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PREMIO A LA INVESTIGACIÓN 2003
Péptidos antihipertensivos derivados de proteínas de la clara de huevo obtenidos mediante
hidrólisis enzimática
Marta Miguel, Rosina López-Fandiño, Isidra Recio, Amaya Aleixandre1, Mercedes Ramos
Instituto de Fermentaciones Industriales. Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).
1
Instituto de Farmacología y Toxicología (CSIC). Facultad de Medicina, Universidad
Complutense de Madrid.
1
RESUMEN
La hidrólisis de clara de huevo con pepsina, quimiotripsina y tripsina dio lugar a hidrolizados con
actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (IECA). La mayor actividad
IECA se obtuvo tras la hidrólisis de clara de huevo con pepsina durante 3 horas (IC50 55
g/ml). Este hidrolizado se tomó como punto de partida para aislar los péptidos responsables de
esta actividad. El permeado que se obtuvo tras un paso de ultrafiltración a través de una
membrana de 3000 Da de tamaño de poro se separó mediante cromatografía de líquidos de
alta eficacia en fase inversa. Se obtuvieron 3 fracciones con actividad IECA en las que se
identificaron 14 péptidos, de los cuales, 12 correspondieron a fragmentos de la ovoalbúmina y
2 a fragmentos de la ovotransferrina. Los fragmentos de la ovoalbúmina: IVF, RADHPFL,
FRADHPFL y YAEERYPIL demostraron potente actividad IECA in vitro y actividad
antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas. Además ninguno de estos péptidos, el
permeado o el hidrolizado de clara de huevo presentó actividad antihipertensiva en ratas
normotensas lo que, en principio, permitiría descartar efectos indeseables sobre la presión
arterial de sujetos normotensos. La actividad IECA de estos péptidos no había sido
anteriormente
descrita.
Solamente
el
fragmento
FRADHPFL
(ovokinina)
había
sido
anteriormente identificado como agonista de la bradiquina B1 y, por tanto, con actividad
antihipertensiva. Por lo tanto, este trabajo aporta nuevas secuencias con actividad
antihipertensiva e IECA y propone un nuevo mecanismo de acción para la ovokinina. Estos
ovoproductos, los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos, o uno o más de los
péptidos activos identificados podrían utilizarse como ingredientes de alimentos funcionales o
productos farmacéuticos para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial.
2
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, los alimentos funcionales han irrumpido con fuerza en el sector
alimentario, debido a que existe una mayor concienciación por parte de los consumidores de la
relación existente entre la dieta y la salud. Dentro de los ingredientes funcionales, es decir,
componentes que, incorporados al alimento, proporcionan al mismo actividades biológicas
específicas que van más allá de la mera nutrición, ocupan un lugar destacado los péptidos
bioactivos, por su diversidad y multifuncionalidad. Los péptidos bioactivos corresponden a
fragmentos que se encuentran inactivos dentro de la proteína precursora, pero que pueden
liberarse mediante hidrólisis in vivo o in vitro y, en esta forma, ejercer distintas funciones fisiológicas
en el organismo. Desde su descubrimiento, en 1979, se han descrito péptidos derivados de
proteínas alimentarias con diferentes actividades biológicas: antihipertensiva, antitrombótica,
opiácea, antioxidante, inmunomodulante, etc (Gobbetti et al., 2002).
Entre
los
péptidos
bioactivos,
cabe
destacar
aquellos
que
ejercen
actividad
antihipertensiva mediante la regulación del sistema renina-angiotensina (Takano, 1998). Es
notoria la elevada incidencia de enfermedades cardiovasculares en la población y el tratamiento
de la hipertensión constituye una de las estrategias más utilizadas para reducir el riesgo estas
enfermedades. Uno de los mecanismos de acción más aceptado para estos péptidos es la
inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), que cataliza la formación de
angiotensina II, un octapéptido con una potente actividad vasoconstrictora y, además, inactiva la
bradiquinina, que produce vasodilatación. Se han descubierto distintos péptidos con actividad
inhibidora de la ECA (IECA), obtenidos a partir de hidrolizados enzimáticos de proteínas de
suero lácteo, caseínas, músculo de pescado, o de origen vegetal (Yamamoto, 1997; Fujita et
al., 2001; Vermeirssen et al., 2003).
Existen muchos menos estudios relacionados con las proteínas de huevo, a pesar de ser
éstas una fuente de nitrógeno muy importante en la dieta. El reciente desarrollo de nuevas técnicas
biotecnológicas y de separación permite el fraccionamiento de distintos componentes del huevo
para su uso con nuevos propósitos alimenticios o no alimenticios y, de este modo, están
apareciendo nuevas aplicaciones que contribuyen a aumentar su consumo. Así, distintas empresas
dedicadas a la producción de proteínas aisladas a partir de fracciones del huevo, están interesadas
en aumentar y diversificar los usos de algunos componentes, como la ovoalbúmina y la
ovotransferrina. Este es el caso de las industrias dedicadas a la producción de lisozima, utilizada
como agente antimicrobiano, que obtienen como subproductos otras fracciones nitrogenadas de
bajo coste, destinadas generalmente a alimentación animal o para su uso como emulgentes y
3
gelificantes en distintos alimentos. La producción de péptidos antihipertensivos a partir de las
proteínas de la clara de huevo permitiría encontrar nuevos usos al huevo de gallina, más allá de su
valor alimenticio clásico, incluyendo la producción de bioproductos medicinales y nutracéuticos.
