasio y se adicionaron 500 L de enzima, manteniendo agitación magnética
durante 12 horas. Finalmente esta mezcla fue filtrada y lavada nuevamente con solución
buffer. La enzima inmovilizada filtrada se adicionó directamente a la mezcla de reacción.
24
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
2.2.8 Análisis HPLC
Para la identificación y cuantificación de azúcares se utilizó Cromatografía Líquida de
Alto Desempeño (HPLC) comparando y validando los resultados con estándares de
lactosa, glucosa y galactosa (Ver Anexo B).
Las características del equipo fueron: HPLC (LaChrom Elite ®, Merck-Hitachi High-Tech,
Tokio, Japón) constituido por una bomba (L-2130) con desgasificador en línea, un horno
de columnas (L-2350), un automuestreador (L-2200) con volumen de inyección de 20 L,
un detector de Índice de Refracción (L-2490) y equipado con EZChrom Elite Software
para la adquisición y tratamiento de datos (Scientific Software, Pleasonton, CA, USA).
Se analizaron las muestras en una columna CarboSep CHO411 (300 mm x 7.8 mm,
BioRad, USA) bajo las siguientes condiciones de operación: 75°C temperatura de
columna, fase móvil agua desionizada a un flujo de 0.4 cm3 min-1 y 40°C temperatura en
el detector de índice de refracción.
Los azúcares cuantificados fueron lactosa, galactosa, glucosa y GOS. Los GOS totales
producidos fueron reportados por balance de masa respecto a los otros compuestos
identificados y la concentración de lactosa inicial.
2.2.9 Modelo cinético y determinación de parámetros
Con base en las reacciones presentadas en las Figuras 1.3 y 1.4 se propuso el siguiente
mecanismo de reacción para describir la producción de GOS.
𝐿𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 + 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
𝐺𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 − 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
k1
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐺𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 − 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
k2
k3
𝐿𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 + 𝐺𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 − 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
𝐺𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 + 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
k4
k5
𝑇𝑟𝑖𝑠𝑎𝑐á𝑟𝑖𝑑𝑜 (𝐺𝑂𝑆) + 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
Reacción 1
Reacción 2
Reacción 3
Materiales y metodología
25
Este mecanismo ha sido planteado y aplicado por otros autores para conocer la
concentración de los compuestos involucrados en la reacción [Boon, M. A. et al., 1999;
Boon, M.A. et al., 2000; Chen, C W et al., 2003]. En este se consideraron únicamente los
oligosacáridos producidos de tercer grado de polimerización, como el principal GOS
producido, debido a la limitación en la cuantificación de GOS con la técnica analítica
utilizada.
Se utilizó el modelo cinético de reacciones elementales, cuyo sistema de ecuaciones
empleado para la conocer la evolución en el tiempo de la concentración de cada
compuesto, se presenta a continuación
𝒅𝑪𝑳𝒂𝒄
𝒅𝒕
= − 𝒌𝟏 𝑪𝑳𝒂𝒄 𝑪𝑬 − 𝒌𝟒 𝑪𝑬−𝑮𝒂𝒍 𝑪𝑳𝒂𝒄 + 𝒌𝟓 𝑪𝑮𝑶𝑺 𝑪𝑬
Ecuación
2-6
𝒅𝑪𝑮𝒍𝒖
𝒅𝒕
= 𝒌𝟏 𝑪𝑳𝒂𝒄 𝑪𝑬
Ecuación 2-7
𝒅𝑪𝑮𝒂𝒍
𝒅𝒕
= 𝒌𝟐 𝑪𝑬−𝑮𝒂𝒍 − 𝒌𝟑 𝑪𝑬 𝑪𝑮𝒂𝒍
Ecuación 2-8
𝒅𝑪𝑮𝑶𝑺
𝒅𝒕
= 𝒌𝟒 𝑪𝑬−𝑮𝒂𝒍 𝑪𝑳𝒂𝒄 − 𝒌𝟓 𝑪𝑮𝑶𝑺 𝑪𝑬
Ecuación 2-9
𝒅𝑪𝑬
𝒅𝒕
= − 𝒌𝟏 𝑪𝑳𝒂𝒄 𝑪𝑬 + 𝒌𝟐 𝑪𝑬−𝑮𝒂𝒍 − 𝒌𝟑 𝑪𝑬 𝑪𝑮𝒂𝒍 + 𝒌𝟒 𝑪𝑬−𝑮𝒂𝒍 𝑪𝑳𝒂𝒄 − 𝒌𝟓 𝑪𝑮𝑶𝑺 𝑪𝑬
𝒅𝑪𝑬−𝑮𝒂𝒍
𝒅𝒕
= 𝒌𝟏 𝑪𝑳𝒂𝒄 𝑪𝑬 − 𝒌𝟐 𝑪𝑬−𝑮𝒂𝒍 + 𝒌𝟑 𝑪𝑬 𝑪𝑮𝒂𝒍 − 𝒌𝟒 𝑪𝑬−𝑮𝒂𝒍 𝑪𝑳𝒂𝒄 + 𝒌𝟓 𝑪𝑮𝑶𝑺 𝑪𝑬
Siendo:
ki: constante cinética de cada reacción.
CLac: concentración de lactosa.
CE: concentración de enzima.
CGlu: concentración de glucosa.
CGal: concentración de galactosa.
CE-Gal: concentración de complejo enzima-galactosa.
Ecuación 2-10
Ecuación 2-11
26
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Los parámetros cinéticos del modelo propuesto fueron determinados empleando los
datos experimentales de la producción de GOS a partir de lactosa y lactosuero como
sustrato, y en los esquemas de producción con enzima libre y la técnica de inmovilización
con mayor rendimiento a GOS. Los parámetros se estimaron por regresión no lineal,
minimizando por el método de Nelder-Mead, la suma de las diferencias al cuadrado,
entre las concentraciones de cada compuesto medidas y calculadas. La minimización se
realizó por medio de un algoritmo desarrollado en Wolfram Mathematica 6.0TM. El método
de Runge-Kutta se utilizó para la solución numérica del sistema de ecuaciones
diferenciales
propuesto
concentraciones.
en
cada
modelo,
y
generar
el
respectivo
perfil
de
3. Resultados y Análisis
3.1 Identificación y cuantificación de GOS
La identificación de GOS se hizo por medio de HPLC con la columna CarboSep CHO411.
Esta columna separa por tamaño de moléculas los compuestos analizados, permitiendo
identificar oligosacáridos de diferente grado de oligomerización. En la figura 3-1 se
presentan los cromatogramas obtenidos en cada uno de los tiempos de muestreo,
durante la producción de GOS con enzima libre. En dichos cromatogramas se
identificaron tri- y tetrasacáridos producidos durante la reacción de lactosa a altas
concentraciones con -galactosidasa. Del mismo modo, se aprecia que el tiempo de
retención de la lactosa es de 18.5 minutos aproximadamente en la columna empleada,
mientras que para los compuestos con mayor grado de oligomerización identificados en
la síntesis, este tiempo fue menor. Caso contrario ocurre para moléculas más simples
como glucosa o galactosa cuyo tiempo de retención es mayor, como se presenta en la
calibración realizada para estos compuestos (Anexo B).
1000
900
Lactosa
800
Glucosa
700
GOS
uRIU
Galactosa
t Rx: 0 min
600
t Rx: 2.5 min
500
t Rx: 5 min
400
t Rx: 10 min
300
t Rx: 20 min
200
t Rx: 40 min
100
t Rx: 90 min
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 3-1. Evolución de los cromatogramas de HPLC durante la producción de GOS con enzima libre
(Temperatura = 40°C, pH= 6.5 y R: 1.00)
28
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Igualmente, se observa la disminución de la concentración de lactosa a medida que
transcurre el tiempo de reacción, así como la formación y aumento en la concentración
de monosacáridos y compuestos de mayor peso molecular. Estos compuestos
corresponden a oligosacáridos de lactosa o galactooligosacáridos (GOS) cuya
cuantificación se hizo partiendo del valor inicial de lactosa y la cantidad de glucosa y
galactosa producidas durante la reacción. Por balance de materia se determinó la
cantidad total de GOS formados en los tiempos de muestreo, tomando como referencia la
concentración inicial de lactosa y restando las concentraciones de los monosacáridos
obtenidas con las curvas de calibración presentadas en el Anexo B.
Este tipo de metodología para la identificación y cuantificación de galactooligosacáridos
ha sido reportada en estudios como la síntesis enzimática de oligosacáridos utilizando
-galactosidasa de Bacillus circulans [Boon, M. A. et al., 1999] o la producción de GOS
con enzima libre [Boon, M.A. et al., 2000; Iwasaki et al., 1996; Mahoney, 1998] o
inmovilizada en diferentes soportes [Neri, D et al., 2009; Shin et al., 1998; Will Chen et
al., 2003]. La confiabilidad de los resultados reportados de esta forma, ha permitido el
modelamiento y estimación de parámetros cinéticos para describir la obtención de GOS
[Boon, M. A. et al., 1999], así como el estudio de diferentes configuraciones de reactor
para su producción [Curda et al., 2006; Hsu et al., 2007].
Por otro lado, se han reportado otras técnicas analíticas para la identificación de
componentes como alolactosa, galactobiosa y compuestos de mayor grado de
oligomerización producidos durante la reacción de lactosa con -galactosidasa. Algunas
de estas técnicas son HPLC integrado con espectrómetro de masas (MS), que permite
identificar hasta heptasacáridos [Hernádez-Hernández et al., 2011], HPLC con detector
amperométrico de pulsos (PAD) [Rodriguez-Fernandez et al., 2011; Splechtna et al.,
2007; Splechtna et al., 2006] y espectrofotometría UV [Dias et al., 2009]. En todas ellas
se hace una relación del área de los picos para establecer el porcentaje másico de cada
compuesto o un balance de masa para obtener los perfiles de concentración en el tiempo
de reacción.
Resultados y Análisis
29
3.2 Actividad hidrolítica
En la evaluación de la actividad de hidrólisis de la enzima, se obtuvo que a pH inferiores
a 4.5 y superiores a 8, se pierde la función catalizadora de la enzima sobre el enlace  14 entre el ONP y la galactosa [Nguyen, TH. et al., 2007]. Este comportamiento se puede
observar en la figura 3-2A, donde también se muestra la actividad relativa de la enzima
(Actividad observada / Máxima actividad) a diferentes valores de pH y 40°C. Se
determinó que la mejor condición para la enzima en la reacción de hidrólisis se tiene a pH
6.0, donde se obtuvo una actividad de 6354 ± 205 Uh. Esta actividad enzimática equivale
a 5693 ± 205 mol ONP/ genz x min, que comparado con el valor máximo reportado por el
fabricante es inferior en un 12.4%. La diferencia entre los dos valores puede deberse a
que la actividad reportada por el proveedor se determinó a 45°C y pH=6.0 (Anexo C).
100
100
B
Actividad Relativa (%)
Actividad Relativa (%)
A
80
60
40
20
80
60
40
20
0
0
4.0
5.0
6.0
pH
7.0
8.0
9.0
10
20
30
40
50
60
70
T ( C)
Figura 3-2. Comportamiento de la actividad hidrolítica con ONPG respecto al pH @ 40°C (A) y la
temperatura @ pH = 6.0 (B), para enzima libre
Por otro lado, en la figura 3-2B se presenta el comportamiento de la actividad hidrolítica
respecto a la temperatura de reacción a pH = 6.0. En este caso la galactosidasa
empleada alcanzó la mejor actividad a 40°C, mientras que presentó una actividad relativa
del 30% aproximadamente (1830 ± 136 Uh) a temperatura ambiente, con una tendencia a
disminuir a menores temperaturas. Del mismo modo, a 50°C se obtuvieron 2829 ± 211 Uh
con valores inferiores a mayor temperatura.
En la Tabla 3-1 se presentan algunos de los resultados y condiciones reportadas en la
medición de la actividad hidrolítica de distintas -galactosidasas obtenidas a partir de
diferentes microorganismos. Se puede evidenciar que para el género de Kluyveromyces
30
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
las condiciones obtenidas en este estudio para la mayor actividad hidrolítica de la
enzima, son muy similares a las reportadas por otros autores [Ladero et al., 2006; Ladero
et al., 2002; Martínez-Villaluenga et al., 2008a; Santos et al., 1998]. Asimismo, se han
publicado algunos casos en los que la mejor temperatura de hidrólisis de ONPG, difiere
de la condición encontrada experimentalmente en el presente estudio. Esto debido a que
las enzimas utilizadas en dichos casos, se obtienen a partir de microorganismos
psicrófilos [Nakagawa et al., 2007] o termófilos [Ladero et al., 2005; Ladero et al., 2002].
Tabla 3-1. Actividad hidrolítica con ONPG para -galactosidasa obtenida de diferentes microorganismos
Máx Actividad
(Uh)
pH
T (°C)
2040
8.0
10
[Nakagawa et al., 2007]
3000
7.5
25
Kluyveromyces fragilis
2900
6.5
40
Kluyveromyces lactis
3205
6.5
40
Lactobacillus acidophillus
Lactobacillus reuteri
1800
6.5 – 8.0
8.0
55
50
Thermus sp strain T2
5500
5.0
70
[Ladero et al., 2001]
[Ladero et al., 2006; Ladero et al.,
2002; Santos et al., 1998]
[Martínez-Villaluenga et al.,
2008a]
[Nguyen, TH et al., 2007]
[Nguyen, TH. et al., 2007]
[Ladero et al., 2005; Ladero et al.,
2002]
Fuente de enzima
Arthrobacter psychrolactophilus
strain F2
Escherichia coli JM109
Referencia
Con base en los resultados encontrados para la actividad hidrolítica de la -galactosidasa
estudiada, las condiciones sugeridas por el fabricante y algunas condiciones reportadas
por otros autores, se establecieron los valores de pH y temperatura para el estudio de la
producción de GOS. Esto considerando que la actividad de transgalactosilación de la
enzima puede tener un comportamiento similar al de la actividad hidrolítica [Boon, M.A. et
al., 2000; Hsu et al., 2007; Ladero et al., 2000; Ladero et al., 2001; Santos et al., 1998;
Splechtna et al., 2006]. Los resultados de la producción de GOS a partir de lactosa y
lactosuero se muestran en la siguiente sección.
Resultados y Análisis
31
3.3 Producción de GOS utilizando -galactosidasa libre
3.3.1 Sustrato: Lactosa
El efecto de la concentración inicial de lactosa, el pH, la temperatura y la concentración
de enzima, sobre la actividad enzimática de la -galactosidasa, el rendimiento de la
producción de GOS (YGOS), la conversión de lactosa (XLac) y la selectividad de la reacción
a GOS (SGOS), fueron estudiados empleando un diseño experimental 33 con una
repetición en el punto central y duplicado en todos el diseño experimental. El análisis de
varianza del diseño experimental elaborado indica que para un error del 5%, todos los
factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la respuesta estudiada
(YGOS), como se presenta en la Tabla 3-2. No obstante, el efecto de la relación entre la
cantidad de enzima y la cantidad de lactosa inicial (R), no es tan marcado como el efecto
de la temperatura y el pH. Esto se observa tanto en las superficies de respuesta, cuyo
coeficiente de correlación ajustado fue de 0.9267, como en los perfiles de lactosa,
glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-3, 3-4, 3-5 y 3-7).
