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Estudio de reacciones
enzimáticas sobre polímeros
naturales.
HOMBERT Clotilde
IUT A Lille 1 Departamento de química
Tutora: Margarita CALAFELL
Departament d’Enginyeria Químical UPC (TERRASSA)
1
Agradecimientos
Ante todo quisiera agradecer a Margarita CALAFELL por su buena acogida,
su ayuda preciosa y que me haya mostrado el emocionante mundo de las enzimas.
También
agradezco
a
Gustavo
GRACIA
GRILLASCA,
Alejendra
RODRIGUEZ por su ayuda y guía a lo largo de mi proyecto.
Finalmente agradezco a Kamelia TRAEGER, Angela VILCHEZ y Arfaxad
REYES por la documentación.
2
INDICE:
Objetivos del trabajo
p5
Motivación
p5
Extensión y limites del trabajo
p6
Primera parte; estudio bibliográfico
p7
I.
Generalidades
1.
p8
Estructura
p8
a.
Sitio activo
p8
b.
Estructura especifica de las enzimas
p9
c.
Clasificación
p11
2. Mecanismos de reacción enzimática
p12
3
3.
Influencia de los factores
p13
a.
Temperatura
p14
b.
pH
p14
Substrato
c.
p15
4. Mecanismos de regulación
p15
a. Variación por acción de masa
p15
b. Variación por activación o inhibición
p16
c.
Variación de la concentración de la enzima
p17
II.
Celulasa
1.
2.
III.
IV.
p17
Definición
p18
Propiedades químicas y físicas
p19
Laccasa
p21
1. Sitio activo
p21
2. Mecanismo de reacción
p22
Aplicaciones:
1. Degradación de la lignina
p23
p24
a. Reacción
p24
b. Dominios de utilización
p26
4
2. Degradación de hidrocarburos aromáticos
policiclicos
p26
a. Reacción
p26
b. Dominios de utilización
p27
3. Fermentación y biocombustible
Segunda parte; experiencias
p29
p30
Ensayos de actividad de celulasa
I.
p30
Ensayos de actividad de laccasa
II.
p32
Tercera parte; resultados y discusión
p37
Ensayos de actividad de celulasa
I.
p37
1.
Resultados
p37
2.
Discusión
p38
Ensayos de actividad de laccasa
II.
p39
1.
Resultados
p40
2.
Discusión
Conclusiones
p41
p42
Cuarta parte; Referencias i bibliografía
p43
Bibliografía
p43
Referencia
p44
5
Objetivos del trabajo:
El objetivo principal de este trabajo ha sido:
Estudiar las propiedades de las enzimas (laccasa y celulasa): su estructura,
susbtratos, actividad y aplicaciones industriales.
Los objetivos secundarios necesarios por alcanzar el estudio han sido:
-
Estudio bibliográfico de las distintas celulasas y laccasas conocidas;
-
Búsqueda de los métodos existentes para determinar su actividad;
-
Valoración de los métodos encontrados según su fiabilidad y facilidad de
realización;
-
Puesta a punto de un método experimental y su valoración.
Motivación:
Desde el inicio de la vida, las enzimas juegan un papel muy importante en el
metabolismo de hombres, animales y plantas. Se puede decir que es el inicio de la
vida en el mundo. Pero no es solamente el inicio sino el porvenir.
En efecto, hoy se preocupan mucho del impacto sobre el medio ambiente, la
contaminación, etc. Actualmente se utilizan enzimas en muy variadas aplicaciones,
desde la industria de alimentación, hasta la química verde pasando por el papel
ecológico y el textil. Además, en un futuro, las enzimas serán reconocidas por su
capacidad de transformar los residuos y obtener nuevos materiales con variadas
propiedades como el aislamiento de viviendas, reciclado de papel i cartón la
prometedora obtención de biocombustible y también la eliminación de la
contaminación (eliminando la toxicidad del agua).
Por ello el mundo de las enzimas es muy apasionante. A mi me parece que
hacer mi proyecto con este objetivo es muy interesante e instructivo.
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Además mi formación en IUT Lille ha sido en química y por tanto he podido
adaptarme muy bien a los conocimientos de química y bioquímica que se requieren
para este estudio.
Extensión y limites del trabajo:
El titulo de este trabajo es muy amplio, imposible de abordar en los tres
meses de mi estancia en la UPC. Por ello se he optado por la caracterización de
las enzimas que actúan sobre substratos poliméricos naturales y concretamente
el estudio experimental de su actividad.
7
De todas formas también las enzimas que tienen como substrato polímeros
naturales son muy variadas y por ello se ha decidido centrar el estudio sobre dos
enzimas: celulasa y laccasa.
Por tanto, se ha hecho el estudio bibliográfico de su estructura y
propiedades, para la parte experimental se ha hecho el estudio de su actividad,
realizando los experimentos con los criterios antes mencionados en los objetivos
secundarios.
8
Estos enzimas estudiados por mi son utilizados por el grupo de la Dra. CALAFELL
en aplicaciones concretas, y por tanto mi trabajo se puede considerar una parte
del estudio de las aplicaciones de estas enzimas en los proyectos de este grupo y
el análisis de sus aplicaciones.
9
Primera parte; estado del arte (estudio
bibliográfico):
Las enzimas
Introducción:
Las enzimas tienen una gran importancia en el metabolismo de las células. Para
reproducirse la célula transcribe las proteínas. Los genes que codifican las proteínas se
encuentran en el ARN mensajero (ARNm). El ARNm se desarrolla por la influencia de una
enzima: ARN polimerasa, sobre el ADN. Así se produce un ARNm idéntico a la secuencia
de ADN del gen. El ARNm no tiene doble hélice sino una forma secundaría compleja. Este
ARNm se transduce en proteínas en el ribosoma de las células. Las enzimas, al catalizar la
transcripción del código que contiene el ARNm y unir así los diferentes aminoácidos para
formar una proteína, se puede decir que son el inicio de la vida.
Las enzimas son proteínas constituidas por la repetición de 20 aminoácidos
diferentes. Las propiedades de una molécula enzimática dependerán en cierta medida de
la secuencia de aminoácidos de su cadena molecular. Cada enzima es única y cataliza una
determinada reacción. Sus propiedades de aumentar la velocidad de reacción se utilizan
en muchos ámbitos industriales. Al principio no se conocía ni su existencia ni su
estructura ni sus mecanismos de reacción, pero se sabía que algunas plantas y animales
o sus partes, tenían propiedades de acelerar procesos metabólicos y se aprovechaban
para producir substancias manufacturadas. También se aprovechaba las propiedades de
las enzimas microbianas en las fermentaciones controladas para la fabricación, por
ejemplo, de vino y queso.
Las propiedades de las enzimas dependen de su estructura (el sitio activo, su
forma, etc.) y le dan el modo específico de acción para catalizar las reacciones. Su
actividad también depende de factores exteriores (la temperatura, el pH, el substrato).
Hay mecanismos reguladores que aumentan o disminuyen la velocidad de las reacciones
(variaciones por acción de masas, variación de la actividad específica de la enzima por
activación o inhibición, etc.). Las enzimas que se van a estudiar en este proyecto son la
celulasa y la lacassa.
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I.
Generalidades:
1) Estructura:
a) Sitio activo:
Las enzimas catalizan las reacciones celulares. Para cumplir su función requieren
conservar su estructura nativa en la que se destaca una región formada por un número
reducido de residuos aminoacidicos que poseen afinidad por los compuestos que
intervienen en la reacción. Este lugar se llama “sitio activo”. Ese centro activo se llama
también la apoenzima. La apoenzima es la enzima propiamente dicha, de naturaleza
proteica formada por cadenas de polipéptidos, con peso moléculas elevado, no dializable
y termolábil.