Esto contribuiría al desarrollo de alimentos saludables, seguros y de alta calidad, contribuyendo al
aprovechamiento y revalorización de los ovoproductos.
Fujita et al. (2000) encontraron actividades IECA en hidrolizados de ovoalbúmina con
pepsina y termolisina que presentaban valores de IC50 (concentración que inhibe el 50% de la
actividad de la enzima) de 45.0, 83.0
g/ml respectivamente. Sin embargo, según estos
autores, tripsina y quimiotripsina no producían hidrolizados activos, ya que proporcionaban
valores de IC50 >1000 g/ml. Se han descrito dos péptidos con actividad vasodilatadora, que
provienen de la misma región de la ovoalbúmina hidrolizada con diferentes enzimas. Fujita et al.
(1995) aislaron un octapéptido de un hidrolizado de ovoalbúmina con pepsina (ovokinina,
FRADHPFL), que poseía actividad vasorelajadora en arterias mesentéricas caninas, pero no
mostraba actividad IECA, ni actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas
(SHR). Matoba et al. (1999) purificaron, a partir de un hidrolizado de ovoalbúmina con
quimotripsina, un hexapéptido correspondiente al fragmento 2-7 de la ovokinina (RADHPF,
ovokinina (2-7)) que, a diferencia de ésta, ejercía una potente acción antihipertensiva en SHR.
Posteriormente, se sintetizaron análogos de la ovokinina (2-7) con el objetivo de
aumentar su actividad antihipertensiva. Entre ellos, los péptidos RPFHPF y RPLKPW mostraron,
respectivamente, 10 y 100 veces más actividad que la ovokinina (2-7) tras su administración
oral a SHRs, lo que se atribuyó a una mayor resistencia a las proteasas del tracto digestivo
(Matoba et al., 2001; Yamada et al., 2002). Debe destacarse que, con frecuencia, muchos
péptidos que se muestran como potentes inhibidores de la ECA in vitro pierden toda o parte de
su actividad cuando se ensayan in vivo o, por el contrario, péptidos que in vitro no presentan
gran actividad IECA la adquieren in vivo debido a la actuación de las enzimas digestivas (Maeno
et al., 1996; Vermeirssen et al., 2003).
El presente trabajo se ha abordado con el propósito de obtener ovoproductos con
actividad inhibidora de la ECA a partir de proteínas de la clara de huevo e identificar los
péptidos responsables de dicha actividad. El estudio se complementa con la evaluación de la
actividad antihipertensiva de los ovoproductos y los péptidos en SHR.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Para este estudio se procedió inicialmente a la preparación de hidrolizados de proteínas
de huevo en los que se determinó el grado de hidrólisis y la actividad IECA. Esto permitió la
selección del hidrolizado más activo, del que posteriormente se aislaron fracciones peptídicas.
Tras la medida de su actividad IECA, se identificaron los péptidos presentes en las fracciones
más activas y, posteriormente, se procedió a sintetizar químicamente los péptidos identificados.
Finalmente, se evaluó el efecto sobre la presión arterial de SHR de los péptidos sintéticos con
mayor actividad IECA y de los ovoproductos de los que procedían. Un esquema general de la
estrategia usada, que se describe con más detalle a continuación, se muestra en la Figura 1.
CLARA DE HUEVO
hidrólisis enzimática
pepsina
tripsina
quimiotripsina
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD IECA
Selección del hidrolizado más activo
HIDROLIZADO DE CLARA DE HUEVO
CON PEPSINA (3 HORAS)
ULTRAFILTRACIÓN (3000 Da tamaño de poro)
permeado < 3000 Da
RP-HPLC a escala semipreparativa
9 fracciones
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD IECA
FRACCIÓN 6
FRACCIÓN 7
FRACCIÓN 8
SECUENCIACIÓN MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM
5
Figura 1: Esquema de la estrategia seguida para la identificación de los péptidos inhibidores de la
enzima convertidora de angiotensina en hidrolizados enzimáticos de clara de huevo.
Preparación de hidrolizados de proteínas de clara de huevo
Los hidrolizados se obtuvieron empleando como sustratos clara de huevo de gallina,
procedente de huevos frescos, separada de la yema y liofilizada y ovoalbúmina grado VI (99%
de pureza) (Sigma, Chemicals Co, St. Louis, MO, USA). Se utilizaron las siguientes enzimas:
pepsina (E.C. 3.4.23.1. tipo A, 10000 U/mg de proteína) procedente de estómago de cerdo
y tripsina (E.C. 3.4.21.4. tipo I, 10900 U/mg de proteína) y quimiotripsina (E.C. 3.4.21.1.
tipo I-S, 44 U/mg de proteína) procedentes de pancreas bovino (Sigma).
Para la hidrólisis con pepsina, los sustratos se disolvieron en agua a una concentración de
100 mg/ml y el pH se ajustó a 2.0 con HCl 1 N. En el caso de las hidrólisis con tripsina y
quimiotripsina, la concentración de sustrato fue 25 mg/ml y el pH se ajustó a 7.8 y 8.0
respectivamente con NaOH 1 N. La relación enzima/sustrato fue 1/100, p/p en las hidrólisis
con pepsina y quimiotripsina y 5/100, p/p, en las hidrólisis con tripsina. Las hidrólisis se
llevaron a cabo a una temperatura de 37 ºC durante 24 horas tomando alícuotas tras distintos
tiempos. La inactivación de la pepsina se consiguió elevando el pH a 7.0 con NaOH 1N. La
tripsina y la quimiotripsina se inactivaron calentando a 100ºC, 15 min.
