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Scientific Registration nº : 2317
Symposium nº : 41
Presentation : poster
Estabilidad de enzimas exocelulares incorporadas al
suelo
Stabilité des enzymes exocellulaires incorporées dans le
sol
Stability of exocellular enzymes after addition to soil
RIMOLO Mirta (1), MIYASAKY Silvia (2)
(1) Instituto de Suelos, INTA. Argentina
(2) Facultad de Agronomía (UBA). Argentina
INTRODUCCION
Estudios realizados con enzimas exocelulares muestran que es posible incorporar las
mismas al suelo con considerable retención de su actividad (Sarkar et al., 1989). Las
investigaciones en cinética enzimática indican que las enzimas libres y las inmovilizadas
en diferentes soportes responden, ambas, a las leyes de Michaelis-Menten (Lai y
Tabatabai, 1992; Gianfreda et al., 1992). Con respecto a la estabilidad enzimática, las
enzimas inmovilizadas en humus o arcillas son más resistentes a la acción de proteasas y
otros compuestos desnaturalizantes (Nanninpieri et al., 1982). En varios trabajos
realizados con enzimas exocelulares se efectuó la inmovilización previa en suspensiones
de arcillas o humus y posteriormente se incorporaron al suelo. Las enzimas libres que
son incorporadas al suelo pueden ser rápidamente degradadas o inactivadas (Sarkar et
al., 1989) pero una parte de las mismas será adsorbida en los coloides con retención de
su actividad. La dimensión de esta adsorción dependerá de las enzimas utilizadas y de
las características del suelo. Las celulasas presentan gran estabilidad, pero se conoce
poco acerca de su persistencia cuando son incorporadas en el suelo. Se denomina
celulasa al complejo enzimático que interviene en la degradación de la celulosa,
involucra la acción de por lo menos tres enzimas: exoglucanasa (1,4-ß-D-glucan
celobiohidrolasa), endoglucanasa (endo 1,4-ß-D-glucan-4-glucanohidrolasa) y ßglucosidasa (Wood y García Campayo, 1990). Las enzimas celulolíticas son
exocelulares; son sintetizadas por bacterias y hongos del suelo y liberadas al medio.. El
objetivo del presente estudio fue estudiar la estabilidad de celulasas exógenas
incorporadas al suelo sin inmovilización previa.
MATERIALES Y METODOS
Se sembró la cepa de Trichoderma reesei BAFC 2147 en medio basal de Mandels y
Andreotti (1978). Fue incubada a 28 ºC con agitación rotatoria constante a 180 rpm
durante 9 días. Luego se separó el micelio por filtración y se obtuvo el extracto
sobrenadante en cual se encontraban las enzimas exocelulares liberadas al medio. En el
1
extracto enzimático se hicieron determinaciones de actividad enzimática celulolítica y
proteína (Lowry et al.,1951).
Actividad enzimática: se determinó la capacidad del complejo enzimático para producir
glucosa a partir de distintos sustratos. Una unidad de actividad enzimática se definió
como la cantidad de enzima necesaria para liberar un mmol de glucosa por minuto. Los
sustratos
utilizados
fueron:
Celulosa amorfa (actividad de Endo-1,4 ß-glucanasa): una alícuota del extracto
enzimático se incubó con carboximetilcelulosa (CMC) en buffer acetato según
Yamanobe et al.(1987) y se determinó la cantidad de glucosa producida (Henry et
al.,1974).
Celulosa cristalina (actividad de Exo-1,4-ß-glucanasa): se utilizó celulosa
microcristalina (avicel) en buffer acetato (Yamanobe et al.,1987) y se determinó la
cantidad de glucosa producida (Henry et al.,1974).
Celobiosa (actividad de B-glucosidasa): el sustrato utilizado fue celobiosa en buffer
acetato según la técnica de Wood y Mahalingeshwara Bhat (1988),se determinó la
concentración de glucosa liberada (Henry et al.,1974).
Suelo: se utilizó un suelo de la serie Arroyo Dulce con las siguientes características: MO
= 2,84 %; N = 0,149 %; pH = 6,0; arcillas = 25,2 %.
