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Título del proyecto:
Evaluación de la actividad antihipertensiva de péptidos obtenidos por hidrólisis
enzimática a partir de aislados proteicos de P. vulgaris, P. lunatus y L. mutabilisis
Clave de registro: 20070800
Resumen
La hipertensión arterial es un padecimiento multifactorial que puede dañar órganos
vitales como el corazón, riñón, e incluso las arterias, por lo que está considerada como
un problema importante de salud pública. Esta enfermedad ha sido tratada con diversos
medicamentos sintéticos que inhiben la actividad de la enzima convertidora de la
angiotensina-I (ECA-I), la cual juega un papel importante en la alteración de la presión
arterial. Actualmente, la Ciencia de los Alimentos ha ido promoviendo un nuevo concepto
de nutrición alimentaria que incluye a aquellos alimentos que presentan una
potencialidad en el mejoramiento de la salud y disminuyen los riesgos de enfermedades
en el cuerpo humano, dentro de los cuales, se encuentran los péptidos bioactivos, que se
definen como secuencias de aminoácidos entre 2 y 15 residuos, los cuales se
encuentran inactivos dentro de la proteína precursora, pero que, al ser liberados
mediante digestión enzimática, procesos químicos o por fermentación, ejercen efectos
fisiológicos benéficos a la salud. Por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar la
actividad antihipertensiva en hidrolizados obtenidos a partir de aislado proteico de frijol
negro jamapa (Phaseolus vulgaris), frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris) frijol lima
(Phaseolu lunatus) y lupino (Lupinus mutabilis).Se realizó la obtención de harinas y
aislados proteicos de estas leguminosas con un contenido de proteína entre 22.78 y
33.65% en la harinas y entre 63.83% y 91.38% en los aislados proteínicos
respectivamente. Los aislados proteínicos fueron hidrolizados mediante el uso de
enzimas comerciales (Alcalase® y Flavourzyme®, Pepsina® y Pancreatina®) en ochos
experimentos diferentes. Los grados de hidrólisis GH oscilaron entre 7.17 y 49.48%; la
actividad inhibitoria de la ECA-I (IC50) en los hidrolizados osciló entre 0.0069 y 1.159
mg/ml donde los mejores valores de IC50 se obtuvieron con los hidrolizados de P.
lunatus, en un tiempo de 90 min, empleando Alcalase® (0.056 mg/ml) y Flavourzyme®
(0.0069 mg/ml).
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I. Introducción
Los problemas de salud a nivel mundial han ido en aumento, ya que casi 17
millones
de
personas
mueren
anualmente
(WHO,
2002).
Siendo
las
enfermedades crónicas, incluidas las enfermedades cardiovasculares la principal
causa de las mismas en casi todos los países del mundo. En México, las cifras
también van en aumento con respecto a este tipo de enfermedades,
principalmente en la hipertensión arterial, y en menor grado la diabetes mellitus
tipo-2, dislipidemias, obesidad y aterosclerosis entre otras (SSA, 2000). La
hipertensión arterial es un padecimiento multifactorial que puede dañar órganos
vitales como el corazón, riñón, entre otros, por lo que está considerado como un
problema importante de salud pública. Sin embargo, esta enfermedad ha sido
tratada mediante diversos tipos de medicamentos sintéticos que inhiben a la
enzima convertidora de la angiotensina-I (ECA-I), la cual es responsable directa
de alterar la presión normal de la sangre, al circular ésta a través de venas y
arterias en el cuerpo humano. Siendo los medicamentos más comunes en el
mercado el captopril, benazipril, lisinopril, enalipril, ramipril, entre otros los cuales
han sido eficaces y bien tolerados en el tratamiento de la hipertensión. De igual
forma se han administrado otros medicamentos como son: bloqueadores de la
ECA,
calcioantagonista,
diuréticos,
etc,
que
ayudan
a
combatir
otras
enfermedades que de una u otra forma están relacionadas con la hipertensión
arterial. Sin embargo, la principal desventaja de estos medicamentos de origen
sintético, es que, además de ser muy caros, producen ciertas alteraciones
secundarias a corto y largo plazo en su uso como: la hipotensión, tos normal, tos
irritante, hipercalemia (exceso de nivel de potasio en el torrente sanguíneo),
dolores de cabeza desde ligeros a severos, leucopenia (disminución del número
de leucocitos totales), ageusia o desgeusia (alteración del sentido del gusto),
vasculitis (inflamación de vasos sanguíneos), anticuerpos antinucleares positivos,
mialgias y artralgias (dolores de músculos y articulaciones), fallas y disturbios
renales, angioedema (alergias y ronchas) (Atkinson y Robertson, 1979) e incluso
no deben administrase durante el embarazo debido al riesgo de lesiones fetales e
incluso la muerte (Lip y col., 1997; Baltar y col., 2004).
Actualmente la ciencia de los alimentos ha ido promoviendo un nuevo concepto
de nutrición alimentaria que incluye a aquellos alimentos que presentan una
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potencialidad en el mejoramiento de la salud y disminuyen los riesgos de
enfermedades en el cuerpo humano. Por lo que, muchas industrias alimentarias
como DanoneMR, NestléMR, PolevaMR, etc., han incluido en sus productos
alimenticios ciertos nutrientes y componentes bioactivos extraídos de fuentes
animales y vegetales, capaces de ofrecer y preservar la salud a los
consumidores. Las proteínas alimentarias, además de ser una fuente de energía,
son una excelente materia prima para la obtención de hidrolizados proteínicos
que contengan péptidos bioactivos, así como también son componentes
esenciales en la nutrición humana, ya que forman parte de los alimentos y
cumplen con funciones básicas desde el punto de vista nutricional como funcional
(Clemente y col., 1999). Nutricionalmente, proporcionan los aminoácidos
necesarios para la síntesis de proteínas corporales y otras sustancias
nitrogenadas esenciales para el crecimiento y mantenimiento del organismo.
Funcionalmente, afectan las propiedades fisicoquímicas y sensoriales de los
alimentos, proporcionando atributos únicos debido a sus características
intrínsecas y/o a su interacción con otros componentes, fundamentalmente lípidos
e hidratos de carbono. Además algunas proteínas y péptidos presentan
propiedades biológicas específicas que las hacen ingredientes potenciales de
alimentos específicos (Korhonen y col., 1998). Las principales fuentes de
proteínas son de origen animal, como la caseína y el lactosuero; son las fuentes
proteínicas más utilizadas en la elaboración de hidrolizados proteicos, tanto en
preparaciones infantiles como en la elaboración de dietas especiales para
adultos. Sin embargo, desde los años 80’s ha existido una demanda de fuentes
proteínicas vegetales para la elaboración de formulaciones alimentarias,
sustituyendo a los hidrolizados de origen animal. Recientemente se ha
encontrado que las proteínas de origen vegetal presentan un contenido elevado
del mismo, el cual es importante para ser explotadas en la obtención de ciertos
componentes bioactivos como son: péptidos, fracciones peptídicas e incluso
aminoácidos libres, que pueden tener cierta actividad benéfica al organismo
(Clemente y col., 1999).
Los péptidos bioactivos son pequeñas cadenas peptídicas compuestas por 2 a 15
residuos de aminoácidos (Vioque y col., 2000), los cuales se encuentran inactivos
dentro de la proteína intacta pero que pueden ser liberados durante la digestión
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del alimento o por un proceso previo del mismo, por ejemplo mediante hidrólisis
enzimática (Vioque y col., 2000) y estos pueden ejercer diversas funciones
metabólicas
tales
como
actividad
antiherpertensiva,
antitrombótica,
inmunomodulatoria, opioide, antixodante, antimicrobiana y/o hipocolesterolémica
(Kitts, 1993; Smacchi y Gobbetti, 2000; Clare y Swaisgood, 2000; Fujita y col.,
2000). Cabe mencionar que se han realizado estudios sobre péptidos bioactivos
obtenidos de fuentes animales como: leche, huevo, plasma de sangre, músculo
de pescado (Pihlato-Leppälä y col., 2000; Yoshii y col., 2001; Wanasundara y
col., 2002; Suetuna y Osajima, 1989; Yokohama y col., 1992) así como también
se han extraído de fuentes vegetales como la soya, frijol mungo, garbanzo,
girasol, entre otros (Jeong y col., 2003; Hong y col., 2005; Clemente y col., 1999;
Megías y col., 2004), en todos los casos han demostrado tener actividad
antihipertensiva debido a la presencia de los biopéptidos con poder inhibitorio de
la ECA-I y que han sido purificados o como componentes de los productos
hidrolizados demostrando disminuir la presión arterial en ratas y en algunos
estudios clínicos en humanos después de consumir el producto enriquecido con
dichos componentes. Por lo tanto, el interés de la industria de los alimentos en
encontrar materias primas naturales de origen vegetal tales como las
leguminosas, ya que estas presentan altos contenidos en proteínas del cual se
pueden extraer ciertos péptidos bioactivos con efectos benéficos en el organismo.
En México, el frijol negro jamapa (Phaseolus vulgaris) y el frijol flor de mayo
(Phaseolus vulgaris) son las principales leguminosas de mayor consumo y se
siembra en casi todas las regiones productoras, aunque se consume
principalmente en el Altiplano del centro y sureste de México. En la región sur el
90% de las amas de casa prefieren este tipo de frijol. Otra leguminosa es el frijol
lima (Phaseolus lunatus) mejor conocido como ib en la Península de Yucatán,
México, es una leguminosa tolerante a la sequedad con rendimientos reportados
por 1500 kg/ha y se conoce por ser un eficaz fertilizante orgánico (Sullivan y
Davenport, 1983). Además de ser una rica fuente de proteína (24%) y almidón
(63%) posee un alto consumo por la población que vive en la Península de
Yucatán, México (Oshodi y Adeladun, 1993). En tanto que el lupino (Lupinus
mutabilis) es una leguminosa de gran consumo en el Ecuador y que presenta
importante contenido proteínico. Por lo tanto, estas leguminosas pueden ser una
alternativa para la extracción de péptidos bioactivos que presenten actividad
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inhibitoria de la ECA-I. Debido a todo lo anterior el objetivo de este trabajo es
evaluar la actividad antihipertensiva de péptidos obtenidos por hidrólisis
enzimática a partir de aislados proteínicos de frijol negro jamapa (Phaseolus
vulgaris), frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris), frijol lima (Phaseolus lunatus) y
lupino (Lupinus mutabilis).
II. Objetivos
II.1. Objetivo general
Obtener y caracterizar biopéptidos obtenidos por hidrólisis enzimática de aislados
proteínicos de Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris y Lupinus mutabilis.
II.2. Objetivos específicos
II.2.1. Evaluación del rendimiento de aislado proteínicos.
II.2.2. Realizar la hidrólisis del aislado proteínico a partir de P. vulgaris, P. lunatus
y L. mutabilisis, mediante tratamientos enzimáticos con pepsina-pancreatina a 0,
15, 30, 45, 60 min.
II.2.3. Determinar el grado de hidrólisis de los aislados de P. vulgaris, P. lunatus y
L. mutabilis.
II.2.4. Caracterización electroforética (SDS-PAGE) de los hidrolizados de P.
vulgaris, P. lunatus y L. mutabilis.
II.2.5. Evaluar in vitro la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina-I
(ECA-I) de los péptidos obtenidos en la hidrólisis.
II.2.6. Separar por cromatografía de filtración en gel por exclusión de tamaño en
sephadex G-50, los péptidos obtenidos de la hidrólisis de los aislados de P.
vulgaris, P. lunatus y L. mutabilis
II.2.7. Purificar mediante HPLC, los péptidos que muestren mejor poder inhibitorio
de la ECA-I
II.2.8. Análisis de la secuencia de aminoácidos de los péptidos purificados.
III. Avances del proyecto
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III.1. Obtención de harinas a partir de frijol jamapa (Phaseolus vulgaris) frijol flor
de mayo (Phaseolus vulgaris) y frijol lima (Phaseolus lunatus).
III.2. Obtención de harinas a partir de frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris)
germinado y de frijol lima (Phaseolus lunatus) germinado.