La fracción menor de 3000 Da de los hidrolizados se obtuvo mediante ultrafiltración a
través de una membrana hidrofílica de 3000 Da (Centriprep, Amicon, Inc., Beverly, MA,
EEUU), centrifugando a 1900 g durante 40 min. Se determinó el grado de hidrólisis y la
actividad IECA de los hidrolizados como se describe a continuación.
Determinación del grado de hidrólisis mediante cromatografía de líquidos de alta eficacia
(RP-HPLC)
Se utilizó un cromatógrafo de líquidos Beckman System Gold (Beckman Instruments,
Fullerton, MA, EEUU), compuesto por dos bombas (module 116), un detector de diodos
alineados (module 168), un inyector automático 717 plus (Waters Corp., Mildford, MA,
EEUU), y el sistema de adquisición de datos System Gold Software 7.11 (Beckman). Las
separaciones se realizaron en una columna Hi-Pore C18 RP318 (250 x 4.6 mm, BioRad
Laboratories, Hercules, CA, EEUU) a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 214 y
280 nm. Se empleó como fase A agua milli-Q con 0.1% de trifluoroacético (TFA) y como
fase B acetonitrilo con un 0.1 % de TFA. Las separaciones se realizaron con un flujo de 0.8
6
ml/min. El gradiente lineal de fase B utilizado fue del 2 a 65% en 60 minutos, se lavó la
columna con un 90% de fase B y finalmente se acondicionó la columna en las condiciones
iniciales durante 15 minutos. Todas las muestras se filtraron a través de un filtro de 0.45 µm de
Millipore (Waters Corp., Mildford, MA, EEUU) y se inyectaron en el cromatógrafo 3 l de los
hidrolizados con pepsina y 12 l de los hidrolizados obtenidos con tripsina y quimiotripsina. El
grado de hidrólisis se expresó como porcentaje de hidrólisis de la ovoalbúmina.
Medida de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (IECA)
La actividad inhibidora de la ECA se midió in vitro de acuerdo con el método de
Cushman y Cheung (1971), modificado posteriormente por Kim et al. (1999).
El sustrato hipuril histidil leucina (HHL, Sigma) se disolvió en tampón borato 0.1 M con
NaCl 0.3 M, pH 8.3, para obtener una concentración final 5 mM. A 100 µl de disolución de
sustrato se le añadieron 40 µl de cada una de las muestras cuya actividad IECA se quiso
determinar. Se añadió la enzima ECA (EC 3.4.15.1, Sigma), disuelta en glicerol al 50%, y
diluida en el momento de realizar el ensayo 1/10 en agua bidestilada. La reacción se llevó a
cabo a 37ºC, durante 30 min en un baño de agua y, a continuación, la enzima se inactivó
descendiendo el pH con 150 µl de HCl 1N. El ácido hipúrico formado se extrajo con 1000 µl
de acetato de etilo. Tras agitación en vórtex durante 20 segundos, se centrifugó a 4000 rpm
durante 10 min, a temperatura ambiente. Se tomaron 750 µl de la fase orgánica que se
evaporó por calentamiento a 95ºC durante 10 minutos. El residuo de ácido hipúrico se
redisolvió en 800 µl de agua bidestilada y, tras agitar durante 20 segundos, se midió la
absorbancia a 228 nm en un espectrofotómetro Dur-70 (Beckman).
Para calcular el porcentaje de actividad IACE se emplea la fórmula siguiente:
Acontrol-Amuestra
% IACE = -------------------------------* 100
Acontrol-Ablanco
El blanco se utiliza para corregir la absorbancia de fondo. Éste contiene sustrato, enzima
y 20 µl de agua bidestilada en lugar de muestra, y la reacción se para a tiempo cero. El control
supone el 100% de la acción enzimática sobre el sustrato en ausencia de inhibidores, y contiene
20 µl de agua en lugar de muestra y se incuba el mismo tiempo que la muestra.
7
Los resultados se presentan como el IC50 ( M o g/ml) o concentración que inhibe el
50% de la actividad de la enzima. La concentración de proteína se determinó mediante el
ensayo del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EEUU) empleando como patrón
seroalbúmina bovina.
Aislamiento de fracciones peptídicas mediante cromatografía líquida de alta eficacia en
fase inversa (RP-HPLC) a escala semi-preparativa
Se utilizó un equipo formado por dos bombas programables modelo Waters Delta 600,
un detector de diodos alineados modelo 966, un inyector automático modelo 717 plus, y un
colector de fracciones automático (Waters Corp., Mildford, MA, EEUU) Se emplea una
columna C18 Prep NovaPack® HR, 7.8 x 300 mm y 6 µm de tamaño de poro (Waters), con
un cartucho C18 (Waters) como precolumna. Los análisis se realizan a 30ºC y la detección a
214 y 280 nm. La adquisición de los datos se llevó a cabo con el Software Millennium versión
3.2 (Waters). Para la elución de las muestras se utiliza un gradiente binario de agua (fase A) y
acetonitrilo (fase B) con 0.1 % de TFA en cada uno de ellos y un flujo de 4 ml/min. El
gradiente de fase B es de 2% al 10% en 15 min, del 10% al 20% durante 35 min, del 20% al
30% durante 20 min, se lava la columna con 70% de fase B y finalmente se acondiciona en las
condiciones iniciales durante 15 min. La concentración de la muestra fue 50 mg/ml y el
volumen de muestra inyectado fue 200 µl. Antes de la inyección, las muestras se pasan por un
filtro Millipore (Waters) de 0.45 µm. El cromatograma obtenido se dividió en fracciones que se
recogieron tras, aproximadamente 10-12 análisis. Las fracciones se liofilizaron y se mantuvieron
a –20ºC hasta su utilización.