Algunas enzimas tienen una especificidad prácticamente absoluta para un
determinado substrato y no se acoplan ni siquiera con substratos muy parecidos. Por
ejemplo, la enzima aspartasa cataliza la adición reversible de amoniaco al doble enlace
del acido fumárico, y a ningún otro acido no saturado. La aspartasa también presenta una
rígida estereoespecificidad y regioespecificidad, por eso no desamina el D-aspartato ni
adiciona amoniaco al malato, que es el isómero geométrico-cis del fumarato. Otro
ejemplo de especificad absoluta es el de la maltasa, que solo hidroliza al azúcar maltosa.
En el otro extremo están las enzimas que tienen une especificidad relativamente amplia
y actúan sobre muchos substratos que presentan características comunes. Por ejemplo,
la fosfatasa del riñón que cataliza la hidrólisis de muchos ésteres diferentes del acido
fosfórico, pero a velocidades variables. Otro ejemplo lo constituyen las lipasas, que
pueden romper la unión éster (hidrolizan igual etilbutirato que un triglicérido).
Del estudio de especificidad de las enzimas por el substrato surgió la idea de que
existe una relación complementaria, tipo llave-cerradura, entre la enzima y el substrato,
denominada sitio activo o sitio catalítico, en el que se une la molécula del substrato con
la enzima para poder realizar la reacción catalítica.
Dos características estructurales determinan la especificidad de una enzima por
su substrato: en primer lugar, el substrato debe poseer el grupo químico específico o
enlace, que debe ser catalizado por la enzima, y además el substrato debe tener
habitualmente algún otro grupo funcional, un grupo de unión donde se une a la enzima y
se ubica en posición de modo que, el enlace susceptible se disponga apropiadamente en
relación al sitio activo de la enzima, para que tenga lugar la reacción.
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Muchas apoenzimas tanto si están constituidas por una única cadena polipeptídica
plegada o por varias unidades, requieren de otras moléculas no proteicas para funcionar.
Esas moléculas (cofactores) pueden ser iones inorgánicos que se unen temporalmente a
las enzimas. Por ejemplo el hierro ([Fe ] o [Fe ]) o el cobre ([Cu+] o [Cu ]) que durante
3+
2+
2+
la reacción catalizada, provocan las oxidaciones y las reducciones. Por ejemplo el cinc
2+
([Zn ]) que ayuda a unir el NAD a la enzima. También pueden ser coenzimas, pequeñas
moléculas orgánicas que interaccionan débilmente con la enzima y el substrato durante la
catálisis. Muchos de estos coenzimas deben ser incorporados con la dieta. Las coenzimas
reaccionan con las enzimas de igual modo que el substrato En la mayoría de los casos son
vitaminas cómo la biotina (ayuda a transferir un grupo –COO-) o la coenzima A
(transporta un grupo –CH2-CH3-) o como el NAD y el FAD que transportan electrones.
Cuando estas moléculas están unidas permanentemente a la enzima y ayudan a la
reacción de catálisis se llaman grupos prostéticos. Por ejemplos, el grupo hemo que
transfiere O2 y electrones (contiene el cofactor hierro) y la flavina que transfiere
también electrones
b) Estructura de las enzimas:
La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales
denominados:
Estructura primaria,
Estructura secundaria,
Estructura terciaria,
Estructura cuaternaria.
Cada una de estas estructuras informa de la disposición de la anterior en el
espacio.
La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la proteína. Nos indica
qué aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que dichos aminoácidos
se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que
ésta adopte.
La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el
espacio. Los aminoácidos, a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de las
proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición
espacial estable. Existen dos tipos principales de estructura secundaria: la configuración
en alfa-hélice y en láminas beta.
La configuración en alfa-hélice se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la
estructura primaria. Se debe a la formación de puentes de hidrógeno entre el -C=O- de
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un aminoácido y el –NH- del cuarto aminoácido que le sigue en la cadena primaria. La
configuración en laminas beta puede ser en laminas beta antiparalelas o laminas beta
paralelas, según se formen los puentes de hidrogeno entre tramos de estructura
primaria con terminales carboxilo-amina o carboxilo-carboxilo
La estructura terciaria informa sobre la disposición de la estructura secundaria
de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular. Esta
conformación globular facilita la solubilidad en agua y así poder realizar funciones de
transporte, enzimáticas, hormonales, etc.
Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre
los diferentes aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces:
-puentes disulfuro entre aminoácidos que tiene azufre;
-puentes de hidrógeno;
-interacciones electrostáticas;
-interacciones hidrófobas.
Esta configuración proporciona la estructura tridimensional de las proteínas. Podemos
observar la estructura terciara de una enzima, la laccasa, en la figura 1. Notamos la
presencia de alfa-hélices y laminas beta. Vemos también los cuatros átomos de cobre en
marón (el sitio activo).
Figura 1: estructura tercera de la
laccase
Los cuatros átomos de cobre
Fuente: htp://www.brendaenzymes.org/
Code PBDsum: 1kya
La estructura cuaternaria la forma la unión, mediante enlaces débiles (no
covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un
complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptidicas recibe el nombre de
subunidad.
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c) La clasificación:
Las enzimas se clasifican por un sistema numérico de cuatro dígitos. Este sistema
numérico contiene una referencia al susbtrato, al tipo de reacción que cataliza, al
mecanismo y a la enzima en concreto. La clasificación sistemática de una enzima se
realiza según el Enzymatic Code (E.C.). [http://www.brenda-enzymes.org/]
Tipo de sustrato sobre el que actúa
Tipo de reacción que cataliza
1. 2. 3. 4.
Identfcación de la enzima
Tipo de mecanismo de la reacción
Según el tipo de reacción que catalizan (primer dígito del código numérico EC), las
enzimas pueden pertenecer a seis grupos:
-1) Oxidoreducatasas: catalizan reacciones Red-Ox. Se las llama también
deshidrogenasas. Transfieren iones H+ y electrones (están asociadas a coenzimas redox).
Las enzimas pueden ser peroxidasas, reductasas, oxidasas, oxigenasas, hidrogenasas y
deshidrogenasas. Todas ellas catalizan este mismo tipo de reacción:
-
A + B ―› A + B
-
-2) Tansferasas: catalizan reacciones donde se transfieren grupos funcionales de un
compuesto a otro. Las quinasas representan un grupo especializado que transfiere
grupos fosfato. Tipo de reacciones:
A-X + B ―› A + B-X
donde A es un donante (como una coenzima) y B un aceptor.
-3) Hidrolasas: catalizan la rotura de un enlace, adicionando una molécula de agua:
R-R’ ―› R-OH + R’H
-4) Lyasas: catalizan la rotura de enlaces por mecanismo distintos a la hidrólisis o la
oxidación:
A―› B+C
Las decarboxilasas y aldolasan son ejemplos de lyasas.
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-5) Isomerasas: catalizan reacciones donde hay cambios en el seno de la molécula
(reordenación de grupos funcionales y conversión de la molécula en un isómero).
A―›B
(donde B es un isómero de A).
-6) Ligases: catalizan la unión de moléculas utilizando energía proveniente del ATP.
También se llaman sintetesas. Catalizan la unión de dos moléculas por formación de
nuevos enlaces: -C-C-, -C-S-, -C-O- y -C-N[DR. Mario Sapag-Hagar y de Hermann Schmidt-Hebbel Biblioteca digital de la
universidad de Chile. Parte II: Generalidades sobre enzimas]
2) Mecanismo de acción enzimática:
Cada reacción necesita una energía adicional (energía de activación) para
iniciarse. Una vez iniciada la reacción, esta se realiza espontáneamente. La energía
requerida es la anergia de activación. Una enzima actúa de forma que se une a los
reactivos para reducir la energía de activación.
