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PARÁMETROS CINÉTICOS Y ACTIVIDAD DE LA ENZIMA
POLIFENOLOXIDASA DE DISTINTAS VARIEDADES DE MANZANAS
Lorena Martín; Cecilia Bernardi; Daniel Güemes; María Pirovani y
Andrea Piagentini
Instituto de Tecnología de Alimentos (Facultad de Ingeniería Química - U.N.L.)
1º de Mayo 3250 - (3000) Santa Fe (Argentina). e-mail: [email protected]
Resumen: Con el objetivo posterior de controlar el pardeamiento enzimático
catalizado por la polifenoloxidasa (PPO) en manzanas frescas cortadas, se propone
realizar una caracterización parcial de dicha enzima extraída del tejido
parenquimatoso de cinco variedades de manzanas, a través de la determinación del
pH óptimo de actividad, parámetros cinéticos y actividad enzimática. Se
estudiaron cinco variedades de manzanas: Caricia (C), Eva (E), Granny Smith
(GS), Princesa (P) y Red Delicious (RD). El pH óptimo para todas las variedades
fue de 5,5. La actividad de la PPO fue significativamente mayor (p≤0,01) para RD,
siguiéndole en orden decreciente P, C, E y por último GS. Los parámetros
cinéticos (Vm y Km) fueron significativamente diferentes (p≤0,05) entre las
diferentes variedades de manzanas. La PPO de RD presentó el mayor valor de Vm
y, junto a E, la mayor afinidad por el sustrato debido a que sus Km fueron las
menores (15,27 y 13,8 mM, respectivamente). El valor de Km de la PPO de GS
(afinidad por el sustrato), difiere significativamente de los respectivos valores de E
y RD. La PPO de GS y E presentaron los menores valores de Vm (0,09 y 0,07
abs/min, respectivamente). La eficiencia de reacción con el sustrato (Vm/Km) fue
menor para GS, siguiéndole en orden creciente E, C, P y RD.
Palabras
claves:
polifenoloxidasa,
INTRODUCCIÓN
La polifenoloxidasa (E.C. 1.10.3.1), PPO, es
una de las enzimas más estudiadas en la
industria de los alimentos ya que es la principal
responsable de las reacciones de pardeamiento
enzimático en frutas y hortalizas. Además,
puede modificar las propiedades sensoriales,
nutricionales y de calidad, en general, de frutas
y
hortalizas,
lo
cual
perjudica
la
comercialización de un producto entero o
mínimamente procesado.
El mecanismo de reacción de la PPO se basa en
la catálisis de dos etapas: oxidación de un
monofenol a o-difenol y la subsiguiente
oxidación de éste a o-quinona, actividad
cresolasa y catecolasa respectivamente. La
oxidación del o-difenol a o-quinona finaliza el
ciclo
(Belitz
y
Grosh,
2004).
La
pardeamiento,
manzana,
variedades.
polifenoloxidasa es capaz de catalizar
reacciones de oxidación de compuestos
polifenólicos en presencia de oxígeno
molecular y, la presencia de los compuestos
oxidados por la enzima son precursores de las
reacciones de pardeamiento que ocurren en los
procesos de post-recolección y manipulación
de frutas y hortalizas (Ayaz et al., 2007).
Estas
reacciones
pueden
ser
extraordinariamente rápidas y contribuyen al
desarrollo de polímeros coloreados (melaninas)
pardos, oscuros, marrones y negros, al
reaccionar con aminoácidos, proteínas u otras
especies fenólicas.
La actividad polifenoloxidásica es uno de los
principales factores involucrados en el
pardeamiento de manzanas (Amiot et al.,
1992). La actividad enzimática y la
susceptibilidad al pardeamiento difieren con la
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variedad de manzana, y a pesar de que se ha
estudiado la actividad PPO para muchas
variedades de manzanas, no existe información
sobre la caracterización cinética de las
variedades Caricia, Eva y Princesa. La
caracterización de la PPO es necesaria para
tener medios más efectivos para controlar el
pardeamiento enzimático en frutas, o para
comprender mejor el mecanismo de
pardeamiento
bajo
condiciones
de
almacenamiento.
Como el pardeamiento enzimático de
manzanas es dependiente del pH, es muy
importante conocer el valor de pH óptimo de
actividad de la enzima, para su control. A pesar
de que la actividad PPO es insignificante al pH
natural de la fruta, es suficiente para que
ocasione el pardeamiento (Vámos-Vigyázó,
1981). Muchos estudios previos indican que los
valores de pH óptimo de la enzima PPO
pueden ser diferentes para cada variedad de
manzana (Zhou et. al., 1993; Weemaes et. al.,
1998; Rocha et al., 1998; Soysal, 2009).