Análisis mediante espectrometría de masas en tandem (off-line)
Se emplea un equipo de trampa iónica Esquire3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen,
Alemania). Las fracciones peptídicas 6, 7 y 8, recogidas mediante RP-HPLC preparativo, se
liofilizaron y se disolvieron a una concentración 5-10 g/ml en una mezcla de acetonitrilo al 50
% en agua conteniendo 0.3 % de ácido fórmico. Las muestras se inyectaron en el nebulizador
de electrospray a un flujo de 4
l/min, utilizando una bomba de jeringa tipo 22 (Harvard
Apparatus, South Natick, MA, EEUU). El equipo emplea nitrógeno como gas nebulizador y de
secado, y opera con una presión de helio de 5 x 10–3 bar. Los espectros de masas se
adquirieron en un intervalo de 50-1500 m/z y a una velocidad de 13000 Da/segundo. La
interpretación de los espectros de masas en tandem para la identificación de las secuencias
peptídicas se realizó con el programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik).
8
Síntesis de los péptidos identificados
Los péptidos se sintetizaron químicamente, mediante el método Fmoc en fase sólida con
un sintetizador modelo 431A de Applied Biosystems Inc. (Überlingen, Alemania). La pureza de
los péptidos sintéticos se verifica mediante RP-HPLC-MS/MS. Para ello, se empleó un equipo
Esquire-LC (Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Alemania). El equipo de HPLC (serie 1100) está
formado por una bomba cuaternaria, un inyector automático, un sistema de desgasificación de
eluyentes y un detector ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies,
Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa iónica Esquire
3000 (Bruker Daltonik). La columna es una columna Hi-Pore C18 (250 x 4,6 mm d.i., 5 m
de tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EEUU). La fase A es una
mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:0.37) y la fase B una mezcla de acetonitrilo y
ácido trifluoroacético (1000:0.27). Se inyectan 50 l de muestra, a una concentración de 1-2
mg/ml. Se emplea un flujo de 0.8 ml/minuto, con un gradiente lineal de 0% al 30% del fase B
en A en 25 minutos. El eluyente se monitoriza a 214 nm y mediante espectrofotometría de
masas, bajo las mismas condiciones que las indicadas en el apartado anterior, pero en este caso
el flujo de inyección de la muestra a través del nebulizador es de 60 l/min.
Estudio de la actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas
Se estudió el efecto antihipertensivo de varios de los péptidos identificados y de algunos
productos que los contenían, como el hidrolizado de clara de huevo con pepsina y la fracción
del mismo menor de 3000 Da, sobre la presión arterial de ratas espontáneamente hipertensas
(SHR) y de ratas Wistar-Kyoto, que son el control normotenso de las ratas SHR.
Para ello se utilizaron ratas macho SHR (n = 10) y ratas Wistar-Kyoto de 17-24
semanas de edad, y peso comprendido entre 300 y 350 g. Todos estos animales procedían de
Charles River Laboratories España S.A. Las ratas se almacenaron en jaulas de cinco en cinco y se
mantuvieron a una temperatura estable de 25ºC con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas,
ingiriendo agua y comida a libre disposición. Para realizar las medidas de la presión arterial
sistólica (PAS) se utiliza un equipo de “tail cuff” (método del manguito en la cola) (Le5001,
Letica, Barcelona, España) que proporciona un valor digital de este valor automáticamente. Se
realizaron varias medidas, y se obtuvo la media de todas ellas para conseguir un valor fiable de la
9
PAS. Antes de colocar el manguito y el transductor en la cola de las ratas, éstas se expusieron a
una temperatura próxima a los 30ºC para facilitar la dilatación de la arteria caudal. Además,
para asegurar la fiabilidad de la medida, los animales se acostumbraron al procedimiento 2
semanas antes de llevar a cabo el ensayo en cuestión. Las ratas SHR utilizadas para el estudio
tenían valores de PAS comprendidos entre 230 y 280 mm Hg. Las ratas WKY utilizadas para el
estudio tenían en ese momento valores de PAS comprendidos entre 160 y 200 mm Hg.
La administración de los productos a ensayar se realizó mediante sonda intragástrica en
un margen de tiempo comprendido entre las 9 y las 10 h de la mañana. Se tomaron medidas
de la PAS en los animales periódicamente, cada 2 horas, hasta las 8 horas post-administración
de los productos a ensayar; adicionalmente se tomó una medida de la PAS 24 horas después de
la administración de dichos productos. Como control negativo (para establecer la variación
circadiana de la PAS en ratas sondadas), se utilizaron las medidas de la PAS obtenidas en ratas a
las que se les administró mediante sonda intragástrica 1 ml de agua. Como control positivo, se
utilizaron las medidas de la PAS obtenidas en ratas a las que se les administró mediante sonda
intragástrica 50 mg/kg de Captopril (fármaco IECA prototipo). Esta dosis de Captopril se
administró a cada rata en un volumen de 1 ml. Para establecer el efecto de la clara de huevo no
hidrolizada sobre la presión arterial de los animales, se llevaron a cabo ensayos semejantes a los
descritos anteriormente, en los que los animales se trataron por el mismo procedimiento con
200 mg/kg de clara de huevo previamente liofilizada (testigo).