El reconocimiento enzima-sustrato según el modelo de FISHER con su imagen de
la “llave y la cerradura” (1894) plantea la complexidad estructural entre el sustrato
transformado y una cavidad de la enzima llamada “sitio activo”. El sustrato está
“atrapado” en una posición que está a favor de la estabilización de ciertas cadenas a
través de ciertos residuos enzimáticos.
La enzima y el sustrato, unificados por las interacciones fuertes, constituyen el
intermediario de una reacción inestable, que permite la disminución de la barrera de la
energía de activación. La velocidad de reacción es inversamente proporcional a esta
energía de activación “Ea” o barrera de potencial. En este tipo de reacción, el estudio del
mecanismo catalítico supone el conocimiento de los residuos del sitio de enlace y del
sitio activo de la enzima, la naturaleza y el tipo de conexiones de los intermediaros, de
los intercambios de protón, electrón y residuos funcionales.
Sea cual sea el tipo de reacción catalítica, un ciclo catalítico respeta siempre
cuatro etapas:
-La difusión de los reactivos en el medio;
-El reconocimiento especifico enzima-sustrato;
-La reacción por los mecanismos implicados;
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-La expulsión de los productos que liberan la enzima y que da su funcionalidad para otro
ciclo catalítico.
Figura 2:
La figura 2 nos muestra la conexión del substrato en el centro activo de la enzima.
A diferencia de otros catalizadores, las enzimas tienen en su estructura, el sitio
activo que les permite unir y orientar las moléculas eficientemente. Una enzima es capaz
de catalizar la reacción de alrededor de mil moléculas de substratos en producto por
segundo.
3) La influencia de los factores:
Las enzimas son catalizadores biológicos que tienen una configuración
determinada por las fuerzas estabilizadoras de la proteína. Cualquier factor externo que
altere esas fuerzas va a modifica la actividad de la misma.
a) La temperatura:
Como en todas las reacciones químicas, la velocidad de las reacciones enzimáticas
depende de la temperatura y es óptima en el punto donde las enzimas son estables y
mantienen su actividad más elevada. Según ARRHENIUS:
Kcat = C * exp-Ea/RT
C: constante
R: constante de los gases ideales
T: temperatura (Kelvin)
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Ea: energía de activación de la reacción (según ARRHENIUS)
La velocidad de la mayoría de las reacciones enzimáticas se dobla cuando la
temperatura aumenta en 10ºC sin sobre pasar su temperatura óptima (Myron I. Bender,
Lewis J. Brulacher, 1977).
La temperatura óptima de una reacción enzimática se deduce del estudio de la
desnaturalización o la desactivación de la proteína enzimática por el calor.
Un calor extremo provoca en primer lugar una rotura de los puentes de hidrogeno, las
hélices y las láminas se deforman. Después, si la temperatura sigue en aumento, existen
roturas de ciertos enlaces covalentes. Cuando la estructura espacial de la enzima ya no
está adaptada a su función, se dice que la enzima se ha desnaturalizado. La figura 3
muestra a la izquierda la forma activa y a la derecha la forma desnaturalizada.
Figura: 3
Fuente: http://www.brenda-enzymes.org
Podemos observar que las hélices de la estructura desnaturalizada son abiertas. Por eso,
los aminoácidos están desplegados y el substrato no reacciona con ella.
b) El pH:
La mayoría de las enzimas muestran un pH óptimo característico donde su
actividad esta al máxima: por encima o por debajo de este pH, la actividad de la enzima
disminuye.
La relación entre el pH y la actividad de una enzima seleccionada depende del
comportamiento acido-básico de la enzima y de su substrato.
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Los valores de pH y temperatura óptimos varían según la enzima pero en todos los casos
permiten que la estructura del sitio activo sea la más adecuada para la catálisis.
El pH tiene una influencia sobre la ionización del substrato (o del producto), la
estructura de la proteína (y por tanto sobre la estabilización enzimática), el complejo
substrato-enzima y la actividad catalítica de la enzima. En función del pH de la disolución, la
actividad pasa por un máximo. Los residuos de aminoácidos en el sitio activo de la enzima se
pueden ionizar e interferir en la catálisis.
c) El substrato:
Son las substancias que son transformadas específicamente por las enzimas. Se usan
para medir la actividad catalítica de las enzimas y también para determinar el carácter
específico de una acción enzimática.
Para que una substancia sea apropiada como substrato de una enzima debe reunir los
siguientes requisitos:
En primer lugar es necesario que experimente una transformación bien definida por la
acción catalítica de la enzima. Por ejemplo, la formación estequiométrica de un producto
coloreado. Además hace falta que sea específico para la enzima estudiada o para un grupo muy
restringido de enzimas. Por ejemplo, el almidón para las alfa- y beta- amilasas, que da una
modificación definida detectable por absorción al ultravioleta.
También es necesario que, no sufra una descomposición espontánea o produzca otras
reacciones no catalizadas por la enzima, como lo confirma la liberación de ácido o de alcalino
que sea medible por valoración (la liberación de ácido carboxílico en la pectina por la pectinoestearasa).
Finalmente, la transformación del substrato que es catalizada por la enzima, deber ser
fácilmente medible. Esta ha de tener alguna propiedad detectable, es decir un acoplamiento
con otras reacciones químicas o enzimáticas, llamadas reacciones indicadoras (cómo por
ejemplo, la reacción química de fosfatasa en leche, del fenol liberado con la dibromoquinonclorimida parar dar indo-fenol de color azul, etc.).
Los substratos enzimáticos pueden tener dos orígenes. Por una parte pueden ser los
naturales de las respectivas enzimas, como el almidón para amilasas o el etanol para la alcohol
dehidrogenasa, o también pueden ser derivados de los substratos naturales. Es decir,
obtenidos por síntesis con una estructura química tal que pueden ser reconocidos y
transformados por la respectiva enzima con formación de productos, ya sea coloreados o
fácilmente medibles por otro medios (las 4-nitroanilidas de aminoácidos como substrato de
proteasas y los 4-nitrofenil derivados de azucares, como substratos para glucosidasas, son
dos ejemplos).
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4)
Mecanismo reguladores:
a)
Variaciones por acción de masas:
Las variaciones por acción de masas es el mecanismo regulador más primitivo y
mediante él la velocidad de la reacción puede variarse, alterando la concentración del
substrato, del producto (si la reacción es lo suficientemente reversible como para que la
concentración del producto afecte significativamente la reacción opuesta) o de cualquiera de
los cofactores que intervienen estequiométricamente en la reacción.
b)
Variación por activación o inhibición:
Las enzimas están sujetas a la regulación de su capacidad catalítica, ya sea en dirección
positiva, negativa, o en ambas, mediante moléculas pequeñas que han sido denominadas
efectores o moduladores. Este tipo de substancias incluye substratos y productos
metabólicos de rutas metabólicas aparentemente no relacionadas.
En la mayoría de los sistemas multienzimáticos donde intervienen secuencialmente
varias enzimas y el producto de una es el substrato de la siguiente. La primera enzima de la
secuencia, funciona como reguladora de la velocidad de todo el sistema y se denomina “enzima
reguladora o enzima alostérica”. Habitualmente esta enzima es inhibida por el producto final
de la secuencia, de tal modo que cuando se produce acumulación del producto final sobre
determinada concentración crítica, éste inhibe a la enzima reguladora, interrumpiendo o
cerrando así ese segmento del metabolismo.