III.3. Obtención de aislados proteínicos a partir de frijol jamapa (Phaseolus
vulgaris), frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris), frijol lima (Phaseolus lunatus) y
lupino (Lupinus mutabilis).
III.4. Obtención de aislados proteínicos a partir de frijol flor de mayo (Phaseolus
vulgaris) germinado y de frijol lima (Phaseolus lunatus) germinado.
III.5. Caracterización química proximal de las harinas y aislados proteínicos de
frijol jamapa (Phaseolus vulgaris), frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris) y frijol
lima (Phaseolus lunatus). Caracterización del aislado proteínico de lupino
(Lupinus mutabilis)
III.6. Caracterización química proximal de las harinas y aislados proteínicos de
frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris) germinado y de frijol lima (Phaseolus
lunatus) germinado.
III.7. Evaluación de las cinéticas de hidrólisis de los aislados proteínicos de frijol
jamapa (Phaseolus vulgaris), frijol flor de mayo (Phaseolus lunatus), frijol lima
(Phaseolus lunatus) y lupino (Lupinus mutabilis) mediante el empleo de enzimas
comerciales a diferentes tiempos de reacción.
III.8. Evaluación de las cinéticas de hidrólisis de los aislados proteínicos de frijol
flor de mayo (Phaseolus lunatus) germinado y frijol lima (Phaseolus lunatus)
germinado, mediante el empleo de enzimas comerciales a diferentes tiempos de
reacción.
III.9. Evaluación in vitro de la inhibición de la ECA-I de los péptidos obtenidos en
la hidrólisis a partir de aislados proteínicos de frijol jamada (Phaseolus vulgaris),
frijol flor de mayo (Phaseolus lunatus), frijol lima (Phaseolus lunatus) y lupino
(Lupinus mutabilis).
III.10. Evaluación in vitro de la inhibición de la ECA-I de los péptidos obtenidos en
la hidrólisis a partir de aislados proteínicos de frijol flor de mayo (Phaseolus
lunatus) germinado y frijol lima (Phaseolus lunatus) germinado
III.11. Caracterización electroforética (SDS-PAGE) de los hidrolizados de frijol
jamapa (Phaseolus vulgaris) y de frijol lima (Phaseolus lunatus).
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IV. Materiales y métodos
IV.1 Materia prima: Se utilizaron granos de frijol negro variedad jamapa
(Phaseolus vulgaris), frijol flor de mayo M-38, los cuales fueron donados por el
INIFAP Unidad Texcoco, Edo. de México; los granos de frijol lima (Phaseolus
lunatus) fueron adquiridos en el mercado público de la ciudad de Mérida,
Yucatán, México. Posteriormente se trasladaron al Laboratorio de Química de
Alimentos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico
Nacional donde fueron procesados. El aislado proteínico de Lupino (Lupinus
mutabilis) fue donado por la Dra. Cristian Jiménez de la Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.
IV.2 Reactivos: Todos los reactivos utilizados en los análisis son de marcas
registradas como Sigma y J.T. Baker (Phillisburg, NJ, USA). Los enzimas fueron
adquiridos de los laboratorios Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA);
Merck (Darmstadt, Germany) y Novo (Copenhague, Denmark).
IV.3. Métodos
IV.3.1. Germinación de frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris) y frijol lima
(Phaseolus lunatus)
El proceso para la germinación se realizó de acuerdo a los parámetros
establecidos por la Asociación Internacional de Prueba de Semilla (Anon, 1999).
Las semillas fueron remojadas previamente en 20 ml de solución de hipoclorito
de sodio (0.2 g Cl/l), después se enjuagó con agua destilada (25 ml, 3 veces)
antes de la germinación para evitar la proliferación de hongos. El método de
germinación se hizo de la manera siguiente: se colocaron 80 semillas en papel
filtro humedecido a saturación (Albet 1516, 42 x 52 cm) y cubiertas con otra capa
del mismo papel. Se colocaron en una cámara de germinación, controlando la
humedad y a una temperatura de 30ºC. Los germinados obtenidos fueron
sometidos a extracción de las fracciones proteicas y posterior hidrólisis
enzimática.
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IV.3.2. Obtención de las harinas
Los granos de frijol negro jamapa (P. vulgaris), frijol flor de mayo (P. vulgaris) y
frijol lima (P. lunatus,) se limpiaron manualmente seleccionando los mejores y
eliminando las impurezas que contenían. Posteriormente los granos del frijol
jamapa (P. vulgaris) fueron quebrados parcialmente en un molino Cemotec 1090
(Tecator Sweden) para lograr el desprendimiento de la cáscara de color negro
que contiene, seguido se aplicó aire para separar ésta del grano. Una vez
separada la cáscara se procedió a moler el grano en un molino Cyclotec 1093
(Tecator Sweden) hasta obtener una harina capaz de pasar a través de una malla
60. En el caso del grano del frijol lima (P. lunatus) éste fue quebrado con todo y
cáscara (color crema) y fue molido en los mismo molinos y pasado a través de la
malla 60 al igual que el frijol flor de mayo (P. vulgaris).
IV.3.3. Obtención del aislado proteínico de Phaseolus vulgaris y Phaseolus
lunatus.
Se utilizó el método reportado por Betancur y col., (2004) con algunas
modificaciones. Se realizó una suspensión de harina en agua destilada en una
relación 1:6 p/v (harina/agua), se ajustó el pH a 11 con una solución de NaOH 1
N y se dejó en agitación por 1 h con un agitador mecánico (Caframo RZ-1) a 400
rpm. Posteriormente la suspensión se pasó por dos tamices (malla 80 y 100)
secuencialmente se separó el bagazo (rico en fibra) de la mezcla de almidón y
proteína el cual se lavó tres veces con agua destilada y el filtrado se colectó en
un recipiente de plástico y se dejó reposar por 4 h a 4ºC para el P. lunatus y por 4
h a temperatura ambiente para el P. vulgaris. El residuo (bagazo) se secó en
charolas de aluminio a 60ºC en una estufa de convección (Lab-Line).
Transcurrido el tiempo de reposo (4 h) de la suspensión se sifóneo el
sobrenadante, para obtener así el sedimento rico en almidón, el cual se secó de
igual forma que el bagazo. Al sobrenadante se le ajustó el pH a 4.5 con HCl 1 N,
posteriormente se centrifugó en una centrífuga (Mistral 3000i) a 1,317 x g por 12
min para recuperar el precipitado proteínico, el cual se secó a -47ºC y 13 x 10-3
mbar en un liofilizador Labconco.
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IV.3.4. Composición proximal de las harinas y aislado proteínicos de
Phaseolus vulgaris, Phaseolus lunatus y L. mutabilis
Se determinaron de acuerdo a los procedimientos oficiales descritos por la
AOAC, (1997), comprendiendo los siguientes análisis:
1) Humedad (método 925.09). La humedad se determinó por la pérdida de peso
después de secar la muestra a 105°C por 4 h. 2) Proteína cruda (método
954.01). Se determinó en el sistema Kjeltec (Tecator, Sweden), calculando el
contenido de proteína como nitrógeno x 6.25. 3) Grasa cruda (método 920.39).
La grasa se cuantificó después de la extracción de la muestra durante 1 h con
héxano en un equipo Soxlet. 4) Fibra cruda (método 962.09). Se calculará
después de su digestión ácida y alcalina con un sistema Fibertec (Tecator,
Sweden). 5) Cenizas (método 923.03). Las cenizas se calcularon como el peso
remanente después de calcinar la muestra en una mufla a 550°C durante 4 h. 6)
Carbohidratos totales (ELN). Los carbohidratos totales se estimarán por
diferencia al 100% como el extracto libre de nitrógeno (ELN).
IV.3.5. Rendimiento en la obtención de aislados proteínicos
Para el cálculo del rendimiento del método de obtención de los aislados
proteínicos a partir de granos germinados y sin germinar de Phaseolus lunatus y
Phaseolus vulgaris se tomó como referencia el contenido de proteína cruda, de
acuerdo a la fórmula:
% Rendimiento = (Proteína (g) en el concentrado) x 100
Proteína en la harina (g)
IV.3.6. Hidrólisis enzimática del aislado proteínico de Phaseolus lunatus,
Phaseolus vulgaris y Lupinus mutabilis
Para la hidrólisis de los aislados proteínicos se efectuaron 8 diseños
experimentales distintos mismos que se describen a continuación, ya que se
consideró pertinente el empleo adicional de las enzimas Alcalase® y
Flavourzyme® (además de la Pepsina® y la Pancreatina®) que no se habían
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considerado en el inicio del proyecto y que son comúnmente empleados, en la
actualidad, en la obtención de hidrolizados proteínicos con actividad inhibitoria de
la ECA-I. Así mismo, también se decidió evaluar el efecto de la germinación en
dos de las leguminosas estudiadas sobre la actividad inhibitoria de la ECA-I.
IV.3.6.1. Experimento 1. Hidrólisis enzimática a partir de frijol jamapa
(Phaseolus vulgaris) empleando Alcalase® y Flavourzyme®
Se prepararon suspensiones acuosas de aislados proteínicos con una
concentración de proteína de 2.5% p/v. Se utilizó el método descrito por
Pedroche y col., (2002), para lo cual se empleó un diseño de bloques aleatorios,
donde los bloques fueron las enzimas comerciales empleadas (Alcalase® 2.4 L
FG y Flavourzyme® 500 MG) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), el factor que
se evaluó fue el tiempo de reacción (0, 15, 30, 45, 60, 75 y 90 min) y la variable
de respuesta fue el grado de hidrólisis (GH). A todos los hidrolizados se les
determinó la actividad inhibitoria de la ECA-I. Los parámetros utilizados para la
hidrólisis
fueron
los
siguientes:
concentración
de
sustrato
10%
v/v;
enzima/sustrato en una proporción 0.3 AU/g-1 de Alcalase® y 50 LAPU/g-1 de
Flavourzyme®; a pH 8 para la Alcalase® y 7 para el Flavourzyme®; a una
temperatura de 50ºC. La reacción fue detenida por calentamiento a 85°C por 10
min para inactivar la enzima. Los hidrolizados obtenidos fueron liofilizados
y
almacenados para su uso posterior.
IV.3.6.2
Experimento 2. Hidrólisis enzimática a partir de frijol lima
(Phaseolus lunatus) empleando Alcalase® y Flavourzyme®
Se prepararon suspensiones acuosas de aislados proteínicos con una
concentración de proteína de 2.5 % p/v. Se utilizó el método descrito por
Pedroche y col., (2002), para lo cual se empleó un diseño de bloques aleatorios,
donde los bloques fueron las enzimas comerciales empleadas (Alcalase® 2.4 L
FG y Flavourzyme® 500 MG) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), el factor que
se evaluó fue el tiempo de reacción (0, 15, 30, 45, 60, 75 y 90 min) y la variable
de respuesta fue el GH. Así mismo, a todos los hidrolizados se les determinó la
actividad inhibitoria de la. ECA-I. Los parámetros utilizados para la hidrólisis
10
fueron los siguientes: concentración de sustrato 10% v/v; enzima/sustrato en una
proporción 0.3 AU/g-1 de Alcalase® y 50 LAPU/g-1 de Flavourzyme®; a pH 8 para
la Alcalase® y 7 para el Flavourzyme®; a una temperatura de 50ºC. La reacción
fue detenida por calentamiento a 85°C por 10 min para inactivar la enzima. Los
hidrolizados obtenidos fueron liofilizados y almacenados para su uso posterior.
IV.3.6.3. Experimento 3. Hidrólisis enzimática a partir de frijol flor de mayo
(Phaseolus vulgaris) germinado y sin germinar empleando Alcalase®
Se prepararon suspensiones de los aislados proteínicos en agua con una
concentración de proteína al 4% p/v, similar al reportado por Hong y col., (2005).