Con el objetivo posterior de controlar el
pardeamiento enzimático, mediado por la PPO
en éstas variedades de manzanas específicas, se
llevó a cabo en el presente trabajo la
caracterización cinética de la enzima PPO de
las variedades Caricia, Eva y Princesa junto
con las variedades comerciales Red Delicious y
Granny Smith, a través de la determinación del
pH óptimo para la actividad máxima de la
enzima, los parámetros cinéticos Vm y Km, y
la actividad polifenoloxidásica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron frutos provenientes de plantas de
manzanos (Malus domestica Borkh) de 5
variedades, dos de reconocida importancia
comercial y de alto requerimiento de horas de
frío Red Delicious (RD) y Granny Smith (GS)
y 3 variedades de cultivos experimentales de
bajo requerimiento de horas de frío Caricia
(C), Eva (E) y Princesa (P), cultivadas en el
Campo Experimental de Cultivos Intensivos y
Forestales (CECIF) de la Facultad de Ciencias
Agrarias de la Universidad Nacional del
Litoral, en la localidad de Esperanza, provincia
de Santa Fe (Argentina).
Extracción de la PPO
Se lavaron las manzanas con agua potable y se
escurrieron sobre papel absorbente, luego se
eliminó la cáscara, se descorazonaron y se
cortaron en octavos. Se pesaron 100 gramos de
fruta y se colocaron en buffer fosfato de potasio
pH 7,2 junto con 0,375g de polivinilpirrolidona
(PVP), de manera de obtener una
concentración en el volumen final de
extracción de 0,25% de PVP, y 4,5 ml de una
solución 1:6 de Triton X-100 de manera de
obtener una concentración final de 0,75% en el
volumen total de extracción que fue de 150 ml.
Luego se homogeneizó con un mixer durante 3
minutos a 4°C y se centrifugó durante 30
minutos a 12000 g con una centrífuga (Mistral
4L) refrigerada a 4°C. El sobrenadante se
utilizó como extracto para la determinación de
pH òptimo, la actividad enzimática y
parámetros cinéticos de las PPO.
Determinación del pH óptimo
Para determinar el pH óptimo de la enzima
PPO de manzana, se evaluó la actividad de la
misma en un rango de pH entre 4,5 y 7. Se
prepararon soluciones buffer acetato de pHs
4,5; 5,0 y 5,5; y soluciones buffer fosfato de
potasio de pHs 6,0; 6,6 y 7,0 (Soysal, 2009).
Dichas soluciones se utilizaron como buffer de
reacción para determinar la actividad
enzimática de la PPO a 405nm manteniendo
fija la concentración de sustrato (catecol 50
mM para GS y RD; y 30 mM para C, E y P).
Cada mezcla de reacción contenía: 1,5 ml de
buffer; 0,15 ml de extracto enzimático; 0,9 ml
de agua, y una cantidad específica de catecol
200 mM (0,45 ml para las variedades
experimentales y 0,75 ml para las comerciales).
Cada reacción se realizó por triplicado. Se
graficó la absorbancia en función del tiempo de
reacción a temperatura ambiente, determinando
las velocidades iniciales (vi) como las
pendientes de la parte lineal de cada curva
(para cada pH), y luego se graficaron las vi
(abs/min) en función del pH, determinándose el
valor óptimo de pH para la enzima PPO, como
aquel al cual se obtiene la mayor vi de reacción.
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Determinación de la actividad PPO
La actividad de la PPO del extracto de las
manzanas fue medida a través del incremento
de la absorbancia a temperatura ambiente, con
un espectrofotómetro a 405nm, longitud de
onda en la cual se observa la aparición del
producto de oxidación del catecol, difenol
utilizado como sustrato enzimático. Las
mezclas de reacción contenían: 1,5 ml de buffer
acetato 0,2 M pH 5,5; 0,15 ml de extracto
enzimático; la cantidad adecuada de catecol
200 mM para lograr obtener la concentración
final deseada de sustrato para cada
determinación en el volumen de reacción (5 a
30 mM); completando a 3ml con la cantidad
necesaria de agua destilada. Las reacciones se
realizaron por triplicado y se utilizó como
blanco, la mezcla buffer acetato, agua destilada
y extracto enzimático, la cual no desarrolló
color durante la realización de ninguno de los
ensayos. Las velocidades iniciales (vi) de
reacción se calcularon a partir de las pendientes
de las partes lineales de las gráficas de
absorbancia en función del tiempo para cada
concentración de sustrato utilizada. Se definió
una unidad de actividad PPO (U) como el
incremento en 0,001 unidades de absorbancia
por minuto (Zhou et al., 1993; Carbonaro y
Mattera, 2001; Dincer et al., 2002). Los
resultados fueron expresados también en
unidades de actividad PPO (U) por 100 gramos
de fruta fresca (Fang et al., 2007), y por
mililitro de extracto enzimático (Rocha et al.,
1998; Ni Eidhin et al., 2006), bajo condiciones
experimentales.