Este tipo de inhibición se conoce como inhibición por producto final o retroinhibición
(inhibición "feedback"). Las enzimas reguladoras o alostéricas están formadas por dos a más
subunidades que tienen sitios de unión no sólo para su substrato normal, sino también para el
metabolito regulador, el cual se denomina efector o modulador alostérico y es altamente
especifico. Cuando el sitio alostérico está desocupado la enzima funciona con su velocidad
catalítica normal; en cambio, si está ocupado por el metabolito regulador, la enzima sufre una
modificación en su conformación a una forma menos activa o más activa, dependiendo de sí el
modulador es inhibidor o estimulador.
La inhibición de la actividad enzimática por moléculas especificas y por iones es
importante porque sirve como mecanismo de control mayoritario en los sistemas biológicos.
También muchos fármacos y agentes tóxicos actúan de este modo. Es más, la inhibición
enzimática puede suministrar una idea acerca del mecanismo de la acción enzimática.
19
La inhibición enzimática puede ser reversible o irreversible. En la inhibición
irreversible el inhibidor queda covalentemente unido a la enzima o ligado tan fuertemente que
su disociación es lenta; produciendo una modificación permanente de algún grupo funcional del
sitio activo de la enzima. Ejemplos de los inhibidores irreversibles son las sales de metales
pesados y el yodoacetato que se fijan en los grupos sulfhidrílicos de la enzima y, por otra
parte, el di-isopropil-fluorofosfato (uno de los más potentes gases tóxicos del sistema
nervioso) que inhibe a la enzima acetilcolinoesterasa al unirse a una serina fundamental del
sitio activo, bloqueándolo.
La inhibición reversible, en cambio, se caracteriza por un rápido equilibrio entre el
inhibidor y la enzima. Ejemplos lo constituyen la inhibición competitiva y la no competitiva. Los
inhibidores competitivos son aquellos cuya acción puede ser revertida aumentando la
concentración de substrato. Habitualmente forman un complejo con él uniéndose al enzima por
el sitio activo. Un ejemplo es el malonato que se asemeja al succinato y por ello inhibe la
succinato-deshidrogenase.
El inhibidor no competitivo no se une en el sitio del substrato, sino en otro grupo de la
enzima, que es esencial para su función. La inhibición no competitiva no puede ser revertida
por aumento de la concentración de substrato. Un ejemplo lo constituye la inhibición por el
cianuro de algunas enzimas que contienen Fe, el cual se combina reversiblemente con el
cianuro, dando una forma inactiva.
c)
Variación de la concentración de la enzima:
Hoy se reconoce que uno de los principales mecanismos reguladores se basa en la
alteración de la cantidad absoluta de enzima en la célula. La concentración de la enzima es la
resultante entre las velocidades de su síntesis y de su degradación. Se denomina inducción al
aumento de la concentración de la enzima por aumento en su síntesis y represión a su
disminución por disminuir la síntesis. La síntesis de proteínas, y por lo tanto de las enzimas,
está regulada principalmente a nivel de la transcripción del DNA para dar RNA mensajero. La
transcripción de un gen o de un grupo coordinado de genes (lo que se llama un operón) puede
reprimirse al unirse una substancia represora a un gen operador que forma parte del operón.
Se puede bloquear la represión (o sea, producir inducción) por la presencia de ciertos
metabolitos reguladores (moléculas inductoras), que puede ser un substrato de la enzima
codificada por el gen reprimido. Este tipo de mecanismos reguladores que implica alteración
en la velocidad de síntesis de una enzima conlleva una apreciable cantidad de tiempo (desde
una hora hasta varios días).
II.
Celulasa:
20
Las celulasas son enzimas complejas, es decir que presentan diversas estructuras
que actúan sobre los mismos susbtratos. Producidas principalmente por hongos,
bacterias y protozoos, existen organismo que las producen como plantas y el estómago
de los rumiantes. El numero E.C. de este grupo de enzima es 3. 2. 1. 4., lo que indica que
esta familia de enzimas son hidrolasas, es decir que catalizan la hidrólisis y la
degradación de la celulosa.
1)
Definición:
Como toda enzima las celulasas se clasificadan en función de las reacciones que
catalizan. Hasta ahora se han descrito 85 familias a partir de las regiones de su
secuencia que se encuentran mejor conservadas. Las celulasas reconocen e hidrolizan el
enlace β (1-4) de la celulosa descomponiéndola en pequeñas moléculas de glucosa. La
configuración β permite a la celulosa formar puentes de hidrogeno y por tanto crear
cadenas largas, lineales y tridimensionales,
se conocen como micro fibrillas. Estos
enlaces dan a la celulosa las características de insolubilidad, rigidez y resistencia al
ataque enzimático. Existen tres tipos de celulasas no agregativas según el tipo de
reacción que catalizan, como lo indica el diagrama siguiente:
Endoglucanasas
Sistema no agregativo
Exoglucanasas
Celulobiosas
Degradación de la celulosa
Celulosoma
Sistema agregativo
Por otro lado también están los celulosomas: Investigaciones sobre bacterias como el
Cellulomonos
thermocelluim
y
C.
cellulovorans
revelan
la
formación
de
complejos
multienzimaticos de alto peso molecular (celluosomas), los cuales reconocen las fibras de
celulosa desde la superficie de la célula. Un celulosoma se compone de al menos 14 proteinas
distintas incluyendo varias celulasas, xilanasas y al menos una β-glucosidasa. Estos compuestos
están unidos por una proteína sin actividad enzimática que se conoce como proteína de unión a
21
celulosa (CbpA: Cellulose binging protein A). La proteína de unión es necesaria para romper las
estructuras amorfas de celulosa pero no puede actuar en las formas cristalinas del polímero.
A
B
Figura 4: moléculas de celobiosa (A) y glucosa (B)
Fuente: http://www.ciencia.cl/CienciaAlDia/volumen3/figura3.gif
Las enzimas que pertenecen a la familia de hidrolasas glicosídicas presentan distintas
actividades dentro de las que se destacan: endoglucanasa, beta-mananasa, exo-1,3-glucanasa,
endo-1,6-glucanasa, xilanasa y endoglicoceramidasa.
Dentro de estas estructuras proteicas encontramos alfa-hélices con forma en espiral así
como también las estructuras-beta que se componen de laminas planas. Algunas de las
proteínas pueden no presentar alfa-hélices mientras que otras tienen un gran número.
2)
Mecanismo de reacción:
22
La hidrolisis de la celulosa a través de celulasas requiere de un sistema
multienzimatico, es decir un complejo de celulasas. Sin embargo también existen los sistemas
no agregativos que se dividen en tres grupos según la reacción que catalizan:
1. Exoglucanasas (o exo-β-1,4-D-glucanasas): también llamadas cellobiohidrolasas, son
enzymas que cortan las cadenasde 1,4 β-D-glucano a partir del extremo no reductor de
la molécula de celulosa y de las celodextrinas. Producen tetrasacaridos o disacáridos de
glucosa o celobiosa. La figura 4 presenta las moléculas de celobiosa (A) y de glucosa
(B) y la figura 5 muestra la hidrólisis de maltosa.
2. Endoglucanasas (o endo- β-1,4-D-glucanasa): Descomponen los enlaces internos β (14), alteran la estructura cristalina de la celulosa y producen cadenas de oligosacáridos
de diferentes longitudes, los cuales mantienen la configuración beta de la celulosa. La
acción de estas celulasas sobre las regiones amorfas de las moléculas de celulosa
disminuye la polimerización y crea la formación de nuevos extremos que sirven de
substrato para posteriores reacciones.