Los aislados proteínicos fueron hidrolizados con esta enzima en una
concentración de 0.30 AU/g, a un pH 7 y una temperatura de 50°C, de acuerdo a
Yust y col., (2003), deteniéndose ésta mediante la adición de HCl concentrado
hasta modificar el pH a 5.0. Se estudiaron 3 factores de dos niveles cada uno
(diseño 23) con un punto central, en donde el primer factor (A) consistió en la
fuente de aislado proteico (a partir de grano germinado y sin germinar); el factor B
se estableció como la relación de enzima/sustrato a usar, en los niveles (E/S)
de1/50 y 1/10; el factor C se definió como el tiempo de hidrólisis en los niveles:
0.5 y 2 h. El punto central fue definido por las condiciones: (A) mezcla al 50% de
grano sin germinar y germinado; (B) relación (E/S) de 1/30 y (C) un tiempo de
1.25 h. La variable de respuesta fue el GH. Para los hidrolizados con mayor GH
se les determinó la actividad inhibitoria de la ECA-I.
IV.3.6.4. Experimento 4 Hidrólisis enzimática a partir de frijol lima
(Phaseolus lunatus) germinado y sin germinar empleando Alcalase®
En este experimento, se prepararon suspensiones de los aislados proteínicos en
agua con una concentración de proteína de 4% p/v, similar al reportado por Hong
y col., (2005). Los aislados proteínicos fueron hidrolizados con esta enzima en
una concentración de 0.30 AU/g, a un pH 7 y una temperatura de 50°C, de
acuerdo a Yust y col., (2003), deteniéndose ésta mediante la adición de HCl
concentrado hasta modificar el pH a 5.0. Se estudiaron 3 factores de dos niveles
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cada uno (diseño 23) con un punto central, en donde el primer factor (A) consistió
en la fuente de aislado proteico (a partir de grano germinado y sin germinar); el
factor B se estableció como la relación de enzima/sustrato a usar, en los niveles
(E/S) de1/50 y 1/10; el factor C se definió como el tiempo de hidrólisis en los
niveles: 0.5 y 2 h. El punto central fue definido por las condiciones: (A) mezcla al
50% de grano sin germinar y germinado; (B) relación (E/S) de 1/30 y (C) un
tiempo de 1.25 h. La variable de respuesta fue el GH. Para los hidrolizados con
mayor GH se les determinó la actividad inhibitoria de la ECA-I.
IV.3.6.5. Experimento 5. Hidrólisis enzimática a partir de lupino (Lupinus
mutabilis) empleando Alcalase®
En este experimento, se prepararon suspensiones de los suspensiones
proteínicos en agua con una concentración de proteína de 4% p/v, similar al
reportado por Hong y col., (2005). El aislado proteínico fue hidrolizado con esta
enzima en una concentración de 0.30 AU/g, a un pH 7 y una temperatura de
50°C, de acuerdo a Yust y col.,(2003), deteniéndose ésta mediante la adición de
HCl concentrado hasta modificar el pH a 5.0. Se estudiaron 2 factores de dos
niveles cada uno (diseño 22), en donde el primer factor (A) consistió en la relación
de enzima/sustrato a usar, en los niveles (E/S) de1/50 y 1/10 y el factor B se
definió como el tiempo de hidrólisis en los niveles: 0.5 y 2 h. La variable de
respuesta fue el GH. Para los hidrolizados con mayor GH se les determinó la
actividad inhibitoria de la ECA-I.
IV.3.6.6. Experimento 6. Hidrólisis enzimática a partir de frijol flor de mayo
(Phaseolus vulgaris) germinado y sin germinar, empleando el sistema
secuencial enzimático Pepsina®-Pancreatina®
Se prepararon suspensiones acuosas de los aislados proteínicos con una
concentración de proteína de 4 % p/v similar a Hong y col., (2005) y se empleó el
sistema Pepsina®-Pancreatina® de acuerdo a Megías y col., (2004) y a Yang y
col. (2003), empleando un baño provisto de agitación New Brunswick Cientific,
modelo R76. La primera digestión se realizó con pepsina 1:10,000 (Sigma), a la
mitad del tiempo de hidrólisis a una temperatura de 37ºC y un pH de 2.0 con una
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concentración de enzima de 4% p/v, ajustando este valor con HCl 1 N. La
segunda digestión se realizó durante la segunda mitad del tiempo restante
inmediatamente después de finalizar la primera, en la cual a la suspensión
proteica se le agregó pancreatina (Sigma P32292-100G), a la misma
concentración de enzima de 4% p/v, misma temperatura y tiempo, modificando el
valor de pH hasta 7.5 con NaOH 1 N. La hidrólisis fue interrumpida al calentar las
suspensiones a una temperatura de 80ºC durante 15 min. En este experimento
se evaluó el efecto de 3 factores de dos niveles cada uno (diseño 23) con un
punto central, en donde el primer factor (A) consistió en la fuente de aislado
proteico (a partir de grano germinado y sin germinar); el factor B se estableció
como la relación de enzima/sustrato a usar, en los niveles (E/S) de1/50 y 1/10; el
factor C se definió como el tiempo de hidrólisis en los niveles: 1.0 y 3 h. El punto
central fue definido por las condiciones: (A) mezcla al 50% de grano sin germinar
y germinado; (B) relación (E/S) de 1/30 y (C) un tiempo de 2.0 h. La variable de
respuesta fue el GH. Para los hidrolizados con mayor GH se les determinó la
actividad inhibitoria de la ECA-I.
IV.3.6.7. Experimento 7. Hidrólisis enzimática a partir de frijol lima
(Phaseolus lunatus) germinado y sin germinar, empleando el sistema
secuencial enzimático Pepsina®-Pancreatina®
Se prepararon suspensiones de los aislados proteínicos en agua con una
concentración de proteína de 4% p/v similar a Hong y col., (2005) y se empleó el
sistema Pepsina®-Pancreatina® de acuerdo a Megías y col. (2004) y a Yang y
col., (2003), empleando un baño provisto de agitación New Brunswick Cientific,
modelo R76. La primera digestión se realizó con pepsina 1:10,000 (Sigma), a la
mitad del tiempo de hidrólisis a una temperatura de 37ºC y un pH de 2.0 con una
concentración de enzima de 4% p/v, ajustando este valor con HCl 1 N. La
segunda digestión se realizó durante la segunda mitad del tiempo restante
inmediatamente después de finalizar la primera, en la cual a la suspensión
proteica se le agregó pancreatina (Sigma P32292-100G), a la misma
concentración de enzima de 4% p/v, misma temperatura y tiempo, modificando el
valor de pH hasta 7.5 con NaOH 1 N. La hidrólisis fue interrumpida al calentar las
suspensiones a una temperatura de 80ºC durante 20 min. En este experimento
13
se evaluó el efecto de 3 factores de dos niveles cada uno (diseño 23) con un
punto central, en donde el primer factor (A) consistió en la fuente de aislado
proteico (a partir de grano germinado y sin germinar); el factor B se estableció
como la relación de enzima/sustrato a usar, en los niveles (E/S) de1/50 y 1/10; el
factor C se definió como el tiempo de hidrólisis en los niveles: 1.0 y 3 h. El punto
central fue definido por las condiciones: (A) mezcla al 50% de grano sin germinar
y germinado; (B) relación (E/S) de 1/30 y (C) un tiempo de 2.0 h. La variable de
respuesta fue el GH. Para los hidrolizados con mayor GH se les determinó la
actividad inhibitoria de la ECA-I.
IV.3.6.8. Experimento 8. Hidrólisis enzimática a partir de lupino (Lupinus
mutabilis)
empleando
el
sistema
secuencial
enzimático
Pepsina®-
Pancreatina®
Se hicieron suspensiones acuosas de los aislados proteínicos con una
concentración de proteína de 4% p/v, similar al reportado por Hong y col., (2005).
Se empleó el sistema Pepsina®-Pancreatina® de acuerdo a Megías y col., (2004)
y a Yang y col., (2003), empleando un baño provisto de agitación New Brunswick
Cientific, modelo R76. La primera digestión se realizó con pepsina 1:10,000
(Sigma), a la mitad del tiempo de hidrólisis a una temperatura de 37ºC y un pH de
2.0 con una concentración de enzima de 4% p/v, ajustando este valor con HCl 1
N. La segunda digestión se realizó durante la segunda mitad del tiempo restante
inmediatamente después de finalizar la primera, en la cual a la suspensión
proteica se le agregó pancreatina (Sigma P32292-100G), a la misma
concentración de enzima de 4% p/v, misma temperatura y tiempo, modificando el
valor de pH hasta 7.5 con NaOH 1 N. La hidrólisis fue interrumpida al calentar las
suspensiones a una temperatura de 80ºC durante 15 min. Se estudiaron 2
factores de dos niveles cada uno (diseño 22), en donde el primer factor (A)
consistió en la relación de enzima/sustrato a usar, en los niveles (E/S) de1/50 y
1/10 y el factor B se definió como el tiempo de hidrólisis en los niveles: 1.0 y 3.0
h. La variable de respuesta fue el grado de hidrólisis GH. Para los hidrolizados
con mayor GH se les determinó la actividad inhibitoria de la ECA-I.
IV.4. Determinación del grado de hidrólisis
14
Se determinó el grado de hidrólisis (GH) utilizando el método reportado por Kim y
col., (1990). Este se estimó midiendo la cantidad de nitrógeno soluble en ácido
tricloroacético (TCA) al 10% y su proporción con respecto a la cantidad de
nitrógeno total en la suspensión del aislado proteínico según la fórmula:
Nitrógeno soluble en TCA al 10%
%GH =
IV.5.
Determinación
x 100
Nitrógeno total
del
patrón
electrofóretico
de
los
hidrolizados
proteínicos de frijol lima (Phaseolus lunatus) y frijol jamapa (Phaseolus
vulgaris) empleando Alcalase® y Flavourzyme®
Se determinó de acuerdo al método de Laemmli, (1970), para el cual, se utilizó
dodecil sulfato de sodio en un gel poliacrilamida (SDS-PAGE), por lo que las
bandas de proteínas obtenidas fueron teñidas mediante el uso del reactivo azul
brillante de Coomassie R-250 (BIO-RAD, 161-0400), también se emplearon
marcadores de proteínas de amplio rango de peso molecular (BIO-RAD, 1610303).
IV.6. Evaluación in vitro de la actividad inhibitoria de la ECA-I de los
hidrolizados proteínicos
La actividad inhibitoria de la ECA-I se determinó de acuerdo al método descrito
por Hayakari y col., (1978). Dicha actividad se determinó a los hidrolizados
proteínicos a partir de los aislados proteínicos de P. lunatus, P. vulgaris y Lupinus
mutabilis en los diferentes tratamientos enzimáticos descritos con anterioridad. La
ECA-I hidroliza al Hippuryl-L-histidyl-L-leucina (HHL) produciendo ácido hipúrico e
his-leu. Este método se basa en la reacción colorimétrica del ácido hipúrico con 2,
4, 6-tricloro-triasina (TT). La inhibición de la ECA-I se expresa como IC50, que se
define como la mínima concentración de proteína en el hidrolizado capaz de
15
inhibir la actividad de la ECA-I en un 50 %. Este valor se determinó mediante
regresión lineal al relacionar diferentes concentraciones de proteína en el
hidrolizado con los valores de inhibición de la ECA-I correspondientes.
ESTUDIOS POR REALIZARSE
Los estudios que han quedado pendientes se habían programado para realizarse
en el período Julio a Diciembre de 2007 y que se pueden resumir en separación,
purificación y caracterización de péptidos presentes en los hidrolizados con
mayor actividad de inhibición de la ECA-I. Como se ha explicado con anterioridad,
el empleo de enzimas adicionales (Alcalase® y Flavourzyme®), así como también
el empleo de materiales germinados ha permitido obtener mayor cantidad de
hidrolizados proteicos y esto ha dificultado la consecución de la última actividad
del proyecto; sin embargo, se ha reprogramado para efectuarse en este año
2008. Se describen a continuación las metodologías a emplear en la consecución
de esta última actividad.
IV.7.