El hidrolizado de clara de huevo y su fracción menor de 3000 Da se emplearon
liofilizados. Se administraron distintas concentraciones a los animales, comprendidas entre 100 y
400 mg/kg, y entre 25 y 100 mg/kg, en el caso del hidrolizado y de la fracción menor de
3000 Da, respectivamente. Se administraron también diferentes dosis de los péptidos sintéticos,
siendo la dosis máxima utilizada siempre equivalente en unidades de actividad IECA a la dosis
50 mg/kg de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo. Los péptidos se
disolvieron siempre en agua destilada y la dosis correspondiente se administró a cada rata en un
volumen de 1ml.
Los resultados obtenidos se agruparon y se obtuvo la media ± el error estándar de la
media (ESM) para un mínimo de 9 ensayos homogéneos. Los datos de los animales tratados se
compararon siempre con los datos que se consideran control negativo. Para compararlos y
obtener la significación estadística se utilizó el test de la “t” de “Student” para datos no
apareados, y se consideró significativa la diferencia para valores de p<0.05.
10
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina de la ovoalbúmina y la
clara de huevo hidrolizadas con distintas enzimas
Se midió la actividad IECA y el grado de hidrólisis tras diferentes tiempos de incubación
de clara de huevo con pepsina, tripsina y quimiotripsina. Los resultados mostraron que la clara
de huevo sin hidrolizar no poseía actividad IECA (IC50 > 750 g/ml), pero inhibía la enzima
tras distintos tiempos de hidrólisis con las enzimas. El IC50 de los hidrolizados disminuyó al
aumentar el tiempo de incubación, tal y como se muestra en la tabla 1. La mayor inhibición se
observó tras la hidrólisis con pepsina, con la que se obtuvieron valores de IC50 del orden de 55
g/ml después de 3 h de tratamiento. La pepsina también mostró la mayor actividad proteolítica
hacia la ovoalbúmina hasta las 3 h de hidrólisis, aunque no pudo establecerse una relación
directa entre la proporción de proteína intacta y la actividad IECA de los hidrolizados, puesto
que en ésta influye decisivamente la especificidad de la enzima. En cuanto a los hidrolizados con
tripsina y quimotripsina, sólo se obtuvieron valores de IC50 aceptables tras 24 h de hidrólisis con
tripsina y a partir de 3 h de hidrólisis con quimotripsina.
La ovoalbúmina de grado VI (con un 99% de pureza) se trató con pepsina durante 3
horas y con tripsina y quimiotripsina durante 24 horas. Los niveles de inhibición, aunque
ligeramente superiores, resultaron del mismo orden que los obtenidos con clara de huevo
hidrolizada durante los mismos tiempos. Los perfiles peptídicos también fueron muy parecidos
(resultados no mostrados). Esto sugiere que, bajo estas condiciones, la mayoría de los productos
de hidrólisis de la clara de huevo provendrían de la ovoalbúmina, que constituye más del 50%
del total de las proteínas que la constituyen. Nuestros resultados están de acuerdo con los
obtenidos por Fujita et al. (2000) que obtuvieron hidrolizados de ovoalbúmina y pepsina con
actividad IECA. Sin embargo, estos autores no consiguieron hidrolizados activos con tripsina y
quimiotripsina (IC50 > 1000
g/ml), probablemente porque los tiempos de hidrólisis
empleados fueron demasiado cortos (3 horas frente a 24 horas en el presente estudio).
Se decidió continuar los experimentos con clara de huevo hidrolizada con pepsina,
puesto que ésta resulta un sustrato proteico más barato y asequible que la ovoalbúmina aislada
para la producción de péptidos bioactivos. Se determinó la actividad IECA en el permeado
(fracción < 3000 Da) y en el retenido (fracción > 3000 Da) tras la ultrafiltración del
hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 h. Los valores de IC50 fueron,
respectivamente, de 34.5 y 298.4
g/ml. Esto pone de manifiesto que el permeado posee
11
aproximadamente 10 veces más actividad IECA y que, por tanto, la actividad se debe
fundamentalmente a péptidos de pequeño tamaño. Muchos de los péptidos con actividad IECA
descritos hasta el momento (Pihlanto Leppälä et al. 1998) corresponden a secuencias peptídicas
cortas (de 3 a 7 aminoácidos) lo que concuerda con la mayor actividad encontrada en esta
fracción.
Tabla 1: Actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina y grado de hidrólisis a
distintos tiempos de incubación con cada enzima. La actividad está expresada como
cantidad de proteína ( g) necesaria para inhibir el 50% la actividad de la enzima
convertidora de angiotensina (IC50) y el grado de hidrólisis está expresado como
porcentaje de hidrólisis de la ovoalbúmina.
Clara de
Pepsina
Tripsina
Quimotripsina
huevo
IC 50
( g/ml)
Grado de
hidrólisis
(%)
IC 50
( g/ml)
Grado de
hidrólisis
(%)
IC 50
( g/ml)
Grado de
hidrólisis
(%)
0 min
> 750
0
> 750
0
> 750
0
200.9
±1.5
55.3
±2.1
72.2
±2.3
43.07
±1.4
40.2
±0.9
41.3
±3.4
56.9
±1.1
64.8
±0.7
71.5
±0.2
74.3
±1.6
> 750
129.0
±0.6
0
85.3
±1.3
30 min
3 horas
5 horas
8 horas
24 horas
454.1
±2.0
385.9
±1.9
290.4
±2.9
248.7
±0.1
15.2
±1.8
40.7
±1.2
74.5
±3.4
79.1
±0.7
86.7
±1.5
114.1
±2.9
12.6
±3.8
27.8
±2.9
68.1
±1.7
74.8
±1.6
78.6
±1.0
> 750
0
>750
0
168.2
±1.0
89.1
±1.2
189.4
±1.1
90.3
±0.9
>750
>750
>500
>500
> 750
OVO VI
0 min
3 horas
24 horas
Identificación de péptidos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la
angiotensina
12
La fracción menor de 3000 Da obtenida tras la hidrólisis de clara de huevo con pepsina
durante 3 h se fraccionó mediante RP-HPLC a escala semipreparativa. Tal y como se muestra en
la Figura 2 A, se recogieron 9 fracciones cuya actividad IECA se muestra en la Figura 2 B.
