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“Quenching” de fluorescencia
quenching = desactivación= apagamiento = menor emisión
IF (Q) < IF (-Q)
Reacciones en el estado excitado (Quenching colisional)
Entrecuzamiento intersistema a estado Triplete
Rearreglos moleculares
Transferencia de energía
Transferencia de carga
Formación de complejo en el estado basal (Quenching estático)
Quenching colisional o dinámico
hν’
τ0
X
hν
X* Q
kQ
X
XQ*
τ < τ0
τ / τ0 = F/F0
X+Q
Quenching colisional o dinámico
Stern-Volmer
F0/F
Quenching de
triptofano por O2
KSV = 32 M-1
Quenching colisional o dinámico
KSV = kq τ0
kq = cte. vel. quenching
k0 = cte. vel. colisional (controlada por difusión)
fQ = fracción de encuentros efectivos que
terminan en quenching
kQ se determina experimentalmente a partir de KSV. Se estima la eficiencia de
quenching fQ calculando k0 según Smoluchowski:
O se conoce la eficiencia de quenching fQ entonces se calcula k0 para estimar
el coeficiente de difusión D usando la ecuación de Stokes-Einstein:
Determinación de coeficiente de difusión de NO en LDL
por desactivación de la fluorescencia
O
CH2O C CH CH3
O
O C
•NO
(CH2)7
(CH2)7CH3
C C
H
H
NO
NO
NO
Denicola et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 932-
Denicola et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 932-
=1
Quenching colisional y estático combinado
Quenching dinámico y estático
• Se requiere contacto entre Q y F, interacción molecular
• Quenching dinámico o colisional: Q + F*
• Quenching estático: Q + F
• Q debe difundir hacia F distancias moderadas (a diferencia
de relajación por solvente)
Indica localización del F, exposición de F de manera
de ser accesible a Q
Colicin E1 = proteina de membrana
12 W
Quenchers of W emission: Iodide, acrylamide, disulfide, e-defficient groups like
–NH3+, -COOH, histidine protonated
Carga del quencher afecta el quenching (Ksv)
Impedimento estérico disminuye quenching (Ksv)
DHE = dihidroequinelin = esteroide fluorescente
SBP = steroid binding protein
Fracción accesible al quencher
a = fluoróforo accesible a Q
b = fluoróforo no accesible
fa = fracción de la fluorescencia
inicial que se quenchea
Stern-Volmer modificada
F0/F
cAMP Receptor Protein (CRP)
2 subunidades idénticas de 209 aa
W13 (expuesto) W85 (no accesible
+ cAMP = cambio conformacional =
W13 y W85 expuestos
10-doxilnonadecano = quencher hidrofóbico
Acrilamida = quencher soluble
Quencher soluble en membrana
Calcular la partición P
Lípido marcado (NBD)
Q = 5-nitroxide estearico
Quenching como indicador de analitos – cuantificación del Q
Fluoróforo sensible a cloruros
Detección por levantamiento de Quenching
Secuencia de ADN con
Fluoresceina quencheada
por pireno
Hibridización, se intercala el Pireno hidrofóbico y
levanta el quenching de la Fluoresceina
Detección por levantamiento de Quenching
Oligómero con tiol en 3’ para unirse a la
superfcie (o coloide) Au.
Rodamina (TMR) en 5’ quencheada por Au.
Hibridización correcta, levanta el quenching
(aleja TMR de Au)
Quenching intermolecular
Q y F están unidos covalentemente
Enzima flavina reductasa con FMN unido
La F de FMN es solución > F de FMN unido
La Y35 responsible de quenching
interno de FMN por transferencia
electrónica
Autoquenching – elevada concentración del fluoróforo
Fluoróforos con poco
corrimiento Stokes
- reabsorción de las λ
menores de emisión
- formación de excímeros
Rodamina 6G
5 µM
0.16 mM
5.7 mM