Los perfiles del efecto de los factores y su interacción sobre el rendimiento de la
producción a GOS se presentan en la Figura 3-6. En esta se observa que a pH 6.0, 40°C
y R de 1.25 (Figura 3-4 D), se logra el mayor rendimiento de la reacción hacía la
producción de GOS (32.71 ± 1.33 %). Esto también se puede apreciar en los perfiles de
concentración, en los que la mayor cantidad de galactooligosacáridos a estas
condiciones se alcanza a los 40 min de reacción: 130.84 ± 5.32 g L-1 (Tabla 3-4). Aunque
con una relación enzima/lactosa inicial menor (R=1.00) con las mismas condiciones de
pH y temperatura se obtiene una concentración máxima de GOS de 135.61 ± 1.32 g L-1
(Figura 3-3D), este valor no representa un mayor rendimiento de la reacción hacía
galactooligosacáridos, debido a que se requiere una mayor cantidad de lactosa inicial
(500 gL-1). Esto puede deberse a la inhibición de la enzima por mayor galactosa
producida [Boon, M. A. et al., 1999; Ladero et al., 2001; Neri, D et al., 2009; Rogalski et
al., 1994], puesto que en el caso de la reacción con menos lactosa (R=1.25) se obtiene
una máxima concentración de galactosa 45.23 ± 4.27 g L-1 (Figura 3-4 C, D), mientras
que con 500 g L-1 es valor fue de 91.42 ± 0.31 g L-1 (Figura 3-3 C, D).
32
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
140
450
120
400
100
350
80
300
60
250
120
0
20
40
60
80
60
100
50
80
40
60
30
20
10
0
100
0
0
20
Tiempo (min)
600
250
200
80
100
400
150
300
100
200
D
140
160
Galactosa (g L -1)
200
160
30 C
40 C
50 C
180
Glucosa (g L -1)
Lactosa (g L -1)
500
60
Tiempo (min)
30 C
40 C
50 C
C
40
120
140
100
120
100
80
80
60
GOS (g L-1)
0
70
20
20
150
B
40
40
200
80
30 C
40 C
50 C
GOS (g L-1)
140
Galactosa (g L -1)
500
Lactosa (g L-1)
160
30 C
40 C
50 C
A
Glucosa (g L-1)
550
60
40
50
100
40
20
20
0
0
0
20
40
60
80
0
100
0
0
20
Tiempo (min)
600
160
180
80
100
140
30 C
40 C
50 C
140
F
120
120
300
100
80
200
120
100
100
80
80
60
60
60
GOS (g L-1)
140
400
Galactosa (g L -1)
160
Glucosa (g L-1)
Lactosa (g L-1)
500
60
Tiempo (min)
200
30 C
40 C
50 C
E
40
40
40
40
100
20
0
0
0
20
40
60
80
Tiempo (min)
Lactosa (
), Glucosa (- - -)
100
20
20
0
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
), GOS ( - - -)
Galactosa (
Figura 3-3. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.00 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosa
Resultados y Análisis
100
100
80
300
60
250
40
60
80
50
70
60
40
50
30
40
30
200
20
20
20
150
B
GOS (g L-1)
350
70
30 C
40 C
50 C
90
Galactosa (g L-1)
400
Lactosa (g L -1)
120
30 C
40 C
50 C
A
Glucosa (g L -1)
450
33
10
10
100
0
20
40
60
80
0
100
0
0
20
Tiempo (min)
30 C
40 C
50 C
C
400
120
80
100
100
100
250
80
200
60
150
Glucosa (g L-1)
120
300
160
30 C
40 C
50 C
140
350
Lactosa (g L-1)
60
Tiempo (min)
160
Galactosa (g L -1)
450
40
D
140
120
80
100
60
80
60
40
40
100
GOS (g L-1)
0
40
20
20
50
0
20
0
20
40
60
80
0
100
0
0
20
Tiempo (min)
30 C
40 C
50 C
Lactosa (g L -1)
400
100
140
300
120
250
100
200
80
150
60
100
40
50
20
0
0
20
40
60
80
Tiempo (min)
), Glucosa (- - -)
Lactosa (
80
100
100
120
30 C
40 C
50 C
160
350
0
120
Galactosa (g L -1)
E
60
Tiempo (min)
180
Glucosa (g L -1)
450
40
F
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
GOS (g L-1)
0
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
Galactosa ( ), GOS ( - - -)
Figura 3-4. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.25 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosa
34
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
140
140
120
120
250
100
200
80
150
60
100
Glucosa (g L-1)
40
50
20
0
0
20
40
60
80
25
80
20
60
15
40
10
20
5
0
100
0
0
20
160
160
80
100
120
200
100
150
80
Glucosa (g L -1)
250
100
D
90
80
140
Lactosa (g L-1)
60
30 C
40 C
50 C
140
Galactosa (g L -1)
300
40
Tiempo (min)
180
30 C
40 C
50 C
C
30
100
Tiempo (min)
350
35
B
120
70
100
60
80
50
40
60
60
30
100
40
40
50
20
20
20
0
0
0
20
40
60
80
10
0
100
0
0
20
Tiempo (min)
300
160
140
120
250
80
40
60
30
40
40
20
20
20
10
60
50
0
0
60
80
Tiempo (min)
Lactosa (
), Glucosa ( - - -)
100
70
50
80
100
80
F
100
150
40
100
60
100
20
80
120
200
0
60
30 C
40 C
50 C
140
Glucosa (g L -1)
Lactosa (g L-1)
160
30 C
40 C
50 C
E
40
Tiempo (min)
Galactosa (g L -1)
350
GOS (g L-1)
0
30 C
40 C
50 C
0
GOS (g L-1)
Lactosa (g L-1)
300
160
GOS (g L-1)
30 C
40 C
50 C
A
Galactosa (g L -1)
350
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
Galactosa (
), GOS (- - -)
Figura 3-5. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.50 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosa
Resultados y Análisis
35
Figura 3-6. Efectos principales de la temperatura, pH y la relación enzima/lactosa inicial R, sobre YGOS
(Enzima Libre – Sustrato: Lactosa)
Varios autores [Park, A-R et al., 2010; Portaccio et al., 1998; Shulka et al., 1993; Yang, ST et al., 2001b] han reportado que la galactosa es un inhibidor competitivo de la hidrólisis
de lactosa y de las reacciones de transgalactosilación. [Chen, S X et al., 2001; Ladero et
al., 2001; Ladero et al., 2002; Neri, D B, V. et al., 2009; Rodriguez-Fernandez et al., 2011;
Sanz-Valero, 2009] reportaron los efectos de la adición de galactosa y/o glucosa durante
la reacción de la -galactosidasa con lactosa, encontrando una disminución simultánea
en la hidrólisis y la producción de GOS, debido a la inhibición por galactosa. Asimismo, la
glucosa también influye en la cinética de la reacción de transgalactosilación actuando
como un inhibidor no competitivo, por lo que su efecto es menor que el causado por la
galactosa [Cavaille et al., 1995; Shin et al., 1998].
Por otro lado, en los casos de producción con una mayor relación enzima/lactosa inicial
(R=1.50) se observó la menor producción de GOS para todas las condiciones de
temperatura y pH. Esto se evidencia también en el comportamiento de la selectividad de
la reacción hacía GOS presentado en la Figura 3-8B. Sin embargo, en esta condición de
menor concentración de lactosa inicial (333 g L-1) se obtuvo la mayor conversión del
sustrato (Figura 3-8A). Dicho comportamiento se debe a que a menores concentraciones
de lactosa, prevalece la actividad de hidrólisis sobre la actividad de transgalactosilación
por el mecanismo de reacción durante la formación de galactooligosacáridos [Boon, M.A.
et al., 2000; Martínez-Villaluenga et al., 2008b; Rodriguez-Fernandez et al., 2011;
Splechtna et al., 2007; Torres et al., 2010; Will Chen et al., 2003; Yang, S-T et al., 2001a].
A medida que la concentración de lactosa disminuye, la probabilidad de transferir el
complejo galactósido-enzima al agua aumenta, debido a que es más difícil que otra
unidad de lactosa u oligosacárido acepten el complejo para la formación de GOS [Zhou,
Q Z K et al., 2001b].
36
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Tabla 3-2. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa libre en la prodición de GOS a partir de lactosa
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:Temperatura
B:pH
C:R
AA
AB
AC
BB
BC
CC
bloques
Error total
Total (corr.)
226.921
589.722
30.1666
1499.87
43.781
0.257819
1204.85
0.087713
131.632
1.52536
264.068
4310.74
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
45
55
226.921
589.722
30.1666
1499.87
43.781
0.257819
1204.85
0.087713
131.632
1.52536
5.86817
0.0000
0.0000
0.0282
0.0000
0.0090
0.8349
0.0000
0.9032
0.0000
0.6127
38.67
100.50
5.14
255.59
7.46
0.04
205.32
0.01
22.43
0.26
El comportamiento del efecto de la temperatura y el pH sobre la producción de GOS a
cualquier valor de concentración inicial de lactosa (Figura 3-6 y 3-7), muestra la misma
tendencia que la actividad hidrolítica determinada con ONPG. De este modo, a un pH
inferior a 6.0 y a una temperatura de 50°C se observó la menor actividad de
transgalactosilación de la enzima, mientras que la mayor producción de GOS se obtuvo a
las condiciones de mayor actividad de hidrólisis.
El rendimiento de GOS respecto a la conversión de lactosa durante la reacción, tuvo un
comportamiento similar al reportado por otros autores [Curda et al., 2006; Hsu et al.,
2007; Splechtna et al., 2007; Yang, S-T et al., 2001a]. La mayor producción de
galactooligosacáridos se registró después de alcanzar un 50% de conversión de lactosa,
para todos los casos de concentración inicial de lactosa evaluados (Figura 3-8A). Por otro
lado, se observa que la selectividad de la reacción hacía GOS decrece después de este
porcentaje, debido a que los oligosacáridos formados comienzan a ser hidrolizados para
producir monosacáridos (Figura 3-8B). Este comportamiento es más evidente cuando se
emplean menores concentraciones iniciales de lactosa (R=1.50) por las razones
expuestas anteriormente.
Resultados y Análisis
37
A)
B)
C)
Figura 3-7. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima libre y lactosa como
sustrato a pH 5.5 (A), 6.0 (B) y 6.5 (C)
El mayor rendimiento a GOS obtenido durante la reacción con lactosa y las respectivas
condiciones (Tabla 3-4), fue similar
al reportado por
otros autores usando
-galactosidasas de microorganismos del mismo género (Tabla 3-5). Se aprecia también
que a través de microorganismos modificados, se han obtenido enzimas que producen
una mayor cantidad de oligosacáridos de lactosa, con una menor o igual concentración
inicial de lactosa [Boon, M.A. et al., 2000; Chen, S X et al., 2001; Hung et al., 2002].
35
60
A
R=1.00
B
R=1.25
50
R=1.50
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
R=1.00
R=1.25
30
25
20
15
10
R=1.50
40
30
20
10
5
0
0
0
20
40
60
Conversión de Lactosa (X Lac)
80
100
0
20
40
60
80
100
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-8. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS con enzima libre y lactosa,
respecto a la conversión de lactosa a diferentes relaciones de enzima/lactosa inicial (pH=6.0 y 40°C)
38
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.3.2
Sustrato: Lactosuero
En la producción de galactooligosacáridos a partir de lactosuero, se evaluó el efecto de la
concentración inicial de lactosa, la concentración de enzima, el pH y la temperatura,
sobre la actividad enzimática de la -galactosidasa, el rendimiento de la producción de
GOS (YGOS), la conversión de lactosa (XLac) y la selectividad de la reacción a GOS (SGOS).
Esto se efectuó mediante un diseño experimental 33 con una repetición en el punto
central con los mismos niveles evaluados en la producción con lactosa. El análisis de
varianza del diseño experimental elaborado indica que para un error del 5%, todos los
factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la respuesta estudiada
(YGOS), como se presenta en la Tabla 3-3. Esto se observa tanto en las superficies de
respuesta, cuyo coeficiente de correlación ajustado fue de 0.8808, como en los perfiles
de lactosa, glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-9, 3-10, 3-11 y 3-13).
En la Figura 3-12 se presentan los perfiles del efecto de los factores y su interacción
sobre el rendimiento de la producción a GOS. En esta se observa que a pH 6.0, 40°C y R
de 1.50 (Figura 3-11 D), se logra el mayor rendimiento de la reacción hacia la producción
de GOS (24.54 ± 0.95 %). Esto también se puede apreciar en los perfiles de
concentración, en los que la máxima cantidad de galactooligosacáridos a estas
condiciones se alcanza a los 20 min de reacción: 81.72 ± 3.18 g L-1 (Tabla 3-4). Con este
sustrato la producción de GOS se redujo un 62.45% respecto a la producción con
lactosa.
En los casos de menores relaciones enzima/lactosa inicial (R=1.00 y 1.25) con las
mismas condiciones de pH y temperatura no se obtienen mayores concentraciones de
GOS (Figura 3-10D y 3-11D), como si se presentó usando lactosa como sustrato. Este
comportamiento pudo ser causado por una interferencia entre los iones y proteínas
presentes en el lactosuero con la enzima [Curda et al., 2006; Mariotti et al., 2008]. Por
esta razón, al aumentar la concentración de lactosuero, se pudo afectar la reacción
disminuyendo la actividad de transgalactosilación y la cantidad de GOS producida.
Igualmente, la mayor concentración de oligosacáridos se logró en un tiempo inferior,
debido posiblemente a que esta se obtuvo con una menor concentración inicial de
Resultados y Análisis
39
lactosuero (R=1.50), que según el mecanismo de reacción, propicia la hidrólisis de los
oligosacáridos formados a medida que transcurre el tiempo.
Adicionalmente, el efecto de inhibición por mayor galactosa residual también se observó
en este caso de producción de GOS [Boon, M. A. et al., 1999; Ladero et al., 2001; Neri, D
et al., 2009; Rogalski et al., 1994]. A mayores concentraciones iniciales de lactosuero
(400 y 500 g L-1), se obtuvieron 42.88 ± 6.98 g L-1 (Figura 3-10 C, D) y 66.12 ± 8.68 g L-1
(Figura 3-11 C, D), respectivamente a los 20 min de reacción. Esto equivale a 4.3% más
de galactosa producida para el caso de (R=1.25) y un 52.49% con un R=1.00.
En las Figuras 3-12 y 3-13 se presenta el efecto de la temperatura y el pH sobre la
producción de GOS a cualquier valor de concentración inicial de lactosa equivalente,
mostrando la misma tendencia que la actividad hidrolítica determinada con ONPG. De
este modo, la mayor reducción en la actividad de transgalactosilación de la enzima se
produjo a un pH inferior a 6.0 y a una temperatura de 50°C.
Figura 3-9. Efectos principales de la temperatura, pH y la relación enzima/lactosa inicial R, sobre Y GOS
(Enzima Libre – Sustrato: Lactosuero)
Contrario al caso de producción con lactosa, en esta condición de menor concentración
de lactosa inicial (333 g L-1) se obtuvo la mayor conversión del sustrato (Figura 3-14A) y
la mayor selectividad a GOS (Figura 3-14B). En este caso se pudo evidenciar que a
mayores concentraciones de lactosa, la actividad de transgalactosilación tiene menor
influencia que la actividad de hidrólisis [Rustom et al., 1998]. Esto puede ser debido a la
interacción con proteínas y otros compuestos del suero que afectan el mecanismo de
reacción antes mencionado.