La mayor actividad se encontró en las fracciones 6, 7 y 8, con valores de IC50< 40
g/ml. Estas fracciones se analizaron por espectrometría de masas en tandem para determinar
sus péptidos constituyentes. Todas las fracciones presentaron un espectro muy complejo,
poniendo de manifiesto que estaban compuestas por diferentes péptidos. Por ello, la técnica de
elección para llevar a cabo la secuenciación de los péptidos en cada fracción fue la
espectrometría de masas en tandem. Esta técnica permitió aislar en el analizador de masas cada
uno de los iones mayoritarios de cada fracción y fragmentarlos. A partir del espectro de
fragmentación se obtuvo la secuencia de los péptidos mayoritarios presentes. De esta forma se
identificaron 14 péptidos, 12 de los cuales procedían de la ovoalbúmina y 2 correspondían a
fragmentos de la ovotransferrina (Tabla 2). Todos los péptidos identificados se sintetizaron
químicamente y se determinó la actividad IECA de los péptidos sintéticos, tal y como se
muestra en la tabla 2.
13
F1
0.80
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
0.70
0.60
0.50
AU 214 nm 0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
-0.10
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
45.00
50.00
55.00
60.00
65.00
70.00
75.00
80.00
85.00
90.00
IC 50 ( υg/ml)
Tiempo (minutos)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
Figura 2: (A) Cromatograma obtenido utilizando cromatografía de líquidos de alta
eficacia en fase reversa a escala semipreparativa de la fracción menor de 3000 Da producida
mediante hidrólisis de clara de huevo con pepsina durante 3 h, en el que se seleccionan 9
fracciones (F1-F9), que fueron recogidas automáticamente. (B) Actividad inhibidora de la
enzima convertidora de angiotensina, expresada como la concentración proteica necesaria para
inhibir el 50 % de la enzima (IC50), correspondiente a cada una de las fracciones recogidas
mediante el RP-HPLC a escala preparativa.
Destacan por su actividad 8 péptidos con IC50 inferiores a 450 M y, sobre todo, las
secuencias: IVF, RADHPFL, FRADHPFL y YAEERYPIL, con IC50 inferiores a 34
M. Debe
resaltarse que, exceptuando el octapéptido FRADHPFL (previamente identificado como
ovokinina), el resto de las secuencias son nuevas y, por tanto, constituyen un aspecto original de
este trabajo. Además, aunque se había comprobado la actividad vasodilatadora en arterias
mesentéricas caninas del péptido identificado como ovokinina (Fujita et al., 1995), no se
conocía que presentara una potente actividad IECA.
14
95.00
Tabla 2. Péptidos identificados en el hidrolizado de clara con pepsina durante tres horas.
Masa
Fracc. nº. experiment
Masa
Proteina
teorica
IC
50
Posición
Aminoácidos
(µM)
al
6
592.3
592.32
Ovoalbúmina
212-216
YQIGL
173.8
6
377.2
377.23
Ovoalbúmina
178-180
IVF
33.9
6
854.4
854.44
Ovoalbúmina
359-365
RADHPFL
6.2
6
365.2
365.20
Ovoalbúmina
99-101
FSL
172.9
6
644.4
643.35
Ovotransferrina 392.398
VALDGGL
> 1000
6
212.1
212.12
Ovotransferrina
PP
> 1000
varios
fragment
os
7
721.3
721.37
Ovoalbúmina
256-261
ESIINF
> 1000
7
1001.4
1001.51
Ovoalbúmina
358-365
FRADHPFL
3.2
7
1152.3
1152.58
Ovoalbúmina
106-114
YAEERYPIL
4.7
8
757.2
757.41
Ovoalbúmina
84-89
RDILNQ
435.7
8
1040.2
1040.58
Ovoalbúmina
8
491.1
491.24
Ovoalbúmina
36-40
SALAM
229.1
8
487.1
487.26
Ovoalbúmina
144-147
ELIN
> 1000
8
1164.2
1164.59
Ovoalbúmina
125-134 YRGGLEPINF
243-252 VLLPDEVSGL
> 1000
> 1000
El heptapéptido RADHPFL, encontrado en el presente estudio, guarda similitud tanto
con la ovokinina (FRADHPFL; Fujita et al., 1995) como con la ovokinina (2-7) (RADHPF;
Matoba et al. (1999). Cabe destacar que, de acuerdo con Matoba et al., (2001) y Yamada et
al., (2002), ni la ovokinina, ni la ovokinina (2-7), ni sus derivados RPFHPF o RPLKPW
poseerían actividad IECA. Estos autores postularon que disminuirían la presión arterial a través
de su interacción con receptores del tracto gastrointestinal o debido a efectos en el sistema
nervioso central. Sin embargo, nuestros resultados demuestran que, al igual que ocurre con
muchos péptidos antihipertensivos de origen alimentario, la inhibición de la ECA es, al menos,
uno de sus mecanismos de acción.