Estabilidad enzimática: se agregó el extracto enzimático al suelo con diferentes dosis de
aplicación: 4 g de suelo húmedo tamizado por tamiz de 2 mm se colocaron en tubos de
2,5 cm de diámetro y 10 cm de longitud, se agregó el extracto y agua destilada en
cantidad necesaria para obtener la dosis requerida y un porcentaje de humedad igual a ¾
de humedad equivalente. Se hicieron determinaciones de actividad enzimática en el
extracto antes de su incorporación, y en el suelo con y sin el agregado de enzimas.
Actividad enzimática en el suelo: En los tubos se adicionó 0,8 ml de tolueno para inhibir
la actividad biológica, 4 ml de buffer con el sustrato correspondiente para cada enzima,
se incubó el mismo tiempo que el extracto líquido. Después de la incubación se
centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos, se extrajo una alícuota del sobrenadante y se
determinó glucosa. Las determinaciones, que se hicieron por triplicado, se realizaron
periódicamente durante una semana después de la aplicación de las enzimas para
estudiar la estabilidad de las mismas en el tiempo.
Dosis: se expresa como miliunidades enzimáticas (mUE) incorporadas por gramo de
suelo. Las diferentes dosis se obtuvieron haciendo diluciones del extracto enzimático
líquido, o utilizando el extracto liofilizado para concentrarlo.
Dosis
(mUE)
1
2
3
exogluca
nasa
5.33
7.46
14.95
endogluc
anasa
20.33
39.85
60.82
ß-glucosidasa
79.97
143.47
212.16
Actividad en la fase acuosa: se realizaron columnas de suelo en recipientes de porcelana
de 3 cm de diámetro y 5 cm de longitud, con la base perforada. Se hizo una extracción
con agua destilada, 2 horas después de la incorporación de las enzimas, y se estimó la
actividad y la concentración proteica en la fase acuosa.
2
RESULTADOS
La primera determinación de actividad enzimática se realizó 2 horas después de la
incorporación del extracto al suelo. En esta oportunidad no se detectó actividad en la
fase acuosa, y en el suelo la actividad de la mayoría de las enzimas mostró valores que
fluctuaban entre 50 y 90 % de la actividad inicial del extracto agregado (Tabla N° 1).
Parte de la actividad enzimática (10 – 50%) se perdió inmediatamente después del
agregado de la solución con las enzimas al suelo. La determinación de actividad
enzimática en el suelo incluye la actividad de las enzimas retenidas en las partículas y
las que están en la solución del mismo ya que se trabaja con suelo húmedo, pero al
separar la fase acuosa no se detectó actividad ni concentración proteica (Tabla N° 2) de
manera que se consideró que un alto porcentaje de las enzimas (50 –90 %) fueron
retenidas en la fase coloidal y el resto (10 –50 %) permanecían inactivas, unidas a las
partículas del suelo, o fueron degradas.
El estudio de estabilidad enzimática mostró que la actividad de las enzimas exógenas
incorporadas al suelo disminuyó con el tiempo según un modelo exponencial negativo
que presentó los siguientes coeficientes de correlación : r1= – 0,92, r2 = – 0,98 y r3 = 0,83 para la exoglucanasa; r1= - 0,99, r2 = - 0,99 y r3 = - 0,97 para la endoglucanasa y
para ß-glucosidasa r1= - 0,99, r2 = - 0,99 y r3 = - 0,99 para las distintas dosis utilizadas
(Figura N° 1). La mayor disminución se observó en el período comprendido entre la
incorporación de las enzimas y el segundo día, luego el proceso de pérdida fue mas
lento. La actividad enzimática que se detectó 8 días después de agregadas las enzimas al
suelo, se encontraba entre el 7 y 25 % del agregado; era menor para la endoglucanasa y
mayor para la ß-glucosidasa. Cada una de las enzimas presentó curvas con distintas
pendientes. La exoglucanasa presentó la mayor disminución de actividad en la primera
determinación, 2 horas después de incorporada, con valores que representan entre el 24
y 51 % de pérdida de actividad con respecto al valor inicial (Tabla N° 1). En la segunda
determinación, a las 48 horas, ya había perdido más del 50 % de su actividad inicial. Es
la enzima que mayor pérdida presentó en las primeras horas, luego de agregada al suelo;
después la disminución fue más lenta con valores muy bajos de pérdida de actividad por
hora. La endoglucanasa permanecía en mayor proporción activa en el suelo, pero a las
48 horas los porcentajes de pérdida fueron similares a los de la exoglucanasa y la
actividad continuó disminuyendo hasta mostrar los mayores porcentajes al finalizar el
estudio. La ß-glucosidasa fue la enzima con mayor retención de la actividad luego de
agregada al suelo. La disminución fue mayor las primeras 2 horas y mucho más lenta y
constante los siguientes días. La pérdida total fue levemente menor (Tabla Nº 1).