40
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
140
450
120
400
100
350
80
300
60
250
40
200
20
150
120
0
20
40
60
80
25
80
20
60
15
40
10
20
5
0
100
0
0
20
250
180
60
80
100
400
150
300
100
200
Galactosa (g L -1)
200
D
70
140
60
120
50
100
40
80
30
60
20
40
50
100
80
30 C
40 C
50 C
160
Glucosa (g L -1)
10
20
0
0
0
20
40
60
80
0
100
0
0
20
Tiempo (min)
600
160
180
80
100
80
30 C
40 C
50 C
140
F
70
140
400
120
300
100
80
200
Galactosa (g L -1)
160
Glucosa (g L-1)
Lactosa (g L-1)
500
60
Tiempo (min)
200
30 C
40 C
50 C
E
40
120
60
100
50
80
40
60
30
40
20
20
10
GOS (g L-1)
Lactosa (g L -1)
500
40
Tiempo (min)
30 C
40 C
50 C
C
30
100
Tiempo (min)
600
B
GOS (g L-1)
0
35
30 C
40 C
50 C
GOS (g L-1)
140
Galactosa (g L -1)
500
Lactosa (g L-1)
160
30 C
40 C
50 C
A
Glucosa (g L-1)
550
60
40
100
20
0
0
0
20
40
60
80
Tiempo (min)
Lactosa (
), Glucosa (- - -)
100
0
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
), GOS ( - - -)
Galactosa (
Figura 3-10. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.00 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosuero
Resultados y Análisis
100
100
80
300
60
250
40
B
35
80
30
70
25
60
50
20
40
15
30
200
10
20
20
150
5
10
100
0
20
40
60
80
0
100
0
0
20
Tiempo (min)
30 C
40 C
50 C
C
400
60
80
100
Tiempo (min)
180
140
160
300
120
250
100
200
80
150
60
90
30 C
40 C
50 C
120
140
Glucosa (g L-1)
350
Galactosa (g L -1)
450
40
D
80
70
100
60
80
50
60
40
30
GOS (g L-1)
0
Lactosa (g L-1)
GOS (g L-1)
350
40
30 C
40 C
50 C
90
Galactosa (g L-1)
400
Lactosa (g L -1)
120
30 C
40 C
50 C
A
Glucosa (g L -1)
450
41
40
100
40
50
20
20
20
0
0
20
40
60
80
100
0
0
20
Tiempo (min)
140
30 C
40 C
50 C
E
400
120
120
80
100
250
80
200
60
150
Glucosa (g L -1)
100
300
80
30 C
40 C
50 C
100
350
Lactosa (g L -1)
60
Tiempo (min)
Galactosa (g L -1)
450
40
F
70
60
80
50
60
40
30
40
40
20
100
20
50
0
0
0
20
40
60
80
Tiempo (min)
Lactosa (
), Glucosa ( - - -)
100
GOS (g L-1)
0
10
0
20
10
0
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
Galactosa (
), GOS ( - - -)
Figura 3-11. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.25 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosuero
42
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
120
120
100
200
80
150
60
100
40
50
20
0
60
80
30
80
25
60
20
15
40
10
5
0
100
0
0
20
Tiempo (min)
30 C
40 C
50 C
C
140
140
250
100
200
80
150
60
100
50
0
0
40
60
80
70
80
50
60
30
10
0
100
-10
0
20
140
140
100
200
80
150
60
100
40
50
20
0
0
20
40
60
80
Tiempo (min)
Lactosa (
), Glucosa (- - -)
100
Galactosa (g L-1)
120
250
0
60
80
100
80
30 C
40 C
50 C
120
Glucosa (g L -1)
Lactosa (g L -1)
300
40
Tiempo (min)
160
30 C
40 C
50 C
E
90
100
Tiempo (min)
350
110
D
20
20
20
100
40
40
0
80
30 C
40 C
50 C
120
120
Glucosa (g L -1)
Lactosa (g L-1)
300
60
Tiempo (min)
160
Galactosa (g L -1)
350
40
GOS (g L-1)
40
35
F
70
60
100
50
80
40
60
30
40
GOS (g L-1)
20
40
20
0
0
B
GOS (g L-1)
250
30 C
40 C
50 C
100
Galactosa (g L -1)
300
Lactosa (g L -1)
140
30 C
40 C
50 C
A
Glucosa (g L -1)
350
20
20
10
0
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (min)
Galactosa (
), GOS ( - - -)
Figura 3-12. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a R = 1.50 y
temperaturas de 30, 40, 50°C. (A, B) pH = 5.5, (C, D) pH = 6.0 y (E, F) pH = 6.5. Sustrato Lactosuero
Resultados y Análisis
43
Tabla 3-3. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa libre en la producción de GOS con lactosuero
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:Temperatura
B:pH
C:R
AA
AB
AC
BB
BC
CC
bloques
Error total
Total (corr.)
56.6036
202.514
190.907
857.415
5.24454
3.0461
440.417
0.315464
0.0416561
0.0235624
183.838
2193.07
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
47
57
56.6036
202.514
190.907
857.415
5.24454
3.0461
440.417
0.315464
0.0416561
0.0235624
3.91144
0.0004
0.0000
0.0000
0.0000
0.2527
0.3820
0.0000
0.7777
0.9182
0.9385
14.47
51.77
48.81
219.21
1.34
0.78
112.60
0.08
0.01
0.01
La mayor producción de GOS se registró después de alcanzar un 50% de conversión de
lactosa, para todos los casos de concentración inicial de lactosa evaluados (Figura 3-8A).
En este caso se observó un comportamiento similar al reportado por otros autores sobre
el rendimiento de GOS usando lactosuero [Manucci, 2009; Yang, S-T et al., 2001a].
Igualmente, se observa que la selectividad de la reacción hacía GOS decrece después
de este porcentaje, debido a que los oligosacáridos formados comienzan a ser
hidrolizados para producir monosacáridos (Figura 3-8B). Este comportamiento es más
evidente cuando se emplean mayores concentraciones iniciales de lactosa (R=1.00 y
1.25).
A)
C)
B)
44
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Figura 3-13. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima libre y lactosuero
como sustrato a pH 5.5 (A), 6.0 (B) y 6.5 (C)
45
25
A
R=1.00
R=1.00
B
R=1.25
40
R=1.50
R=1.50
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
R=1.25
20
15
10
5
35
30
25
20
15
10
5
0
0
0
.
20
40
60
80
100
Conversión de Lactosa (X Lac)
0
20
40
60
80
100
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-14. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS con enzima libre y Lactosuero,
respecto a la conversión de lactosa a diferentes relaciones de enzima/lactosa inicial (pH=6.0 y 40°C)
En la Tabla 3-5 se observa que en varios estudios reportados se encontró el mismo
comportamiento de la producción de GOS con lactosuero. Se tiene un mayor rendimiento
de GOS, al utilizar una menor concentración de lactosa inicial equivalente. Asimismo, se
observó que para la reacción con lactosuero (Tabla 3-4), se reportan valores similares de
rendimiento de GOS y condiciones de producción (Tabla 3-5).
Tabla 3-4. Rendimiento y concentración de GOS a partir de lactosa y lactosuero
Sustrato
Lactosa
Suero
pH
6.0
6.0
T (°C)
40
40
R
1.25
1.50
Y GOS Max
(g GOS / g Glu o)
x 100
32.71
± 1.33
24.54
± 0.95
-1
C GOS máx (g L )
130.84 ± 5.32
81.72
± 3.18
Resultados y Análisis
45
Tabla 3-5. Producción de GOS reportada a partir de lactosa y lactosuero usando -Galactosidasa libre
Microorganismo fuente
de
 - galactosidasa
Condiciones de Reacción
Sustrato
Conc.
T (°C)
Lactosa
-1
(g L )
pH
Y GOS Max
(g GOS / g
Glu o) x 100
Referencia
Aspergillus niger
Lactosa
200
45
4.5
18.9
[Kim et al., 1990]
Aspergillus oryzae
Lactosa
400
40
4.5
32.0
[Iwasaki et al., 1996]
Lactosa
400
45
7.0
51.0
[Chen, S X et al., 2001]
Suero
230
40
5.0
18.0
[Rustom et al., 1998]
Bifidobacterium bifidum
Suero
300
40
6.0
38.0
[Goulas et al., 2007]
Bifidobacterium linfantis
Lactosa*
300
60
7.5
68.0
[Hung et al., 2002]
Bifidobacterium longum
Lactosa*
400
45
6.8
32.5
[Hsu et al., 2007]
Bullera singuaris
Lactosa
100
45
4.8
37.0
[Shin et al., 1998]
Kluyveromyces lactis
Lactosa
200
45
7.0
31.0
[Foda et al., 2000]
Lactosa
250
50
6.5
12.9
[Martínez-Villaluenga et al., 2008a]
Suero
230
40
7.0
22.0
[Rustom et al., 1998]
Suero
200
45
7.0
31.0
[Foda et al., 2000]
Lactosa*
400
40
6.5
45.0
[Boon, M.A. et al., 2000]
Suero
230
45
7.0
24.0
[Rustom et al., 1998]
Lactobacillus reuteri
Lactosa
205
30
6.5
38.0
[Splechtna et al., 2006]
Kluyveromyces marxiums
Penicillium simplicissimum
Lactosa
600
50
6.5
30.5
[Cruz et al., 1999]
Saccharopolyspora rectivirgula
Lactosa
600
70
7.0
41.0
[Nakao et al., 1994]
Sulfolobus solfataricus
Lactosa*
600
80
6.0
53
[Park, H Y et al., 2008]
* Enzima obtenida a partir de microorganismos modificados
46
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.4 Actividad hidrolítica con enzima inmovilizada
Con el fin de conocer el comportamiento de la actividad hidrolítica de cada uno de los
biocatalizadores preparados, se realizó la reacción con ONPG a diferentes condiciones
de pH y temperatura, basadas en las condiciones evaluadas con la enzima libre. En la
Tabla 3-6 se reportan las mayores actividades obtenidas durante cada una de estas
cuantificaciones.
Inicialmente, se observa que para los casos de inmovilización por atrapamiento se obtuvo
la menor retención de actividad respecto al valor obtenido con enzima libre. Esto pudo
ser consecuencia del efecto de fenómenos de transporte que aumentan el tiempo en el
que el ONPG llega al sitio activo de la enzima. Durante las inmovilizaciones en alginato
de calcio, se pueden anular sitios activos de la enzima o bloqueo de estos debido al
pequeño tamaño de los poros del biocatalizador [Chibata, 1978a; Cruz et al., 1998;
Guisan, 2006a; Ladero et al., 2000; Panesar et al., 2010; Shin et al., 1998],
Tabla 3-6. Actividad hidrolítica con ONPG de los diferentes biocatalizadores preparados
Actividad Hidrolítica
Enzima libre
Alginato de calcio
Alginato de calcio con material zeolítico
Sílica
Sílica tratada
1
Actividad reportada a las mejores condiciones
6384
1176
1300
2166
2669
±
±
±
±
±
1
205
99
87
151
139
Por otro lado, se evidencia que los métodos de atrapamiento tuvieron un menor
porcentaje de retención de actividad, respecto a la inmovilización por unión covalente. En
el caso del biocatalizador con alginato de calcio se logró una retención del 18.42% de la
actividad de la enzima (1176 ± 99 Uh). Utilizando el material zeolítico dentro del alginato
de calcio, se aumentó la actividad a 1300 ± 87Uh, equivalente a un 20.36% de retención.
Este aumento se puede explicar por un posible aumento en el tamaño de poro en el
biocatalizador [Serrato, 2004].
Resultados y Análisis
47
`
100
100
B
Actividad Relativa (%)
Actividad Relativa (%)
A
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
4.0
5.0
6.0
pH
7.0
8.0
4.0
9.0
100
5.0
6.0
pH
7.0
8.0
100
D
Actividad Relativa (%)
C
Actividad Relativa (%)
9.0
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
4.0
5.0
6.0
pH
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
pH
7.0
8.0
9.0
Figura 3-15. Comportamiento de la actividad hidrolítica con ONPG respecto al pH, para enzima inmovilizada
en (A) alginato de calcio, (B) alginato de calcio con material zeolítico, (C) Sílica y (D) Sílica tratada.
En el caso de la inmovilización por unión covalente, se observa que el porcentaje de
retención de la actividad es superior a los métodos de atrapamiento, siendo del 33.92%
para la inmovilización en sílica y del 41.80% con la sílica tratada (2669. ± 139 Uh) a 40°C
y pH 6.0.
En la Figura 3-15 se observa el comportamiento de la actividad hidrolítica de la enzima a
40°C para cada uno de los biocatalizadores. En esta se evidencia que en las
inmovilizaciones sobre sílica se logró una mayor estabilidad de la enzima a pH’s más
básicos, ya que la actividad relativa es superior al 40% en ambos casos, mientras que la
enzima libre sólo presentó un valor cercano al 25% en esta condición. Esta tendencia
también se observó a pH entre 6.0 y 7.0, siendo muy cercana la actividad máxima a pH
6.5 para la inmovilización sobre sílica tratada. En este caso la acidez del soporte podría
ayudar a la hidrólisis del ONPG actuando sobre el enlace  1-4 entre el ONP y la
galactosa [Nguyen, TH. et al., 2007] y así aumentar la medición de actividad.
48
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
100
100
B
Actividad Relativa (%)
Actividad Relativa (%)
A
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
10
20
30
40
50
60
10
70
20
30
T ( C)
40
50
60
100
100
D
Actividad Relativa (%)
C
Actividad Relativa (%)
70
T ( C)
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
10
20
30
40
T ( C)
50
60
70
10
20
30
40
50
60
70
T ( C)
Figura 3-16. Comportamiento de la actividad hidrolítica con ONPG respecto a la temperatura, para enzima
inmovilizada en (A) alginato de calcio, (B) alginato de calcio con material zeolítico, (C) Sílica y (D) Sílica
tratada.
El efecto de la temperatura sobre la actividad hidrolítica en cada biocatalizador se
presenta en la Figura 3-16. En el caso de inmovilización por unión covalente el
comportamiento es muy similar al obtenido con enzima libre (Figura 3-2). Sin embargo,
para los casos de inmovilización en alginato se logró una estabilidad a mayor
temperatura y poca actividad a bajas temperaturas. Este comportamiento puede ser
debido a que a mayores temperaturas se disminuye la viscosidad del medio y se
favorece la transferencia de masa hasta el sitio activo de la enzima. Así, a 50°C se tiene
una actividad relativa superior al 75 % en ambos casos, mientras que enzima libre fue
cercana al 40%.
Con los resultados del porcentaje de actividad hidrolítica retenida en cada biocatalizador,
determinada a partir de la actividad medida directamente en cada caso, se calculó el
valor que tendría la relación enzima/lactosa inicial empleando la definición de esta
variable para enzima libre, la cantidad de enzima inmovilizada y el porcentaje de
Resultados y Análisis
49
retención de actividad. El resultado de esta determinación para una concentración inicial
de lactosa de 333, 400 y 500 g L-1, se presentan en la Tabla 3.7
Tabla 3-7. Relación enzima inmovilizada/lactosa inicial usadas en la evaluación de la producción de GOS
con cada biocatalizador.
Método de Inmovilización
Alginato de calcio
Alginato de calcio con material
zeolïtico
Sílica
Sílica tratada
Relación enzima
inmovilizada/lactosa inicial
0.17
0.21
0.25
0.20
0.35
0.44
0.26
0.43
0.55
0.31
0.52
0.66
Con base en los resultados encontrados para la actividad hidrolítica de la -galactosidasa
estudiada, las condiciones sugeridas por el fabricante y algunas condiciones reportadas
por otros autores, se establecieron los valores de pH y temperatura para el estudio de la
producción de GOS. Esto considerando que la actividad de transgalactosilación de la
enzima puede tener un comportamiento similar al de la actividad hidrolítica [Boon, M.A. et
al., 2000; Hsu et al., 2007; Ladero et al., 2000; Ladero et al., 2001; Santos et al., 1998;
Splechtna et al., 2006]. Los resultados de la producción de GOS a partir de lactosa y
lactosuero con los biocatalizadores preparados, se muestran en las siguientes secciones.
50
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.5 Producción de GOS con enzima inmovilizada en
alginato de calcio
3.5.1 Sustrato: Lactosa
El rendimiento de la producción de GOS (YGOS), la conversión de lactosa (XLac) y la
selectividad de la reacción a GOS (SGOS), fueron estudiados empleando un diseño
experimental 33 con una repetición en el punto central, para los factores: concentración
inicial de lactosa, pH y temperatura. El análisis de varianza del diseño experimental
elaborado indica que para un error del 5%, todos los factores tienen un efecto
estadísticamente significativo sobre la respuesta estudiada (YGOS), como se presenta en
la Tabla 3-7. El efecto de la concentración inicial de lactosa, no es tan evidente como si lo
es el pH y la temperatura. Esto se observa tanto en las superficies de respuesta, cuyo
coeficiente de correlación ajustado fue de 0.9377, como en los perfiles de lactosa,
glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-17, 3-18 y 3-19).