Separación
de
hidrolizados
proteínicos
con
mayor
actividad
antihipertensiva en intervalos de tamaño
a). Separación por ultrafiltración
Los hidrolizados obtenidos en los experimentos 1 y 2, que presenten mayor
actividad inhibitoria de la ECA-I serán sometidos a un fraccionamiento por
ultrafiltración de acuerdo a la metodología indicada por Cho y col., (2004): cinco
fracciones se obtendrán usando cuatro membranas con diferentes cortes de peso
molecular de 1 K, 3 K, 5 K y 10 K mediante el uso de una célula de ultrafiltración,
model-8050,
(Amicon,
Inc.,
Beverly,
MA
01915
USA).
Las
fracciones
correspondientes (Figura 1) se denominaran como sigue: A (peso molecular
mayor de 10 K), B (peso molecular entre 5 y 10 K), C (peso molecular entre 3 y 5
K), D (peso molecular entre 1 y 3 K) y E (peso molecular menor de 1 K).
16
Figura 1. Diagrama de flujo de la separación de las fracciones peptídicas de Phaseolus
lunatus y Phaseolus vulgaris por ultrafiltración
b). Separación por cromatografía de filtración en gel
Esta separación se aplicará a los hidrolizados con mayor actividad de inhibición
de los experimentos 3, 4, 5, 6, 7 y 8. Esta separación en intervalos de tamaño se
realizará con el empleo de cromatografía de filtración en gel, de acuerdo a
Megías y col., (2004). Para tal fin se empleará una columna de filtración (2 cm x
55 cm) Sephadex G-50 en la cual se inyectarán 1 ml de los hidrolizados con una
concentración de 10 mg/ml en una solución de bicarbonato de amonio 50 mM a
un pH de 9.1. El flujo será de 10 ml/h; las masas moleculares de los diferentes
hidrolizados se determinarán con ayuda de curvas calibradas con este equipo
que se obtengan con sustancias patrón de pesos moleculares conocidos. Para tal
fin se emplearán 5 estándares: citocromo C (12, 384 Da), bacitracina (1,400 Da),
Val-angiotensina (917 Da), los péptidos RKEVY (693 Da) y WG (261 Da). Todos
los péptidos serán monitoreados a 280 nm.
A todos los hidrolizados separados por intervalos de tamaño se les determinará
otra vez la actividad de inhibición de la ECA-I con el mismo método descrito en el
punto IV.6. Se seleccionarán aquellas fracciones peptídicas que presenten mayor
17
actividad antihipertensiva a fin de realizar la purificación y caracterización de los
péptidos contenidos en ellas.
IV.8. Purificación de los péptidos con mayor poder de inhibición de la ECA-I
in vitro
La purificación de aquellas fracciones peptídicas con mayor poder inhibitorio de la
ECA-I, se realizará con el empleo de cromatografía HPLC de acuerdo a Vioque y
col., (2004). Las fracciones colectadas de la columna de separación en gel serán
redisueltas en agua desionizada e inyectadas en una columna C18 Hi-Pore RP318, 250 mm x 10 mm BIO-RAD. El volumen a inyectar será de 100 μl y la
concentración de los péptidos será de 20 mg/ml en una solución de 0.10 % de
ácido trifluoroacético a una velocidad de flujo de 4 ml/min y a una temperatura de
30ºC. Se empleará un gradiente entre 0-30% de acetonitrilo en agua durante 50
min para separar los péptidos en la cual esta operación será monitoreada a 215
nm y se correlacionará con la medición de la inhibición de la ECA-I. Con ayuda de
otra columna (C18 Hi-Pore RP-318, 250 mm x 4.6 mm BIO-RAD) se medirá la
actividad antihipertensiva en picos individuales de los péptidos purificados que
presenten mayor actividad. En esta etapa el volumen de inyección será de 50 μl
con concentración de 2 mg/ml en la misma solución de ácido trifluoroacético al
0.10% y la misma mezcla de elución durante 50 min. La velocidad de flujo será de
1 ml/min y a una temperatura de operación de 30°C. La determinación se
realizará a la misma longitud de onda (215 nm).
IV.9. Análisis de la composición y secuencia de aminoácidos constituyentes
en los péptidos
La secuenciación de los aminoácidos de aquellos péptidos que en todos los
casos estudiados muestren mayor capacidad inhibitoria de la ECA-I está sujeta a
la disposición del equipo necesario, aspecto que está siendo negociado a través
de la colaboración con el Departamento de Fisiología Vegetal del Instituto de
Química de la UNAM y con el Instituto de la Grasa en Sevilla España. Es nuestra
convicción el logro de este objetivo, no obstante es fundamental precisar que esto
18
depende de la disposición de los investigadores con quienes estamos
interactuando.
En este apartado, se tomarán 2 mg de los péptidos con mayor actividad
antihipertensiva, previamente identificados aislados y purificados. Las muestras
serán sometidas a hidrólisis ácida empleando 4 ml de HCl 6 N. Después las
soluciones serán incubadas en tubos sellados conteniendo N2 a 110°C durante
24 h. Los aminoácidos serán determinados mediante derivatización con dietiletoximetilenmalonato por cromatografía HPLC, de acuerdo a la metodología de
Alaíz y col., (1992), en la cual se empleará D-L-α-ácido aminobutírico como
estándar interno y una columna C18 300x3.9 mm en fase reversa, 4μ, Novapack.
Se empleará un gradiente binario para la elusión con un flujo de 0.90 ml/min. Los
solventes empleados serán (A) Acetato de sodio 25 mM conteniendo azida de
sodio (0.02% p/v) pH 6.0 y (B) acetonitrilo. La elusión se efectuará como sigue:
entre 0.0-3.0 min se usará un gradiente lineal desde 91:9 de A/B; hasta 86:14;
entre 3.0 – 13.0 min el gradiente será constante, 86:14 de A/B; después, entre
13.0 -30 min se manejará un gradiente lineal desde 86/14 de A/B hasta 69/31;
finalmente entre 30.0-35.0 min el gradiente será constante de 69:31 de A/B. Los
aminoácidos constituyentes serán analizados a 280 nm. La secuencia de los
péptidos purificados será determinada en un microsecuenciador Perkin-Elmer
/Applied Biosystems precise 494.
IV. 10. Análisis estadístico
Los experimentos 1 y 2 fueron procesados mediante estadística descriptiva
utilizando medidas de tendencia central (media) y dispersión (desviación
estándar). Los datos obtenidos de la hidrólisis del aislado proteínico fueron
evaluados mediante un análisis de varianza de dos vías, en tanto que la actividad
inhibitoria in vitro de la ECA-I, fueron analizados mediante un análisis de varianza
de una vía y en todos los casos se realizó una comparación de medias (método
de Duncan) para establecer las diferencias entre los tratamientos. En los demás
experimentos la resolución se efectuó siguiendo la metodología del algoritmo de
Yates, específicamente para un diseño factorial 23 y 22 de acuerdo a los métodos
19
descritos por Montgomery, (2003). Todos estos análisis se efectuaron utilizando
el paquete computacional Statgraphics Plus Versión 5.1.
V. JUSTIFICACIÓN
Actualmente las enfermedades cardiovasculares han cobrado la vida de millones
de personas en el mundo, y México no ha sido la excepción, ya que un alto
porcentaje de mexicanos presentan este tipo de problemas. Debido a lo anterior
se ha hecho énfasis de la importancia que tiene el consumo de alimentos para el
buen funcionamiento del organismo o “buena salud”. Los alimentos enriquecidos
con
nutrimentos
o
componentes
bioactivos
“alimentos
funcionales
o
nutracéuticos” han tenido una buena aceptación por el público consumidor debido
a que presentan beneficios al organismo, por lo que la tendencia actual de la
industria de los alimentos es buscar nuevas fuentes que sean ricas en proteínas,
principalmente de origen vegetal y particularmente de las leguminosas, ya que
estas presentan un alto contenido de proteína. El frijol negro jamapa y frijol flor de
mayo (Phaseolus vulgaris) y frijol lima (Phaseolus lunatus) las cuales son tres
leguminosas altamente consumidas por la población mexicana, además del
lupino (Lupinus mutabilis) de gran consumo en Ecuador, cuentan con un
contenido de proteínas elevado, las cuales resultan ser buenas fuentes para la
extracción de péptidos bioactivos que pudiesen presentar actividad inhibitoria de
la ECA-I. Para desarrollar este trabajo se emplearon granos de frijol negro
jamapa, frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris), frijol lima (Phaseolus lunatus) y
lupino (Lupinus mutabilisis) de la cuales se obtendrán las fracciones peptídicas y
se evaluarán sus efectos antihipertensivos en análisis in vitro.
20
VI. AVANCES DE RESULTADOS Y DISCUSIONES.
VI.1. Composición proximal en harinas y aislados proteícos de Phaseolus
lunatus, Phaseolus vulgaris y Lupinus mutabilis
En las harinas a partir de grano sin germinar (Cuadro 1) el mayor contenido de
proteína se obtuvo en el frijol jamapa (26.75%) y el menor contenido se observó
en el frijol flor de mayo (25.96%); el contenido de proteína fue estadísticamente
diferente en las harinas estudiadas (p<0.05). El contenido de proteína cruda se
incrementó durante la germinación lo cual indica que un tiempo de germinación
de dos días permitió la modificación en los componentes químicos de los granos
sin germinar (Cuadro 2); en el germinado de frijol lima se obtuvo un 33.65% en el
contenido de proteína, en tanto que en el germinado de frijol flor de mayo este
contenido fue de 23.59%. Este incremento de proteína durante la germinación es
acorde con la investigación de Sangronis y col., (2006), quienes observaron que a
mayor tiempo de germinación puede ejercer cambios notables en el contenido de
proteína cruda; ellos reportaron que durante un tiempo de germinación de 5 días
en grano negro (variedad Tacarigua) y blanco (variedad Matterhorm) de
Phaseolus vulgaris, el contenido de proteína se incrementó de 24.2 a 28.3% en el
grano negro y de 21.6 a 24.5% en el blanco, similares a los datos encontrados en
el frijol lima y el frijol flor de mayo.
En los aislados proteícos, sin embargo, el mayor contenido de proteína se logró
en el aislado de lupino (91.38%), seguido del frijol flor de mayo germinado
(87.23%). El contenido de proteína en los demás materiales osciló entre 63.83 y
71.81%. El contenido de proteína en el aislado de lupino fue muy similar al
reportado por Rodríguez-Ambris y col., (2005) en lupino desengrasado de la
variedad Lupinus campestris, con un contenido de proteína de 93.20%.
Cuadro 1. Composición proximal de las harinas y aislados proteicos de P. lunatus y P.
vulgaris
Componentes
(%)
Harina
frijol
jamapa
Harina
frijol
flor de
mayo
Harina
frijol
lima
Aislado
frijol
jamapa
Aislado
frijol
flor de
mayo
Aislado
frijol
lima
Aislado
Lupino
21
a
Humedad
(8.77)
Proteína
26.75
Grasa
1.52
Fibra
2.30
Cenizas
4.05
E.L.N.
65.38
a-c, A-D
c
a
b
b
a
(9.83)
22.78
2.71
2.50
3.89
b
a
c
25.96
1.77
c
1.49
a
68.13
(11.28)
(6.51)
b
63.83
b
4.68
a
4.43
b
c
66.35
4.48
a
(5.42)
A
64.10
C
0.63
c
C
2.40
B
0.79
C
26.38
5.04
C
B
B
B
C
D
27.66
D
A
(4.80)
71.81
1.44
1.75
C
A
D
3.53
B
21.47
B
(6.98)
91.38
4.62
D
D
C
0.11
1.98
1.91
A
A
A
Letras diferentes en la misma fila indican diferencia estadística a (p<0.05)
Resultados expresados en base seca.
Cuadro 2. Composición proximal de las harinas y aislados proteicos de P. lunatus y P. vulgaris a
partir de grano germinado
Componentes
(%)
Harina
frijol
flor de
mayo
Humedad
(8.99)
Proteína
23.59
Grasa
2.23
Fibra
2.09
Cenizas
4.11
E.L.N.
