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“Quenching” de fluorescencia quenching = desactivación= apagamiento = menor emisión IF (Q) < IF (-Q) Reacciones en el estado excitado (Quenching colisional) Entrecuzamiento intersistema a estado Triplete Rearreglos moleculares Transferencia de energía Transferencia de carga Formación de complejo en el estado basal (Quenching estático) Quenching colisional o dinámico hν’ τ0 X hν X* Q kQ X XQ* τ < τ0 τ / τ0 = F/F0 X+Q Quenching colisional o dinámico Stern-Volmer F0/F Quenching de triptofano por O2 KSV = 32 M-1 Quenching colisional o dinámico KSV = kq τ0 kq = cte. vel. quenching k0 = cte. vel. colisional (controlada por difusión) fQ = fracción de encuentros efectivos que terminan en quenching kQ se determina experimentalmente a partir de KSV. Se estima la eficiencia de quenching fQ calculando k0 según Smoluchowski: O se conoce la eficiencia de quenching fQ entonces se calcula k0 para estimar el coeficiente de difusión D usando la ecuación de Stokes-Einstein: Determinación de coeficiente de difusión de NO en LDL por desactivación de la fluorescencia O CH2O C CH CH3 O O C •NO (CH2)7 (CH2)7CH3 C C H H NO NO NO Denicola et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 932- Denicola et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 932- =1 Quenching colisional y estático combinado Quenching dinámico y estático • Se requiere contacto entre Q y F, interacción molecular • Quenching dinámico o colisional: Q + F* • Quenching estático: Q + F • Q debe difundir hacia F distancias moderadas (a diferencia de relajación por solvente) Indica localización del F, exposición de F de manera de ser accesible a Q Colicin E1 = proteina de membrana 12 W Quenchers of W emission: Iodide, acrylamide, disulfide, e-defficient groups like –NH3+, -COOH, histidine protonated Carga del quencher afecta el quenching (Ksv) Impedimento estérico disminuye quenching (Ksv) DHE = dihidroequinelin = esteroide fluorescente SBP = steroid binding protein Fracción accesible al quencher a = fluoróforo accesible a Q b = fluoróforo no accesible fa = fracción de la fluorescencia inicial que se quenchea Stern-Volmer modificada F0/F cAMP Receptor Protein (CRP) 2 subunidades idénticas de 209 aa W13 (expuesto) W85 (no accesible + cAMP = cambio conformacional = W13 y W85 expuestos 10-doxilnonadecano = quencher hidrofóbico Acrilamida = quencher soluble Quencher soluble en membrana Calcular la partición P Lípido marcado (NBD) Q = 5-nitroxide estearico Quenching como indicador de analitos – cuantificación del Q Fluoróforo sensible a cloruros Detección por levantamiento de Quenching Secuencia de ADN con Fluoresceina quencheada por pireno Hibridización, se intercala el Pireno hidrofóbico y levanta el quenching de la Fluoresceina Detección por levantamiento de Quenching Oligómero con tiol en 3’ para unirse a la superfcie (o coloide) Au. Rodamina (TMR) en 5’ quencheada por Au. Hibridización correcta, levanta el quenching (aleja TMR de Au) Quenching intermolecular Q y F están unidos covalentemente Enzima flavina reductasa con FMN unido La F de FMN es solución > F de FMN unido La Y35 responsible de quenching interno de FMN por transferencia electrónica Autoquenching – elevada concentración del fluoróforo Fluoróforos con poco corrimiento Stokes - reabsorción de las λ menores de emisión - formación de excímeros Rodamina 6G 5 µM 0.16 mM 5.7 mM