Figura 3-17. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en alginato de calcio – Sustrato: lactosa)
El mayor rendimiento de la reacción hacía la producción de GOS (5.76 ± 0.21 %) se logra
a pH 6.0, 50°C y concentración inicial de 333 g L-1, como se muestra en los perfiles del
efecto de los factores y su interacción sobre el rendimiento de la producción a GOS
(Figura 3-17). Esto también se puede apreciar en los perfiles de concentración (Figura 319), en los que la mayor cantidad de galactooligosacáridos a estas condiciones se
alcanza a los 90 min de reacción (Tabla 3-15). De esta forma se obtuvo un 17.67% del
rendimiento alcanzado con la enzima libre.
Resultados y Análisis
51
En este caso a menores concentraciones de lactosa se obtiene la mayor producción de
GOS, debido a que este tipo de biocatalizadores puede presentar problemas de
transferencia de masa por la forma de inmovilización [Arroyo, 1998; Cruz et al., 1998;
Panesar et al., 2010; Rogalski et al., 1994; Torres et al., 2010] y el tamaño de las
moléculas involucradas en la reacción. En este sentido, al aumentar la temperatura estos
efectos disminuyen, al igual que la viscosidad del medio. Esta puede ser la causa de
tener mejores rendimientos en la producción de GOS a 50°C, como también se presentó
en la medición de la activada hidrolítica.
A)
B)
C)
Figura 3-18. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
-1
alginato de calcio y lactosa como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C)
El comportamiento del efecto de la temperatura y el pH sobre la producción de GOS a
cualquier valor de concentración inicial de lactosa (Figura 3-17 y 3-18), muestra la misma
tendencia que la actividad hidrolítica determinada con ONPG. De este modo, a un pH
inferior a 6.0 y a una temperatura de 30°C se observó la menor actividad de
transgalactosilación de la enzima, mientras que la mayor producción de GOS se obtuvo a
las condiciones de mayor actividad de hidrólisis
52
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Tabla 3-8. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizad en alginato de calcio en la producción de GOS con lactosa
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:T
B:pH
C:Lac0
AA
AB
AC
BB
BC
CC
bloques
Error total
Total (corr.)
65.4284
25.6754
4.00637
5.14675
4.09405
1.14504
18.0831
0.270085
0.338464
0.0000123575
8.66489
139.127
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
47
57
65.4284
25.6754
4.00637
5.14675
4.09405
1.14504
18.0831
0.270085
0.338464
0.0000123575
0.184359
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0163
0.0000
0.2322
0.1819
0.9935
354.90
139.27
21.73
27.92
22.21
6.21
98.09
1.46
1.84
0.00
Para la producción de GOS con este biocatalizador, se observó que para todas las
concentraciones iniciales de lactosa a 50°C y pH 6.0, se obtuvo la misma concentración
máxima de oligosacáridos después de 90 min de reacción (Figura 3-19) (19 g GOS L-1
aproximadamente). Esto evidencia una posible saturación de algunas partes del
biocatalizador que no permiten la acción de la enzima con moléculas de mayor tamaño.
Sin embargo, sí se registra actividad enzimática para la conversión de lactosa hacia
glucosa y galactosa (Figura 3-20). Estos problemas de transferencia de masa, podrían
explicar la conversión de lactosa incluso a altas concentraciones iniciales (Figura 3-19 y
3-20), pero con una baja selectividad a GOS. Esto indica que la conversión de lactosa se
efectúa hacía monosacáridos que pueden tener mayor movilidad en el biocatalizador. De
este modo, para altas concentraciones de lactosa, la actividad de hidrólisis tiene mayor
participación que la actividad de transgalactosilación.
Galactosa
100
80
200
60
40
600
120
B
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
100
C
100
400
80
300
60
200
40
500
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
75
400
300
50
200
100
25
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
100
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
100
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
Figura 3-19. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y
-1
-1
-1
50°C. (A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosa
y enzima inmovilizada en alginato de calcio
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Glucosa
300
500
Lactose (g L -1)
GOS
Lactose (g L-1)
Lactosa
Glu, Gal, GOS (g L-1)
120
A
Glu, Gal, GOS (g L-1)
Lactose (g L-1)
400
Resultados y Análisis
53
7
20
A
333 g/L
6
500 g/L
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
333 g/L
18
400 g/L
5
4
3
2
400 g/L
B
500 g/L
16
14
12
10
8
6
4
1
2
0
0
0
20
40
60
Conversión de Lactosa (X Lac)
80
0
20
40
60
80
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-20. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de
lactosa, con enzima inmovilizada en alginato de calcio y lactosa (pH=6.0 y 50°C)
El rendimiento de GOS respecto a la conversión de lactosa durante la reacción, tuvo un
comportamiento diferente al reportado por otros autores [Neri, D B, V. et al., 2009; Torres
et al., 2010]. La mayor producción de galactooligosacáridos se registró después de
alcanzar un 40% de conversión de lactosa, para todos los casos de concentración inicial
de lactosa evaluados (Figura 3-20A), mientras que para algunos casos de inmovilización
dicha condición se alcanzó después de una conversión del 55% de la lactosa [Bódalo et
al., 1991; Di Serio et al., 2003; Neri, D et al., 2009; Shin et al., 1998]. Por otro lado, se
observa que la selectividad de la reacción hacia GOS decrece después de este
porcentaje, debido a una posible saturación del biocatalizador y a que una vez formados
los oligosacáridos, estos comienzan a ser hidrolizados para producir monosacáridos
(Figura 3-20B). Este comportamiento es más evidente cuando se emplean mayores
concentraciones iniciales de lactosa (500 g L-1) por las razones expuestas anteriormente.
El mayor rendimiento a GOS obtenido durante la reacción con lactosa y las respectivas
condiciones (Tabla 3-15), es menor al reportado por otros autores usando
-galactosidasas de microorganismos (Tabla 3-16). Esto debido al bajo porcentaje de
retención de la actividad enzimática y los problemas de fenómenos de transporte
involucrados en la reacción. Por esta razón, este tipo de inmovilización no es conveniente
para una producción en reactor continuo o a mayor escala.
54
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.5.2 Sustrato: Lactosuero
El efecto de la concentración inicial de lactosa en el lactosuero, el pH y la temperatura,
sobre la actividad enzimática de la -galactosidasa inmovilizada en alginato de calcio, el
rendimiento de la producción de GOS (YGOS), la conversión de lactosa (XLac) y la
selectividad de la reacción a GOS (SGOS), fueron estudiados empleando un diseño
experimental 33 con una repetición en el punto central. El análisis de varianza del diseño
experimental elaborado indica que para un error del 5%, todos los factores tienen un
efecto estadísticamente significativo sobre la respuesta estudiada (YGOS), como se
presenta en la Tabla 3-8. El efecto de la concentración inicial de lactosa, no es tan
evidente como si lo es el pH y la temperatura. Esto se observa tanto en las superficies de
respuesta, cuyo coeficiente de correlación ajustado fue de 0.9014, como en los perfiles
de lactosa, glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-21, 3-22 y 3-23)
El mayor rendimiento de la reacción hacía la producción de GOS (4.09 ± 0.78 %) se logra
a pH 6.0, 50°C y concentración inicial de 333 g L-1, como se muestra en los perfiles del
efecto de los factores y su interacción sobre el rendimiento de la producción a GOS
(Figura 3-21). De esta forma se logró la producción de oligosacáridos con una reducción
del 83.33%, respecto al rendimiento con el mismo sustrato y una disminución del 28.99%
rendimiento alcanzado con el mismo biocatalizador y lactosa. Esto también se puede
apreciar en los perfiles de concentración (Figura 3-22), en los que la mayor cantidad de
galactooligosacáridos a estas condiciones se alcanza a los 90 min de reacción (Tabla 315).
Figura 3-21. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el YGOS
(Enzima inmovilizada en alginato de calcio – Sustrato: lactosuero)
Resultados y Análisis
A)
55
B)
C)
Figura 3-22. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
-1
alginato de calcio y lactosuero como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L
(C)
En este caso a menores concentraciones de lactosuero se obtiene la mayor producción
de GOS, presentándose los mismos problemas de transferencia de masa por la forma de
inmovilización [Arroyo, 1998; Cruz et al., 1998; Panesar et al., 2010; Torres et al., 2010],
el tamaño de las moléculas involucradas en la reacción y adicionalmente la interferencia
con las proteínas presentes en el sustrato [Foda et al., 2000; Manucci, 2009; Mariotti et
al., 2008]. En este sentido, al aumentar la temperatura estos efectos disminuyen, al igual
que la viscosidad del medio, siendo esta una posible causa del aumento del rendimiento
a GOS en la reacción a 50°C, como también se evidenció durante la medición de la
activada hidrolítica.
En la Figura 3-23 y 3-24, se observa que la tendencia del efecto del pH y la temperatura
sobre el rendimiento de GOS a cualquier valor de concentración inicial de lactosa, tiene
el mismo comportamiento que la actividad hidrolítica determinada con ONPG. De este
modo, a temperaturas inferiores a 30°C y pH por debajo de 6.0, se observó la menor
actividad de transgalactosilación de la enzima, mientras que la mayor producción de
GOS se obtuvo a las condiciones de mayor actividad de hidrólisis.
56
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Tabla 3-9. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en alginato de calcio en la producción de GOS con lactosuero
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:T
B:pH
C:Lac0
AA
AB
AC
BB
BC
CC
bloques
Error total
Total (corr.)
36.6296
17.1693
2.34143
3.06875
1.11286
0.779818
11.2456
0.140261
0.141251
0.0163235
3.97395
80.5584
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
47
57
36.6296
17.1693
2.34143
3.06875
1.11286
0.779818
11.2456
0.140261
0.141251
0.0163235
0.0845521
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0007
0.0039
0.0000
0.2041
0.2025
0.6624
433.22
203.06
27.69
36.29
13.16
9.22
133.00
1.66
1.67
0.19
Para la producción de GOS a 50°C y pH 6.0 usando este biocatalizador, se observó que
para las concentraciones iniciales de lactosa de 333 y 400 g L-1, se obtuvo la misma
concentración máxima de oligosacáridos a diferentes tiempos (Figura 3-19). Por el
contrario, en el caso de la mayor concentración de lactosa evaluada, la concentración de
GOS en este tiempo fue equivalente al 51% aproximadamente del valor registrado con
333 y 400 g L-1 de lactosa inicial. Esto evidencia una posible saturación de algunas
partes del biocatalizador por proteínas presentes en el lactosuero, que no permiten la
acción de la enzima con moléculas de mayor tamaño [Manucci, 2009; Mariotti et al.,
2008; Rustom et al., 1998]. Este efecto también se observa en la actividad enzimática
para la conversión de lactosa hacia glucosa y galactosa (Figura 3-24). Estos problemas
de transferencia de masa e interferencia de la enzima, podrían explicar la conversión de
lactosa a concentraciones iniciales no tan altas de lactosuero con una baja selectividad a
GOS (Figura 3-23 y 3-24).
Galactosa
100
80
200
60
40
100
Lactosa
Glucosa
100
C
GOS
Galactosa
100
400
80
300
60
200
40
500
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
75
400
300
50
200
25
100
20
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
100
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
Figura 3-23. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y
-1
-1
-1
50°C. (A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato
Lactosuero y enzima inmovilizada en alginato de calcio
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Glucosa
300
600
120
B
Lactose (g L-1)
GOS
Lactose (g L-1)
Lactosa
Glu, Gal, GOS (g L-1)
500
120
A
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactose (g L-1)
400
Resultados y Análisis
57
4.5
25
A
333 g/L
333 g/L
400 g/L
400 g/L
500 g/L
500 g/L
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y
GOS)
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
20
B
15
10
5
0.5
0
0
0
20
40
60
Conversión de Lactosa (X Lac)
80
0
20
40
60
80
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-24. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de
lactosa, con enzima inmovilizada en alginato de calcio y lactosuero (pH=6.0 y 50°C)
Con este biocatalizador se obtuvo que el mayor rendimiento a GOS obtenido durante la
reacción con lactosuero (Tabla 3-15), es menor al reportado por otros autores usando
enzimas similares de varios microorganismos (Tabla 3-16). Esto debido al bajo
porcentaje de retención de la actividad enzimática y los problemas de fenómenos de
transporte involucrados en la reacción. Por esta razón, este tipo de inmovilización no es
conveniente para una producción en reactor continuo o a mayor escala con ninguno de
los dos sustratos evaluados.
58
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.6 Producción de GOS con enzima inmovilizada en
alginato de calcio con material zeolítico
3.6.1 Sustrato: Lactosa
En las Figuras 3-25, 3-26 y 3-27, se presenta el comportamiento de los efectos
principales, la superficie de respuesta y los perfiles de lactosa, glucosa, galactosa y GOS,
obtenidos durante la producción de GOS con lactosa y la enzima inmovilizada en alginato
de calcio con material zeolítico. El rendimiento de la producción de GOS (YGOS), la
conversión de lactosa (XLac) y la selectividad de la reacción a GOS (SGOS), fueron
estudiados por duplicado de un diseño experimental 33 con una repetición en el punto
central, para los factores: concentración inicial de lactosa, pH y temperatura. El análisis
de varianza del diseño experimental elaborado indica que para un error del 5%, todos los
factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la respuesta estudiada
(YGOS), como se presenta en la Tabla 3-9. El efecto de la concentración inicial de lactosa,
no es tan evidente como si lo es el pH y la temperatura. Esto se observa tanto en las
superficies de respuesta, cuyo coeficiente de correlación ajustado fue de 0.9103 y en las
gráficas antes mencionadas.
Figura 3-25. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el YGOS
(Enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico – Sustrato: lactosa)
El mayor rendimiento de la reacción hacía la producción de GOS (6.64 ± 0.18 %) se
obtuvo a pH 6.0, 50°C y concentración inicial de 333 g L-1, como se muestra en los
perfiles del efecto de los factores y su interacción sobre el rendimiento de la producción a
GOS (Figura 3-25). Esto también se puede apreciar en los perfiles de concentración
(Figura 3-19), en los que la mayor cantidad de galactooligosacáridos a estas condiciones
Resultados y Análisis
59
se alcanza a los 90 min de reacción (Tabla 3-15). De esta forma se obtuvo un incremento
de 15.27% para el rendimiento y la concentración de GOS, en la reacción de lactosa y la
enzima inmovilizada en alginato de calcio.
En las condiciones evaluadas para este biocatalizador se observó que a menores
concentraciones de lactosa se obtiene la mayor producción de GOS. Esto debido a que
la inmovilización de la enzima sigue siendo por atrapamiento, por lo que presenta las
mismas limitaciones expuestas en el caso de la inmovilización con alginato de calcio
[Arroyo, 1998; Cruz et al., 1998; Panesar et al., 2010; Torres et al., 2010]. Sin embargo,
en este caso se reducen el efecto de dichas limitaciones por la presencia del material
zeolítico [Panesar et al., 2010; Serrato, 2004], llevando a que se logre una mayor
conversión de lactosa en todas las condiciones evaluadas.