Algunos productos como la celobiosa inhiben las exoglucanasas y endoglucanasas, lo que
provoca la disminución de actividad. En cuanto las zonas amorfas de la celulosa son
degradadas, la hidrólizacion comienza por la región cristalina. Son las endoglucanasas y
los exoglucanasas que provocan la hidrólisis de las celulasas.
3. Beta-Glucosidasas: Cortan la celobiosa y otros oligosacáridos para producir glucosa.
Las glucanasas son inhibidas por la celobiosa. Por tanto, la hidrólisis de la celulosa en glucosa
mediante los β (1-4) glucidasas, limitan la degradación de la celulosa.
Molécula de oxigeno
Link glucósido
Figura5: hidrólisis del maltosa
23
Fuente: http://i654.photobucket.com/albums/uu263/Okihita/5-pembentukandisakarida.jpg
El disacárido maltosa se descompone al agregarle agua en dos moléculas de
glucosa. Esto forma parte del proceso llamado catabolismo y la reacción específica se le
conoce con el nombre de hidrólisis.
III.
Las laccasas:
Las Laccasas, (benzenediol oxydoreductasas) EC: 1.10.3.2 son enzimas multi-cobre que
pertenecen a los grupos de oxidasas azules. Son enzimas muy estables. Las Laccasas catalizan
la oxidación de multitud de compuestos fenólicos, también diaminos y aminas aromáticas,
utilizando oxigeno como transportador de electrones. Solamente la laccase puede oxidar la
syringaldazine [4-hydroxy-3,5-dimethoxy benzaldehyde azine]. Se considera el substrato
típico de esta enzima. También otros compuestos orgánicos con grupos hidroxilo, ácido, o
amino pueden actuar como substratos. Esto es otro factor favorable de las laccasas.
1)
El sitio activo:
La laccasa tiene cuatro átomos de cobre. Están identificados por resonancia
paramagnética de electrón (EPR: Electron Paramagnetic Resonance) que los identifica como:
Tipo 1 (T1), Tipo 2 (T2) y Tipo 3 (T3) [5]. Los cuatros átomos están organizados como sigue:
un átomo aislado que provoca la reducción de los fenoles y un grupo de tres átomos de cobre,
uno de tipo 2 y dos de tipo 3, son los causantes de la activación del oxigeno. La organización
de los cuatros átomos está representada en la figura 6.
24
a
b
c
d
Figura 6: Sitios activos de la laccasa.
La espectroscopia combinada con cristalografía proporciona la descripción detallada
sobre el sitio activo de la laccasa. El análisis por Dicroísmo Magnético Circular (MCD:
Magnetic Circular Dichrosm) y la espectroscopia de absorción de rayos X muestra que el tipo
2 y 3 funcionan como un grupo de cobre trinuclear [6].
El cobre tipo 2 (fig 6 c) posee tres coordinaciones (es un 3-coordinador): 2 con la
histidine y otro con el agua. El átomo de tipo 3 es un 4-coordinador: tres ligando con la histine
y uno con agua (fig 6 b). El cobre T2 provoca la reducción del oxigeno.
El sito T2 es necesario para la reducción del oxigeno. La reducción del oxígeno no se
produce en el cobre T1. Así el sitio trinuclear T2/3 represente el sitio activo para la
formación de enlace y reducción del oxigeno. O sea, el cobre T1 no es necesario para
reaccionar con el oxigeno [8].
2)
Mecanismo de la reacción:
25
Las laccasas oxidan los substratos por sustracción de un electrón y formación de
radicales libres que pueden polimerizar [8]. Las laccasas pueden reducir el oxigeno molecular
por transferencia de electrones y posteriormente formar agua.
El cobre T1 es el principal aceptor de electrones. Al menos uno de los dos electrones
necesarios para la reducción de un átomo de oxigeno provienen de este sitio [9]. La velocidad
de reacción de T1 es el paso limitante de la velocidad de la reacción global. El cobre T2 es
necesario para la oxidación aeróbica del sitio reducido T3, esto permite al sitio T3 actuar
como un aceptor de dos electrones [10]. El mecanismo de catálisis de la laccasa sugiere que el
cobre T2 estabiliza un intermediario en la reducción del oxígeno a agua, esto indica que el
cobre de tipo2 forma parte del sitio de reducción del oxígeno en la enzima.
Se ha visto que la inhibición de la enzima a pH alto es debido a la formación del
complejo cobre T2-OH-. Este complejo no permite la reducción del sitio T3 hasta que el grupo
OH- se haya disociado o se convierta en agua. A pH bajos, una molécula de agua formada en el
sitio reductor de la enzima parece que se re-oxida para uniese al sitio Cu T2. En las figuras 7
y 8 se pueden ver estos mecanismos de la laccasa.
Figura7: Polimerización de los grupos fenólicos.
26
Figura 8: reacción de oxidation de la laccase
IV.
Aplicaciones:
Las enzimas oxidantes tienen muchas aplicaciones de utilidad [11]. Las laccasas pueden
degradar la lignina (para la producción del papel), pigmentos (utilizada el industria del textil),
parte de la contaminación de las aguas residuales, se adiciona también a detergentes, etc. Por
otro lado, la celulasa se utiliza en los procesos alimentarios, las energías renovables, la
industria cosmética y farmacéutica, para controlar el crecimiento de los microorganismos,
etc.
A continuación se verán las principales aplicaciones de estas enzimas, relacionadas con
el papel, la química alimentara, las aguas residuales y la transformación en biocombustible.
27
1)
Degradación de la lignina:
a)
Explicaciones:
Los materiales lignocelulósicos son los constituyentes principales de la pared de las células
vegetales. La lignina forma una matriz amorfa en la pared secundaria de la fibra celulósica que
la protege de la degradación microbiana y de la hidrólisis enzimática en general. En la pared
vegetal existen enlaces interpoliméricos: enlaces éter entre grupos OH (de los polisacáridos)
y fenólicos (de la lignina), y puentes formados por los ácidos p-hidroxicinámicos.
Figura 9: Lignina, celulosa y hemicelulosa en la madera [12].
Fuente:José C. del Rio Valorización de productos agroforestales para la fabricación de
pasta de papel: Caracterización química y modificación estructural de sus constituyentes
en los procesos de cocción y blanqueo. IRNAS-CSIC, Sevilla
La figura 10 nos muestra la complicada estructura de la lignina.
La laccasa degrada la lignina por oxidación de los compuestos cíclicos.
28
Figura 10: Estructura de la lignina.
Fuente: K. Haideer, S. Lim and W. Flaig. Holzforschung 18. 81-88 (1964). Reprinted by permission
of Walter de Gruyter & Co
Podemos observar la presencia de varios grupos fenólicos en formula de la lignina.
Figura 11: Esquema de reacción generalizado para monómeros de lignina.
Fuente: adaptado de Barth 2000; Gónzalez, 2004.
29
La figura 11 presenta la oxidación de la lignina y sus derivados fenólicos sometidos a
conversión hidrotérmica en ausencia de oxigeno.
La laccase es la enzima más significativa en la degradación de la lignina. Rompe las
conexiones en el seno de las estructuras fibrosas para obtener los productos intermedios de
la fabricación del papel [21]
b)
Dominios de utilización:
La degradación de la lignina se encuentra en varias aplicaciones, pero la aplicación
principal es en la fabricación del papel. La producción de la pulpa de papel necesita la
separación y la degradación de la lignina de la madera. La optimización de los rendimientos se
hace con los tratamientos preliminares de la madera con enzimas. Este paso ayuda a romper
las diferentes conexiones en el seno de la estructura fibrosa y mejora el proceso de la deslignificación. Al contrario de otros compuestos oxidantes (MgO2, H2O2) la laccase es el más
estable y el mas fácil de utilizar. El H2O2 se descompone fácilmente con muchas substancias
como los metales de transición, etc. El MgO2 es un poderoso reductor pero no es selectivo y
es irritante.