Determinación de parámetros cinéticos de la
PPO
Para la determinación de los parámetros
cinéticos, constante de Michaelis-Menten (Km)
y velocidad máxima (Vm), se midió la actividad
de la PPO a diferentes concentraciones del
sustrato catecol (desde 5 a 30 mM) durante 10
minutos de reacción y por triplicado para cada
concentración de sustrato. Los valores de Km y
Vm de la PPO, de las distintas variedades de
manzana, se calcularon utilizando el método de
Lineweaver y Burk (1934) en el cuál se grafica
la inversa de las velocidades iniciales, en
función de la inversa de las concentraciones de
catecol utilizadas en cada mezcla de reacción
(Soysal, 2009).
Análisis estadístico
Se aplicó el análisis de la varianza a los
resultados obtenidos, y el test de Duncan para
la comparación de medias, utilizando el
programa estadístico Statgraphic Plus 5.1.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
pH óptimo de la enzima PPO de cinco
variedades de manzanas
La actividad máxima en todas las variedades de
manzanas se registró a pH 5,5 según puede
observarse en las Figura 1. Se ha estudiado el
pH óptimo de la enzima PPO, en muchos
trabajos de investigación, y el mismo varía para
cada variedad de manzana. Es así que se
encontró que el pH óptimo para la variedad de
manzana Monroe fue 4,6 (Zhou et. al., 1993)
utilizando metil-catecol, mientras que para la
variedad Golden fue 6 (Weemaes et. al., 1998)
utilizando catecol como sustrato. Rocha et al.
(1998) determinaron que el pH óptimo la PPO
de manzana variedad Starking fue 6,5
utilizando catecol como sustrato enzimático.
Soysal (2009) determinó para la variedad
Golden Delicious un pH óptimo de 5,5
utilizando
metil-catecol
como
sustrato
enzimático, coincidiendo con el valor
determinado en nuestro trabajo para todas las
variedades de manzanas estudiadas.
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Vi (abs/min)
0.25
Vi (abs/min)
pH óptimo = 5.5
0.20
0.20
0.15
0.15
0.10
Caricia
Eva
Princesa
0.10
Granny Smith
Red Delicious
0.05
pH óptimo = 5.5
0.25
0.05
0.00
0.00
3
4
5
pH
6
7
8
3
4
5
pH
6
7
8
Figura 1. Cambio en la actividad de la enzima PPO de manzanas Granny Smith, Red Delicious,
Caricia, Eva y Princesa en función del pH
Actividad de la PPO de cinco variedades de
manzanas
La velocidad a la cual una enzima cataliza una
reacción es conocida como actividad
enzimática. Esta puede ser medida por la
velocidad de formación de productos o
desaparición de reactivos en presencia de una
cantidad de enzima dada (Guerrero Eraso,
2009). Muchos autores utilizan diversos
procedimientos y sustratos dependiendo de la
actividad estudiada. El mecanismo detallado de
acción es único para cada enzima.
Como puede observarse en la Tabla 1, las
actividades PPO de cada variedad de manzana
difieren muy significativamente (p≤0,01). Red
Delicious es la variedad que difiere
significativamente del resto presentando la
mayor actividad PPO. La actividad PPO de las
variedades GS y E en cambio son similares y
las de menor valor con respecto al resto de las
variedades, siendo E similar también a C.
Caricia y Princesa mostraron valores similares
de actividad PPO y le siguen en orden
decreciente de actividad a Red Delicious.
Tabla 1. Actividad de la PPO para cinco variedades de manzanas
Variedad
vi
(abs/min)
Act PPO
(U)
Act PPO
(U/100gFF)
ActPPO
(U/mlE)
Caricia
0,0465bc
46,55bc
465,50bc
310,33bc
Eva
0,0250ab
25,36ab
253,58ab
169,05ab
Granny Smith
0,0170a
17,16a
171,56a
114,37a
Princesa
0,0570c
56,82c
568,16c
378,78c
Red Delicious
0,0970d
96,78d
967,83d
645,22d
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas por el test de Duncan (p≤0,05).
vi=calculada a partir de catecol 10 mM al pH óptimo de la enzima (5,5); FF=fruta fresca; U=0,001 unidades
de absorbancia/min; E=extracto enzimático; Act PPO=actividad polifenoloxidásica
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Las variedades experimentales C, E y P
muestran valores de actividad PPO medios y
similares entre ellas, en comparación a las
variedades comerciales RD y GS, cuyas
actividades PPO se encuentran en el extremo
superior e inferior respectivamente.