A)
B)
C)
Figura 3-26. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
alginato de calcio con material zeolítico y lactosa como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400
-1
-1
g L (B) y 500 g L (C)
Para la producción de GOS con este biocatalizador, se observó que para todas las
concentraciones iniciales de lactosa a 50°C y pH 6.0, se obtuvo la misma concentración
máxima de oligosacáridos después de 90 min de reacción (Figura 3-27) (22 g GOS L-1
aproximadamente). Esto evidencia una posible saturación de algunas partes del
60
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
biocatalizador que no permiten que moléculas de mayor tamaño interactúen con la
enzima. Sin embargo, si se registró actividad enzimática para la conversión de lactosa
hacia glucosa y galactosa (Figura 3-28). Estos problemas de transferencia de masa,
podrían explicar la conversión de lactosa incluso a altas concentraciones iniciales (Figura
3-27 y 3-28), pero con una baja selectividad a GOS por la conversión de lactosa hacía
monosacáridos. De este modo, para altas concentraciones de lactosa, la actividad de
hidrólisis tiene mayor participación que la actividad de transgalactosilación
Galactosa
120
100
80
200
60
40
100
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
140
400
120
100
300
80
200
60
0
0
50
100
150
200
250
500
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
100
400
75
300
50
200
40
100
25
100
20
0
125
C
20
0
300
Tiempo (min)
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
0
0
0
50
100
150
Figura 3-27. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y
-1
-1
-1
50°C. (A) Lact. inicial = 333 g L , (B) Lact. inicial = 400 g L y (C) Lact. inicial = 500 g L . Sustrato Lactosa
y enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico
En la Figura 3-19 se observa que en la reacción con alginato de calcio existe un periodo
inicial con una baja producción de GOS (t<20 min), que puede ser debido a problemas de
transferencia de masa en el interior del biocatalizador. Esta etapa es menor en la
reacción con el biocatalizador que contiene material zeolítico, ya que con este se logra un
ligero aumento en el tamaño de poro del biocatalizador, que ayuda al transporte de
lactosa hasta el sitio activo de la enzima para formar oligosacáridos (Figura 3-27). Sin
embargo, esto no garantiza un incremento significativo en la producción de GOS al
observarse mayor actividad hidrolítica (Figura 3-28) con este tipo de inmovilización. Esto
puede ser consecuencia de una mayor disponibilidad para la interacción de compuestos
de menor tamaño y con el catalizador.
200
Tiempo (min)
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Glucosa
300
600
160
B
Lactose (g L-1)
GOS
Lactose (g L -1)
Lactosa
Glu, Gal, GOS (g L -1)
500
140
A
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactose (g L-1)
400
Resultados y Análisis
61
Tabla 3-10. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en alg. de calcio con material zeolítico en la producción de
GOS con lactosa
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:T
B:pH
C:Lac0
AA
AB
AC
BB
BC
CC
bloques
Error total
Total (corr.)
59.4289
42.3343
8.08188
6.62665
5.8807
0.584372
45.1698
0.525725
0.22344
0.0963289
14.8957
197.29
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
47
57
59.4289
42.3343
8.08188
6.62665
5.8807
0.584372
45.1698
0.525725
0.22344
0.0963289
0.31693
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0001
0.1810
0.0000
0.2041
0.4054
0.5840
187.51
133.58
25.50
20.91
18.56
1.84
142.52
1.66
0.71
0.30
El rendimiento de GOS respecto a la conversión de lactosa durante la reacción, tuvo un
comportamiento que se asemeja al reportado en estudios anteriores. La mayor
producción de galactooligosacáridos se registró después de alcanzar un 50% de
conversión de lactosa, para el caso de menor concentración inicial de lactosa evaluado
(Figura 3-28A), al igual que en otros casos de inmovilización donde esta condición se
alcanzó después de una conversión del 55% de la lactosa [Bódalo et al., 1991; Di Serio
et al., 2003; Neri, D et al., 2009; Shin et al., 1998]. De otra parte, se observa que la
selectividad de la reacción hacía GOS decrece después de este porcentaje, debido a que
los oligosacáridos formados comienzan a ser hidrolizados para producir monosacáridos y
por la saturación del biocatalizador (Figura 3-28B). Este comportamiento es más evidente
cuando se emplean mayores concentraciones iniciales de lactosa (500 g L-1) por las
razones expuestas anteriormente
Por los resultados obtenidos durante la producción de GOS con la enzima inmovilizada
en alginato de calcio con material zeolítico (Tabla 3-15) respecto a otros valores
reportados (Tabla 3-16), no es conveniente el uso de este biocatalizador para una
producción en reactor continuo o a mayor escala.
62
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
8
16
A
333 g/L
7
B
400 g/L
14
500 g/L
500 g/L
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
333 g/L
400 g/L
6
5
4
3
2
1
12
10
8
6
4
2
0
0
0
20
40
60
Conversión de Lactosa (X Lac)
80
0
20
40
60
80
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-28. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de
lactosa, con enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico y lactosa (pH=6.0 y 50°C)
Resultados y Análisis
63
3.6.2 Sustrato: Lactosuero
Mediante un diseño experimental 33 con una repetición en el punto central, se valuó el
efecto de la concentración inicial de lactosa en el lactosuero, el pH y la temperatura,
sobre la actividad enzimática de la -galactosidasa inmovilizada en alginato de calcio con
material zeolítico, el rendimiento de la producción de GOS (YGOS), la conversión de
lactosa (XLac) y la selectividad de la reacción a GOS (SGOS). La superficie de respuesta y
análisis de varianza para este diseño experimental se presentan en la Figura 3- 30 y
Tabla 3-10, respectivamente.
El análisis de varianza del diseño experimental elaborado indica que para un error del
5%, todos los factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la respuesta
estudiada (YGOS), como se presenta en la Tabla 3-10. Del mismo modo, los factores pH y
la temperatura tienen mayor efecto sobre el rendimiento de la reacción a GOS. Esto se
observa tanto en las superficies de respuesta, cuyo coeficiente de correlación ajustado
fue de 0.8997, como en los perfiles de lactosa, glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-29,
3-30 y 3-31)
Figura 3-29. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico – Sustrato: lactosuero)
Con este biocatalizador y usando lactosuero como sustrato, se alcanzó el mayor
rendimiento de la reacción hacía la producción de GOS (4.82 ± 0.16 %), a pH 6.0, 50°C y
concentración inicial de 333 g L-1. Esto se evidencia tanto en la gráfica del efecto de los
factores sobre el rendimiento de la producción a GOS (Figura 3-29), como en los perfiles
de concentración de cada compuesto en el tiempo (Figura 3-30). En esta última gráfica
se aprecia que la mayor concentración de galactooligosacáridos se obtiene después de
90 min de reacción (Tabla 3-15). De esta forma, se logró incrementar la cantidad de GOS
64
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
producida en un 17.84%, respecto a la síntesis con la enzima inmovilizada en alginato de
calcio y el mismo sustrato en la reacción. Sin embargo, este valor sigue siendo muy bajo
respecto al 24.54% de rendimiento a GOS alcanzado durante la reacción con la enzima
libre y lactosuero.
Durante la producción de GOS con lactosuero y este biocatalizador, se observó que a
menores concentraciones de lactosa se obtiene el mayor rendimiento de GOS. Esto
debido a que la inmovilización de la enzima sigue siendo por atrapamiento, por lo que las
limitaciones por transferencia de masa, así como la interacción de proteína con el soporte
y la enzima, expuestas en el caso de la inmovilización con alginato de calcio también
están presentes en este caso [Arroyo, 1998; Cruz et al., 1998; Manucci, 2009; Mariotti et
al., 2008; Panesar et al., 2010; Torres et al., 2010]. Sin embargo, en este caso se
reducen estos efectos por la presencia del material zeolítico [Panesar et al., 2010;
Serrato, 2004], llevando a que se logre una mayor conversión de lactosa en todas las
condiciones evaluadas.
A)
B)
C)
Figura 3-30. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
alginato de calcio con material zeolítico y lactosuero como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A),
-1
-1
400 g L (B) y 500 g L (C)
Resultados y Análisis
65
El periodo inicial registrado en el caso de la síntesis enzimática con lactosa y galactosidasa inmovilizada en alginato de calcio, también se presentó en la reacción con
lactosuero (Figura 3-23). Utilizando el biocatalizador que contiene material zeolítico se
logra un ligero aumento en el tamaño de poro del biocatalizador, que ayuda al transporte
de lactosa hasta el sitio activo de la enzima para formar oligosacáridos y reduce esta
etapa de transición en la reacción (Figura 3-31).
De la misma manera que en el caso de producción con lactosa, esto no garantiza un
incremento significativo en la producción de GOS al observarse mayor actividad
hidrolítica (Figura 3-32) con este tipo de inmovilización. Esto puede ser consecuencia de
una mayor disponibilidad para la interacción de compuestos de menor tamaño y con el
catalizador.
El rendimiento y selectividad hacía GOS respecto a la conversión de lactosa en este caso
de síntesis, tuvo un comportamiento similar al obtenido con la enzima inmovilizada en
alginato de calcio (Figura 3-24A). Aunque en la Figura 3-32A se evidencia el aumento en
el rendimiento de GOS al utilizar material zeolítico, se observa también que la
selectividad de la reacción disminuye pasando de un valor máximo de 20% aprox. con
alginato de calcio (Figura 3-24B), a un valor máximo de 17% aprox. usando material
zeolítico en el atrapamiento de la enzima (Figura 3-32B). De igual forma, este
biocatalizador presenta una mayor conversión de lactosa, evidenciando que la actividad
hidrolítica
con
este
transgalactosilación.
biocatalizador
tiene
prelación
sobre
la
actividad
de
66
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
100
300
80
200
60
40
600
140
B
100
C
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
120
400
100
300
80
60
200
40
100
500
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
75
400
300
50
200
25
100
20
0
20
0
0
0
50
100
150
200
250
0
0
300
50
100
150
200
250
300
100
0
0
0
50
100
Tiempo (min)
Tiempo (min)
150
Figura 3-31. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y
-1
-1
-1
50°C. (A) Lact. inicial = 333 g L , (B) Lact. inicial = 400 g L y (C) Lact. inicial = 500 g L . Sustrato
Lactosuero y enzima inmovilizada en alginato de calcio con material zeolítico
Por los resultados obtenidos durante la producción de GOS con la enzima inmovilizada
en alginato de calcio con material zeolítico y lactosuero (Tabla 3-15) respecto a otros
valores reportados (Tabla 3-16), no se recomendaría el uso de este biocatalizador para
una producción en reactor continuo o a mayor escala.
6
20
A
333 g/L
333 g/L
18
400 g/L
500 g/L
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
5
4
3
2
1
400 g/L
B
500 g/L
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
0
20
40
60
Conversión de Lactosa (X Lac)
80
0
200
Tiempo (min)
20
40
60
80
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-32. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de
lactosa, con enzima inm. en alginato de calcio con material zeolítico y lactosuero (pH=6.0 y 50°C)
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Galactosa
Lactose (g L-1)
GOS
Glucosa
Lactose (g L -1)
Lactosa
Glu, Gal, GOS (g L -1)
500
120
A
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactose (g L -1)
400
Resultados y Análisis
67
3.7 Producción de GOS con enzima inmovilizada en
sílica
La inmovilización de -galactosidasa en sílica gel llevada a cabo para la producción de
galactooligosacáridos, se puede representar por la síntesis presentada en la Figura 3-33.
En esta se muestra que la unión al soporte se hace debido al carácter ácido de la
superficie y se da por un enlace oxígeno-nitrógeno cuidando la estructura de la enzima
[Talbert et al., 2012; Yang, G et al., 2010]. No obstante, esto no se puede garantizar
completamente, ya que por medio de esta inmovilización la distancia entre la enzima y el
soporte es muy reducida, causando que puedan existir más de un enlace para una
unidad de enzima [Arroyo, 1998; Chibata, 1978a]. Esto tendría un efecto negativo debido
a que modificaría espacialmente la -galactosidasa y se perdería su acción catalítica
O
O
O
Si OH
O
+
O
H2N
Sílica
O
-galactosidasa
Si O
N
-galactosidasa inmovilizada
Figura 3-33. Esquema de la inmovilización de la -galactosidasa en sílica gel
El efecto de la inmovilización por unión covalente entre este tipo de soporte y la enzima,
sobre la producción de galactooligosacáridos a diferentes condiciones de reacción, se
presentan a continuación:
3.7.1 Sustrato: Lactosa
El efecto de la concentración inicial de lactosa, el pH y la temperatura, sobre la actividad
enzimática de la -galactosidasa inmovilizada en sílica, la conversión de lactosa (XLac), la
selectividad de la reacción a GOS (SGOS) y el rendimiento de la producción de GOS
(YGOS), se estudiaron por medio de un diseño experimental 33 con una repetición en el
punto central y una réplica de todos los ensayos del diseño. El análisis de varianza del
diseño experimental elaborado indica que para un error del 5%, todos los factores tienen
un efecto estadísticamente significativo sobre la respuesta estudiada (YGOS), como se
presenta en la Tabla 3-11. Esto igualmente se observa tanto en las superficies de
68
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
respuesta, cuyo coeficiente de correlación ajustado fue de 0.8857, como en los perfiles
de lactosa, glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-34, 3-35 y 3-36)
Figura 3-34. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el YGOS
(Enzima inmovilizada en sílica– Sustrato: lactosa)
En la Figura 3-34, que muestra los perfiles del efecto de los factores y en la Figura 3-36
con los perfiles de concentración en el tiempo, se observa que el mayor rendimiento de la
reacción hacía la producción de GOS (13.61 ± 0.41%) se obtuvo a pH 6.0, 40°C y
concentración inicial de 400 g L-1. Igualmente, en la Figura 3-36 se aprecia que la mayor
cantidad de galactooligosacáridos a estas condiciones se alcanza a los 90 min de
reacción (Tabla 3-15). De esta forma se obtuvo una cantidad mayor de oligosacáridos
respecto a las dos inmovilizaciones por atrapamiento estudiadas.
Tabla 3-11. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en sílica en la producción de GOS con lactosa
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:T
B:pH
C:Lac0
AA
AB
AC
BB
BC
CC
bloques
Error total
Total (corr.)
40.8634
183.303
85.9491
183.185
14.6824
0.551267
147.056
1.34915
65.6519
0.530947
77.0462
806.203
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
45
55
40.8634
183.303
85.9491
183.185
14.6824
0.551267
147.056
1.34915
65.6519
0.530947
1.71214
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0053
0.5732
0.0000
0.3794
0.0000
0.5804
23.87
107.06
50.20
106.99
8.58
0.32
85.89
0.79
38.34
0.31
En las condiciones evaluadas para este biocatalizador se observó que a las diferentes
concentraciones iniciales de lactosa, se obtiene un comportamiento similar al observado
con la enzima libre. En este caso los fenómenos de transporte no tienen el mismo efecto
Resultados y Análisis
69
que en las inmovilizaciones en alginato y se logra una mayor actividad de la enzima. Por
esta razón, la concentración inicial de lactosa para obtener la mayor cantidad de GOS, es
mayor en este caso de reacción (400 g L-1)
A)
B)
C)
Figura 3-35. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
-1
sílica y lactosa como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C)
Con este biocatalizador podría no obtenerse una estabilización de la enzima para
utilizarla a mayores temperaturas. La mayor concentración de GOS se logró a una
temperatura de 40°C, similar a la enzima libre con lactosa. Esto debido a que la galactosidasa está en la superficie del soporte y el aumento de la temperatura no tiene el
mismo efecto que en el atrapamiento, al ser menores los problemas de transferencia de
masa existentes con esta configuración.