67.98
a
b
a
b
b
a
Harina
frijol
lima
(9.32)
33.65
1.48
4.76
4.04
b
a
c
c
a
56.08
b
Aislado
frijol
flor de
mayo
(7.63)
87.23
1.23
0.68
b
b
a
6.42
4.44
c
c
a
Aislado
frijol
lima
(5.40)
69.14
4.16
C
A
C
0.95
3.68
A
B
20.87
B
a-b, A-B
Letras diferentes en la misma fila indican diferencia estadística a (p<0.05)
Resultados expresados en base seca.
Los datos obtenidos en los diferentes materiales, fueron semejantes a los
reportados por Betancur-Ancona y col., (2004) ya que en la harina y aislado
proteíco de P. lunatus reportaron 25.50 y 71.13% de proteína respectivamente.
Valores similares se han encontrado en otros trabajos de investigación (Augustin
y Klein, 1989; Oshodi y col., 1993). Otros valores reportados por Chel-Guerrero y
col., (2002) en la harina de Canavalia ensiformis fue de 26.86%, similar al valor
encontrado en el frijol jamapa en estudio. Por otro lado, estos autores han
reportado un contenido de proteína en el aislado de C. ensiformis de 73.75% el
cual es más alto que el encontrado en el aislado proteico del frijol jamapa. Chau y
col., (1997) encontraron diversos contenidos de proteínas en aislados proteicos
de diferentes granos de leguminosas (Phaseolus angularis, Phaseolus calcaratus
y Dolichos lablab) con valores de 79.6, 78.0 y 85.0% de proteína
respectivamente. Vioque y col., (2001) reportaron un contenido de proteína mayor
22
en aislados proteicos de garbanzo con 83.4% y en girasol con 97.0%. Debido al
contenido de proteínas hallados en estos materiales los hace factibles para ser
utilizados en la obtención de hidrolizados proteicos, que puedan presentar
diversas actividades fisiológicas en el organismo tales como: antihipertensiva,
antioxidante, antimicrobiana, entre otras.
Con respecto al contenido de grasa cruda en el aislado proteínico de frijol lima
(1.44%) fue el menor de todos los materiales analizados, mientras que los valores
más altos se obtuvieron en los aislados proteínicos de frijol jamapa (4.68%) y
lupino (4.16%), similares al valor de grasa hallado en el aislado proteínico de C.
ensiformis (5.12%) reportado por Chel-Guerrero y col., (2002). Cabe mencionar,
que el contenido mayor de grasa encontrado en estos últimos materiales pudiera
deberse a que, durante la extracción de la proteína, se emplearon pH alcalinos
(pH 11 con NaOH), por lo que la grasa pudo haber interactuado con el álcali,
saponificándola, principalmente aquellas con naturaleza polar, y éstas con las
proteínas del aislado proteico y al momento de llevar las proteínas a su punto
isoeléctrico para su precipitación, las grasas precipitaron junto con las proteínas,
tal como lo menciona Sánchez-Vioque y col., (1999) para el chícharo (Cicer
arietinum L.) y Chel-Guerrero y col., (2002) para el aislado proteico de C.
ensiformis. Sin embargo, esta saponificación es probablemente dependiente de la
composición de ácidos grasos de las leguminosas.
VI.2. Rendimiento del proceso para la obtención de aislados proteínicos
Tomando en consideración el contenido de proteína en las harinas y en los
aislados proteicos se puede mencionar que en el frijol jamapa el rendimiento o
recuperación de la proteína presente fue de 38.27%, en el frijol lima 44.6%, en el
frijol flor de mayo 22.44%; en el caso de granos germinados, se tuvo un
rendimiento de 30.84% con el frijol lima y 45.77% con el frijol flor de mayo.
Conviene aclarar que, en la obtención del aislado proteico de frijol flor de mayo
germinado, cuyo valor de rendimiento fue el mayor (45.77%), no se observó la
precipitación del material no proteico y posterior decantación del sobrenadante,
es decir, que hubo necesidad de centrifugar todo la suspensión para su posterior
ajuste de pH a 4.6. Este comportamiento contribuyó a incrementar la cantidad de
23
proteína en el aislado respectivo (80.57%). Los datos obtenidos en la
recuperación
investigadores,
de
proteína
tales
fueron
como,
similares
a
los
obtenidos
por
Paredes-López
y
Ondorica-Falomir,
otros
(1986),
reportaron un rendimiento de 46% en un aislado de semillas de una variedad de
girasol (safflower), en tanto que Arntfield y col., (1985) han registrado un
rendimiento de 44 % en la obtención de aislados de semillas de haba. RodríguezAmbriz y col., (2005) obtuvieron un mejor rendimiento (60%) en la obtención de
aislados de lupino (Lupinus campestris).
VI.2. Cinéticas de hidrólisis extensiva de los aislados proteicos de frijol lima
(P. lunatus), frijol jamapa (P. vulgaris) y lupino (Lupinus mutabilis)
VI.2.1. Experimentos 1 y 2. Hidrólisis enzimática en frijol jamapa y frijol lima
empleando Alcalase® y Flavourzyme®
En el cuadro 3 se muestra el GH obtenido en los hidrolizados a partir de frijol lima
y frijol jamapa con las enzimas: Alcalase® y Flavourzyme®, indicando diferencia
estadística entre ellas (enzimas=bloques) y entre los tiempos de reacción
(p<0.05). En la figura 1 se muestran las cinéticas de hidrólisis extensiva de los
aislados proteicos respectivamente. El GH se obtuvo con el frijol lima (37.94%)
empleando la enzima Alcalase® a los 45 min de reacción, mientras que el mayor
GH en el frijol jamapa (49.48%) con la misma enzima ocurrió a los 30 min de
reacción. Por otro lado, en ambas leguminosas evaluadas con la enzima
Flavourzyme® el GH se fue incrementando con el tiempo de reacción ya que, en
el frijol lima, el intervalo de GH fue de 7.17 a 22.03% a los 15 - 90 min de
reacción y en el frijol jamapa, el GH osciló entre 10.84 y 26.05%, en los mismos
tiempos de reacción.
Cuadro 3. Grado de hidrólisis (%) en los aislados proteicos de frijol lima y frijol jamapa
Tiempo
(min)
15
30
45
60
75
Frijol lima
(P. lunatus)
Flavourzyme®
Alcalase®
a
29.02
a
31.47
a
37.94
a
32.69
a
33.39
A
7.17
A
9.79
A
11.01
A
14.00
A
18.01
Frijol jamapa
(P. vulgaris)
Alcalase®
Flavourzyme®
b
41.78
b
49.48
b
44.23
b
43.36
b
43.71
B
10.84
B
12.94
B
15.73
B
17.13
B
18.71
24
90
a-b, A-B
a
A
b
B
32.69
22.03
44.23
26.05
Letras diferentes en la misma fila indican diferencia estadística a (p<0.05).
Estos valores de GH hallados en ambas leguminosas con la enzima Alcalase®
fueron mayores a los obtenidos en hidrolizados proteicos a partir de frijol caupí
(Vigna unguiculata), cuyos GH oscilaron entre 13.61 - 23.61% (Espinosa, 2006).
De igual forma este autor reportó valores de GH empleando la enzima
Flavourzyme® , con 4.76 a 7.27% a los 15 y 90 min de reacción, respectivamente,
siendo estos valores inferiores encontrados en los hidrolizados de las
leguminosas en estudio. Mientras que Hong y col., (2005) a partir de el aislado
proteico de frijol mungo (Phaseolus vulgaris L.) sometido a hidrólisis mediante la
aplicación por separado de dos enzimas: Alcalase® y Neutrase® obtuvieron GH
de 22 y 12% respectivamente, durante 10 h de reacción. Los valores encontrados
en dicho estudio, fueron menores que los hallados con la enzima Alcalase® y
Flavourzyme® de los hidrolizados de frijol lima y frijol jamapa.
Figura 1. Cinética de hidrólisis extensiva de los aislados proteicos
de frijol lima
(Phaseolus lunatus) y frijol jamapa (Phaseolus vulgaris)
Cabe mencionar que la enzima Alcalase® es una proteasa alcalina de uso
industrial producida por Bacillus licheniformis siendo su principal componente
activo la endopeptidasa serina subtilisina Carlsberg, la cual hidroliza enlaces
peptídicos con amplia especificidad liberando péptidos con aminoácidos
25
hidrofóbicos tal como la Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile, Val y Met en su región C-terminal
(Markland y Smith, 1971). Esto sugiere que el contenido de aminoácidos
hidrofóbicos pudiera ser mayor en el frijol jamapa que en el frijol lima, por lo que
la enzima Alcalase® actuó mejor en la primera leguminosa. Sin embargo, el uso
de la endoproteasa Alcalase® puede presentar ciertas desventajas, ya que, puede
generar péptidos con sabor amargo, el cual no es aceptable para la elaboración
de un producto alimenticio. Esto se debe a que los péptidos obtenidos con esta
enzima pueden presentar un alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos, sin
tener en cuenta su estructura primaria (Cho y col., 2004). Por lo que el empleo de
una exoproteasa como la enzima Flavourzyme® puede reducir el sabor amargo
de los hidrolizados proteicos tal como lo menciona Imm and Lee, (1999) en la
producción de sabor a marisco en merluza roja (Urophycis chuss). Por lo que,
una reducción del número de aminoácidos aromáticos en los hidrolizados
enzimáticos puede mejorar su sabor, el cual es un factor importante para su
exitoso uso en una dieta especial. Por otro lado, los hidrolizados de proteínas
libres de fenilalanina (Phe) pueden ser ingerido por pacientes con fenilcetonuria,
evitando así un daño en el cerebro (Tardioli y col., 2003).
VI.2.2. Electroforesis SDS-PAGE
Los patrones electroforéticos de los aislados proteicos de frijol lima (P. lunatus y
frijol jampa (P. vulgaris) se muestran en las figuras 2 y 3 respectivamente (Nota:
las figuras no se anexan por su gran extensión). En la figura 2a y 3a se presentan
las electroforesis de los hidrolizados de frijol lima y frijol jamapa con la enzima
Alcalase® la cual tiene una actividad endopeptidasa. En los carriles 0 min, se
observan los aislados proteicos sin hidrolizar, en el cual se encontraron diversas
bandas de proteína, presentando un intervalo de peso molecular entre 135.02 y
5.08 kDa para el frijol lima y entre 199.93 y 16.20 kDa en el frijol jamapa. En los
carriles correspondientes a los tiempos 15, 30, 45, 60, 75 y 90 min de hidrólisis se
hallaron cinco bandas de proteína en cada una de ellas, con pesos moleculares
entre 30.54 y 3.98 kDa en frijol lima, mientras que en el frijol jamapa se hallaron
solo tres bandas de bajo peso molecular en los carriles con 15, 30 y 45 min de
reacción con pesos moleculares entre 24.28 y 15.95 kDa; en los carriles
marcados con 60 y 75 min los pesos moleculares oscilaron entre 25.03 y 19.96
26
kDa y en el último carril las últimas dos bandas desaparecieron quedando
solamente una banda con un peso molecular de 24.57 kDa. Este hallazgo sugiere
que la hidrólisis con dicha enzima fue extensiva debido a la generación de
bandas de bajo peso molecular, por lo que podrían formarse péptidos que
presenten actividad inhibitoria de la ECA-I, tal y como lo menciona Pedroche y
col., (2002) en la obtención de péptidos con actividad inhibitoria de la ECA-I a
partir de aislados proteínicos de semillas de garbanzo sometidas a hidrólisis con
Alcalase®. De igual forma, Yust y col., (2003) encontraron péptidos bioactivos
obtenidos de la legumina (principal proteína en el garbanzo), con un intervalo de
peso molecular entre 14 y 6 kDa y estos mismos presentaron actividad de
inhibición sobre la ECA-I.