Parámetros cinéticos de la enzima PPO de
cinco variedades de manzanas
La cinética de oxidación catalizada por la
enzima PPO fue estudiada a distintas
concentraciones del sustrato (catecol), a pH =
5,5 (pH óptimo de la PPO). Dentro del rango
de concentraciones estudiado, la enzima PPO
siguió el modelo de Michaelis-Menten. Los
parámetros cinéticos Vm y Km, tuvieron
diferencias significativas (p≤0,05) entre las
distintas variedades de manzana.
En la Tabla 2, se puede observar que la
variedad con mayor Vm para la enzima PPO fue
Red Delicious y a su vez es la enzima con
mayor afinidad por el catecol, junto con Eva,
debido a que sus Km son las de menor valor.
También se puede observar, que RD reaccionó
más eficientemente con el sustrato fenólico,
teniendo en cuenta que la relacion Vm/Km fue
superior a las demás variedades. La variedad
GS, fue la de menor Vm junto con E. Además,
la relación Vm/Km para GS, que mide la
eficiencia de reacción con el sustrato, fue
inferior a todas las demás, siguiéndole en orden
creciente E, C, P y RD. En cuanto a la afinidad
(Km) por el sustrato de la PPO presente en la
variedad GS, se puede observar en la Tabla 2
que difiere significativamente de las variedades
RD y E.
Los valores de Km determinados en este trabajo
se encuentran dentro del rango publicado por
Nicolas et al. (1994), en el cual se informó que
las Km para manzanas se encontrarían entre 5,3
y 140 mM utilizando catecol como sustrato.
Soysal (2009) determinó los parámetros
cinéticos a 405 nm para la variedad de
manzana Golden Delicious, utilizando metilcatecol como sustrato y obtuvo como resultado
una Vm = 0,45 abs/min y una Km = 4,76 mM;
mientras que Rocha et al. (1998) determinaron
valores de 0,52 abs/min y 0,18 x 10 -3 mM para
la
variedad
Starking
respectivamente,
utilizando catecol como sustrato y midiendo la
absorbancia a una longitud de onda de 420nm.
Gasull y Becerra (2006) obtuvieron para la
variedad Red Delicious un valor de Km = 232,8
mM, superior al encontrado en el presente.
Tabla 2. Parámetros cinéticos para cinco
variedades de manzanas
Variedad
Vm
(abs/min)
Km
(mM)
Vm/Km
Caricia
0,195ab
37,03ab
0,0055b
Eva
0,070a
13,80a
0,0050b
Granny Smith
0,090a
42,74b
0,0022a
Princesa
0,185ab
20,38ab
0,0090c
Red Delicious
0,245b
15,27a
0,0160d
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias
significativas por el test de Duncan (p≤0,05). Valores
determinados utilizando catecol 10 mM al pH óptimo de la
enzima (5,5); Vm=velocidad máxima; Km=constante de
Michaelis-Menten
CONCLUSIONES
Para todas las variedades de manzanas se
determinó que el pH óptimo de la enzima PPO
fue de 5,5. La actividad de la PPO fue
significativamente diferente dependiendo de la
variedad de manzana (p≤0,01), siendo Red
Delicious la que presenta mayor actividad,
siguiéndole en orden decreciente Princesa,
Caricia, Eva y por último Granny Smith. Los
parámetros cinéticos (Vm y Km) tuvieron
diferencias significativas (p≤0,05) entre las
diferentes variedades de manzanas. La PPO de
RD presentó el mayor valor de Vm, y la mayor
eficiencia de reacción con el sustrato, debido a
que la relación de Vm/Km fue la mayor de
todas las variedades estudiadas. En cuanto a los
valores de Km de la PPO presentes en RD y E,
fueron significativamente menores (mayor
afinidad por el catecol) del determinado para la
PPO de GS. La PPO de GS y E presentaron los
menores valores de Vm. La eficiencia de
reacción con el sustrato (relación de Vm/Km)
fue menor para Granny Smith, siguiéndole en
orden creciente de eficiencia las variedades
Eva, Caricia, Princesa y Red Delicious.
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AGRADECIMIENTOS
Trabajo realizado con fondos de la Universidad
Nacional del Litoral a través de la
programación CAI+D Proyecto 12/Q103. Se
agradece al Dr. Norberto Gariglio (Cátedra de
Cultivos Intensivos - FCA – UNL) por la
provisión de manzanas variedades Caricia, Eva
y Princesa.
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