En el extracto obtenido a partir del cultivo de T. reesei se estableció la proporción en que
se encontraban las tres enzimas por medio de la relación exoglucanasa : endoglucanasa
: ß-glucosidasa (Tabla N° 3), estos coeficientes se mantenían aproximadamente
constantes para las condiciones de cultivo determinadas previamente. Una vez
incorporado el extracto al suelo, las determinaciones de actividad enzimática en el suelo
mostraron que los coeficientes presentaron valores similares a los del extracto para la
exoglucanasa y la endoglucanasa, pero se modificaron levemente con incrementos en la
proporción de ß- glucosidasa, por ser la enzima que más retiene su actividad en el suelo;
y se observó la mayor disminución en la actividad de la endoglucanasa en la última
determinación.
3
DISCUSION
Se estudió la estabilidad de las enzimas frente a las condiciones heterogéneas del medio,
en función del tiempo y con distintas dosis de aplicación.
Las enzimas extracelulares que persisten en estado activo en el suelo pueden ser
estabilizadas por asociaciones físicas o químicas con los coloides (Ladd y Butler, 1975).
La adsorción de enzimas y otras proteínas en arcillas se estudia desde hace muchos años
(Ensninger y Gieseking, 1939; McLaren, 1954; Esterman et al., 1959). Posteriormente
los investigadores consideraron la participación de la materia orgánica en la adsorción
mediante la formación de complejos humus-enzima por uniones covalentes durante la
formación del polímero húmico o por uniones iónica o hidrógeno al polímero ya
formado (Ladd y Butler, 1975)
Al agregar enzimas exógenas los coloides del suelo podrían comportarse como un
soporte en el cual son adsorbidas e inmovilizadas; la adsorción puede realizarse en las
partículas húmicas o arcillosas.
Si las enzimas agregadas son adsorbidas y protegidas por los coloides del suelo, la
probabilidad de encontrar sitios de unión a los mismos, antes de ser degradadas por los
microorganismos, sería menor cuanto menor sea la cantidad de enzima que se
incorpora. Probablemente la exoglucanasa desaparece mas rápidamente porque es la
enzima que se encuentra en menor proporción en el extracto enzimático producido por T.
reesei y la cantidad de unidades enzimáticas que se agregaron al suelo es menor. De la
misma manera la enzima que permanece en mayor cantidad es la ß-glucosidasa.
Para cada enzima con las mayores dosis se obtuvieron valores más altos de actividad, las
curvas en función del tiempo son similares con algunas variaciones en las pendientes
(Figura N° 1). Las diferentes dosis no modificaron significativamente la respuesta si
bien en las tres enzimas se observó, con la dosis 2, mayor retención de la actividad
durante las primeras 2 horas. Sarkar (1989), relacionó la cantidad de unidades
enzimáticas agregadas y la cantidad recuperada, y determinó la capacidad de saturación
del soporte o suelo utilizado cuando añadía lacasa. En el presente estudio no se alcanzó
la saturación de los sitios de adsorción. Al aumentar la dosis aumenta la retención
enzimática en el suelo y aparentemente no se satura la capacidad del complejo para
retener actividad (Figura Nº 1).
Los factores que pueden afectar la actividad enzimática en el suelo son la degradación o
la inavtivación de las enzimas. Los procesos que determinarían o influirían en la
inactividad pueden ser: que la adsorción involucre el sitio activo; que alguna propiedad
del suelo como pH o concentración salina cambie la relación de sinergismo entre las
enzimas, que se produzca un efecto estérico debido a las arcillas o materia orgánica
(Ladd y Butler, 1975). El porcentaje de disminución de la actividad que se registró
durante las 2 horas iniciales podría ser consecuencia de la degradación de las enzimas
por las proteasas presentes en el suelo. En estudios realizados con enzimas libres
adicionadas al suelo y expuestas a la acción de proteasas durante 2 horas
aproximadamente, a 37 ºC, se determinó una actividad residual del 85 % para ureasa
(Gianfreda et al., 1992) , 70 % para lacasa, 50 % para tirosinasa y 15 % para fosfatasa
ácida (Sarkar et al.,1989).
