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Oscurecimiento enzimático EC 1.10.3.1. Polifenoloxidasa Monofenolmonoxigenasa Difenol:O2 oxidoreductasa OH OH OH + O2+2H++2e- difenol monofenol CH3 CH3 E-2Cu+ E-2Cu2+ O HO O OH + 1/2 O2 -2eo-benzoquinona catecol E-2Cu2+ E-2Cu+ Fenolasas se han aislado de cutículas de camarón, de cangrejo, langosta, de la glándula de tinta de moluscos y de piel de peces “goldfish” (dorados) Enzimas activas en rango de pH de 5 a 8.5, el PM varía según la fuente: camarón 3040, langosta 64, mejillones 120 y cefalópodos 125-205 kDa Las fenolasas de crustáceos pueden existir latentes como prepolifenoloxidasas En langosta esta se activa por tripsina La mancha negra ocurre en langosta enhielada o congelada Es suceptible a melanosis por trauma La mancha azul-negra del cangrejo puede estar asociada a fenolasas pero también a oscurecimiento no enzimático Los cangrejos estresados contienen mas sustratos de la rx fenolasa Tirosina (un monofenol) es el sustrato más abundante para la PPO en crustáceos La mancha negra en camarón ocurre mas en hembras Melanosis en camarón rosa Escala 0 Ausente 2 ligera en algunos 4 ligera en la mayoria 6 moderado en mayoria 8 Alta en algunos 10 Alta en la mayoria Funciones fisiológicas Esclerotización del exoesqueleto (mudas) Las quinonas reaccionan con grupos laterales de las proteínas adyacentes (endurecimiento) Proceso de cicatrización Defensa contra microorganismos Implicaciones en inmunidad y reconocimiento Al reconocer microorganismos actúan las enzimas que activan los zimógenos de PPO Se producen compuestos fenólicos que actúan defendiendo contra la invasión Manchas ($$) Esquema de la activación de PPO por Microorganismos Antimicrobianos Melaninas Microorganismos Glucanos, Glucoproteinas, Laminarina Proteasas ? Productos polimerizados PPO inactiva PPO activa fenolicos Principal problema de los crustaceos como producto alimenticio No tiene implicaciones nutricionales Calidad Características de PPO de crustáceos Fuente c. blanco PM Act (kDa) esp 30 59 Km (mM) 2.83 pH opt 7.5 Temp opt (oC) 45 c. cafe 210 0.26 c. rosa 40 82.8 1.63 8 40 Langosta spiny 97 0.36 9.85 6.5 35 Langosta 21.1 2.13 6.5 30 6 PPO Sitio activo Control del oscurecimiento Procesamiento Calentamiento Refrigeración Congelación Deshidratación Irradiación Alta presión CO2 supercrítico Ultrafiltración Sonicación Calentamiento Congelación Los solutos a altas concentraciones son inhibidores (Tappel, 1966) Cambios en pH (Fennema, 1975) Perturbación de grupos tiol, por: 1) mayor concentración de grupos disulfuro 2) cambios en la conformación 3) oxidación de los grupos sulfidrilos debido a aumento en la concentración de O2 en el hielo (Fennema, 1975). Remoción de agua durante la congelación, alteración del ambiente para la enzima (algo similar a la deshidratación) Irradiación Dosis (kGy) 0.05-0.15 Efectos Inhibe germinación en tubérculos, bulbos y raíces de plantas; inhibe el crecimiento de espárrago y hongos 0.15-0.75 Desinfestación Insectos 0.25-0.50 Retarda la maduración de frutas tropicales, papaya, plátano, mango >1.75 1.00-3.00 >3.00 Control de enfermedades poscosecha Acelera maduración; desarrollo de malos sabores en algunos productos Reblandecimiento, madurez anormal; desórdenes fisiológicos, mal sabor Altas presiones Desnaturalización de la enzima Rearreglo y/o destrucción de enlaces no covalentes Puentes H. interacción hidrofóbica, enlaces iónicos Reducción de espacios moleculares Presiones de más de 5 kbar causan desnaturalización irreversible de las enzimas Altas presiones Fluído supercrítico Un fluido supercrítico existe en el estado fluido arriba de su temperatura y presión crítica Tiene una densidad similar a la de un líquido, una tensión superficial cerca de cero y un rango de difusividad y viscosidad entre líquido y gas CO2 supercrítico El bióxido de carbono tiene una temperatura y presión críticas baja Su efectividad en la preservación de alimentos es debido a que al disolver el agua, el CO2 a alta presión produce ácido carbónico, que afecta temporalmente el pH, por lo tanto inactiva enzimas y microorganismos PPos de langosta de Florida, de camarón café y de papa han mostrado una reducción relacionada a tiempos de exposición a tratamientos de 43 oC y CO2 a alta presión a 58 atm (Chen et al. 1992). Estudios cinéticos muestran que las ppos de crustáceos fueron más vulnerables a los tratamientos que las ppos de papa Sonicación El uso combinado de calor y ondas ultrasónicas puede contribuir a la inactivación de enzimas Cuando se aplica a líquidos, las ondas ultrasónicas promueven la formación de burbujas La interfase de burbuja/líquido contínuamente pasa por cambios en tamaño y forma. Las corrientes acústicas en el líquido causan esfuerzo que promueve la desnaturalización de las enzimas La sonicación tambien promueve rx que involucran a los radicales libres H× y OH× que se forman de la descomposición del agua por la oscilación de las burbujas (El. piner et al. 1965) Estos radicales pueden ser atrapados por los residuos de aminoacidos de las enzimas que participan en la estabilidad de la estructura, la unión con el sustrato o las funciones catalíticas (Gebicki and Gebicki, 1993). Inhibidores Agentes reductores/antioxidantes Sulfitos, ac. ascorbico, ac. eritorbico, cys, Acidulantes Ac. láctico, citrico, fosfórico Quelantes EDTA, fosfatos, maltol, ac. kojico Agentes complejos Ciclodextrinas, quitosano Inhibidores de enzimas 4 hexilresorcinol, sales de haluros, miel, AA y proteinas, Otros Enzimas asesinas:actinidina, papaina, bromelina, Películas comestibles Sulfitos SO2: dióxido de azufre SO32-: sulfito HSO3-: bisulfito S S2O52-: metabisulfito Sulfitos Es la práctica más común en la industria para el control de manchas Baño en solución al 1.25% de bisulfito 100 ppm residual máximo Quinonas a difenoles El sulfito es competidor de la PPO, une S al sitio activo Ac Asc GRAS sustituto de sulfitos Por agentes reductores Ácido. Kójico Metabolito de hongos Aspergillus y Penicillium Presente en productos fermentados asiáticos Act antifúngica y antibacteriana Acción quelante del Cu Dudas de su uso por act mutagénica Ciclodextrinas quitosano Reduce el oscurecimiento No se conoce bien su modo de acción Cargas positivas Si se usa como película limita la cantidad de oxígeno disponible 4 hexil resorcinol Por su semejanza compite por sustratos por la PPO Mancha en camarón (Lambrecht, 1995)