Para la producción de GOS con este biocatalizador, se observó que para las
concentraciones iniciales de lactosa de 400 y 500 gL-1 a 40°C y pH 6.0 (Figura 3-36), se
obtuvo la mayor concentración de oligosacáridos después de 90 min y 150 min de
reacción, respectivamente. Aunque, en el caso de mayor concentración inicial de lactosa,
la cantidad máxima de oligosacáridos producida fue 60.75 ± 0.36 g L-1, siendo mayor a la
obtenida de 400 g L-1 de lactosa (54.48 ± 1.66 g L-1), no representa un mayor rendimiento
70
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
de la reacción hacía galactooligosacáridos, debido a que se requiere una mayor cantidad
de lactosa inicial (500 gL-1). Esto puede deberse a que con esta condición inicial se tiene
una mayor concentración de galactosa (71.42 ± 3.86 g L-1 - Figura 3-36C), respecto al
caso de producción con 400 gL-1 de lactosa (60.16 ± 4.96 g L-1 - Figura 3-36B). La
presencia de una mayor cantidad de galactosa puede inhibir la enzima [Boon, M. A. et al.,
1999; Ladero et al., 2001; Neri, D et al., 2009; Rogalski et al., 1994] afectando su
capacidad de producir más oligosacáridos
120
300
100
80
200
60
40
100
600
160
B
Lactosa
Glucosa
125
C
GOS
Galactosa
140
400
120
100
300
80
200
60
500
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
100
400
75
300
50
200
40
100
20
0
0
0
50
100
150
200
250
Tiempo (min)
300
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
25
100
0
0
0
50
100
150
Figura 3-36. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y
-1
-1
-1
40°C. (A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosa y
enzima inmovilizada en sílica
La mayor producción de galactooligosacáridos se registró después de alcanzar un 45%
de conversión de lactosa, para concentraciones iniciales de lactosa inferiores a 400 g L-1
(Figura 3-37A), Este rendimiento de GOS respecto a la conversión de lactosa, tuvo un
comportamiento que se asemeja al reportado en estudios anteriores con enzimas
inmovilizadas, donde esta condición se alcanzó después de una conversión del 55% de
la lactosa [Neri, D B, V. et al., 2009; Sheu et al., 1998; Shin et al., 1998]. Por otro lado, se
observa que la selectividad de la reacción hacía GOS decrece después de este
porcentaje, debido a que los oligosacáridos formados comienzan a ser hidrolizados para
producir monosacáridos y por la saturación del biocatalizador (Figura 3-37B). Este
comportamiento es más evidente cuando se emplean menores concentraciones iniciales
de lactosa, ya que se favorece la hidrólisis para producir galactosa y glucosa, como se
observó con la enzima libre.
200
Tiempo (min)
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Galactosa
Lactose (g L -1)
GOS
Glucosa
Lactose (g L -1)
Lactosa
Glu, Gal, GOS (g L -1)
500
140
A
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactose (g L-1)
400
Resultados y Análisis
71
16
45
A
333 g/L
14
400 g/L
40
500 g/L
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
333 g/L
400 g/L
12
10
8
6
4
2
B
500 g/L
35
30
25
20
15
10
5
0
0
0
20
40
60
Conversión de Lactosa (X Lac)
80
0
20
40
60
80
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-37. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de
lactosa, con enzima inmovilizada en sílica y lactosa (pH=6.0 y 40°C)
De acuerdo con los resultados obtenidos durante la producción de GOS con la enzima
inmovilizada en sílica (Tabla 3-15) y respecto a otros valores de producción reportados
usando -galactosidasa inmovilizada (Tabla 3-16). Este biocatalizador podría ser
empleado para una producción en reactor continuo o a mayor escala
72
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.7.2 Sustrato: Lactosuero
La producción de galactooligosacáridos a partir de lactosuero y -galactosidasa
inmovilizada en sílica, se evaluó el efecto de la concentración inicial de lactosa, el pH y la
temperatura, sobre la actividad enzimática de la enzima, el rendimiento de la producción
de GOS (YGOS), la conversión de lactosa (XLac) y la selectividad de la reacción a GOS
(SGOS). Esto se efectuó realizando por duplicado un diseño experimental 33 con una
repetición en el punto central con los mismos niveles evaluados en la producción con
lactosa. El análisis de varianza del diseño experimental elaborado indica que para un
error del 5%, el pH y la temperatura tienen un efecto estadísticamente significativo sobre
la respuesta estudiada (YGOS), como se presenta en la Tabla 3-12. No obstante, aunque
la concentración inicial de lactosa no es estadísticamente significativa, se observa su
efecto tanto en las superficies de respuesta, cuyo coeficiente de correlación ajustado fue
de 0.8768, como en los perfiles de lactosa, glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-38, 3-39
y 3-40).
Figura 3-38. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en sílica – Sustrato: lactosuero)
En la Figura 3-40 se presentan los perfiles del efecto de los factores y su interacción
sobre el rendimiento de la producción a GOS. En esta se observa que a pH 6.0, 40°C y
concentración inicial de lactosa 400 g L-1(Figura 3-41), se logra el mayor rendimiento de
la reacción hacía la producción de GOS (8.60 ± 0.24 %). Esto también se puede apreciar
en los perfiles de concentración, en los que la máxima cantidad de galactooligosacáridos
a estas condiciones se alcanza a los 90 min de reacción: 34.47 ± 0.92 g L-1 (Tabla 3-15).
Con este biocatalizador se redujo a un 35.04% el rendimiento de la reacción a GOS,
respecto a la utilización de la enzima libre.
Resultados y Análisis
73
A diferencia del comportamiento observado con la enzima libre, una menor concentración
inicial de lactosuero no representa un rendimiento mayor de GOS. Esto muestra que el
efecto de sales y proteínas presentes en este sustrato pueden no interfiere en la acción
de la enzima, ya que posiblemente interactúan con el soporte y esto reducen su efecto
adverso sobre la actividad enzimática [Manucci, 2009; Mariotti et al., 2008; Rustom et al.,
1998].
A)
B)
C)
Figura 3-39. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
-1
sílica y lactosuero como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C)
Igualmente, el efecto de inhibición por mayor galactosa residual se observó en este caso
de producción de GOS [Boon, M. A. et al., 1999; Ladero et al., 2001; Neri, D et al., 2009;
Rogalski et al., 1994]. A mayores concentraciones iniciales de lactosa (400 y 500 g L-1),
se obtuvieron 56.59 ± 6.34 g L-1 (Figura 3-40 B) y 56.12 ± 4.53 g L-1 (Figura 3-41 C), a los
90 y 150 min de reacción, respectivamente.
74
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Tabla 3-12. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizad en sílica en la producción de GOS con lactosuero
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:T
B:pH
C:Lac0
AA
AB
AC
BB
BC
CC
bloques
Error total
Total (corr.)
13.1042
98.3224
0.748382
59.6527
5.10809
0.607607
50.818
2.4421
18.7892
0.0231416
29.8902
315.723
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
45
55
13.1042
98.3224
0.748382
59.6527
5.10809
0.607607
50.818
2.4421
18.7892
0.0231416
0.664226
0.0001
0.0000
0.2941
0.0000
0.0081
0.3440
0.0000
0.0615
0.0000
0.8528
19.73
148.03
1.13
89.81
7.69
0.91
76.51
3.68
28.29
0.03
La mayor producción de galactooligosacáridos se registró después de alcanzar un 40%
de conversión de lactosa, para concentraciones iniciales de lactosa inferiores a 400 g L-1
(Figura 3-41A). Para concentraciones superiores se observa este porcentaje de
conversión, solo después de cumplir el tiempo total de reacción (270 min). La posible
causa de este comportamiento, es la mayor cantidad de sales y proteínas presentes en el
medio de reacción, aunque tienen un menor efecto sobre la enzima, alcanzan a reducir
su actividad.
100
300
80
200
60
40
600
160
B
Lactosa
Glucosa
125
C
GOS
Galactosa
140
400
120
100
300
80
200
60
500
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
100
400
75
300
50
200
40
100
100
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
25
100
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
Figura 3-40. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y
-1
-1
-1
40°C. (A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato
Lactosuero y enzima inmovilizada en sílica
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Galactosa
Lactose (g L-1)
GOS
Glucosa
Lactose (g L -1)
Lactosa
Glu, Gal, GOS (g L -1)
500
120
A
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactose (g L-1)
400
Resultados y Análisis
75
Por otro lado, se observa que la selectividad de la reacción hacía GOS decrece después
de la conversión a la que se alcanza el mayor rendimiento. En este punto comienzan a
ser hidrolizados los oligosacáridos formados, para producir monosacáridos (Figura 341B).
Este
comportamiento
es
más
evidente
cuando
se
emplean
menores
concentraciones iniciales de lactosa, ya que se favorece la hidrólisis para producir
galactosa y glucosa, como se observó con la enzima libre
10
40
A
333 g/L
333 g/L
400 g/L
500 g/L
8
400 g/L
35
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
9
7
6
5
4
3
2
B
500 g/L
30
25
20
15
10
5
1
0
0
0
20
40
60
Conversión de Lactosa (X Lac)
80
0
20
40
60
80
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-41. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de
lactosa, con enzima inmovilizada en sílica y lactosuero (pH=6.0 y 40°C)
76
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.8 Producción de GOS con enzima inmovilizada en
sílica tratada
En la Figura 3-42 se presenta la inmovilización de -galactosidasa en sílica gel tratada
llevada a cabo para la producción de galactooligosacáridos. Este procedimiento se
realizó en varios pasos intermedios con diferentes compuestos que pudiera dar un brazo
de anclaje de mayor tamaño entre la enzima y el soporte. Al igual que en el caso anterior,
se muestra que la unión a la extensión del soporte pudo haberse efectuado por el
carácter ácido de éste, dada por el grupo aldehído al final de la extensión. La enzima
posiblemente interactuó con el brazo del soporte formando un enlace oxígeno-nitrógeno
para su inmovilización .[Talbert et al., 2012; Yang, G et al., 2010]. Esto se hace con el fin
de cuidar la estructura de la enzima y reducir el impedimento estérico, evitando diversas
interacciones con el soporte como se mencionó en la sección anterior [Arroyo, 1998;
Chibata, 1978a; Ozyilmaz, 2009].
OH
O
Si OH
+
HO
C
O
C
N
NH2
Sílica activada -básica
Si O
C
+
NH2
CHO
( )3
Sílica activada - ácida
O
O
O
O
O
O
O
O
2
-galactosidasa
C
N
CHO
( )3
Sílica activada - ácida
Glutaraldehído
+HN
Si O
Si O
C
N
( )3
O
Si O
C
TRIS
Sílica activada -básica
O
O
O
Si O
O
OH
Sílica
O
O
O
O
O
NH2
N
O
-galactosidasa inmovilizada
Figura 3-42. Esquema de la inmovilización de la -galactosidasa en sílica gel tratada
El efecto de la inmovilización por unión covalente entre este tipo de soporte y la enzima,
sobre la producción de galactooligosacáridos a diferentes condiciones de reacción, se
presenta a continuación para los sustratos lactosa y lactosuero:
Resultados y Análisis
77
3.8.1 Sustrato: Lactosa
Mediante un diseño experimental 33 con una repetición en el punto central y duplicado en
todo el diseño, se evaluó el efecto de la concentración inicial de lactosa, el pH y la
temperatura, sobre la actividad enzimática de la -galactosidasa inmovilizada en sílica
tratada, el rendimiento de la producción de GOS (YGOS), la conversión de lactosa (XLac) y
la selectividad de la reacción a GOS (SGOS). La superficie de respuesta y análisis de
varianza para este diseño experimental se presentan en la Figura 3- 44 y Tabla 3-13,
respectivamente.
El análisis de varianza del diseño experimental elaborado indica que para un error del
5%, todos los factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la respuesta
estudiada (YGOS), como se presenta en la Tabla 3-13. Esto igualmente se observa tanto
en las superficies de respuesta, cuyo coeficiente de correlación ajustado fue de 0.9298,
como en los perfiles de lactosa, glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-43, 3-44 y 3-45)
Figura 3-43. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en sílica tratada – Sustrato: lactosa)
En la Figura 3-43, que muestra los perfiles del efecto de los factores y en la Figura 3-44
con los perfiles de concentración en el tiempo, se observa que el mayor rendimiento de la
reacción hacia la producción de GOS (22.90 ± 0.14%) se obtuvo a pH 6.0, 40°C y
concentración inicial de 400 g L-1. Igualmente, en la Figura 3-45 se aprecia que la mayor
cantidad de galactooligosacáridos a estas condiciones se alcanza a los 90 min de
reacción (Tabla 3-15). De esta forma se obtuvo la mayor concentración de oligosacáridos
con los biocatalizadores evaluados, mostrando que la adición de una cadena de
carbonos a la sílica gel para soportar mejor la enzima, tiene un efecto positivo para la
actividad de la -galactosidasa. (Incremento del 68.25% sobre YGOS)
78
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
A)
B)
C)
Figura 3-44. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
-1
sílica tratada y lactosa como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C)
Por otro lado, la enzima presentó una mayor actividad a pH básico durante la reacción
con la lactosa. En esta condición la enzima tiene una alta actividad a pH 6.5 (Figura 344), obteniéndose un rendimiento a GOS del 20.04 ± 0.75% a 40°C y una concentración
inicial de lactosa de 400 g L-1. Esta misma tendencia se observó en el caso de la reacción
de hidrólisis con ONPG (Figura 3-15).
Galactosa
Lactosa
Glucosa
140
120
100
200
80
60
100
40
140
400
120
100
300
80
200
60
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
500
Lactosa
GOS
Glucosa
Galactosa
125
400
100
300
75
200
50
100
25
40
100
20
20
0
150
C
GOS
Galactosa
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
Figura 3-45. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y
-1
-1
-1
40°C. (A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato Lactosa y
enzima inmovilizada en sílica tratada
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Glucosa
300
600
160
B
Lactose (g L -1)
GOS
Lactose (g L -1)
Lactosa
Glu, Gal, GOS (g L -1)
500
160
A
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactose (g L-1)
400
Resultados y Análisis
79
Tabla 3-13. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en sílica tratada en la producción de GOS con lactosa
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:T+bloque
B:pH+bloque
C:Lac0+bloque
AA+bloque
AB+bloque
AC+bloque
BB+bloque
BC+bloque
CC+bloque
bloques
Error total
Total (corr.)
191.675
708.84
223.648
376.305
39.886
1.06151
381.266
7.78967
157.708
0.0253045
131.856
2248.53
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
45
55
191.675
708.84
223.648
376.305
39.886
1.06151
381.266
7.78967
157.708
0.0253045
2.93014
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0006
0.5503
0.0000
0.1100
0.0000
0.9264
65.41
241.91
76.33
128.43
13.61
0.36
130.12
2.66
53.82
0.01
En la Figura 3-45 se observa que para las concentraciones iniciales de lactosa de 400 y
500 gL-1 a 40°C y pH 6.0 , se obtuvo la mayor concentración de oligosacáridos después
de 90 min y 150 min de reacción, respectivamente. En el caso de mayor concentración
inicial de lactosa, la cantidad máxima de oligosacáridos producida fue 101.40 ± 3.91 g L-1,
siendo mayor a la obtenida con 400 g L-1 de lactosa (91.69 ± 0.59 g L-1). Del mismo modo
que en el caso de enzima libre e inmovilizada en sílica, esto no representa un aumento
en el rendimiento de GOS, por ser mayor la cantidad de lactosa empleada y su causa
puede ser la inhibición de la enzima por producir más unidades de galactosa residual
[Boon, M. A. et al., 1999; Ladero et al., 2001; Neri, D et al., 2009; Rogalski et al., 1994]
con 500 g L-1 de lactosa inicial.
Para este caso se evidencia que la selectividad de la reacción hacía GOS se mantiene
más que con los otros biocatalizadores a medida que aumenta la conversión de lactosa.
Solo decrece a bajas conversiones de lactosa, cuando se utilizan menores
concentraciones iniciales de sustrato. Esto debido a que los oligosacáridos formados
comienzan a ser hidrolizados para producir monosacáridos (Figura 3-46B) y que a bajas
concentraciones de lactosa, la actividad hidrolítica desplaza a la actividad de
transgalactosilación.
Por otro lado, el mayor rendimiento a galactooligosacáridos se
registró después de alcanzar un 40% de conversión de lactosa, para todos los casos de
concentración inicial de lactosa evaluados (Figura 3-46A).