2)
Degradación de los hidrocarburos aromáticos poli cíclicos:
a)
Definición y explicación:
Los pigmentos son compuestos que se dividen en dos familias. La familia de los
pigmentos minerales con conexiones metálicas (cobalto, azufre, oxido de hierro), y la familia
de los pigmentos orgánicos, que están constituidos por cadenas carbonadas (perilenos,
ftalocianinas, azoicos).
La familia de los hidrocarburos aromáticos poli cíclicos (HAP) se compone solamente de
carbono e hidrógeno, cuya estructura molecular está formada al menos por dos ciclos
aromáticos condensados. La pirolisis con temperaturas por encima de 500°C de estos
productos provoca la formación de radicales libres (pequeñas moléculas inestables que
degradan todas las partículas que encuentran).
Se almacenan en las grasas de los organismos, pueden reaccionar con las moléculas
biológicas, por ejemplo el ARN y el ADN, provocando su destrucción o alteración.
30
La figura siguiente muestra la estructura de los HAP. Lo que llama la atención es la
repetición del compuesto “fenolico”. Ahora bien, la laccase va a reaccionar con estos
compuestos cómo su substrato. El producto que se forma ya no puede actuar sobre las
moleculas de nuestro organismo.
3.
Utilizacionb) A
Figura 12: presentación de los diferentes Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)
Fuente: http//:www.personal.telefonica.terre.es/web/catastrophe/quim/nhap.html
31
b)
Aplicaciones:
Las propiedades oxidantes de las laccasas se utilizan en la industria textil, como en la
decoloración de los pantalones tejanos “jeans” donde tradicionalmente se había utilizado la
piedra pómez. Hoy se sabe que una pequeña cantidad de enzima reemplaza varios kilogramos
de piedra y por eso este método causa menos daños a las telas y menos degradación de las
lavadoras. Se utilizan también por su capacidad de degradar los pigmentos.
Actualmente se estudian las laccasas por su capacidad de inhibir la contaminación de
las aguas. En el caso de aguas residuales, se utilizan sobre los contaminantes cómo el
chlorofenol y los nitro-aromáticos. Las aguas residuales contienen materiales biológicos
fácilmente degradables (Daigger and Grady 1995) [13], mientras que las aguas subterráneas e
industriales contienen compuestos orgánicos. El tratamiento de estas es complicado y
requiere estudios sobre sus estructuras.
La degradación de contaminantes en aguas
residuales es un área muy prometedora de la aplicación de las laccasas.
Igualmente la industria alimentaria emplea enzimas. Las celulasas se utilizan en el
procesamiento de bebidas, en el ensayo del acido ascórbico, en la fabricación de azúcar de
remolacha, gelatinas, pectina, bicarbonato y en biosensores.
3)
Degradación de azucares:
Hoy se buscan alternativas a la utilización de combustibles fósiles que tiene un gran
impacto en el medio ambiente. Por eso los biocombustibles procedentes de biomasa, como el
bioetanol, parecen una alternativa prometedora.
Provienen de la fermentación de los azucares de los cereales como: el maíz, el trigo o de
simientes oleaginosas como la soja. La lignocelulosa es la fuente mas abundancia de carbono y
está constituida por un 40% a un 50% de celulosa, de un 25% a un 50% de hemicelulosa y de
un 10% a un 40% de lignina, dependiendo de la planta o del tipo de madera.
Los microorganismos producen enzimas con las que pueden convertir la celulosa en
energía. Pero antes la celulosa debe ser hidrolizada en pequeños carbohidratos por acción de
enzimas extracelulares que la hacen más accesible a otras enzimas. (Stephanopoulos 2007)
[14]
32
H+
O
D-glucosa
O
O
NADH+ H+ NAD
CO2
H
H
OH
H
CH3
CH3
Piruvato
O
Acetaldehído
CH3
Etanol
Dibujo1: Degradación de la celulosa en alcohol.
Fuente: wikipédia
El dibujo 1 muestra el mecanismo de reacción de la degradación de glucosa en alcohol. El
primer paso es una glucolisis seguida de una decarboxilación del piruvato y finalmente la
reducción del acetaldehído a etanol.
La transformación del polímero en azucares simples (hexosas o pentosas), necesita un
tratamiento posterior para eliminar los residuos que no sirven a la fabricación del papel.
La conversión de la biomasa implica tres pasos:
- Obtención de la celulosa (extracción de la lignina);
- Hidrólisis de la celulosa que cataliza la celulasa;
- Fermentación de las pentosas y hexosas en alcohol.
(Lynd et al. 2005)[14].
Para completar la hidrólisis es necesaria la acción de un combinado enzimático. El problema de
la hidrolisis es que no existen
microorganismos capaces de hidrolizar directamente los
polisacáridos y de fermentar el azúcar deseado para la producción de etanol, butanol o acido
láctico.
El microorganismo debería romper la celulosa de forma eficaz, y para ello debería
poseer la familia de enzimas celulósicos, fermentar los azúcares a etanol y ser tolerante
al alcohol producido en el proceso de degradación de la celulosa.
Para ello se puede utilizar una co-cultura de levaduras Saccharomyces cerevisiae y
brettanomyces clauseii para estimular la sacarificación y la fermentación (Spindler et
al. 1989) [15].
→Figura13: modelo de
ataque de la celulasa sobre la
celulosa
Fuente: https://www.ornl.gov/info/ornlreview/v40_1_07/article10.shtml
33
Uno de los factores más costosos en la producción de etanol de celulosa es el
uso de enzimas y métodos mecánicos para fragmentar la celulosa.
Segunda parte:
Métodos Experimentales
I.
Ensayos de actividad de la celulasa:
Método colorimétrico [2]:
El método con el substrato anthrone es recomendado por DREYWOOD (1946). Este
protocolo es estudiado por MORRIS en 1948. El anthrone, según Morris, actúa sobre todas las
“-osas”. Por igual la glucosa y la fructosa dan la misma reacción coloreada. El anthrone tiene
color amarillo claro en una disolución de ácido sulfúrico concentrado y en disolución de glucosa
se vuelve de color azul. La figura 14 nos muestra la formula del anthrone.
Figura 14: Anthrone
Fuente: wikipedia para el dibujo de la anthrone
34
La técnica:
-preparar la solución de acido sulfúrico a 95%: poner 50 mL en 1 litro de agua distilada.
-pesar 1 gramo de anthrone y disolver en 500 mL de acido sulfúrico a 95%.
-5 mL de la solución a analizar son puestos en un tubo de vidrio de 25mm de diámetro, después
poner 10mL del reactivo sulfúrico (con el anthrone).
-agitar para homogeneizar y poner en un baño de agua durante 10min a 30°C.
-medir la absorbancia de la gamma glucosa a 580nm.
Método de difusión en gel:
La carboximetilcelulasa que hay en los extractos de fruta, rompe les cadenas de
celulosa en pequeñas moléculas de glucosa.
En una placa de petri, donde hemos puesto 0,5% de carboximetilcelulosa (CMC) y 1,7% de
agar, se practican dos pozos y se pone el mismo volumen de extracto de frutas y de agua
destilada (control). Se incuba durante 24 horas a temperatura de 30°C. Después se limpia
bien la placa de petri con agua destilada y se inunda con una solución de rojo Congo durante 15
minutos. Alrededor de los pocitos con extracto de fruta, hay una zona clara cuyo diámetro
nos da la medida de la actividad de la carboximetilcelulasa.