En las figuras 2b y 3b se ilustran los patrones electroforéticos del frijol lima y frijol
jamapa hidrolizados con Flavourzyme® la cual es a la vez endo y exoproteasa. En
los carriles correspondientes a los tiempos entre 15 y 90 min se hallaron diversas
bandas con un intervalo de peso molecular entre 87.73 y 6.06 kDa en frijol lima y
entre 50.87 a 4.85 kDa para el frijol jamapa. En los hidrolizados de ambas
leguminosas, se observaron diversidad de bandas proteicas, debido a que,
durante el hidrolizado de los aislados proteicos, la enzima Flavourzyme® mostró
menor grado de hidrólisis (ver cuadro 3). Esto pudiera deberse a que la estructura
globular de las globulinas, proteína mayoritaria en leguminosas, es una limitante
para la acción de una sola enzima proteolítica (Clemente y col., 1999). Cabe
mencionar que en los carriles 60, 75 y 90 min del hidrolizado de frijol lima (Figura
2b) desaparecieron aquellas bandas de peso molecular inferior, como las
halladas en los carriles 15, 30 y 45 min. Mientras que en el frijol jamapa P.
vulgaris (Figura 3b) en el carril 90 min, las bandas permanecieron, aunque de
manera más tenue que los observados en los demás carriles (15, 30, 45, 60 y 75
min).
27
Figura 2. Patrón de electroforesis (SDS-PAGE) en gel de poliacrilamida de los
hidrolizados proteínicos de frijol lima (P. lunatus) con a) Alcalase® y b) Flavouryme® a
diferentes tiempos de reacción
Figura 3. Patrón de electroforesis (SDS-PAGE) en gel de poliacrilamida de los
hidrolizados proteínicos de frijol jampa (P. vulgaris) con a) Alcalase® y b) Flavouryme® a
diferentes tiempos de reacción
VI.2.3. Actividad inhibitoria de los hidrolizados proteínicos sobre la ECA-I,
obtenidos en los experimentos 1 y 2
La actividad inhibitoria de la ECA-I (Cuadro 4) mostrada por los hidrolizados
proteicos del frijol lima y frijol jamapa obtenidos con la enzima Alcalase® a
diferentes tiempos de reacción, ha sugerido que los péptidos liberados de las
proteínas intactas de las leguminosas por la hidrólisis enzimática, fueron los
responsables de la inhibición de la ECA-I. La actividad inhibitoria de la ECA-I
obtenida en el P. lunatus con Alcalase® alcanzó su máxima a los 90 min de
reacción con una IC50 = 0.056 mg/ml. Mientras que en los demás tiempos de
reacción (15, 30, 45, 60 y 75 min) el intervalo de actividad fue de IC50 = 0.112 –
0.569 mg/ml. Por otro lado, dicha actividad en el P. lunatus con Flavourzyme® dio
un máximo a los 90 min de reacción con una IC50 = 0.00691 mg/ml, seguida por el
tratamiento de 60 min con una IC50 = 0.181mg/ml. De igual forma, las pruebas de
inhibición de la ECA-I de los hidrolizados proteicos de frijol jamapa con Alcalase®
mostró un valor de IC50 = 0.061 mg/ml a los 60 min de reacción, seguida por el
tratamiento de 45 min con un valor de IC50= 0.074 mg/ml. Por otro lado, el frijol
jamapa con Flavourzyme® tuvo mayor actividad inhibitoria de la ECA-I a los 45
28
min de reacción con un IC50 = 0.127 mg/ml, mientras que los demás tiempo de
reacción oscilaron entre 0.0151 a 0.850 mg/ml.
Cuadro 4. Actividad inhibitoria “in vitro” de los hidrolizados proteicos sobre la ECA-I
Tiempo de
Frijol lima
reacción
IC50 (mg/ml)
IC50 (mg/ml)
Alcalase®
Flavourzyme®
0.287
0.591
0.401
0.569
0.237
0.454
0.151
45
0.112
0.265
0.074
0.127
60
0.254
0.181
0.061
0.852
75
0.259
0.274
0.098
0.820
90
0.056
0.0069
0.394
0.185
(min)
Alcalase
15
0.437
30
®
Frijol jamapa
Flavourzyme
®
Estos valores fueron similares a los encontrados por Hong y col., (2005) en el
frijol mungo (P. radiatus L.) a las 2 h de reacción con Alcalase® con IC50 = 0.64
mg/ml. Otros investigadores como Pedroche y col., (2002) encontraron valores de
inhibición de la ECA-I en aislados proteicos de garbanzo con una IC50 = 0.19
mg/ml, al ser hidrolizados de manera secuencial con Alcalase® y Flavourzyme®,
debido a lo anterior sugiere que los valores encontrados en esta investigación se
encuentran dentro de los intervalos de inhibición reportados por diversos
investigadores con otras leguminosas.
VI.2.1. Experimentos 3, 4 y 5.Hidrólisis enzimática a partir de frijol flor de
mayo (germinado y sin germinar), frijol lima (germinado y sin germinar) y
lupino empleando Alcalase®
a). Hidrolizados a partir de Flor de Mayo (Phaseolus vulgaris)
En el sistema de hidrólisis empleando la enzima comercial Alcalase® sobre el
aislado de frijol flor de mayo, se puede mencionar que la resolución del sistema
factorial factorial 23 , específicamente para la variable GH (Cuadro 5), indicó que
los factores evaluados (fuente de aislado proteico (A), relación enzima:sustrato
(B) y tiempo de hidrólisis (C), fueron estadísticamente diferentes (p<0.05); así
29
mismo, las dobles interacciones AB y AC también mostraron efecto significativo
(p<0.05). El factor C fue el que presentó mayor efecto estadístico y, en menor
proporción, el factor B. El mayor GH (28.7%). se obtuvo con aislado a partir de
grano sin germinar al mayor tiempo (2 h) y mayor relación enzima:sustrato (1/10),
en tanto que con el aislado a partir de grano germinado a las mismas
condiciones, se logró un GH de 25.0% (Figura 4). Estos tratamientos
mencionados con mayor GH tuvieron actividad inhibitoria de la ECA-I, con valores
de IC50 = 0.648 y 0.603 mg/ml, respectivamente. De los datos de la gráfica de la
Figura 4, se pudo observar que el GH es directamente proporcional a los niveles
de enzima/sustrato y tiempo de hidrólisis, para ambos aislados proteicos.
Cuadro 5. Grados de hidrólisis obtenidos en los hidrolizados a partir de los aislados de
frijol flor de mayo, empleando la enzima Alcalase®.
Tratamiento
Factores
Nivel
Nivel
Nivel
Grado de
Actividad
A B C
Factor A
Factor B
Factor C
Hidrólisis
Inhibitoria
Fuente de
Relación
Tempo de
(%)
ECA-1
aislado
(E/S)
hidrólisis
IC
(h)
(mg/ml)
a
1
(1)
-
-
-
Sin germinar
1/50
0.5
13.0
2
a
+
-
-
Germinado
1/50
0.5
15.7
3
b
-
+
-
Sin germinar
1/10
0.5
18.7
4
ab
+ +
-
Germinado
1/10
0.5
17.2
5
c
-
- +
Sin germinar
1/50
2.0
22.4
6
ac
+
-
+
Germinado
1/50
2.0
20.1
7
bc
-
+
+
Sin germinar
1/10
2.0
28.7
8
abc
+
+
+
Germinado
1/10
2.0
25.0
9
(0)
0
0
0
50%/50%
1/30
1.25
21.7
a-i
50
b
d
c
g
e
i
0.648
h
0.603
f
letras diferentes en la misma columna indica diferencia estadística significativa (p<0.05).
30
Alcalasa 2.4L
Alcalasa 2.4L
35
35
30
(E/S):1/10
25
20
(E/S):1/50
15
% GH
% GH
30
(E/S):1/10
25
(E/S): 1/30
20
(E/S):1/50
15
10
0.5
2
t
Grano sin germinar
10
0.5
2
t
Grano germinado
Figura 4. Grados de hidrólisis obtenidos con el sistema Alcalase® sobre aislados de frijol flor de
mayo (Phaseolus vulgaris) a partir de grano germinado y sin germinar. El punto de la gráfica en
azul de la derecha es el punto central del diseño estadístico.
b). Hidrolizados a partir de frijol lima (Phaseolus lunatus)
En los hidrolizados obtenidos con la enzima comercial Alcalase®, a partir de
aislados de frijol lima, se observó que la resolución del sistema factorial 23, sobre
el GH (Cuadro 6), indicó que, al igual que con el frijol flor de mayo, los factores
evaluados (fuente de aislado (A), relación enzima/sustrato (B) y tiempo de
hidrólisis (C), fueron estadísticamente diferentes (p<0.05); la doble interacción AB
tuvo efecto significativo (p<0.05). Así mismo, se observó un comportamiento
similar con el factor C, ya que fue el que presentó mayor diferencia estadística y
en menor proporción el factor B. En este experimento se observaron mayores
GH, cuyos valores oscilaron entre 14 y 43%. De nuevo, los mayores GH se
tuvieron al mayor tiempo de hidrólisis (2 h) y a mayor relación enzima/sustrato
(1/10). Así, con el aislado a partir de grano sin germinar se logró un GH de 33.5%
y para el otro aislado el GH fue mayor (43.0%). En estos dos tratamientos, la
actividad antihipertensiva (IC50) fue 0.560 mg/ml para el primero y 1.159 mg/ml
para el segundo.
31
Cuadro 6. Grados de hidrólisis obtenidos en los hidrolizados a partir de aislados de frijol
lima, empleando la enzima Alcalase®.
Tratamiento
Factores
Nivel
Nivel
Nivel
Grado de
Actividad
A B C
Factor A
Factor B
Factor C
Hidrólisis
Inhibitoria
Fuente de
Relación
Tempo de
(%)
ECA-1
Aislado
(E/S)
hidrólisis
IC50
(h)
(mg/ml)
a
10
(1)
-
-
-
Sin germinar
1/50
0.5
14.6
11
a
+
-
-
Germinado
1/50
0.5
16.2
12
b
-
+
-
Sin germinar
1/10
0.5
15.2
13
ab
+ +
-
Germinado
1/10
0.5
24.9
14
c
-
- +
Sin germinar
1/50
2.0
23.0
15
ac
+
-
+
Germinado
1/50
2.0
23.7
16
bc
-
+
+
Sin germinar
1/10
2.0
33.5
17
abc
+
+
+
Germinado
1/10
2.0
43.0
18
(0)
0
0
0
50%/50%
1/30
1.25
26.0
a-i
c
b
e
d
d
g
0.560
h
1.159
f
letras diferentes en la misma columna indica diferencia estadística significativa (p<0.05)
Alcalasa 2.4L
Alcalasa 2.4L
45
35
40
(E/S):1/10
25
20
(E/S):1/50
15
(E/S):1/10
35
% GH
% GH
30
30
(E/S): 1/30
25
(E/S):1/50
20
15
10
0.5
2
Grano sin germinar
t
10
0.5
2
Grano germinado
t
Figura 5. Grados de hidrólisis obtenidos con el sistema Alcalase® sobre aislados de frijol
lima (Phaseolus lunatus) a partir de grano germinado y sin germinar. El punto azul de la
gráfica de la derecha representa el punto central del diseño estadístico.
En forma similar con los hidrolizados a partir de frijol flor de mayo, se pudo
constatar que el GH (en el frijol lima), es directamente proporcional a los niveles
de enzima/sustrato y tiempo de hidrólisis, tanto para el aislado de grano
germinado como para el de grano sin germinar (Figura 5). Se pudo observar,
32
además, que para el aislado a partir de grano sin germinar a un tiempo de
hidrólisis de 0.50 h, el GH fue muy similar (14.6 y 15.2%) tanto para 1/50 como
para 1/10 (relación enzima/sustrato). Sin embargo, para un tiempo de hidrólisis de
2 h, esta diferencia en GH fue notable.
c) Hidrolizados a partir de lupino (Lupinus mutabilis)
En el sistema de hidrólisis empleando la enzima comercial Alcalase® sobre el
aislado de Lupinus mutabilis, se observó que mencionar que la resolución del
sistema factorial factorial 22 sobre la variable GH (Cuadro 7), indicó que los 2
factores evaluados (relación enzima/sustrato (A) y tiempo de hidrólisis (B)
presentaron diferencia estadística significativa, siendo el tiempo de hidrólisis
(factor B), el que tuvo la mayor contribución en esta diferencia estadística, es
decir, que la variación en el tiempo de hidrólisis, repercute notablemente en el GH
de los diferentes hidrolizados. Es importante hacer notar que la interacción de
ambos factores (AB) fue paralela, no habiendo interrelación entre ellos. Los GH
obtenidos en estos tratamientos, oscilaron entre 15.6 y 39.1%. Los mayores GH
se obtuvieron con el tiempo de hidrólisis de 2 h; así, para este tiempo se logró un
GH de 30.6% para E/S de 1/50 y una IC50 = 0.442 mg/ml, en tanto que para E/S
de 1/10, el GH fue de 39.1% y una IC50 = 0.860 mg/ml.