80
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
25
50
A
333 g/L
333 g/L
45
500 g/L
20
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
400 g/L
15
10
5
400 g/L
B
500 g/L
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
0
20
40
60
80
100
Conversión de Lactosa (X Lac)
0
20
40
60
80
100
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-46. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de
lactosa, con enzima inmovilizada en sílica tratada y lactosa (pH=6.0 y 40°C)
Los resultados con la enzima inmovilizada en sílica gel tratada (Tabla 3-15), muestra que
este tipo de soporte alcanza rendimientos de la reacción hacía galactooligosacáridos
similares a los reportados con otras técnicas de inmovilización [Neri, D et al., 2009; Sheu
et al., 1998]. Sin embargo, existen reportes de otros biocatalizadores con desempeños
superiores como perlas de quitosan o resinas fenolformaldehído, que evidencian que la
selección del soporte adecuado, es un paso importante para la producción de
oligosacáridos de lactosa, al brindar las condiciones y estabilidad a la enzima para que
su actividad se exprese en un alto porcentaje.
Resultados y Análisis
81
3.8.2 Sustrato: Lactosuero
El efecto de la concentración inicial de lactosa en el lactosuero, el pH y la temperatura,
sobre la actividad enzimática de la -galactosidasa inmovilizada en sílica tratada, el
rendimiento de la producción de GOS (YGOS), la conversión de lactosa (XLac) y la
selectividad de la reacción a GOS (SGOS), fueron estudiados empleando un diseño
experimental 33 con una repetición en el punto central. . El análisis de varianza del diseño
experimental elaborado indica que para un error del 5%, el pH y la temperatura tienen un
efecto estadísticamente significativo sobre la respuesta estudiada (YGOS), como se
presenta en la Tabla 3-14. No obstante, el efecto de la concentración inicial de lactosa no
tiene una diferencia estadísticamente significativa sobre el rendimiento de GOS. Esto se
observa tanto en las superficies de respuesta, cuyo coeficiente de correlación ajustado
fue de 0.8840, como en los perfiles de lactosa, glucosa, galactosa y GOS (Figuras 3-47,
3-48 y 3-49).
Figura 3-47. Efectos principales de la temperatura, pH y la concentración inicial de lactosa sobre el Y GOS
(Enzima inmovilizada en sílica tratada – Sustrato: lactosuero)
Con este biocatalizador se obtuvo a pH 6.0, 40°C y concentración inicial de 400 g L-1 el
mayor rendimiento de la reacción hacía la producción de GOS (13.10 ± 0.08%), como se
presenta en las Figuras 3-47 y 3-48. Del mismo modo, en la Figura 3-48 se aprecia que
la mayor cantidad de galactooligosacáridos a estas condiciones se alcanza a los 90 min
de reacción (Tabla 3-15), siendo esta también la mayor concentración obtenida con los
biocatalizadores evaluados en la obtención de GOS, con lactosuero como sustrato. En
este caso se evidencia que el tratamiento llevado a cabo para la superficie de la sílica,
incrementó la actividad de la enzima, aunque en un porcentaje menor comparado con la
82
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
reacción de lactosa (aumento del 52.32% en el rendimiento a GOS, respecto a
inmovilización en sílica)
De forma similar al caso de producción de GOS con lactosa usando este biocatalizador,
se observa que para las concentraciones iniciales de 400 y 500 gL-1 de lactosa se
obtuvieron las mayores concentraciones de GOS: 52.41 y 38.23 gL-1, respectivamente.
En la Figura 3-49 A se observa también que para el caso de menor concentración inicial
de lactosa, se hidrolizan con mayor velocidad la lactosa y GOS formados, coincidiendo
con el comportamiento de la enzima libre, donde a bajas concentraciones de lactosa
prevalece la hidrólisis sobre la transgalactosilación Esto también se muestra en la Figura
3-50C, donde se presenta que para esta condición se obtuvo la máxima conversión de
lactosa (80% aproximadamente), pero solo un rendimiento máximo a GOS del 11.34% a
una conversión de 52.72% de lactosa. De otro modo, en la Figura 3-49C se aprecia que
con una concentración inicial de 500 gL-1, también se pudieron presentar los efectos de
inhibición por galactosa, ya que la máxima concentración obtenida de este monosacárido
fue de 78.47 gL-1, que es inferior a la obtenida con las otras concentraciones iniciales de
lactosa.
A)
B)
C)
Figura 3-48. Superficies de respuesta para el rendimiento de GOS (YGOS) con enzima inmovilizada en
-1
-1
-1
sílica tratada y lactosuero como sustrato. Conc. Lactosa inicial: 333 g L (A), 400 g L (B) y 500 g L (C)
Resultados y Análisis
83
Tabla 3-14. Análisis de varianza del efecto de la temperatura (A), pH (B) y relación R (C) sobre la actividad
enzimática de la -Galactosidasa inmovilizada en sílica tratada en la producción de GOS con lactosuero
Fuente
Suma de
Cuadrados
Gl
Cuadrado Medio Razón-F
Valor-P
A:T+bloque
B:pH+bloque
C:Lac0+bloque
AA+bloque
AB+bloque
AC+bloque
BB+bloque
BC+bloque
CC+bloque
bloques
Error total
Total (corr.)
60.3276
171.703
0.139455
100.408
6.91137
0.646434
97.6022
1.68809
36.9654
0.305274
57.7836
595.8
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
45
55
60.3276
171.703
0.139455
100.408
6.91137
0.646434
97.6022
1.68809
36.9654
0.305274
1.28408
0.0000
0.0000
0.7433
0.0000
0.0249
0.4817
0.0000
0.2576
0.0000
0.6282
46.98
133.72
0.11
78.19
5.38
0.50
76.01
1.31
28.79
0.24
Por otro lado, la mayor producción de galactooligosacáridos se registró después de
alcanzar un 40% de conversión de lactosa, para todos los casos de concentración inicial
de lactosa evaluados (Figura 3-50A). Respecto a la selectividad se observa que ésta se
reduce a medida que aumenta la conversión de lactosa, debido a que los oligosacáridos
formados comienzan a ser hidrolizados para producir monosacáridos (Figura 3-50B) y
que a bajas concentraciones de lactosa, la actividad hidrolítica desplaza a la actividad de
transgalactosilación.
200
80
60
100
40
120
100
300
80
200
60
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
GOS
Glucosa
Galactosa
125
400
100
300
75
200
50
100
25
40
100
20
20
0
500
Lactosa
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
Figura 3-49. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa, glucosa, galactosa y GOS a pH = 6.0 y
-1
-1
-1
40°C. (A) Lact. inicial = 333g L , (B) Lact. inicial = 400g L y (C) Lact. inicial = 500g L . Sustrato
Lactosuero y enzima inmovilizada en sílica tratada
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
100
140
400
Lactose (g L -1)
120
150
C
GOS
Galactosa
Lactose (g L -1)
Lactosa
Glucosa
140
Galactosa
300
600
160
B
GOS
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactosa
Glucosa
Lactose (g L-1)
500
160
A
Glu, Gal, GOS (g L -1)
400
84
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
16
45
A
333 g/L
400 g/L
40
500 g/L
Selectividad a GOS (S GOS)
Rendimiento de GOS (Y GOS)
333 g/L
400 g/L
14
12
10
8
6
4
2
B
500 g/L
35
30
25
20
15
10
5
0
0
0
20
40
60
80
100
0
20
Conversión de Lactosa (X Lac)
40
60
80
100
Conversión de Lactosa (X Lac)
Figura 3-50. Rendimiento (A) y selectividad (B) de la producción de GOS respecto a la conversión de
lactosa, con enzima inmovilizada en sílica tratada y lactosuero (pH=6.0 y 40°C)
A continuación se presenta el resumen de las condiciones de reacción en las que se
obtuvo la mayor concentración de GOS, para cada caso de producción de oligosacáridos
con enzima inmovilizada:
Tabla 3-15. Rendimiento y concentración de GOS a partir de lactosa y lactosuero, usando -galactosidasa
inmovilizada en varios soportes
Inmovilización
Sustrato
pH
T (°C)
Conc
Lac
inicial
-1
(g L )
Y GOS Max
(g GOS / g Glu o)
x 100
-1
C GOS máx (g L )
Atrapamiento
Alginato de
Calcio
Lactosa
6.0
50.0
333
5.76
± 0.21
19.32
± 1.06
Suero
6.0
50.0
333
4.09
± 0.78
13.70
± 1.88
Lactosa
6.0
50.0
333
6.64
± 0.18
22.24
± 0.37
Atrapamiento
Alg de Ca +
Material
zeolítico
Suero
6.0
50.0
333
4.82
± 0.16
16.14
± 1.27
Lactosa
6.0
40.0
400
13.61
± 0.41
54.48
± 1.66
Suero
6.0
40.0
400
8.60
± 0.24
34.47
± 0.92
Lactosa
6.0
40.0
400
22.90
± 0.14
91.69
± 0.59
Suero
6.0
40.0
400
13.10
± 0.08
52.41
± 0.41
Unión Covalente
Sílica
Unión Covalente
Sílica tratada
Resultados y Análisis
85
La Tabla 3-16 presenta algunos de los estudios reportados para la producción de GOS
con galactosidasa inmovilizada en diferentes soportes:
Tabla 3-16. Producción de GOS reportada a partir de lactosa y lactosuero usando -Galactosidasa
inmovilizada
Condiciones de Reacción
Fuente de  galactosidasa
Conc. Lactosa
Soporte
Sustrato
-1
(g L )
Aspergillus
candidus
Aspergillus
oryzae
T
(°C)
Referencia
pH
Y GOS Max
(g GOS / g Glu o)
x 100
Lactosa
400
40
6.5
37.0
[Zheng et al., 2006]
Pellets polisiloxanoalcohol polivinílico
Lactosa
550
40
4.5
26.0
[Neri, D et al., 2009]
Pelicula de PVC
Suero
200
40
4.5
14.0
[Leiva et al., 1995]
Perlas de quitosan
BCW 3007 tratadas
con glutaraldehido
Lactosa
300
40
4.6
26.0
[Sheu et al., 1998]
Resina
Fenolformaldehido
Lactosa
46
40
6.0
40.0
[Mozaffar et al., 1986]
Silica Gel
Lactosa
46
40
6.0
48.0
[Mozaffar et al., 1986]
Bullera singularis
Perlas de quitosan
BCW 3510
Lactosa
300
45
3.7
54.0
[Shin et al., 1998]
Bacillus sp.
Quitosan
Lactosa
360
55
5.0
41.0
[Cheng et al., 2006]
Penicillium
expansum
Alginato de calcio
Lactosa
480
50
5.4
29.0
[Li et al., 2008]
Kluyveromyces
lactis
Algodón
Lactosa
130
37
6.6
7.4
[Zhou, Q et al., 2003]
Bacillus circulans
86
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
3.9 Modelamiento Cinético
Por medio de los modelos y métodos planteados en la sección 2.2.9, se realizó el ajuste
de parámetros cinéticos a la producción de GOS en las condiciones de pH (6.0) y
temperatura (40°C) con mayor rendimiento de enzima libre e inmovilizada en sílica
tratada. En la Figura 3-51 se observa los perfiles de cada compuesto obtenidos para el
caso de enzima libre, mostrando un buen ajuste a los datos experimentales en todos los
casos de producción de GOS a las condiciones mencionadas.
180
b)
250
100
200
150
50
100
140
300
Lactosa (g L-1)
150
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactosa (g L-1)
400
350
120
250
100
200
80
150
60
100
0
0
0
20
40
60
80
Tiempo (min)
100
160
c)
300
140
120
250
100
200
80
150
60
100
40
40
50
50
350
160
Lactosa (g L-1)
350
Glu, Gal, GOS (g L -1)
200
a)
450
20
0
0
0
20
40
60
Tiempo (min)
80
100
50
20
0
0
0
20
40
60
Tiempo (min)
Figura 3-51. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa (azul), glucosa (rojo), galactosa (verde) y GOS
(negro), obtenidos con el modelo cinético de reacciones elementales para: a) R=1.00, b) = 1.25 y c)=1.50 a
pH=6.0 y Temperatura = 40°C. Sustrato Lactosa y enzima libre. Línea continua: modelo y Puntos: datos
experimentales.
En la Tabla 3-17 se presentan los parámetros obtenidos del ajuste a los valores
experimentales. En esta se observa que la constante de velocidad inversa en la reacción
2, es mayor que la constante de velocidad directa, mostrando que para el ajuste del
modelo es significativo el efecto de la inhibición de la enzima por galactosa. Igualmente,
en el ajuste de los parámetros se evidenció la importancia de la constante de la primera
reacción en la obtención del perfil de GOS, ya que sin un valor adecuado de esta
variable, no es posible desarrollar los perfiles de concentraciones con el resto de
reacciones. Este comportamiento es similar al modelo reportado por [Chen, C W et al.,
2003], donde la formación del complejo galactosa-enzima es el paso principal para las
reacciones subsecuentes.
80
100
Glu, Gal, GOS (g L -1)
400
500
Resultados y Análisis
87
Tabla 3-17. Parámetros del modelo cinético de reacciones elementales, para la producción GOS con enzima
libre a pH=6.0 y T=4.0
k1 (L molE
-1
-1
min )
0.0423
-1
k2 (min )
k3 (L molE
0.0745
-1
-1
min )
k4 (L molE-Gal
k5 (L molE
-1
-1
0.8407
-1
min )
0.5940
-1
min )
0.2623
Con el modelo de reacciones elementales planteado se obtuvo un ajuste promedio del
0.957 para los tres casos de relación enzima/lactosa inicial evaluados, respecto a los
datos experimentales obtenidos con enzima libre y lactosa como sustrato. En la
Tabla 3-18 se puede observar que para la producción de GOS a pH=6.0 y temperatura
de 40°C, el menor porcentaje de error promediado para todos los datos experimentales,
se logró en el caso de producción con R=1.25. Sin embargo, para este caso no se tuvo el
mejor ajuste, ya que el mayor coeficiente de correlación se alcanzó en la producción de
oligosacáridos con R=1.00. Por otra parte, calculando el rendimiento máximo a GOS con
los valores obtenidos con el modelo, se observa que para todos los casos se
consiguieron rendimientos similares a los determinados experimentalmente.
Tabla 3-18. Comparación del ajuste de datos experimentales para los casos de producción de GOS
evaluados con enzima libre a pH=6.0 y 40°C
Parámetro
R = 1.00
R = 1.25
R = 1.50
17.134
12.085
24.144
Coeficiente de correlación (R )
0.965
0.961
0.944
Y GOS Max Experimental (g GOS / g Glu o) x 100
27.195
32.712
24.346
Y GOS Max Calculado (g GOS / g Glu o) x 100
26.596
30.814
24.522
Error Promedio (%)
2
Para el caso de producción con enzima inmovilizada en sílica tratada, se obtuvieron
ajustes con mayor error promedio y menor coeficiente de correlación en todos los casos.
Los valores de los parámetros cinéticos para este esquema de producción se muestran
en la Tabla 3-19. En este caso, se observa un valor inferior de la constante cinética de la
primera reacción respecto al ajuste de la producción con enzima libre (3% aprox.) Este
comportamiento, pudo deberse a las limitaciones de transferencia de masa con la enzima
inmovilizada, que hizo más lenta la velocidad de esta reacción y por consiguiente la
velocidad de producción de GOS.
88
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Tabla 3-19. Parámetros del modelo cinético de reacciones elementales, para la producción GOS con enzima
inmovilizada en sílica tratada a pH=6.0 y T=4.0
k1 (L molE
-1
min )
-1
-1
min )
0.0013
-1
k2 (min )
0.2514
k3 (L molE
-1
k4 (L molE-Gal
-1
k5 (L molE
-1
0.0392
-1
min )
0.6639
-1
min )
0.0068
En la Figura 3-52 se presentan los perfiles obtenidos aplicando el modelo cinético. Se
observa que en general tuvo un buen ajuste, aunque fue inferior al presentado con los
perfiles de producción de GOS con enzima libre. Este comportamiento también se
evidencia en los valores reportados en la Tabla 3-20, donde se observa que el coeficiente
de correlación promedio para los casos evaluados fue 0.939.