BIBLIOGRAFIA
Ensminger, L. E. And Gieseking, J. E. 1939. The adsorption of proteins by
montmorillonitic clays. Soil Sci. 48 : 467 – 474
4
Estermann, E. F.; Peterson, G. H. And Mc.Laren, A. D. 1959. Digestion of clay-protein,
lignin-protein and silica-protein complexes by enzymes and bacteria. Soil Sci. Soc.
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Gianfreda, L. Rao, M. A. and Violante, A. 1992. Adsorption, avtivity and kinetic
properties of urease on montmorillonite, aluminium hydroxide and AL(OH)xmontmorillonite complexes. Soil Biol. Biochem. 24: 51-58
Henry, R. J.; Cannon, D. L and Winkelman, J. 1974. Principles and techniques. Harper
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Wood, T. M. and Mahalingeshwara Bhat, K. 1988. Method for measuring cellulase
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Yamanobe, T; Mitsuishi, Y. and Takasahy, Y. 1987. Isolation of cellulolytic enzyme
producing microorganism, culture conditions and some properties of the enzymes.
Agric. Biol. Chem. 51: 65-74
Keywords : enzyme activity, enzyme adsorption, endoglucanase, exoglucanase, ßglucosidase, Trichoderma reesei
Mots clés : activité enzymatique, adsorption des enzymes, endoglucanase, exoglucanase,
ß-glucosidase, Trichoderma reesei
5
Tabla Nº 1: Retención de la actividad enzimática en el suelo después de la
incorporación. Expresada como % de UE (unidades enzimáticas) con respecto al valor
inicial de UE agregadas al suelo.
a) Exoglucanasa
Dosis
2 horas
54.78
1
75.87
2
48.82
3
48 horas
35.2
48.12
31.8
120 horas
25.38
30.29
28.76
192 horas
15
17.15
20.26
b) Endoglucanasa
Dosis
2 horas
69.84
1
79.2
2
70.7
3
48 horas
52.73
51.1
48.7
120 horas
30.0
28.85
26.3
192 horas
9.88
6.7
17.7
c) ß-glucosidasa
dosis
2 horas
83.89
1
90.7
2
82.14
3
48 horas
69.76
76.33
66.77
120 horas
37.8
41.12
35.35
192 horas
21.5
25.02
23.05
Tabla Nº 2: Concentración de proteínas en la fase acuosa del suelo con y sin el agregado
de enzimas.
Proteínas (mg. ml-1)
Suelo sin enzimas
Suelo con enzimas
Extracto enzimático
1.1137
1.145
0.153
Actividad
enzimática
No detectable
No detectable
Tabla Nº 3: Relación Exoglucanasa : Endoglucanasa : ß-glucosidasa. Valor inicial en el
extracto agregado y en al suelo a través del tiempo.
Dosis
1
2
3
Inicial
1 : 4 : 15
1 : 5 : 19
1 : 4 : 14
2 horas
1 : 5 : 23
1 : 5 : 23
1 : 6 : 24
48 horas
1 : 6 : 30
1 : 6 : 30
1 : 6 : 30
120 horas
1 : 4 : 22
1 : 5 : 26
1 : 4 : 17
6
192 horas
1 : 2 : 21
1 : 2 : 28
1 : 3 : 16
Figura Nº 1: Actividad enzimática en el suelo después de la incorporación de las
enzimas. Variación de la actividad en el tiempo.
a) Exoglucanasa
25.00
20.00
Dosis 3
Dosis 2
Dosis 1
15.00
10.00
5.00
0.00
0
2
48
120
192
Tiempo (horas)
b) Endoglucanasa
140.00
miliunidades enzimáticas
120.00
100.00
Dosis 3
80.00
Dosis 2
Dosis 1
60.00
40.00
20.00
0.00
0
2
48
120
192
Tiempo (horas)
c) ß-glucosidasa
500.00
450.00
400.00
miliunidades enzimáticas
miliunidades enzimáticas
30.00
350.00
300.00
Dosis 3
250.00
Dosis 2
200.00
Dosis 1
150.00
100.00
50.00
0.00
0
2
48
120
192
Tiempo (horas)
7