Además, los péptidos activos identificados en este estudio con actividad IECA
comparten características estructurales con otros inhibidores de la ECA. De los estudios
15
existentes de relación estructura-actividad de péptidos inhibidores de la ECA se sabe que la
naturaleza del tripéptido del extremo C-terminal juega un papel primordial. Así por ejemplo, la
unión a la ECA se ve favorecida por la presencia de prolina o aminoácidos aromáticos en la
última o antepenúltima posición del extremo C-terminal (Cheung et al., 1980). Esto explicaría
la potente actividad encontrada para los péptidos IVF, RADHPFL, FRADHPFL y YAEERYPIL.
Sin embargo, la enzima sólo une débilmente sustratos con prolina en penúltima posición
(Cheung et al., 1980) lo que concuerda con la baja actividad encontrada para el fragmento PP.
Actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas
Las Figuras 3 y 4 muestran, respectivamente, la disminución de la PAS obtenida en ratas
SHR en distintos momentos tras la administración de diferentes dosis del hidrolizado de clara de
huevo, y tras la administración de diferentes dosis de la fracción menor de 3000 Da de dicho
hidrolizado. Los resultados de estos ensayos con clara de huevo no hidrolizada (200 mg/kg)
mostraron que los valores de PAS fueron semejantes a los obtenidos cuando se administró agua,
de lo que se deduce que la clara de huevo carece de efecto antihipertensivo. En estas figuras se
incluye, además, la disminución de la PAS observada tras la administración de Captopril (50
mg/kg). El Captopril produjo una pronunciada disminución de la PAS en las ratas SHR, que fue
máxima 4-6 horas después de la administración del fármaco. El hidrolizado de clara de huevo y
la fracción menor de 3000 Da ocasionaron significativas disminuciones dosis-dependientes de la
PAS en los animales. La mayor disminución de la PAS después de administrar el hidrolizado de
clara de huevo y la fracción menor de 3000 Da de este hidrolizado, se observaron también 6
horas después de su administración. Los valores de la PAS observados 24 horas después de las
distintas administraciones fueron semejantes a los que tenían los animales antes de las mismas.
La fracción del hidrolizado con peso molecular menor de 3000 Da mostró actividad
antihipertensiva in vivo a dosis de 50 mg/kg, mientras que era necesaria una dosis de 150
mg/kg para una actividad equivalente del hidrolizado completo. Nuestros resultados muestran
que ambos son activos a dosis bajas en comparación con otros hidrolizados de proteínas
alimentarias. Así, Fujita et al., (2001) encontraron que, para producir en SHR una reducción
de la PAS de 10 mm de Hg, eran necesarios 680 mg/kg de hidrolizado con termolisina de
bonito seco, comparados con 290 mg/kg de la fracción del mismo con peso molecular menor
de 3000 Da. De acuerdo con Wu y Ding (2001) la fracción menor de 10000 Da del
hidrolizado de proteína de soja con alcalasa poseía efecto hipotensor en SHR a dosis de 100
mg/kg. En el caso de leches fermentadas son necesarias dosis de 1.0 y 2.5 g/kg para disminuir
significativamente la PAS de SHR (Leclerc et al., 2002).
16
10
∆ PAS (mm Hg)
0
-10
-20
-30
Agua
-40
Captopril
-50
CH
-60
HCH 100
mg/kg
-70
0
2
4
6
8
24
Tiempo después de la administración (horas)
Figura 3: Presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la
administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua ( ), 50 mg/kg de captopril ( ),
200 mg/kg de clara de huevo (CH) (X), y diferentes dosis del hidrolizado de clara de huevo
(HCH): 100 mg/kg ( ), 150 mg/kg ( ), 200 mg/kg ( ), y 400 mg/kg ( ). Los datos
representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales, en distintos momentos después de
la administración.
10
∆ PAS (mm Hg)
0
-10
-20
-30
Agua
-40
Captopril
F<3000 Da 25 mg/kg
-50
F<3000 Da 50 mg/kg
-60
F<3000 Da 100 mg/kg
-70
0
2
4
6
8
24
Tiempo después de la administración (horas)
Figura 4: Presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la
administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua ( ), 50 mg/kg de captopril ( ), y
diferentes dosis de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo (F<3000
Da): 25 mg/kg ( ), 50 mg/kg ( ) y 100 mg/kg ( ). Los datos representan la media ± ESM
para un mínimo de 9 animales, en distintos momentos después de la administración.
17
Las Figuras 5, 6 y 7 muestran las disminuciones de la PAS obtenidas en ratas SHR en
distintos momentos, tras la administración de distintas dosis de los péptidos IVF, RADHPFL, y
YAEERYPIL. Se puede observar que la administración de estos péptidos ocasionó una
disminución dosis-dependiente significativa de la PAS en estos animales. La disminución de la
PAS fue máxima 6 horas después de la administración, y la disminución máxima obtenida fue
además similar con los diferentes péptidos. La administración a SHR de distintas dosis de los
péptidos IVF, RADHPFL, y YAEERYPIL produjo una significativa disminución de la PAS a dosis
de 1 mg/kg, lo cual se compara muy favorablemente con la dosis de 10 mg/kg, que se
considera la necesaria en el caso de la ovokinina (2-7) (RADHPF) (Yamada et al., 2002). Los
resultados presentados demuestran que los péptidos IVF, RADHPFL, y YAEERYPIL tienen un
claro y pronunciado efecto antihipertensivo, que tras su administración aguda sigue un curso
temporal semejante al efecto antihipertensivo que se aprecia cuando se administra el hidrolizado
de clara de huevo o la fracción menor de 3000 Da de dicho hidrolizado.