En este caso de ajuste de datos experimentales, se obtuvo el menor porcentaje de error
promediado, cuando la de producción de GOS se realizó con una concentración inicial de
lactosa de 333 g L-1. En este escenario también se tuvo el mejor ajuste, alcanzando ya
mayor coeficiente de correlación respecto a los otros casos de producción de
oligosacáridos con mayores concentraciones de lactosa inicial.
180
b)
350
300
250
100
200
150
50
100
140
300
Lactosa (g L-1)
150
Glu, Gal, GOS (g L -1)
Lactosa (g L-1)
400
350
120
250
100
200
80
150
60
100
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
160
c)
300
140
120
250
100
200
80
150
60
100
40
40
50
50
350
160
Lactosa (g L-1)
200
Glu, Gal, GOS (g L -1)
a)
450
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
250
300
50
20
0
0
0
50
100
150
200
Tiempo (min)
Figura 3-52. Perfiles de concentración en el tiempo de lactosa (azul), glucosa (rojo), galactosa (verde) y GOS
-1
(negro), obtenidos con el modelo cinético de reacciones elementales para: a) Lact. Inicial=500gL , b) = Lact.
-1
-1
Inicial=400gL y c)= Lact. Inicial=333gL a pH=6.0 y Temperatura = 40°C. Sustrato Lactosa y enzima
inmovilizada en sílica tratada. Línea continua: modelo y Puntos: datos experimentales.
250
300
Glu, Gal, GOS (g L -1)
400
500
Resultados y Análisis
89
Los rendimientos máximos a GOS calculados con los valores obtenidos del modelo
cinético, mostraron un buena aproximación a los determinados de forma experimental,
registrándose una diferencia inferior al 2.9% para todos los modelamientos de
producción de GOS con -galactosidasa inmovilizada en sílica tratada.
Tabla 3-20. Comparación del ajuste de datos experimentales para los casos de producción de GOS
evaluados con enzima inmovilizada en sílica tratada a pH=6.0 y 40°C
Parámetro
Error Promedio (%)
2
Coeficiente de correlación (R )
Y GOS Max Experimental (g GOS / g Glu o) x 100
Y GOS Max Calculado (g GOS / g Glu o) x 100
Lac inicial
-1
500 g L
39.630
Lac inicial
-1
400 g L
35.117
Lac inicial
-1
333 g L
22.996
0.919
0.937
0.963
20.271
22.904
14.456
19.749
22.566
14.035
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
La mejor actividad hidrolítica de la enzima libre Lactozym 6500L, se observó a pH 6.0 y
temperatura 40°C, usando como sustrato ONPG. Para esta misma enzima en la
reacción con lactosa, se encontró una mayor producción de GOS (32.71 ± 1.33) a las
mismas condiciones de pH, temperatura, y una relación enzima/lactosa inicial equivalente
a 1.25.
Teniendo como sustrato lactosuero, se obtuvo un rendimiento de la reacción a GOS del
24.54±0.95 % a pH 6.0, 40°C y una relación enzima / lactosa de 1.50. En este caso, con
un menor contenido inicial de lactosuero, se evidenció una mayor cantidad de GOS,
debido a menores concentraciones de proteínas y sales, que podrían interferir en la
actividad de la enzima.
Las diferentes técnicas de inmovilización utilizadas para la - galactosidasa presentaron
una reducción en su actividad de hidrólisis y transgalactosilación. La enzima inmovilizada
por unión covalente presentó en todos los casos evaluados, un rendimiento en la
producción de GOS mayor al obtenido con la enzima inmovilizada por atrapamiento.
La inmovilización por atrapamiento en alginato de calcio presentó un rendimiento de GOS
del 5.76±0.21 % y 4.09±0.78 % para la reacción con lactosa y lactosuero,
respectivamente.
La adición de material zeolítico en esta técnica de inmovilización,
incrementó ligeramente estos valores siendo 6.64±0.18 % para lactosa y 4.82±0.16 %
para lactosuero. Con estos biocatalizadores se obtuvo el mayor rendimiento a las mismas
condiciones: 50°C, pH 6.0 y 333 g L-1 de concentración inicial de lactosa.
92
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Mediante la inmovilización por unión covalente en sílica gel tratada se obtuvo la mayor
retención de actividad de la enzima, así como las mayores concentraciones de
galactooligosacáridos. Con una concentración inicial de 400 gL-1, pH 6.0 y 40°C se logró
una producción del 13.10 ±0.08 % empleando lactosuero y 22.90±0.14 % respecto a la
lactosa inicial utilizada como sustrato.
Por medio del modelo cinético de reacciones elementales se logró un ajuste promedio del
0.957 y 0.949 para los casos de producción de GOS con enzima libre e inmovilizada en
sílica tratada respectivamente, ajustando los datos experimentales obtenidos a las
condiciones donde se alcanzó mayor rendimiento.
4.2 Recomendaciones
Para obtener una mejor caracterización de los productos formados (GOS), se
recomienda utilizar una técnica analítica complementaria a la cromatografía líquida de
alta eficiencia, como la espectrometría de masas o un detector amperométrico de
pulsos, con el fin de identificar otros subproductos del proceso catalítico tales como
oligosacáridos de alto peso molecular
Se recomienda evaluar la producción de GOS con enzima inmovilizada a mayores
volúmenes de reacción, así determinar el efecto de fenómenos de transporte durante la
producción de oligosacáridos y comenzar el escalado del proceso.
Se sugiere realizar a los biocatalizadores identificados con mayor retención de actividad y
producción de GOS, un estudio de estabilidad de la enzima y desempeño en varios ciclos
de reacción.
Estudiar el efecto de la inhibición de la enzima por la concentración de galactosa
presente a medida que transcurre la reacción.
Conclusiones
93
Identificar el efecto de las condiciones del proceso de inmovilización (cantidades de
soporte, tiempos, cantidades de reactivo), sobre la retención de actividad de la enzima y
la producción de GOS.
Evaluar
en un medio de reacción
con menor contenido de agua, la actividad de
transgalactosilación de la enzima, y la producción de oligosacáridos de lactosa.
Evaluar el modelo cinético planteado a varias temperaturas, con el fin de caracterizar el
efecto de esta variable y poder calcular las concentraciones de los compuestos
involucrados en la reacción, a diferentes condiciones de lactosa inicial y temperatura.
Estudiar otros mecanismos de inmovilización que puedan llevar a una mayor producción
de GOS.
Estudiar el efecto de proteínas y iones en la producción de GOS con lactosuero
A. Anexo: Determinación de
actividad hidrolítica con ONPG
El cálculo de la actividad de hidrolítica de la-Galactosidasa se realizó determinando la
relación entre la concentración de ONPG y la absorbancia registrada en el
espectrofotómetro UV-VIS SPECTRONIC® - Milton Roy Genesys 5 (Numeral 2.2.1).
1.20
1.00
Absorbancia
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0
50
100
150
200
C ONPG [mol L-1]
250
300
Figura A-4-1. Curva de calibración de absorbancia para diferentes concentraciones de ONPG.
La ecuación obtenida para relacionar la concentración de ONPG con la absorbancia
medida, es la que se presenta a continuación:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0.0287699 + 0.00446468 [𝑂𝑁𝑃𝐺]
Ecuación A-1
Igualmente, el análisis estadístico de esta curva de calibración fue el siguiente:
96
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Tabla A-1. Análisis de varianza de las curvas de calibración para ONPG
Coeficientes
Mínimos Cuadrados
Parámetro Estimado
Intercepto 0.028769
Pendiente 0.004465
Estándar
Error
0.009947
0.000065
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
3.0315
Residuo
0.0143
Total (Corr.) 3.0459
Gl
1
22
23
Estadístico
T
2.892
68.097
Cuadrado Medio
3.03154
0.000654
Coeficiente de Correlación = 0.997636
R-cuadrada = 99.5278 porciento
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99.5064 porciento
Error estándar del est. = 0.0255
Error absoluto medio = 0.0191
Estadístico Durbin-Watson = 1.7743 (P=0.2614)
Autocorrelación de residuos en retraso 1 = 0.0337
Valor-P
0.0085
0.0000
Razón-F
4637.22
Valor-P
0.0000
B. Anexo: Cuantificación e
identificación de azúcares por HPLC
La identificación y cuantificación de lactosa, glucosa y galactosa se realizó utilizando
Cromatografía Líquida de Alta Precisión, por el procedimiento descrito en el numeral
2.2.8. A continuación se presentan las curvas de calibración de cada sacárido, con su
1.6E+08
1.6E+08
1.4E+08
1.4E+08
1.2E+08
1.2E+08
1.0E+08
1.0E+08
Área
Área
respectivo análisis de varianza:
8.0E+07
8.0E+07
6.0E+07
6.0E+07
4.0E+07
4.0E+07
2.0E+07
2.0E+07
0.0E+00
0.0E+00
0
10
20
30
40
50
Lactosa (g /L)
0
10
20
30
40
50
Glucosa (g /L)
1.8E+08
1.6E+08
1.4E+08
Área
1.2E+08
1.0E+08
8.0E+07
6.0E+07
4.0E+07
2.0E+07
0.0E+00
0
10
20
30
40
50
Galactosa (g /L)
Figura B-1. Curvas de calibración obtenidas para Lactosa, Glucosa y Galactosa con la columna
CarboSep 411.
El análisis estadístico de las curvas de calibración de cada compuesto se presenta a
continuación:
98
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Tabla B-1. Análisis de varianza de las curvas de calibración para Lactosa.
Á𝒓𝒆𝒂 = 𝟐𝟑𝟖𝟗𝟎. 𝟏 + 𝟑. 𝟒𝟖𝟎𝟗𝟕𝑬𝟔 𝑪𝑳𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂
Coeficientes
Mínimos Cuadrados
Parámetro Estimado
Intercepto 23890.1
Pendiente 3.48097E6
Estándar
Error
914638.
39375.6
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
1.46047E16
Residuo
7.47492E12
Total (Corr.) 1.46122E16
Gl
1
4
5
Estadístico
T
0.0261198
88.4042
Cuadrado Medio
1.46047E16
1.86873E12
Ecuación B-1
Valor-P
0.9804
0.0000
Razón-F
7815.30
Valor-P
0.0000
Coeficiente de Correlación = 0.999744
R-cuadrada = 99.9488 por ciento
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99.9361 por ciento
Error estándar del est. = 1.36702E6
Error absoluto medio = 960773.
Estadístico Durbin-Watson = 1.67841 (P=0.1174)
Autocorrelación de residuos en retraso 1 = 0.102884
Tabla B-2. Análisis de varianza de las curvas de calibración para Glucosa
Á𝒓𝒆𝒂 = −𝟔𝟏𝟏𝟐𝟎𝟒 + 𝟑. 𝟔𝟗𝟓𝟒𝑬𝟔 𝑪𝑮𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒂
Coeficientes
Mínimos Cuadrados
Parámetro Estimado
Intercepto -611204.
Pendiente 3.6954E6
Estándar
Error
1.72218E6
74154.0
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
1.67017E16
Residuo
2.6901E13
Total (Corr.) 1.67286E16
Gl
1
4
5
Estadístico
T
-0.354902
49.8341
Cuadrado Medio
1.67017E16
6.72526E12
Coeficiente de Correlación = 0.999196
R-cuadrada = 99.8392 por ciento
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99.799 por ciento
Error estándar del est. = 2.59331E6
Error absoluto medio = 1.53842E6
Estadístico Durbin-Watson = 2.27481 (P=0.3897)
Autocorrelación de residuos en retraso 1 = -0.176722
Ecuación B-2
Valor-P
0.7406
0.0000
Razón-F
2483.43
Valor-P
0.0000
Anexo B: Cuantificación e identificación de azúcares por HPLC
99
Tabla B-3. Análisis de varianza de las curvas de calibración para Glucosa
Á𝒓𝒆𝒂 = −𝟑. 𝟐𝟓𝟖𝟗𝟐𝑬𝟔 + 𝟑. 𝟗𝟓𝟒𝟒𝑬𝟔 𝑪𝑮𝒂𝒍𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂
Coeficientes
Mínimos Cuadrados
Parámetro Estimado
Intercepto -3.25892E6
Pendiente 3.9544E6
Estándar
Error
3.06497E6
134363.
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
1.81231E16
Residuo
8.36928E13
Total (Corr.) 1.82067E16
Gl
1
4
5
Estadístico
T
-1.06328
29.4308
Cuadrado Medio
1.81231E16
2.09232E13
Coeficiente de Correlación = 0.997699
R-cuadrada = 99.5403 por ciento
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99.4254 por ciento
Error estándar del est. = 4.57419E6
Error absoluto medio = 3.11587E6
Estadístico Durbin-Watson = 2.56967 (P=0.5701)
Autocorrelación de residuos en retraso 1 = -0.338864
Ecuación B-3
Valor-P
0.3476
0.0000
Razón-F
866.17
Valor-P
0.0000
100
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
Igualmente, por medio de esta técnica analítica también se identificó la presencia de
GOS como se muestra a continuación en los cromatogramas típicos:
400
400
a)
b)
300
300
250
250
uRIU
200
200
100
Glucosa
150
Lactosa
150
22.011
350
18.548
uRIU
350
100
50
50
0
0
0
5
10
15
Minutes
20
25
30
0
400
5
10
15
Minutes
5
10
15
Minutes
20
25
30
120
c)
350
d)
100
0
Galactosa
20
50
Glucosa
GOS (DP4)
100
60
40
Galactosa
150
uRIU
23.341
uRIU
200
GOS (DP3)
80
250
Lactosa
300
0
0
5
10
15
Minutes
20
25
30
0
20
25
30
Figura B-2. Cromatogramas de HPLC obtenidos para: a) Lactosa, b) Glucosa, c) Galactosa y d) Muestra de
reacción de producción de GOS (40°C, pH = 6.0 y R = 1.25)
En esta columna de HPLC se analizaron también oligosacáridos de fructosa
(Fructooligosácaridos - FOS) obtenidos a partir de sacarosa (GF). Los principales FOS
obtenidos en esta reacción son:

1-kestosa (GF2) - grado de polimerización (DP3)

Nistosa (GF3) - grado de polimerización (DP4)

1--fructofuranosilnistosa (GF4) - grado de polimerización (DP5)
Utilizando patrones de estos compuestos de grado HPLC, se obtuvieron los
cromatogramas que se presentan a continuación, que hacen parte de otro proyecto sobre
alimentos funcionales realizado por el grupo de investigación [Guio et al., 2012; Ruiz et
al., 2014]
Anexo B: Cuantificación e identificación de azúcares por HPLC
120
140
a)
uRIU
80
Nistosa (GF3)
60
1- Kestosa (GF2)
40
20
0
0
0
5
10
15
Minutes
20
25
30
0
10
15
Minutes
20
25
30
60
40
20
uRIU
80
150
100
50
0
Glucosa (G)
200
Fructofuranosilnistosa (GF4)
100
Fructosa (F)
120
d)
250
Sacarosa (GF)
11.610
c)
140
1- Kestosa (GF2)
300
Nistosa (GF3)
160
5
Fructofuranosilnistosa (GF4)
uRIU
60
20
13.590
100
80
40
b)
120
15.817
100
uRIU
101
0
0
5
10
15
Minutes
20
25
30
0
5
10
15
Minutes
20
25
30
Figura B-3. Cromatogramas de HPLC obtenidos para: a) 1-kestosa (GF2), b) nistosa (GF3), c) 1-fructofuranosil nistosa (GF4) y d) Muestra de reacción de producción de FOS de Sacarosa (GF)
Se observa en la Figura B-3 que compuestos resultantes de la producción de FOS, con
grado de polimerización (DP) igual a 3 y 4, tiene tiempos de retención similares a los
registrados para los GOS obtenidos a partir de lactosa (Figura B-2).
C. Anexo: Hoja de datos de
producto: Lactozym® 6500 L
(Novozymes)
104
Evaluación de la producción de Galactooligosacáridos a partir de materias
primas lácteas con - galactosidasa inmovilizada
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