Método de reducción de viscosidad:
Esta técnica se basa en la acción de la celulasa del extracto de frutas, que corta la
longitud de las moléculas de celulosa en una pulpa viscosa de papel de baja viscosidad.
Poner suficiente pulpa de papel del 2% de consistencia, en tubos de ensayo y adicionar 2 o 5
cm3 de extracto de frutas. Mezclar cuidadamente. Después, poner el medio reaccionante en
una jeringuilla. Contabilizar el número de gotas por minuto que caen de la jeringuilla. Incubar
la mezcla en un baño maría a 30°C y verificar la viscosidad cada 30 minutos. Cuanto más
activa es la enzima, mas reducción de viscosidad hay.
Método de la Hydroxyethylcellulose
Preparación de los reactivos:
35
-Tampon: pesar 8,4g de acido citrico mono hidratado (C6H8O2, H2O). Ajustar el pH con
NaOH y diluirle en dos litros de agua destilada para una concentración de 0, 05M y un
pH de 4,8.
-Substrato : 1.0% HEC (Hydroxyethylcellulose, media viscosidad, Fluka AG pract.) en un
tampon citrato 0.05 M pH 4,8.
La HEC se disuelve usando un agitador magnético durante una hora, después se deja una
hora más para que se clarifique.
Método:
1. Adicionar 1,8mL de disolución de substrato a un tubo de 15mL;
2. Calentar a 50°C;
3. Adicionar 0,2mL de disolución de enzima en tampón citrato, mezclar;
4. Incubar a 50°C durante 10 minutos.
5. Adicionar 3,0mL de DNS, mezclar. Transferir a una gradilla
6. Hervir durante 5 minutos, todas las muestras a la vez: blanco de enzima,
estándar de glucosa y el cero. Después transferir a un baño frio.
7. Medir el color formado fuerte al cero a 540nm después corregir con el blanco de
la enzima.
Espectro cero:
1,8mL HEC
10min, 50°C
3,0mL DNS
0,2mL tampón citrato
Hervir 5min, enfriar y medir espectro a 540nm
Espectro blanco enzima:
1,8mL HEC
10min, 50°C
3,0mL DNS
0,2mL dilución de enzima
Hervir 5min, enfriar y medir espectro a 540nm
Estandar:
1,8mL HEC
10min, 50°C
3,0mL DNS
0,2mL estándar de glucosa
Hervir 5min, enfriar y medir espectro a 540nm
Disoluciones de glucosa (estándar)
Disolución madre de glucosa: glucosa anhidra de alta pureza 10-2 M (ejemplo: 0,18g de
glucosa en 100mL en tampón citrato)
Estándar 1: 1,0mL +
= 10,0μmol/mL (16,67nkat/mL*)
Estándar 2: 1,0mL + 1,0mL tampón = 5,0μmol/mL (8,33nkat/mL)
Estándar 3: 1,0mL + 2,0mL tampón = 3,33μmol/mL (5,56nkat/mL)
36
Estándar 4: 1,0mL + 3,0mL tampón = 2,5μmol/mL (4,17nkat/mL)
*Una concentración de glucosa de 10,0μmol/mL es equivalente a 16,67nkat/mL en la
reacción enzimática:
10,0μmol/mL*1/600*1000=16,67nmol.s-1.mL-1 (nkat.mL-1)
Calculo de las unidades de actividad:
Construir una recta estándar de glucosa poniendo absorbancias a 540nm en ordenadas
frente a concentración de glucosa en forma de nkat/mL en abscisas.
Usar ese estándar de glucosa para leer directamente la actividad enzimática en
nkat/mL.
En la parte experimental se ha escogido el método de la Hydroxyethylcellulose para ensayar la
actividad de la celulasa, por ser un método preciso y bien descrito. Los otros métodos
encontrados en la literatura o eran cualitativos o más complicados.
Ensayo de actividad de la laccase:
II.
Según el libro “Principes de l’analyse enzymatique” de HANS ULRICH BERGMEYER,
antes de las manipulaciones, hace falta determinar la concentración óptima del substrato
para los ensayos. Esta depende de algunas consideraciones metodológicas (la absorbancia, la
solubilidad del substrato, etc.) y de las propiedades de la enzima (inhibición por los substratos
o productos de la hidrólisis, etc.) [16].
Los substratos de la laccase son varios. Todos los compuestos que esta enzima cataliza,
contienen al menos un grupo fenol, diamino o amina aromática [17]. La syringaldazine [4hydroxy-3,5-dimethoxy benzaldehyde azine] se considera el mejor substrato para el ensayo
de este enzima.
Método de la syringaldazine
Reactivos:
A. Tampón fosfato de potasio 100mM, pH 6,5 a 30°C.
Se preparan 100mL en agua desionizada usando fosfato monobásico anhidro de
Sigma. Se ajusta a pH 6,5 a 30°C con hidróxido potásico 1M.
B. Solucion de syrigaldazina 0,216Mm.
Se preparan 3mL en metanol absoluto usando syringaldazina de Sigma.
C. Solución de laccasa
37
Inmediatamente antes de usarse se prepara una disolución de laccasa de 25 a 50
U/mL en agua destilada fría.
Procedimiento:
Se pipetean los siguientes reactivos en una cubeta de espectrofotómetro
Agua destilada
Reactivo A
Reactivo C
Test
2,2
0,5
Blanco
0,5
2,2
-
Se equilibra a 30°C el espectrofotómetro termostatizado a una longitud de onda
de 530nm y se añade:
Reactivo B
0,3
0,3
Se homogeneíza y se lee la absorbancia a 530nm durante unos 10 minutos.
Se obtiene ∆A530 /minuto usando la velocidad lineal para el test y para el blanco.
Calculos:
Se utiliza la siguente ecuación para determinar la actividad de la enzima:
(∆A530nm/min Test – r A530nm/min Blank)* (df)
Units/mL enzima =
(0,001)*(0,5)
-
df: factor de dilución;
-
0,001: el cambio en A530nm/minuto por una unidad de laccase a pH=6,5 a une
temperatura de 30°C en 3mL de reacción;
-
0,5: volumen de enzima utilizado en milímetro.
También otras substancias orgánicas que tienen grupos hidroxilo, acido, o aminos, pueden
actuar como substrato [18].
Los más famosos son ABTS [2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazothiazoline-6-sulphonic
acid)], 2,6 dimethoxyphenol y L-DOPA [3,4dihydroxyphenylalanine] [11]. En la figura 15 se
muestran las formulas de los diferentes substrato.
38
ABTS
Syringaldazine
2,6 dimethoxyphenol
L-DOPA
39
Guaiacol
o-dianisidine
Figura 15: Formulas de los diferentes substratos que la laccasa cataliza.
Fuente: wikipedia
Scholosser y colaboradores [11] utilizan estos substratos para ver la influencia del pH en la
actividad de la laccasa de Trametes versicolor cultivada con diferentes nutrientes.
Según estos autores el substrato que resulta más sensible en los ensayos de actividad
de la laccasa es el 2,6-dimethoxyphenol. Todos los substratos presentan mayor sensibilidad en
el ensayo de actividad de la laccasa a pH’s comprendidos entre 4,5 y 5 a excepción del ABTS
que presenta una mayor sensibilidad a la detección de la actividad de la laccasa a pH 3,5.
Según Li y colaboradores [20] el substrato que funciona mejor para analizar la
actividad de la laccasa es el ABTS frente a la o-dianisidina y el guiacol. Las formulas se
pueden ver en la figura 15.
La comparación de los protocolos de los ensayos de actividad se muestra en la tabla 1.
Tabla 1: resumen de los diferentes reactivos.