Cuadro 7. Grados de hidrólisis obtenidos en los hidrolizados a partir de aislado proteico de lupino,
empleando la enzima Alcalase®.
Tratamiento
a-d
Nivel
Nivel
Grado de
Actividad
Factor A
Factor B
Hidrólisis
Inhibitoria
Factores
Relación
Tiempo
(%)
ECA-1
A B
(E/S)
de
IC50
hidrólisis
(mg/ml)
a
L-1
(1)
-
-
1/50
0.5 h
15.6
L-2
a
+
-
1/10
0.5 h
20.6
L-3
b
-
+
1/50
2.0 h
30.6
L-4
ab
+ +
1/10
2.0 h
39.1
b
c
0.442
d
0.860
letras diferentes en la misma columna indica diferencia estadística significativa (p<0.05).
33
Alcalasa 2.4L
45
40
(E/S):1/10
% GH
35
30
25
(E/S):1/50
20
15
10
0.5
2
Grano sin germinar
t
Figura 6. Grados de hidrólisis obtenidos con Alcalase® sobre aislado proteico de Lupinus
mutabilis.
Al igual que con los hidrolizados a partir de frijol flor de mayo y frijol lima se pudo
constatar que el GH es directamente proporcional a la cantidad de enzima
añadida y al tiempo de hidrólisis (Figura 6).
VI.2.2. Experimentos 6, 7 y 8. Hidrólisis enzimática a partir de frijol flor de
mayo (germinado y sin germinar), frijol lima (germinado y sin germinar) y
lupino empleando el sistema secuencial Pepsina®-Pancreatina®.
a). Hidrolizados a partir de frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris)
En general, con el sistema secuencial enzimático Pepsina®-Pancreatina®, se
obtuvieron menores GH que con Alcalase®. Así, en los hidrolizados de los
aislados a partir de frijol flor de mayo, se puede mencionar que la resolución del
sistema factorial factorial 23 sobre el GH (Cuadro 8), indicó que los factores
evaluados (fuente de aislado (A), relación enzima/sustrato (B) y tiempo de
hidrólisis (C), no mostraron efecto significativo (p<0.05); la misma observación se
obtuvo para las dobles interacciones AB, BC y AC. Esto indica que cualquier
tratamiento puede emplearse para realizar la hidrólisis, ya que los GH serán
iguales, aunque un comparativo de medias indicó que todos los GH son
diferentes entre sí. En estos tratamientos, el mayor GH (16.4%). se obtuvo con el
aislado a partir de grano sin germinar, al mayor tiempo de hidrólisis (3 h) y mayor
relación enzima/sustrato (1/10), en tanto que, con el aislado a partir de grano
34
germinado en las mismas condiciones, se logró un GH de 14.9% (Figura 7). Estos
tratamientos mencionados con mayor GH tuvieron actividad inhibitoria de la ECAI, con valores de IC50 = 0.106 y 0.299 mg/ml, respectivamente. De los datos de la
gráfica de la figura 7, se puede concluir el GH es directamente proporcional a los
niveles de enzima/sustrato y tiempo de hidrólisis, con excepción para el aislado a
partir de grano sin germinar, ya que a mayor tiempo de hidrólisis, el GH
disminuyó en la relación E/S de 1/50.
Cuadro 8. Grados de hidrólisis obtenidos en los hidrolizados a partir de aislados de frijol
flor de mayo, empleando el sistema secuencial enzimático Pepsina®-Pancreatina®
Tratamiento
Factores
Nivel
Nivel
Nivel
Grado de
Actividad
A B C
Factor A
Factor B
Factor C
Hidrólisis
Inhibitoria
Fuente de
Relación
Tempo de
(%)
ECA-1
aislado
(E/S)
hidrólisis
IC50
(h)
(mg/ml)
e
19
(1)
-
-
-
Sin germinar
1/50
1.0
13.0
20
A
+
-
-
Germinado
1/50
1.0
9.1
21
b
-
+
-
Sin germinar
1/10
1.0
15.0
22
ab
+ +
-
Germinado
1/10
1.0
11.7
23
c
-
- +
Sin germinar
1/50
3.0
12.2
24
ac
+
-
+
Germinado
1/50
3.0
9.7
25
bc
-
+
+
Sin germinar
1/10
3.0
16.4
26
abc
+
+
+
Germinado
1/10
3.0
14.9
27
(0)
0
0
0
50%/50%
1/30
2.0
14.0
a-i
a
h
c
d
b
i
0.106
g
0.299
f
letras diferentes en la misma columna indica diferencia estadística significativa (p<0.05)
35
Pepsina-pancreatina
Pepsina-pancreatina
20
20
% GH
% GH
(E/S):1/10
15
1
3
Grano sin germinar
(E/S): 1/30
10
(E/S):1/50
10
(E/S):1/10
15
(E/S):1/50
5
t
1
3
Grano germinado
t
Figura 7. Grados de hidrólisis obtenidos con el sistema secuencial enzimático Pepsina®Pancreatina® sobre aislados de frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris) a partir de grano
germinado y sin germinar. El punto de la gráfica en azul de la derecha representa el
punto central del diseño estadístico.
b). Hidrolizados a partir de frijol lima (Phaseolus lunatus)
El sistema secuencial Pepsina®-Pancreatina®, sobre aislados de frijol lima, mostró
que la resolución del sistema factorial factorial 23 , en el GH (Cuadro 9), hubo
diferencia estadística significativa (p<0.05), en los tres factores evaluados: (fuente
de aislado (factor A), relación enzima/sustrato (factor B) y tiempo de hidrólisis
(factor C), siendo los factores B (relación E/S) y C (tiempo de hidrólisis) los de
mayor efecto significativo. Con relación a las dobles interacciones, se puede
mencionar
que
también
tuvieron
efecto
significativo
(p<0.05.
En
este
experimento, los GH oscilaron entre 8.5 y 21.3%, mayores que los obtenidos con
el frijol flor de mayo con este mismo sistema secuencial. Los mayores GH se
obtuvieron con el mayor tiempo de hidrólisis (3 h) y a mayor relación
enzima/sustrato (1/10). Así, para el aislado a partir de grano sin germinar, se
logró un GH de 20.0% y para el aislado del grano germinado el GH fue
ligeramente
mayor
(21.3%);
en
estos
dos
tratamientos,
la
actividad
antihipertensiva (IC50) fue de 0.416 mg/ml para el primero y 0.526 mg/ml para el
segundo.
36
Cuadro 9. Grados de hidrólisis obtenidos en los hidrolizados a partir de aislados de frijol
lima, empleando el sistema secuencial enzimático Pepsina®-Pancreatina®.
Tratamiento
Factores
Nivel
Nivel
Nivel
Grado de
Actividad
A B C
Factor A
Factor B
Factor C
Hidrólisis
Inhibitoria
fuente de
Relación
Tempo de
(%)
ECA-1
aislado
(E/S)
hidrólisis
IC50
(h)
(mg/ml)
a
28
(1)
-
-
-
Sin germinar
1/50
1.0
8.5
29
a
+
-
-
Germinado
1/50
1.0
15.6
30
b
-
+
-
Sin germinar
1/10
1.0
17.7
31
ab
+ +
-
Germinado
1/10
1.0
14.8
32
c
-
- +
Sin germinar
1/50
3.0
15.7
33
ac
+
-
+
Germinado
1/50
3.0
16.9
34
bc
-
+
+
Sin germinar
1/10
3.0
20.0
35
abc
+
+
+
Germinado
1/10
3.0
21.3
36
(0)
0
0
0
50%/50%
1/30
2.0
17.2
a-i
c
f
b
c
d
g
0.416
h
0.526
e
letras diferentes en la misma columna indica diferencia estadística significativa (p<0.05)
Pepsina-pancreatina
Pepsina-pancreatina
25
25
20
(E/S):1/10
(E/S):1/10
20
(E/S): 1/30
15
(E/S):1/50
10
5
1
3
Grano sin germinar
t
15
(E/S):1/50
10
1
3
Grano germinado
t
Figura 8. Grados de hidrólisis obtenidos con el sistema secuencial enzimático Pepsina®Pancreatina® sobre aislados de frijol lima (Phaseolus lunatus) a partir de grano
germinado y sin germinar. El punto de la gráfica en azul de la derecha representa el
punto central del diseño estadístico.
37
Al igual que con los hidrolizados a partir de frijol flor de mayo, se pudo constatar
que el GH es directamente proporcional a los niveles de enzima/sustrato y tiempo
de hidrólisis, para ambos aislados a partir de frijol lima (Figura 8).
c). Hidrolizados a partir de lupino (Lupinus mutabilis)
En el sistema de hidrólisis empleando el sistema secuencial Pepsina®-Pancreatina®
sobre el aislado de lupino, se puede mencionar que la resolución del sistema
factorial factorial 22 sobre el GH (Cuadro 10), indicó que los 2 factores evaluados:
relación enzima/sustrato (A) y tiempo de hidrólisis (B) presentaron efecto
significativo (p<0.05), siendo el factor B (tiempo de hidrólisis) el que tuvo la mayor
contribución en esta diferencia estadística, es decir, que la variación en el tiempo
de hidrólisis, repercute notablemente en el GH de los diferentes hidrolizados. Es
importante hacer notar que la interacción de ambos factores (AB) fue paralela, no
habiendo interrelación entre ellos. Los GH obtenidos en estos tratamientos,
oscilaron entre 22.1 y 36.9%. Los mayores GH se obtuvieron al tiempo de
hidrólisis de 3 h; así, para este tiempo se logró un GH de 36.9% para E/S de 1/50
y una IC50 = 0.644 mg/ml, en tanto que para E/S de 1/10, el GH fue menor
(32.9%), con una actividad de inhibición de IC50 = 0.519 mg/ml.
Cuadro 10. Grados de hidrólisis obtenidos en los hidrolizados a partir de aislado de
lupino, empleando el sistema secuencial enzimático Pepsina®-Pancreatina®.
Tratamiento
Nivel
Nivel
Grado de
Actividad
Factor A
Factor B
Hidrólisis
Inhibitoria
Factores
Relación
Tiempo
(%)
ECA-1
A B
(E/S)
de
IC50
hidrólisis
(mg/ml)
(h)
a-d
a
L-5
(1)
-
-
1/50
1.0
22.1
L-6
a
+
-
1/10
1.0
31.5
L-7
b
-
+
1/50
3.0
36.9
L-8
ab
+ +
1/10
3.0
32.9
b
d
0.644
c
0.519
letras diferentes en la misma columna indica diferencia estadística significativa (p<0.05)
38
Pepsina-pancreatina
40
35
(E/S):1/10
30
(E/S):1/50
25
20
1
3
Grano sin germinar
t
Figura 9. Grados de hidrólisis obtenidos con el sistema secuencial enzimático, sobre
aislados de Lupinus mutabilis a partir de grano sin germinar.
De los datos de la figura 9, se puede notar que con la relación E/S de 1/50 es
más notoria la razón de cambio en el GH al incrementar el tiempo de hidrólisis, lo
cual indica que la relación E/S de 1/50 fue la mejor en estos tratamientos, es
decir, que las enzimas empleadas se desempeñaron mejor con E/S de 1/50.