Aunque las actividades IECA de los péptidos sintéticos fueron muy inferiores a la del
captopril (IC50 = 0.022 M) su potencia antihipertensiva in vivo, resultó ser del mismo orden.
Esto parece indicar que los inhibidores de la ECA derivados de proteínas alimentarias poseen
una mayor potencia in vivo que la que puede extrapolarse de sus actividades in vitro. Debe
destacarse, además, que por tratarse de fragmentos presentes en proteínas de los alimentos
cumplen los requisitos de ser naturales y sanos.
10
0
∆ PAS (mm Hg)
-10
-20
-30
Agua
-40
Captopril
-50
YAEERYPIL 2 mg/kg
YAEERYPIL 1 mg/kg
-60
YAEERYPIL 0.5 mg/kg
-70
0
2
4
6
8
24
Tiempo después de la administración (horas)
Figura 5: Presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la
administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua ( ), 50 mg/kg de captopril ( ),y
diferentes dosis del péptido YAEERYPIL: 0.5 mg/kg ( ), 1 mg/kg ( ) y 2 mg/kg ( ). Los datos
18
representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales, en distintos momentos después de
la administración.
10
∆ PAS (mm Hg)
0
-10
-20
-30
Agua
-40
Captopril
-50
RADHPFL 0.5 mg/kg
RADHPFL 1 mg/kg
-60
RADHPFL 2 mg/kg
-70
0
2
4
6
8
24
Tiempo después de la administración (horas)
Figura 6: Presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la
administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua ( ), 50 mg/kg de captopril ( ), y
diferentes dosis del péptido RADHPFL: 0.5 mg/kg ( ), 1 mg/kg ( ) y 2 mg/kg ( ). Los datos
representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales, en distintos momentos después de
la administración.
10
∆ PAS (mm Hg)
0
-10
-20
Agua
-30
Captopril
-40
IVF 4 mg/kg
-50
IVF 2 mg /kg
-60
IVF 1 mg/kg
-70
0
2
4
6
8
24
Tiempo después de la administración (horas)
Figura 7: Presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la
administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (X), 50 mg/kg de captopril ( ), y
diferentes dosis del péptido IVF: 1 mg/kg ( ), 2 mg/kg ( ) y 4 mg/kg ( ). Los datos
representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales, en distintos momentos después de
la administración.
19
La Figura 8 muestra, los cambios de la PAS obtenidos en ratas WKY en distintos
momentos, tras la administración de los siguientes compuestos: 400 mg/kg del hidrolizado de
clara de huevo, 100 mg/kg de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado, 2 mg/kg de los
péptidos RADHPFL y YAEERYPIL y 4 mg/kg del péptido IVF. También se incluyen los
resultados obtenidos tras la administración de 50 mg/kg de Captopril. Puede apreciarse, que
ninguno de estos compuestos modificó la PAS de las ratas WKY cuando se administró la dosis
más alta utilizada. Estos resultados permiten descartar posibles efectos indeseables de los
productos ensayados sobre la presión arterial de sujetos normotensos.
10
0
∆ PAS (mm Hg)
-10
-20
Agua
Captopril
CH
IVF 2 m g/kg
RADHPFL 2 m g/kg
YAEERYPIL 2 m g/kg
F<3000 Da 100 m g/kg
HCH 400 m g/kg
-30
-40
-50
-60
-70
1
2
3
4
5
Tiem po después de la adm inistración (horas)
6
Figura 8: Presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas Wistar-Kyoto normotensas, tras la
administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua ( ), 50 mg/kg de captopril ( ),
200 mg/kg de clara de huevo (CH) (X), 400 mg/kg de hidrolizado de clara de huevo (HCH)
(•), 100 mg/kg de la fracción menor de 3000 Da de HCH (F<3000 Da) ( ), 2 mg/kg del
péptido YAEERYPIL( ), 2 mg/kg del péptido RADHPFL ( ), y 4 mg/kg péptido IVF( ). Los
datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales, en distintos momentos
después de la administración.
20
CONCLUSIONES
Nuestros resultados muestran que la proteolisis de clara de huevo con pepsina da lugar a
péptidos con potente actividad IECA in vitro y con actividad antihipertensiva en ratas SHR.
Todos los péptidos activos identificados provienen de la ovoalbúmina y la actividad IECA de
estos fragmentos no había sido previamente descrita. Solamente el fragmento FRADHPFL,
correspondiente a la ovokinina, había sido anteriormente identificado como agonista de la
bradiquina B1 y, por tanto, con actividad antihipertensiva. Por ello, este trabajo, además de
aportar nuevas secuencias con actividad antihipersiva e IECA, propone un nuevo mecanismo de
acción a la actividad antihipertensiva de la ovokinina.
Estos ovoproductos, los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos con menor
peso molecular, o uno o más de sus péptidos bioactivos podrían utilizarse como ingredientes de
alimentos funcionales o productos farmacéuticos para el tratamiento y/o prevención de la
hipertensión arterial.
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AGRADECIMIENTOS: Este trabajo se ha realizado en el marco de los proyectos AGL20001480 y AGL2001-1261 subvencionados por el Ministerio de Ciencia y Tecnología. Marta
Miguel disfruta de una beca predoctoral de Formación de Personal Investigador del Ministerio
de Ciencia y Tecnología.
22