40
Substrato
Absorbencia
Buffer
Medio de cultivo
Otro reactivo
ABTS 1,5 mL
(0,5 mM)
420nm
1.5 mL acetato de
sodio buffer (1mM,
pH 5.0)
o-dianisidine 0,1mL
(1mM)
460nm
0,2mL citrate
(0,1mM)-fosfato
(0,2mM) (pH 5.0)
Guaiacol 1 mL
(2 mM)
450nm
3 mL
buffer de acetato
(10mM, pH 5.0)
1,5mL
600mL
1mL
-
0,1mL (2mM) hidrogeno
peróxido
-
Las diferencias de los resultados pueden atribuirse a los potenciales de oxidación
entre la enzima y el substrato (Reinhammar and Malmström, 1981). El guaiacol es un
monophenol substituido que tiene la posibilidad de actuar sobre los aldehídos. La odianisidine es una diamina que se oxida en presencia de compuestos diazo. El ABTS no es
un fenol sino un heterocíclico. El ABTS puede ser oxidado en las dos formas: ABTS+ o
ABTS2+ (Johannes and Majcherezyk, 2000; Fabbrini et al., 2002). El ABTS no tiene
color, pero sí el ABTS+ que toma una coloración azul-verde que se ve en el dominio del
visible (Solís-Oba et al., 2005) [20].
En la parte experimental se ha escogido la Syringaldazine como substrato de los ensayos
de actividad de la laccase por ser un substrato muy utilizado y haber encontrado un
método muy bien descrito en la literatura.
41
Tercera parte:
Resultavos y Discucion
I.
Ensayos de actividad de la celulase:
La cellulasa ensayada tiene número EC: 3.2.1.4 su nombre comercial es: Cellusoft APL y
ha sido suministrada por Novozymes .El método que se ha seguido es el método de la
Hidroxyethylcellulase (ver pag. 34)
Una vez calculada la curva de calibración con el método de la Hidroxyethylcellulase, se
ha procedido a ensayar la influencia de la temperatura en la actividad de la cellulase EC
3.2.1.4
1) Resultados:
Tabla2: Datos de la curva de calibración.
42
Absorbancia a 540nm
Concentracion de glucosa
expresada en nKat/mL de
enz.
0,01122
4,17
0 ,01912
5,56
0 ,12399
8,33
0,62878
16,7
Figura 16: actividad de la celulasa EC 3.2.1.4 en función de la temperatura.
El HEC rompe las cadenas de celulosa en pequeñas moléculas de glucosa. El DNS
que es un colorante naranja que reacciona con la glucosa y da diferentes tonalidades de
color marrón según la concentración de la glucosa. Las soluciones de glucosa dan
absorbancia que sirven para trazar la curva de calibración. Utilizamos la ecuación de la
curva de calibración para calcular la actividad de la celulasa EC 3.2.1.4.
2) Discusión:
La temperatura óptima de la celulasa EC 3.2.1.4 en estas condiciones de ensayo
está entre 60 y 70°C. La tolerancia es muy pequeña y en la figura 16 se puede observar
que a partir de los 60°C la actividad regresa rápidamente. Por otro lado también la
actividad de la celulasa EC 3.2.1.4 aumenta muy rápidamente entre 40°C y 50°C. Esto
podría ser interpretado quizá por alguna influencia importante de la temperatura en la
estabilidad del complejo entre la celulasa EC 3.2.1.4 y el HEC.
43
II.
Ensayos de la actividad de la laccase:
La laccasa ensayada tiene numero EC 1.10.3.2 su nombre comercial es 51003 y ha sido
suministrada por Novoenzyme. El método que se ha seguido es el método de la
Syringaldazine (ver pag. 35)
Primero se buscó el factor de dilución adecuado de la enzima para obtener una
concentración entre 25 y 50 Unidades por mililitro de disolución, en los ensayos de
actividad. El factor de dilución encontrado fue 10-4.
1) Resultados:
a
44
b
Figura 17: Influencia del pH a temperatura constante de 33°C.
El grafico b de la figura 17 muestra que, el pH óptimo de la laccase esta
alrededor de 6
Figura 18: Influencia de la temperatura a un pH constante de 6,55.
Una vez hallado el factor de dilución para la concentración de enzima se procedió
a estudiar la influencia de la temperatura y el pH en la actividad de la laccasa EC
1.10.3.2. sobre la syringaldazine.
45
Se lee la absorbancia del producto a 530nm. Para una concentración del substrato
superior a 5mM se forma un precipitado que toma la coloración del medio, cuando se
calienta la mezcla en el baño maría después de la reacción.
La velocidad inicial en las gráficas de las figuras 17 y 18 (a), se ha expresado en
términos de unidades de actividad/mL de enzima. Pero la definición de una unidad de
actividad enzimática es la liberación de 1 μmol de substrato por minuto, por tanto es
proporcional a la velocidad inicial de reacción. Por otro lado: Vmax = kcat* [E]o Pero si la
velocidad de reacción es proporcional a las unidades de actividad de la enzima, tenemos
que:
U ~ V ~ kcat
Y podemos describir la afinidad enzimática: kcat/Km, con la expresión: U/Km por mL de
enzima.
2) Discusión:
A pH de 6,55 y a 33°C se ve la mejor actividad de la laccasa EC 1.10.3.2 en las
condiciones de la reacción.
A la temperatura de 65°C, la actividad enzimática es muy pequeña y presenta una curva
muy irregular en la que es difícil calcular la actividad máxima aunque seguramente no
supere las dos unidades por mililitro de enzima.
La actividad de la laccasa no está favorecida a pH altos. Normalmente la actividad de las
enzimas está muy determinada por el pH, esto es debido a los mecanismos de reacción.
Se puede suponer que, en estas condiciones de reacción, la estabilidad del complejo ES
esta más favorecido a pH bajos, o que la k de velocidad de la reacción es mayor a pH
bajos y a 33°C.
Tabla 3: resumen de resultados.
pH
Temperatura (°C)
4,5
33
Km (mM)
1,63
U/mL enz.
15,09
6,55
8,5
33 - 45 - 65
33
0,73 – 1,08 - 1,17*
1,57
15,95 – 11.21 -1,49
6,38
46
U/Km
9,26
21,85 – 10,38 – 1,27
4,06
*Valor dudoso por la irregularidad de la curva.
Si observamos la tabla 4, vemos que las condiciones de pH y temperatura en las
que se obtienen una actividad mayor de la laccasa son pH 6,55 y temperatura 33°C, pero
si observamos le relación que nos da la afinidad E-S, la diferencia con la afinidad con las
otras condiciones es aun mayar.
Conclusiones:
Hay muchos métodos para ensayar la actividad de las enzimas. En general cada
ensayo con un substrato diferente puede variar la actividad de la enzima
correspondiente y también las condiciones óptimas de pH y temperatura. Lo mejor
escoger un método simple y sensible para tenerlo como referencia.
La actividad de la celulasa ensayada tiene un rango de temperaturas óptimas muy
estrecho. Esto hace suponer que su mecanismo de reacción es muy sensible a la
temperatura.
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La actividad de la laccasa en las condiciones ensayadas tiene un pH óptimo de
6,55 y una temperatura óptima de 33°C. Éstos son más evidentes si se calcula la relación
de afinidad E-S. A un pH 6,55 la Km es más pequeña que a un pH 4,55 y la actividad de la
laccasa es prácticamente la misma; lo que implica que a pH 6,55 la actividad es mejor que
a 4,55.
Cuarta parte:
Bibliografía y referencia
A lo largo de las búsquedas, se aprendió a utilizar diferentes bases de datos como
BRENDA, PDBsum y PUBMEB. Estos sitios permiten encontrar los diferentes protocolos
que se describen en el proyecto.
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