VI.3. Actividad antihipertensiva en los hidrolizados obtenidos en los
experimentos 3 a 8
Se obtuvieron valores de IC50 entre 0.106 y 1.159 mg/ml para los 12 tratamientos
de los experimentos 3 al 8, que presentaron el mayor GH, en donde el primer
valor de IC50 ha sido el mejor en estos experimentos en estudio. Este valor se
obtuvo con el tratamiento a partir del concentrado frijol flor de mayo sin germinar,
el cual fue hidrolizado con el sistema secuencial Pepsina®-Pancreatina®, en un
tiempo de hidrolizado de 3 h y una relación E/S de 1/10. Estos valores de
inhibición, son similares a los obtenidos con otras fuentes vegetales y otras
enzimas (Cuadro 11). Tanto para el frijol flor de mayo como para el frijol lima, se
puede mencionar que se han obtenido mejores valores de IC50 en los granos sin
germinar, aunque los valores obtenidos con los granos germinados no dejan de
ser menos importantes. Además, aún falta la etapa de purificación de los
39
péptidos, por lo cual aún no se pueden concluir cuáles serán los mejores
tratamientos. Así mismo, con estos resultados preliminares, no se ha podido
obtener una interdependencia entre el GH y los valores de IC50; así, era de
esperarse que a mayores GH se obtuvieran los mejores valores de IC50; por
ejemplo, el mejor valor de IC50 (0.106 mg/ml) se obtuvo a un GH inferior (16.4%),
en tanto que para un alto valor de GH (43%), el valor de IC50 no fue el mejor
(1.159 mg/ml), lo cual indica que se produjo mayor cantidad de péptidos a 43%
de GH, pero desafortunadamente no se produjeron aquellos que tienen mejor
especificidad en la inhibición de la ECA-I.
Hettiarachchy y Kalapathy (1997), obtuvieron un grado de hidrólisis de 11% a 1 h
de hidrólisis y de 17% a 3 h, en el hidrolizado de concentrado proteico de soya,
empleando la enzima pancreatina extraída de páncreas porcino. Vioque y col.
(2004) obtuvieron un GH de 38% con este mismo sistema secuencial (Pepsina®Pancreatina®) después de 6 h de hidrólisis total (3 h para la pepsina y 3 h para la
Pancreatina®), empleando proteína extraída de semillas de girasol; emplearon
una concentración de proteína de 10% p/v en la suspensión y una relación
enzima/sustrato (E/S) de 1/20 y obtuvieron una IC50 = 0.0024 mg/ml. Neves y col.
(2004), obtuvieron grados de hidrólisis entre 8.1 y 33.3% al emplear diferentes
tratamientos enzimáticos a base de una sola enzima: pepsina, pero extraída de
diferentes fuentes (de páncreas porcino, de Aspergillus oryzae, de Streptomyces
griseus) y de sistemas secuenciales de enzimas en donde la primera enzima fue
la Pepsina® con un tiempo de 3 h seguido de otra enzima (Bromelina®,
Quimiotripsina®) con un tiempo de acción de 2 h. El sustrato empleado fue una
mezcla de proteínas de productos marinos: María Luisa (Paralonchurus
brasiliensis), Pierna de Moca (Cynoscion sp) y Camarón rosa (Penaus
brasiliensis y Penaus pauliensis); la relación (E/S) fue 1/100. El mayor grado de
hidrólisis (33.3 %), se obtuvo con la Pepsina® extraída de Streptomyces griseus.
En el gluten de maíz se han obtenido valores de IC50 entre 0.160 y 250 mg/ml,
empleando enzimas por separado (Flavourzyme® y Proteasa A®) después de 4 h
de hidrólisis (Kim y col., 2004). En tanto que Hong y col., (2005) obtuvieron una
IC50 de 0.640 con un hidrolizado de frijol mungo, leguminosa de gran consumo
en China, empleando Alcalase® en un tiempo de 2 h; el GH respectivo fue de
40
18%; este grupo de investigadores también realizó hidrolizados del mismo
material con la enzima Neutrase®, pero obtuvieron menores grados de hidrólisis y
muy poca actividad de inhibición, por lo que se concentraron en los tratamientos
con Alcalase® para la posterior purificación de péptidos y secuenciación de los
mismos.
Cuadro 11. Tratamientos con mayor GH y con actividad inhibitoria de la ECA-I. FFMSG:
frijol flor de mayo sin germinar; FFMG: frijol flor de mayo germinado; FLSG: frijol lima sin
germinar; FLG: frijol lima germinado; LUSG: lupino sin germinar; Pep: Pepsina®; Alc:
Alcalase®.
Tratamiento
7
Material
como
sustrato
Enzima (s)
Empleada (s)
Tiempo de
Hidrólisis
(h)
Grado
De
Hidrólisis
(%)
FFMSG
Alcalase®
2.0
28.7
Alcalase
®
2.0
25.0
Alcalase
®
2.0
33.5
Alcalase
®
2.0
43.0
Alcalase
®
2.0
39.1
Alcalase
®
FFMG
8
FLSG
16
FLG
17
LUSG
L-3
LUSG
L-4
FFMSG
25
FFMG
26
FLSG
34
FLG
35
LUSG
L-7
L-8
LUSG
----
FRIJOL MUNGO
-------------
CHÍCHARO
MAÍZ (GLUTEN)
ALFALFA
30.6
Pep-pancreatina
3.0
16.4
Pep-pancreatina
®
3.0
14.9
Pep-pancreatina
®
3.0
20.0
Pep-pancreatina
®
3.0
21.3
Pep-pancreatina
®
3.0
32.9
Pep-pancreatina
®
Alc-Flavourzyme
®
®
i
l
k
g
2.0
Alcalase®
f
b
a
c
d
h
j
0.648
0.603
0.560
h
g
1.159
0.442
0.860
0.106
0.299
l
k
d
a
b
0.416
c
0.526
0.644
j
f
e
i
2.0
36.9
18.0
0.519
0.640
1.0
30.0
0.190
3
Flavourzyme
4.0
NR
0.160
3
®
4.0
NR
0.250
8.0
NR
0.009
6.0
30.0
0.0024
Proteasa A
Delvolasa
®
4
GIRASOL
a-i
2
MAÍZ (GLUTEN)
BLANCO
1
IC50
(mg/ml)
e
®
3.0
Actividad
Inhibitoria
ECA-1
5
Pep-pancreatina®
letras diferentes en la misma columna indica diferencia estadística significativa (p<0.05)
1
Hong y col. (2005)
2
Pedroche y col. (2002)
3
Kim y col. (2004)
4
Kapel y col. (2006)
5
Vioque y col. (2004)
41
VII. Conclusiones
El rendimiento de los aislados proteicos osciló entre 22.44 y 45.77% en los
materiales estudiados.
Se obtuvieron las cinéticas de hidrólisis extensiva mediante el uso de Alcalase® y
Flavourzyme®, lográndose un mayor GH con la enzima Alcalase® a los 45 min
con 37.94% en el frijol lima y a los 30 min con 49.48% en el frijol jamapa.
Mientras que, con la enzima Flavourzyme® los intervalos de GH varió
considerablemente, ya que, en el frijol lima fue de 7.17 a 22.03% y en el frijol
jamapa fue de10.84 a 26.05% con un tiempo de reacción de 15 a 90 min para
ambas leguminosas.
En el perfil electroforético de los hidrolizados obtenidos en las cinéticas
extensivas con el empleo de Alcalase®, se hallaron bandas de proteína entre
30.54 y 3.98 kDa para el frijol lima y entre 25.03 y 15.95 kDa para el frijol jamapa.
Empleando la enzima Flavourzyme®, las bandas de proteína tuvieron pesos
moleculares entre 87.73 y 6.06 kDa para el frijol lima y entre 50.87 y 4.85 kDa
para el frijol jamapa.
El hidrolizado de frijol lima con Alcalase® (en hidrólisis extensiva) presentó una
actividad inhibitoria de la ECA-I (in vitro) con un valor de IC50 = 0.056 mg/ml a los
90 min de reacción. Mientras que, en el frijol lima con Flavourzyme® tuvo un valor
de IC50 = 0.00691 mg/ml a los 90 min de reacción. Los hidrolizados proteicos de
frijol jamapa con Alcalase® mostró un valor de IC50 = 0.061 mg/ml a los 60 min de
reacción, y con la enzima Flavourzyme® tuvo mayor actividad inhibitoria de la
ECA-I a los 45 min de reacción con un IC50 = 0.127 mg/ml.
En los hidrolizados a partir de frijol lima, frijol flor de mayo y lupino obtenidos en la
evaluación de tres factores (fuente de aislado proteico, relación E/S y tiempo de
hidrólisis), empleando la enzima Alcalase® se obtuvieron GH entre 13.0 y 43% y
valores de IC50 entre 0.560 y 1.159 mg/ml.
42
En los hidrolizados a partir de frijol lima, frijol flor de mayo y lupino obtenidos en la
evaluación de tres factores (fuente de aislado proteico, relación E/S y tiempo de
hidrólisis), empleando el sistema secuencial Pepsina®-Pancreatina® se obtuvieron
GH entre 9.1 y 32.9% y valores de IC50 entre 0.106 y 0.640 mg/ml.
Las proteínas de frijol lima (Phaseolus lunatus), frijol jamapa (Phaseolus vulgaris),
frijol flor de mayo (Phaseolus vulgaris) y lupino (Lupinus mutabilis)
hidrolizadas
con Alcalase®, Flavourzyme®, Pepsina® y Pancreatina® podrían ser utilizadas
para el desarrollo de alimentos fisiológicamente funcionales para la prevención
y/o tratamiento de la hipertensión, proporcionando un valor agregado a estas
leguminosas estudiadas.
VIII. Productos Generados
Durante la realización de dicha investigación se ha logrado que dos alumnos de nivel de
Doctorado en Ciencias en Alimentos hayan concluido sus créditos, presentando el
Examen Predoctoral y Seminario de Resultados de Avances. Los alumnos son: M. en C.
Juan Gabriel Torruco Uco y M. en C. Mario Alberto de Jesús Domínguez Magaña.
Así mismo han participado en eventos científicos de talla Nacional como Internacional:
•
Torruco Uco Juan, Domínguez Magaña Mario, Chel Guerrero Luis, Betancur
Ancona David, Martínez Ayala Alma, Dávila Ortíz Gloria. Participación en la Sección
de Trabajos Libre con el Tema “Obtención de hidrolizados proteínicos de Phaseolus
lunatus mediante el uso de enzimas comerciales”. Congreso Internacional de
Industria y Tecnología Alimentarias 2006. Benemérita Universidad Autónoma de
Puebla-Facultad de Ingeniería Química. Celebrado del 31 de agosto, 1 y 2 de
septiembre de 2006.
•
Juan Torruco Uco; Mario Domínguez Magaña, David Betancur Ancona, Luis Chel
Guerrero, Alma Martínez Ayala y Gloria Dávila Ortíz. Ponente en Cartel del trabajo:
“Hidrolizados proteínicos de P. vulgaris y P. lunatus con uso potencial en la obtención
de péptidos bioactivos con actividad antihipertesiva”. XII Congreso Nacional de
Biotecnología y Bioingeniería. 25 Aniversario de la SMBB. Del 25 al 28 de Junio de
2007. Morelia, Michoacán, México.
43
•
J. G. Torruco-Uco., D. Betancur-Ancona., L. Chel-Guerrero., A. L. Martínez-Ayala.,
and G. Dávila-Ortíz. Certificate of presentation this certifies that: Production of
bioactive peptides from lima bean (Phaseolus lunatus) and jamapa bean (Phaseolus
vulgaris) seeds. Institute of Food Technologists. FoodSmarts IFT 2007 Annual
Meeting & Food Expo, Chicago, Illinois, USA, July 28 – August 1, 2007.
•
M. A. Domínguez-Magaña, L.A. Chel-Guerrero, A.L. Martínez-Ayala, D. BetancurAncona y G. Dávila-Ortiz. Certificate of presentation this certifies that: Production of
peptides with antihypertensive properties from lima bean (Phaseolus lunatus), flor de
mayo bean (Phaseolus vulgaris) and lupin (Lupinus mutabilis) . Institute of Food
Technologists. FoodSmarts IFT 2007 Annual Meeting & Food Expo, Chicago, Illinois,
USA, July 28 – August 1, 2007.
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